Summary
M2-lignende tumorrelaterte makrofager (TAM) er forbundet med tumorprogresjon og dårlig prognose hos kreft. Denne protokollen fungerer som en detaljert veiledning for å reprodusere og polarisere THP-1 monocyttlignende celler i M2-lignende makrofager innen 14 dager. Denne modellen er grunnlaget for å undersøke de antiinflammatoriske effektene av TAM i tumormikromiljøet.
Abstract
Tumorrelaterte makrofager (TAM) kan bytte uttrykk og cytokinprofil i henhold til ytre stimuli. Denne bemerkelsesverdige plastisiteten gjør det mulig for TAM å tilpasse seg pågående endringer i tumormikromiljøet. Makrofager kan enten primært ha proinflammatoriske (M1-lignende) eller antiinflammatoriske (M2-lignende) attributter og kan kontinuerlig bytte mellom disse to hovedtilstandene. M2-lignende makrofager i tumormiljøet er forbundet med kreftprogresjon og dårlig prognose i flere typer kreft. Mange forskjellige metoder for å indusere differensiering og polarisering av THP-1-celler brukes til å undersøke cellulære og intercellulære mekanismer og effekten av TAM i mikromiljøet av svulster. For tiden er det ingen etablert modell for M2-lignende makrofag polarisering ved hjelp av THP-1 cellelinjen, og resultatene av uttrykk og cytokinprofiler av makrofager på grunn av visse in vitro stimuli varierer mellom studier. Denne protokollen fungerer som detaljert veiledning for å skille THP-1 monocyttlignende celler i M0 makrofager og å polarisere celler ytterligere til en M2-lignende fenotype innen 14 dager. Vi demonstrerer de morfologiske endringene i THP-1 monocyttlignende celler, differensierte makrofager og polariserte M2-lignende makrofager ved hjelp av lett mikroskopi. Denne modellen er grunnlaget for cellelinjemodeller som undersøker de antiinflammatoriske effektene av TAM og deres interaksjoner med andre cellepopulasjoner av tumormikromiljøet.
Introduction
Tumorrelaterte makrofager (TAM) og deres rolle i kronisk betennelse, utbruddet av kreft og tumorutvikling er viktige mål i nyere forskning1,2. Perifere blodmonocytter som rekrutteres til vevsmikromiljøet til den utviklende svulsten, skiller seg ut i makrofager og kan polariseres til to hovedundertyper av makrofager3. Den klassisk aktiverte makrofagen representerer den hovedsakelig proinflammatoriske M1-lignende fenotypen, og den alternativt aktiverte M2-lignende undertypen viser overveiende antiinflammatoriske egenskaper4. Makrofager kan bytte dynamisk mellom disse to viktigste fenotypene avhengig av deres cellulære metabolisme, med mellomliggende undertyper som har både inflammatoriske og antiinflammatoriske attributter5. TAM representerer en heterogen populasjon av begge fenotypene. En tumorfremmende funksjon og dårlig prognose i ulike typer kreft er imidlertid spesielt forbundet med M2-lignende makrofager6,7,8.
De funksjonelle profilene til makrofager og deres interaksjon med andre celler i tumormikromiljøet er komplekse og utfordrende å fange i et kontinuerlig skiftende miljø under pågående tumorutvikling. Cellelinjer kan gi en homogen cellepopulasjon med stabil levedyktighet i kulturen, noe som kan lette prosessen med å demonstrere definerte cellulære og intercellulære mekanismer. Den monocyttlignende THP-1-cellelinjen er et legitimt modellsystem for primære menneskelige monocytter9. Denne spontant udødeliggjorte cellelinjen er hentet fra perifert blod fra et ett år gammelt spedbarn med akutt monocytisk leukemi9,10. Differensiering og polarisering av THP-1 celler har blitt rapportert av flere studier og har blitt utført på flere forskjellige måter11,12,13,14. Aktivering og derfor polarisering av makrofager i en M1-lignende fenotype etterfølges av en kompenserende antiinflammatorisk rebound-mekanisme, som fremmer en M2-lignende fenotype gjennom cytokiner produsert av inflammatoriske makrofager, som interleukin 6 (IL-6) eller itakonat15,16. Dette kan fungere som en pausemekanisme for å dempe en overskytende inflammatorisk respons etter celleaktivering17. Prosessen med å differensiere og polarisere monocytter og THP-1 monocyttlignende celler i en antiinflammatorisk M2-lignende fenotype er i seg selv også ledsaget av proinflammatoriske stimuli som må overvinnes. En inflammatorisk cytokinrespons kan skyldes mekanisk stress18, for eksempel endring av medier for å refeede cellene, eller legge til kjemiske forbindelser for å skille THP-1-celler, for eksempel phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), og indusere produksjon av tumornekrosefaktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-66 19. Denne endrede cytokinuttrykksprofilen som svar på PMA kan påvirke og forhindre etterfølgende makrofagpolarisering20. Tilstrekkelige hvileperioder, som rapportert før etter PMA-behandling, tillater disse inflammatoriske responsene å redusere og lette cellepolarisering i en distinkt M2-lignende fenotype21.
