Summary
एम 2 जैसे ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टैम) कैंसर में ट्यूमर प्रगति और खराब पूर्वानुमान से जुड़े होते हैं। यह प्रोटोकॉल 14 दिनों के भीतर एम 2-जैसे मैक्रोफेज में टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को पुन: अंतर और ध्रुवीकरण करने के लिए एक विस्तृत गाइड के रूप में कार्य करता है। यह मॉडल ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर टैम के विरोधी भड़काऊ प्रभावों की जांच करने का आधार है।
Abstract
ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टैम) बाहरी उत्तेजनाओं के अनुसार अपनी अभिव्यक्ति और साइटोकिन प्रोफाइल को स्विच कर सकते हैं। यह उल्लेखनीय प्लास्टिसिटी टैम को ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर चल रहे बदलावों के अनुकूल बनाने में सक्षम बनाता है। मैक्रोफेज में मुख्य रूप से प्रो-भड़काऊ (एम 1-लाइक) या एंटी-भड़काऊ (एम 2-जैसे) विशेषताएं हो सकती हैं और इन दो मुख्य राज्यों के बीच लगातार स्विच कर सकते हैं। ट्यूमर वातावरण के भीतर M2-जैसे मैक्रोफेज कैंसर की प्रगति और कैंसर के कई प्रकार में गरीब पूर्वानुमान के साथ जुड़े रहे हैं । THP-1 कोशिकाओं के भेदभाव और ध्रुवीकरण को प्रेरित करने के लिए कई अलग-अलग तरीकों का उपयोग सेलुलर और अंतरकोशिकीय तंत्र और ट्यूमर के माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर टैम के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जाता है। वर्तमान में, टीएचपी-1 सेल लाइन का उपयोग करके एम 2-जैसे मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के लिए कोई स्थापित मॉडल नहीं है, और कुछ इन विट्रो स्टिमुली के कारण मैक्रोफेज की अभिव्यक्ति और साइटोकिन प्रोफाइल के परिणाम अध्ययनों के बीच भिन्न होते हैं। यह प्रोटोकॉल M0 मैक्रोफेज में THP-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को अलग करने और 14 दिनों के भीतर M2-जैसे फेनोटाइप में कोशिकाओं को आगे ध्रुवीकृत करने के लिए विस्तृत मार्गदर्शन के रूप में कार्य करता है। हम हल्के माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं, विभेदित मैक्रोफेज और ध्रुवीकृत एम 2-जैसे मैक्रोफेज के रूपात्मक परिवर्तनों को प्रदर्शित करते हैं। यह मॉडल टैम के विरोधी भड़काऊ प्रभावों और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के अन्य सेल आबादी के साथ उनकी बातचीत की जांच करने वाले सेल लाइन मॉडल का आधार है।
Introduction
ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टैम) और पुरानी सूजन में उनकी भूमिका, कैंसर की शुरुआत, और ट्यूमर विकास हाल के शोध1,2में महत्वपूर्ण लक्ष्य हैं । परिधीय रक्त मोनोसाइट्स जो विकासशील ट्यूमर के ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट में भर्ती होते हैं , मैक्रोफेज में अंतर करते हैं और उन्हें मैक्रोफेज3के दो मुख्य उपप्रकारों में ध्रुवीकृत किया जा सकता है। शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज मुख्य रूप से समर्थक भड़काऊ एम 1-जैसे फेनोटाइप का प्रतिनिधित्व करता है और वैकल्पिक रूप से सक्रिय M2-जैसे उपप्रकार मुख्य रूप से विरोधी भड़काऊ विशेषताओं को दर्शाता है4। मैक्रोफेज अपने सेलुलर मेटाबॉलिज्म के आधार पर इन दो मुख्य फेनोटाइप के बीच गतिशील रूप से स्विच कर सकते हैं, जिसमें मध्यवर्ती उपप्रकारों में भड़काऊ और विरोधी दोनों गुण होते हैं5। टैम दोनों फेनोटाइप की विषम आबादी का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, विभिन्न प्रकार के कैंसर में ट्यूमर को बढ़ावा देने वाला कार्य और खराब पूर्वानुमान विशेष रूप से एम 2-जैसे मैक्रोफेज6,7,8से जुड़ा हुआ है।