Denne protokollen demonstrerer en metode for å differensiere og polarisere THP-1 monocyttlignende celler til en M2-lignende fenotype makrofager innen 14 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: En oversikt over trinnene som er beskrevet i denne protokollen, vises i figur 1. Den humane monocyttlignende leukemicellelinjen THP-1 ble kjøpt. Kort tandem repetisjon analyse ble utført for å autentisere THP-1 cellelinjen. Utfør alle trinn under sterile forhold. Den monocytiske cellelinjen THP-1 vokser i suspensjon og festes ikke til cellekulturoverflater. Tilslutning kan induseres ved å differensiere monocytter i makrofaglignende celler gjennom for eksempel mekanisk stress eller spesifikk behandling med PMA.
1. Culturing og vedlikehold av THP-1 monocyttlignende celler
- Still inn en tidtaker på 150 s. Fjern det frosne hetteglasset som inneholder THP-1-cellelinjen (Materialbord) fra det flytende nitrogenet og tine det umiddelbart i et rent vannbad (37 °C). Start timeren så snart hetteglasset er satt i vannbadet. Løsne hetten for å frigjøre trykket som bygger seg opp på grunn av opptiningsprosessen, men sørg for at røråpningen ikke kommer i kontakt med vannet, for å unngå forurensning. Den optimale tidsperioden for opptining av cellene ligger mellom 120-150 s. Fortsett å tine cellefjæringen til en isbit på størrelse med ca. 4 mm er igjen i hetteglasset; Fortsett deretter til neste trinn umiddelbart.
- Overfør væskefasen av cellefjæringen til et 15 ml rør som inneholder 9 ml varmt (37 °C) vekstmedie (Materialbord). Overfør deretter 1 ml av den varme mellomcellefjæringen til THP-1 hetteglasset og tilbake til 15 ml-røret for å smelte den gjenværende isbrikken og skyll hetteglasset for å sikre at ingen celler blir igjen.
- Bland fjæringen forsiktig ved å pipettere opp og ned med en 1000 μL pipette. Fjern en liten prøve (ca. 10 μL) for å telle cellene for levedyktighet (ved hjelp av trypan blå for utelukkelse) mens de er spunnet. Spinn ned den varme cellefjæringen ved 200 x g i 7 min ved 37 °C.
- Fjern supernatanten helt og resuspend med et visst volum varmt vekstmedium for å oppnå en celletetthet på 5 x 105/ ml. Bland suspensjonen forsiktig og overfør 22 ml volum til T-75 cellekulturflasker (Materialbord). Oppbevar kolber oppreist i en inkubator ved 37 °C med 5 % karbondioksidkonsentrasjon (CO2). Bytt vekstmediene hver 3-4 dager.
2. Såing av THP-1 celler og differensiering i M0 makrofager
- Forbered cellen som inneholder vekstmedium med den respektive celletettheten til frøceller med en tetthet på 3 x 105/ ml / brønn i 24-brønns cellekulturplater (Tabell over materialer). Bland mediet forsiktig og lag aliquots på 26 ml, hver satt inn i et 50 ml rør. Bruk hver 26 ml aliquot for såing av cellene i en respektive plate.
- Overfør 1 ml av det celleholdige mediet til hver brønn på en 24-brønns plate. Bland mediet forsiktig ved å pipettere opp og ned mellom overføringer.
- Forbered en lagerløsning av PMA (oppløs 1 mg PMA i 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO) = ~ 16 mM løsning av PMA i DMSO) og fortynn den med kaldt fosfat bufret saltvann (PBS) til en endelig arbeidskonsentrasjon på 10 ng / μL rett før cellebehandling (Tabell over materialer). Hold oppløsningen på is og bruk den umiddelbart. Ikke frys på nytt. Tilsett 100 ng PMA per brønn. La hver celleplate sitte i inkubatoren uten ytterligere behandling i 72 timer.
- Etter 72 timer, fjern vekstmediet og erstatt det med 1 ml fersk vekstmedium. Ikke berør bunnen av brønnene med pipettespisser. La cellene hvile i ytterligere 96 timer i inkubatoren.
- Etter 96 h gjentar du trinn 2.4 (medieendring) og lar cellene hvile i ytterligere 24 timer.
MERK: M0-makrofagene er nå klare til bruk for eksperimenter (figur 2). Umiddelbart før du behandler cellene som en del av ytterligere eksperimenter, bør du vurdere en medieendring bare med RPMI (Tabell over materialer) siden vekstmedietilskudd kan forårsake interferens med reagenser som legges til for cellebehandling. I tilfelle M2-lignende makrofager er nødvendig, fortsett med § 3.