मैक्रोफेज के कार्यात्मक प्रोफाइल और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर अन्य कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत जटिल और चल रहे ट्यूमर विकास के दौरान लगातार बदलते वातावरण में कब्जा करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। सेल लाइनें संस्कृति में स्थिर व्यवहार्यता के साथ एक समरूप सेल आबादी प्रदान कर सकती हैं, जो परिभाषित सेलुलर और अंतरकोशिकीय तंत्र का प्रदर्शन करने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकती है। मोनोसाइट की तरह टीएचपी-1 सेल लाइन प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स9के लिए एक वैध मॉडल प्रणाली है। यह अनायास अमर कोशिका रेखा एक साल के शिशु के परिधीय रक्त से प्राप्त की गई हैजिसमेंतीव्र मोनोसाइटिक ल्यूकेमिया9,10है । टीएचपी -1 कोशिकाओं के विभेदन और ध्रुवीकरण की सूचना कई अध्ययनों द्वारा दी गई है और इसे कई अलग - अलग तरीकों से किया गया है11,12,13,14. सक्रियण और, इसलिए, एम 1-जैसे फेनोटाइप में मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण के बाद एक प्रतिपूरक विरोधी भड़काऊ खुशहाली लौटने लगी तंत्र है, जो भड़काऊ मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के माध्यम से एम 2-जैसे फेनोटाइप को बढ़ावा देता है, जैसे इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) या इटाकोनेट15,16। यह सेल एक्टिवेशन17के बाद एक ओवरशूटिंग भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करने के लिए एक ब्रेक मैकेनिज्म के रूप में काम कर सकता है । मोनोसाइट्स और टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को विरोधी भड़काऊ M2-जैसे फेनोटाइप में अंतर और ध्रुवीकरण करने की प्रक्रिया भी समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ है जिसे दूर किया जाना चाहिए। एक भड़काऊ साइटोकिन प्रतिक्रिया यांत्रिक तनाव18के कारण हो सकती है, जैसे कि कोशिकाओं को फिर से स्तनपान कराने के लिए मीडिया बदलना, या टीएचपी-1 कोशिकाओं में अंतर करने के लिए रासायनिक यौगिकों को जोड़ना, जैसे कि फरबोल 12-myristate 13-एसीटेट (पीएमए), और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (TNFα), इंटरल्यूकिन 1ο (IL-1) या आईएल-619के उत्पादन को प्रेरित करता है। पीएमए की प्रतिक्रिया के रूप में यह परिवर्तित साइटोकिन अभिव्यक्ति प्रोफाइल बाद में मैक्रोफेज ध्रुवीकरणकोप्रभावित और रोक सकता है । पर्याप्त आराम अवधि, जैसा कि पीएमए उपचार के बाद पहले बताया गया है, इन भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करने और सेल ध्रुवीकरण को एक अलग M2-जैसे फेनोटाइप21में सुविधाजनक बनाने की अनुमति देता है।
यह प्रोटोकॉल 14 दिनों के भीतर मैक्रोफेज के M2-जैसे फेनोटाइप में टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं में अंतर और ध्रुवीकरण करने की एक विधि को दर्शाता है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का अवलोकन चित्र 1में दिखाया गया है । मानव मोनोसाइट जैसी ल्यूकेमिया सेल लाइन टीएचपी-1 खरीदी गई थी। टीएचपी-1 सेल लाइन को प्रमाणित करने के लिए शॉर्ट टैंडेम रिपीट एनालिसिस किया गया। बाँझ परिस्थितियों में सभी चरणों का प्रदर्शन करें। THP-1 मोनोसाइटिक सेल लाइन निलंबन में बढ़ता है और सेल संस्कृति सतहों को देते नहीं है । पालन के माध्यम से मैक्रोफेज की तरह कोशिकाओं में मोनोसाइट्स अंतर द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, यांत्रिक तनाव या पीएमए के साथ विशिष्ट उपचार।
1. टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं की खेती और रखरखाव
- 150 एस के लिए एक टाइमर सेट करें। तरल नाइट्रोजन से टीएचपी-1 सेल लाइन(सामग्री की तालिका)युक्त जमे हुए शीशी को हटा दें और इसे तुरंत साफ पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में गल लें। शीशी को पानी में उतारते ही टाइमर शुरू कर दें। विगलन प्रक्रिया के कारण निर्माण कर रहे दबाव को छोड़ने के लिए टोपी को ढीला करें लेकिन यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब खोलने से पानी से संपर्क नहीं होता है, प्रदूषण से बचने के लिए। कोशिकाओं को विगलन करने के लिए इष्टतम समय अवधि 120-150 एस के बीच है। कोशिका निलंबन को तब तक जारी रखें जब तक कि लगभग 4 मिमी के आकार की आइस चिप शीशी के भीतर न रह जाए; फिर, तुरंत अगले कदम पर आगे बढ़ें।
- सेल सस्पेंशन के लिक्विड फेज को 15 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें जिसमें 9 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ग्रोथ मीडिया(मैटेरियल्स की टेबल) होती है। फिर, गर्म मध्यम सेल निलंबन के 1 एमएल को टीएचपी-1 शीशी में स्थानांतरित करें और शेष बर्फ चिप को पिघलाने के लिए 15 एमएल ट्यूब में वापस करें और शीशी को फ्लश करें ताकि यह आश्वस्त किया जा सके कि कोई कोशिका पीछे नहीं रह जाती है।
- निलंबन को धीरे-धीरे 1000 माइक्रोल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पिपिंग करके मिलाएं। व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक छोटा सा नमूना (लगभग 10 माइक्रोन) निकालें (बहिष्कार के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके) जबकि वे घूमती हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर गर्म सेल निलंबन नीचे स्पिन करें।
- 5 x 10 5 /एमएल की सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए गर्म विकास माध्यम की एक निश्चित मात्रा के साथ सुपरनैंट को पूरीतरहसे निकालें और फिर से खर्च करें। निलंबन को धीरे-धीरे मिलाएं और 22 एमएल वॉल्यूम को टी-75 सेल कल्चर फ्लास्क(सामग्री की तालिका)में स्थानांतरित करें। स्टोर 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)एकाग्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में सीधा फ्लास्क। हर 3-4 दिन में ग्रोथ मीडिया का आदान-प्रदान करें।
2. THP-1 कोशिकाओं की सीडिंग और M0 मैक्रोफेज में भेदभाव
- 3 x 10 5/एमएल/वेल के घनत्व पर बीज कोशिकाओं को संबंधित सेल घनत्व के साथ विकास माध्यम युक्त कोशिका को 24-वेल सेल कल्चरप्लेट्स (सामग्रियों की तालिका)में तैयार करें । माध्यम को धीरे-धीरे मिलाएं और 26 एमएल के एलिकेट्स तैयार करें, प्रत्येक को 50 एमएल ट्यूब में डाल दें। कोशिकाओं को संबंधित प्लेट में बोने के लिए प्रत्येक 26 एमएल एलिकोट का उपयोग करें।