3. Polarisering av M0 makrofager i M2-lignende makrofager
- Forbered en lagerløsning på IL-4 og IL-13 (oppløs 20 μg IL-4 eller IL-13 i 200 μL nukleasefritt vann) og fortynn det til en endelig arbeidskonsentrasjon på 2 ng/μL med PBS umiddelbart før cellebehandling. Hold oppløsningen på is og bruk den umiddelbart. Ikke frys på nytt.
- Fjern vekstmediet og erstatt det med 1 ml fersk vekstmedium. Tilsett 20 ng interleukin 4 (IL-4) og 20 ng interleukin 13 (IL-13) per brønn. La cellene hvile i 48 timer i inkubatoren.
- Etter 48 timer gjentar du trinn 3.2. La cellene hvile i ytterligere 48 timer i inkubatoren.
- Fjern vekstmediet og erstatt det med 1 ml fersk vekstmedium. La cellene hvile i 48 timer i inkubatoren.
MERK: M2-lignende makrofager er nå klare til bruk for eksperimenter (figur 2). Umiddelbart før du behandler cellene som en del av ytterligere eksperimenter, bør du vurdere en medieendring bare med RPMI (Tabell over materialer) siden vekstmedietilskudd kan forårsake forstyrrelser.
4. Løsne og høste makrofager for strømningscytometri
MERK: Bruk en mekanisk metode som kombinerer kaldsympende og celleskraping for å løsne og høste de polariserte makrofagene fra plater for strømningscytometri.
- Fjern det varme cellemediet og erstatt det med en blanding av iskald PBS (uten kalsium og magnesium) og 5% foster bovint serum (FBS), 1 ml per brønn. Umiddelbart etter dette, plasser celleplaten på is i 45 min. Ikke plasser celleplaten på is før det varme cellemediet fjernes, da dette vil redusere celle levedyktigheten betydelig. Hold cellene på is først etter å ha fremkalt kaldt støt med iskald PBS/5% FBS-blanding.
- Etter 45 min på is, skrap av cellene ved hjelp av minicelleskrapere (Tabell over materialer). Overfør forsiktig de frittliggende makrofagene i kald PBS / 5% FBS til et 15 ml rør. Hold røret på is til enhver tid til cellene er farget.
MERK: Samle åtte brønner med celler for å nå tilstrekkelige celletall for farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M2-lignende makrofager ble karakterisert, og M2-polarisering ble validert ved hjelp av flowcytometri for Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-lignende markør) og CD206 (M2-lignende markør). Flowcytometrifarging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Makrofager ble vasket med PBS/5% FBS og inkubert med Fcγ-reseptorblokk for å unngå uspesifisert binding. Celler ble deretter farget med FITC-konjugerte mus antimenneskelig CD14 og CD80 antistoffer, med PE-konjugerte mus anti-menneskelige CD11b antistoffer, og med PE-tandem-konjugert mus anti-menneskelige CD206 antistoffer og isotype-matchet IgG (Tabell over materialer) i 30 min ved 4 °C. Firefargers strømningscytometrisk analyse og fluorescensmengder ble utført. Gating av celler ble utført, unntatt celleavfall i henhold til fremoverspredning og sidespredning.
Monocytt- og makrofagmarkørene CD14 og CD11b ble uttrykt i henholdsvis 70,9 % og 74,7 % av cellene (figur 3). Celler viste nesten ingen positivitet for M1-lignende markør CD80 (0,2%) og høye overflatenivåer av M2-lignende markør CD206 i 62,6% av cellene (Figur 4).
Makrofagene som er avledet fra polariseringsmetoden som er beskrevet i denne protokollen, viser uttrykket for CD14 og CD11b-markører. Begge markørene kan, men trenger ikke å uttrykkes i makrofager. Det forventes en klar positivitet for CD206 som en M2-lignende makrofagindikator, mens nivået på CD80-uttrykket som en M1-lignende markør skal være lavt. Raggi et al. viste lignende resultater ved hjelp av perifere blodmonylære celler (PBMC), som ble polarisert til M2-lignende makrofager22. Det gjennomsnittlige uttrykket for CD206 varierte mellom 50%-60%, mens gjennomsnittsuttrykket for CD80 varierte mellom 20%-25%22.
Videre karakterisering av M2-lignende makrofager opprettet av denne protokollen ble utført ved hjelp av kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR). M2-lignende makrofager viste en oppregulering av IL-6 og C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) sammenlignet med THP-1 monocyttlignende celler, samt en oppregulering av de antiinflammatoriske markørene CD206, Interleukin 10 (IL-10) og C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (resultater ikke vist, som skal publiseres).