- सेल युक्त माध्यम के 1 एमएल को 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। स्थानान्तरण के बीच ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मीडिया को धीरे-धीरे मिलाएं।
- पीएमए का स्टॉक समाधान तैयार करें (डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 100 माइक्रोन में पीएमए का 1 मिलीग्राम भंग करें = डीएमएसओ में पीएमए का ~ 16 एमएम समाधान) और इसे कोल्ड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ सेल ट्रीटमेंट(सामग्री की तालिका)से ठीक पहले 10 एनजी/माइक्रोन की अंतिम कार्य एकाग्रता के साथ पतला करें। इसका घोल बर्फ पर रखें और तुरंत इसका इस्तेमाल करें। फिर से फ्रीज न करें। प्रति अच्छी तरह से पीएमए के 100 एनजी जोड़ें। प्रत्येक सेल प्लेट को 72 घंटे के लिए बिना किसी अन्य उपचार के इनक्यूबेटर में बैठने दें।
- 72 घंटे के बाद ग्रोथ मीडियम को हटा दें और इसे फ्रेश ग्रोथ मीडियम के 1 एमएल से रिप्लेस करें। पिपेट टिप्स से कुओं के नीचे न छुएं। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में एक और 96 घंटे के लिए आराम करने दें।
- 96 घंटे के बाद, चरण 2.4 (मीडिया परिवर्तन) दोहराएं और कोशिकाओं को एक और 24 घंटे के लिए आराम करने दें।
नोट: M0 मैक्रोफेज अब प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करने के लिए तैयार हैं(चित्रा 2)। आगे के प्रयोगों के हिस्से के रूप में कोशिकाओं के इलाज से तुरंत पहले, केवल आरपीआईएमआई(सामग्री की तालिका) केसाथ मीडिया परिवर्तन पर विचार करें क्योंकि विकास मीडिया की खुराक कोशिका उपचार के लिए जोड़े गए अभिकर्मकों के साथ हस्तक्षेप का कारण बन सकती है। यदि M2-जैसे मैक्रोफेज की आवश्यकता है, तो धारा 3 के साथ आगे बढ़ें।
3. M2-जैसे मैक्रोफेज में M0 मैक्रोफेज का ध्रुवीकरण
- आईएल-4 और आईएल-13 का स्टॉक समाधान तैयार करें (नाभिक मुक्त पानी के 200 माइक्रोन में आईएल-4 या आईएल-13 के 20 माइक्रोन को भंग करें) और इसे कोशिका उपचार से तुरंत पहले पीबीएस के साथ 2 एनजी/माइक्रोन की अंतिम कार्य एकाग्रता में पतला करें। इसका घोल बर्फ पर रखें और तुरंत इसका इस्तेमाल करें। फिर से फ्रीज न करें।
- ग्रोथ मीडियम को हटाएं और इसे फ्रेश ग्रोथ मीडियम के 1 एमएल से रिप्लेस करें। इंटरल्यूकिन 4 (आईएल-4) के 20 एनजी और इंटरल्यूकिन 13 (आईएल-13) के 20 एनजी को अच्छी तरह से जोड़ें। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 48 घंटे तक आराम करने दें।
- 48 घंटे के बाद, 3.2 चरण दोहराएं। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में एक और 48 घंटे के लिए आराम करने दें।
- ग्रोथ मीडियम को हटाएं और इसे फ्रेश ग्रोथ मीडियम के 1 एमएल से रिप्लेस करें। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 48 घंटे तक आराम करने दें।
नोट: M2 की तरह मैक्रोफेज अब प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करने के लिए तैयार है(चित्रा 2)। आगे के प्रयोगों के हिस्से के रूप में कोशिकाओं के इलाज से तुरंत पहले, केवल(सामग्रीकी तालिका) के साथ एक मीडिया परिवर्तन पर विचार करें क्योंकि विकास मीडिया की खुराक हस्तक्षेप का कारण बन सकती है।
4. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए अलग और कटाई मैक्रोफेज
नोट: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए प्लेटों से ध्रुवीकृत मैक्रोफेज को अलग करने और फसल करने के लिए ठंडे चौंकाने वाले और सेल स्क्रैपिंग के संयोजन वाली यांत्रिक विधि का उपयोग करें।
- गर्म सेल माध्यम को हटा दें और इसे बर्फ-ठंडे पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से मिश्रण से बदलें। इसके तुरंत बाद, सेल प्लेट को 45 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। गर्म सेल माध्यम को हटाने से पहले सेल प्लेट को बर्फ पर न रखें, क्योंकि इससे सेल व्यवहार्यता काफी कम हो जाएगी। बर्फ-ठंडे पीबीएस/5% एफबीएस मिश्रण के साथ ठंडे झटके को प्रेरित करने के बाद ही कोशिकाओं को बर्फ पर रखें ।
- बर्फ पर 45 मिनट के बाद, मिनी सेल स्क्रैपर्स(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके कोशिकाओं को कुरेदना। धीरे से ठंडे PBS/5% FBS में अलग मैक्रोफेज को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें । ट्यूब को हर समय बर्फ पर तब तक रखें जब तक कोशिकाओं पर दाग न लगे।
नोट: पूल कोशिकाओं के आठ कुओं धुंधला के लिए पर्याप्त सेल मायने रखता है तक पहुंचने के लिए ।
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Representative Results
एम 2-जैसे मैक्रोफेज की विशेषता थी, और एम 2-ध्रुवीकरण को विभेदन मार्कर (सीडी) सीडी 14, सीडी 11बी, सीडी 80 (एम 1-जैसे मार्कर) और सीडी 206 (एम 2-जैसे मार्कर) के क्लस्टर के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके मान्य किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लो साइटोमेट्री धुंधला किया गया था। मैक्रोफेज को पीबीएस/5% एफबीएस के साथ धोया गया था और अविशिष्ट बाध्यकारी से बचने के लिए Fcγ-रिसेप्टर ब्लॉक के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । कोशिकाओं को तब 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीई-संयुग्मित माउस एंटी-ह्यूमन सीडी 11बी एंटीबॉडी के साथ, और पीई-टैंडेम-कंजूस माउस एंटी-ह्यूमन सीडी 206 एंटीबॉडी और आइसोटाइप-मिलान आईजीजी(सामग्री की मेज) केसाथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए फिटसी-संयुग्मित माउस एंटी-ह्यूमन सीडी 14 और सीडी 80 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। चार रंग प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और फ्लोरेसेंस क्वांटिटेशन किया गया। कोशिकाओं की गेटिंग आगे बिखराव और पक्ष तितर बितर के अनुसार सेल मलबे को छोड़कर किया गया था।
मोनोसाइट और मैक्रोफेज मार्कर सीडी 14 और सीडी 11बी क्रमशः 70.9% और कोशिकाओं के 74.7%(चित्रा 3)में व्यक्त किए गए थे। कोशिकाओं ने M1-जैसे मार्कर सीडी 80 (0.2%) और M2-जैसे मार्कर सीडी 206 के उच्च सतह स्तर के लिए कोशिकाओं के 62.6%(चित्रा 4)में लगभग कोई सकारात्मकता नहीं दिखाई।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित ध्रुवीकरण विधि से प्राप्त मैक्रोफेज सीडी 14 की अभिव्यक्ति के साथ-साथ सीडी 11बी मार्कर दिखाते हैं। दोनों मार्कर कर सकते हैं लेकिन मैक्रोफेज में व्यक्त करने की जरूरत नहीं है। M2-जैसे मैक्रोफेज मार्कर के रूप में CD206 के लिए एक स्पष्ट सकारात्मकता की उम्मीद है, जबकि M1-जैसे मार्कर के रूप में सीडी 80 अभिव्यक्ति का स्तर कम होना चाहिए। रागी एट अल ने परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का उपयोग करके इसी तरह के परिणामों का प्रदर्शन किया, जो एम 2-जैसे मैक्रोफेज22में ध्रुवीकृत थे। CD206 की औसत अभिव्यक्ति 50%-60% के बीच भिन्न थी, जबकि सीडी 80 की औसत अभिव्यक्ति 20%-25%22के बीच थी।
इस प्रोटोकॉल द्वारा बनाए गए एम 2-जैसे मैक्रोफेज का आगे लक्षण वर्णन मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके किया गया था। एम 2-जैसे मैक्रोफेज ने टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं की तुलना में आईएल-6 और सी-एक्स-सी मोटिफ केमोकिन लिगांड 10 (CXCL10) का एक उपनियम दिखाया, साथ ही विरोधी भड़काऊ मार्कर CD206, इंटरल्यूकिन 10 (आईएल-10) और सी-सी मोटिफ केमोकिन लिगांड 18 (सीसीएल18) (परिणाम नहीं दिखाए गए, प्रकाशित होने के लिए) का एक उपनियमन।
चित्रा 1:M2-जैसे मैक्रोफेज सेल लाइन मॉडल का अवलोकन। 0 दिन, कोशिकाओं को एक विकास माध्यम के साथ प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे है और ७२ घंटे के लिए पीएमए के साथ इनक्यूबेटेड । दिन 3 और दिन 7 सेल माध्यम बदल जाता है, जो कोशिकाओं को कुल 120 घंटे के लिए पीएमए के बिना आराम करने देता है। 8 दिन, विकास माध्यम एक बार फिर बदल जाता है, और कोशिकाओं को आईएल-4 और आईएल-13 के साथ इनक्यूबेटेड करने के लिए M2 की तरह ध्रुवीकरण प्रेरित कर रहे हैं । यह कदम 2 दिनों के बाद दोहराया जाता है, 10 दिन पर। 12 दिन, अंतिम मध्यम परिवर्तन किया जाता है, और M2-जैसी कोशिकाएं प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने से पहले एक और 48 घंटे के लिए विकास माध्यम में आराम करती हैं (पीएमए = फोंबोल 12-myristate-13-एसीटेट; आईएल = इंटरल्यूकिन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:टीएचपी-1 कोशिकाओं की सेल आकृति विज्ञान, विभेदित (एम0) मैक्रोफेज, और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एम 2-जैसे मैक्रोफेज। कोशिकाओं को 24-अच्छी प्लेट में 3 x10 5 प्रति अच्छी तरह से वरीयता दी गई थी। (A,B) टीएचपी-1 कोशिकाओं को बेसलाइन पर दिखाया गया है। (C,D) विभेदित एम0 मैक्रोफेज को ७२ घंटे, विकास माध्यम परिवर्तन और ९६-एच-आराम अवधि के लिए पीएमए उपचार प्राप्त हुआ । (ई,एफ) एम 2-जैसे मैक्रोफेज को इस सेल मॉडल (20x और 40x आवर्धन; स्केल = 100 माइक्रोन) के दिन आईएल-4 और आईएल-13 के साथ पूर्ण ध्रुवीकरण उपचार के बाद दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:CD14 (फिटसी, FL1-H) और CD11b (पीई, FL2-H) के लिए फ्लो साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस विश्लेषण। (ए)घनत्व तितर-बितर साजिश, कोशिकाओं के प्रतिशत प्रत्येक क्वाड्रेंट में दिखाए जाते हैं। (B,C) एक नकारात्मक धुंधला नियंत्रण की तुलना में M2-जैसे मैक्रोफेज में CD14 और CD11b के लिए हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:सीडी 80 (फिटसी, FL1-H) और सीडी 206 (पीई-टैंडेम संजूगेट, FL3-H) के लिए फ्लो साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस विश्लेषण। (ए)घनत्व स्कैटर प्लॉट, कोशिकाओं का प्रतिशत प्रत्येक चतुर्भुज में दिखाया जाता है। (B,C) सीडी 80 और CD206 के लिए हिस्टोग्राम M2-जैसे मैक्रोफेज में एक नकारात्मक धुंधला नियंत्रण की तुलना में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
14 दिनों के भीतर टीएचपी-1 मोनोसाइट जैसी कोशिकाओं को अलग करने और ध्रुवीकरण करने पर यह प्रोटोकॉल चरणों के बीच पर्याप्त आराम अवधि के साथ कोशिकाओं के लंबे उपचार इनक्यूबेशन के कारण एक अलग M2-जैसे फेनोटाइप के साथ मैक्रोफेज प्राप्त करने की विधि प्रदान करता है।
कुछ कदम इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं । टीएचपी-1 मोनोसाइट्स का दोगुना समय लगभग 26 घंटे है। कोशिकाओं को 9 x 105/एमएलके सेल घनत्व पर विभाजित किया जा सकता है और प्रत्येक विभाजन के दौरान 3 x 105/एमएल के घनत्व पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए । विभाजन सभी इस्तेमाल (पुराने) सेल माध्यम को हटाने के बिना किया जा सकता है-ताजा माध्यम के केवल ५०% के साथ कोशिकाओं को refeeding वास्तव में तेजी से सेल विकास के लिए नेतृत्व कर सकते है क्योंकि वातानुकूलित सेल माध्यम में विकास कारकों सेलुलर प्रसार को बढ़ा सकते हैं । सभी सेल मीडिया का आदान प्रदान नहीं, हालांकि, संस्कृति संदूषण का खतरा बढ़ जाता है और इसलिए केवल हौसले से सुसंस्कृत कोशिकाओं के पहले मार्ग के दौरान किया जाना चाहिए । कोशिकाओं की गिनती के लिए सही घनत्व पर संस्कृति कोशिकाओं के लिए सक्षम होना महत्वपूर्ण है और विगलन के बाद सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए । कोशिकाओं को ठीक से विगलन के बाद मृत कोशिकाओं का अनुपात 15% से अधिक नहीं होना चाहिए।
प्लेटों में कोशिकाओं के बोने के लिए प्रत्येक कुएं में एक सुसंगत सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए कोशिका निलंबन के कोमल लेकिन पूरी तरह से मिश्रण की आवश्यकता होती है। एलिकोट कोशिकाओं को संस्कृति प्लेटों में बोने से पहले तैयार किया जाता है ताकि यह आश्वस्त किया जा सके कि माध्यम से युक्त कोशिका की मात्रा ठीक से मिश्रित है। चूंकि माध्यम में टीएचपी-1 मोनोसाइट्स एक शीशी के नीचे तक डूब जाते हैं, इसलिए कोशिकाओं के लगातार घनत्व को प्राप्त करने के लिए हस्तांतरण की मात्रा का निरंतर सौम्य मिश्रण महत्वपूर्ण है।
ठंडे झटकों और भड़काऊ सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया23से बचने के लिए सेल मीडिया को हर समय 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए। इसलिए, मीडिया परिवर्तन और सेल उपचार के लिए भी, प्लेटों को 15 मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेटर से बाहर नहीं छोड़ा जाना चाहिए। इसके अलावा, कोशिकाओं के इलाज से पहले स्टॉक समाधानों को कमजोर करने के लिए सेल उपचार के लिए संबंधित यौगिकों, जैसे कि पीएमए, इंटरल्यूकिंस, और पीबीएस को हमेशा बर्फ पर रखा जाना चाहिए ताकि गिरावट से बचा जा सके।
पीएमए उपचार द्वारा मोनोसाइट्स से विभेदित लाइव मैक्रोफेज कुओं की सतह का पालन करते हैं। मीडिया परिवर्तन और अन्य आगे उपचार चरणों के दौरान, पिपेट टिप्स को सेल क्षति को रोकने के लिए प्लेट के भीतर एक कुएं के नीचे नहीं छूना चाहिए।
विभेदित या ध्रुवीकृत मैक्रोफेज के साथ प्रवाह साइटोमेट्री प्रदर्शन करने के लिए, प्लेटों से जुड़ी कोशिकाओं को काटा जाना चाहिए। कोशिकाओं को टुकड़ी करने के लिए या तो एंजाइमेटिक या यांत्रिक तकनीकें हैं, जिनमें ट्राइप्सिनाइजेशन, प्रोटियोलिटिक और कोलेजनोलिटिक गतिविधि के साथ एंजाइम मिश्रण के साथ उपचार, या एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टिक एसिड (EDTA), ठंडा झटका, सेल स्क्रैपिंग, या ध्वनिक दबाव24,25के माध्यम से भी टुकड़ी शामिल है। मैक्रोफेज की एंजाइमेटिक टुकड़ी से सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति बदल सकती है और इसलिए फेनोटाइपिक या कार्यात्मक विश्लेषण25के लिए पहली पसंद नहीं है। अन्य रिपोर्टों के विपरीत, यहां किए गए प्रयोगों से पता चला है कि ठंडे चौंकाने वाले और मैक्रोफेज को खुरचने के संयोजन ने ट्राइपैन ब्लू डाई अपवर्जन का उपयोग करके अच्छी सेल व्यवहार्यता (>90%) दिखाई। इसलिए, कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, एनोटेशन के साथ कि एक बार ठंडा झटका प्रेरित होता है, कोशिकाओं को हर समय बर्फ पर ठंडा रखना पड़ता है।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा वीवो में मैक्रोफेज तंत्र की नकल करने के लिए एक आधार के रूप में मोनोसाइट जैसी सेल लाइन का उपयोग है। प्राथमिक मैक्रोफेज का उपयोग करके सेल संस्कृति अध्ययन, हालांकि, चर सेलुलर प्रतिक्रियाओं को दिखा सकते हैं और कोशिका विषमता26के कारण तंत्र को नकाबपोश किया जा सकता है। टीएचपी-1 सेल लाइन प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स 9 के लिए एकस्थापितमॉडल प्रणाली है। एक नियंत्रित संस्कृति सेटिंग में समरूप THP-1 सेल आबादी के कारण, सेलुलर प्रतिक्रियाएं संभावित रूप से अधिक सटीक प्रजनन योग्य हैं। इसके अलावा, कुछ तकनीकें प्राथमिक मोनोसाइट्स के समान मॉडल के रूप में टीएचपी-1 कोशिकाओं का अनुकूलन करती हैं। एक महत्वपूर्ण कदम पीएमए उपचार के बाद 5 दिनों की आराम की अवधि है, जो विभेदित मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं21के समान साइटोप्लाज्मिक मात्रा और कोशिका सतह पालन को बढ़ाता है।
एक अन्य सीमा एक निश्चित एम 2-जैसे मैक्रोफेज फेनोटाइप का निर्माण है जिसमें एम 2-जैसे मैक्रोफेज की तुलना में अन्य विशेषताएं हैं जिनका उपयोग पिछले अध्ययनों में किया गया था। टीएचपी-1 कोशिकाओं में अंतर और ध्रुवीकरण करने के लिए कई अलग-अलग तकनीकों की सूचना दी गई है, और बेसलाइन लक्षण वर्णन की कमी इंटरस्टडी प्रजननक्षमता 11, 12,13,14को जटिल बना देती है। इसलिए, जांच किए जाने वाले तंत्रों के आधार पर बेसलाइन पर अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मैक्रोफेज की विशेषता होना महत्वपूर्ण है। उसके बाद, संबंधित उपचार के बाद सेलुलर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल का पालन करके उत्पादित एम 2-जैसे मैक्रोफेज ट्यूमर की शुरुआत में सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच और विभिन्न प्रकार के कैंसर, घाव भरने या फाइब्रोसिस में प्रगति के लिए एक ठोस आधार हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, या तो एम0-मैक्रोफेज या एम 2-मैक्रोफेज का उपयोग विट्रो मेंकिया जा सकता है, और कोशिकाओं को कूकल्चर मॉडल में उपयोग करने के लिए उपयुक्त हैं। यह एक अलग एम 2-जैसे मैक्रोफेज फेनोटाइप के विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोग प्रदान करता है जो समय के साथ विट्रो में मजबूती से नियंत्रित होता है।
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Disclosures
लेखक हितों के कोई संभावित संघर्ष की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
प्राइस इंस्टीट्यूट ऑफ सर्जिकल रिसर्च, यूनिवर्सिटी ऑफ लुइसविले को जॉन डब्ल्यू प्राइस और बारबरा थ्रस्टर एटवुड प्राइस ट्रस्ट द्वारा आर्थिक रूप से सपोर्ट किया जाता है । वित्तपोषण स्रोतों के डिजाइन और अध्ययन के संचालन के साथ ही संग्रह, प्रबंधन, विश्लेषण, और डेटा की व्याख्या में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
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