Figur 1: Oversikt over den M2-lignende makrofagcellelinjemodellen. På dag 0 blir celler sådd i plater med et vekstmedium og inkuberes med PMA i 72 timer. På dag 3 og dag 7 celle medium endres, noe som lar cellene hvile uten PMA i totalt 120 timer. På dag 8 endres vekstmediet igjen, og cellene inkuberes med IL-4 og IL-13 for å indusere M2-lignende polarisering. Dette trinnet gjentas etter 2 dager, på dag 10. På dag 12 utføres den siste middels endringen, og M2-lignende celler hviler i vekstmediet i ytterligere 48 timer før de brukes til eksperimenter (PMA = phorbol 12-myristate-13-acetat; IL = interleukin). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Cellemorfologi for THP-1-celler, differensierte (M0) makrofager og M2-lignende makrofager ved hjelp av lysmikroskopi. Celler ble sådd ved 3 x 105 per brønn i en 24-brønnsplate. (A,B) THP-1-celler vises ved baseline. (C,D) De differensierte M0-makrofagene fikk PMA-behandling i 72 timer, vekstmediumsendring og en hvileperiode på 96 timer. (E,F) M2-lignende makrofager vises etter fullført polariseringsbehandling med IL-4 og Il-13 på dag 14 i denne cellemodellen (20x og 40x forstørrelse; skala = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescensanalyse av strømningscytometri for CD14 (FITC, FL1-H) og CD11b (PE, FL2-H). (A) Tetthetsspredning, prosentandeler av celler vises i hver kvadrant. (B,C) Histogrammer for CD14 og CD11b i M2-lignende makrofager sammenlignet med en negativ fargingskontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fluorescensanalyse av strømningscytometri for CD80 (FITC, FL1-H) og CD206 (PE-tandemkonjugat, FL3-H). (A) Tetthetspredningsplott, prosentandeler av celler vises i hver kvadrant. (B,C) Histogrammer for CD80 og CD206 i M2-lignende makrofager sammenlignet med en negativ fargingskontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen om differensiering og polarisering av THP-1 monocyttlignende celler innen 14 dager gir en metode for å oppnå makrofager med en distinkt M2-lignende fenotype på grunn av lang behandlingsinkubasjon av celler med tilstrekkelig hvileperioder mellom trinnene.
Enkelte trinn er avgjørende for denne protokollen. Doblingstiden for THP-1 monocytter er ca. 26 timer. Celler kan deles med en celletetthet på 9 x 105/ml og bør frøs med en tetthet på 3 x 105/ml under hver splitt. Splitten kan utføres uten å fjerne alt brukt (gammelt) cellemedium - å mate cellene med bare 50% av det friske mediet kan faktisk føre til raskere cellevekst fordi vekstfaktorer i betinget cellemedium kan forbedre cellulær spredning. Å ikke utveksle alle cellemediene øker imidlertid risikoen for kulturforurensning og bør derfor bare utføres under de første passasjene av nykulturerte celler. Telling av cellene er viktig for å kunne dyrke celler med riktig tetthet og for å bestemme cellulær levedyktighet etter opptining. Andelen døde celler etter opptining av celler bør ikke overstige 15%.
Såing av celler i plater krever mild, men grundig blanding av celleopphenget for å oppnå en konsekvent celletetthet i hver brønn. Aliquots er forberedt før sådd cellene i kulturplater for å sikre at volumet av celleholdige mediet blandes riktig. Ettersom THP-1 monocytter i mediet har en tendens til å synke til bunnen av et hetteglass, er kontinuerlig skånsom blanding av overføringsvolum avgjørende for å oppnå en konsekvent tetthet av celler.
Cellemedier bør varmes opp til 37 °C til enhver tid for å unngå forkjølelsessjokk og en proinflammatorisk cellulær stressrespons23. Derfor, også for medieforandringer og cellebehandling, bør plater ikke utelates fra inkubatoren i mer enn 15 minutter. Videre bør de respektive forbindelsene for cellebehandling, som PMA, interleukins og PBS for fortynning av lagerløsninger før behandling av cellene, alltid holdes på is for å unngå nedbrytning.
Levende makrofager som differensieres fra monocytter ved PMA-behandling, holder seg til overflaten av brønnene. Under medieforandringer og andre ytterligere behandlingstrinn, bør pipettespisser ikke berøre bunnen av en brønn i platen for å forhindre celleskade.
For å utføre strømningscytometri med differensierte eller polariserte makrofager, må cellene som er festet til platene høstes. Det er enten enzymatiske eller mekaniske teknikker for å løsne celler, inkludert trypsinisering, behandling med enzymblandinger med proteolytisk og collagenolytisk aktivitet, eller etylendiamintetraacetisk syre (EDTA), kaldt sjokk, celleskraping eller til og med løsrivelse gjennom akustisk trykk24,25. Enzymatisk løsrivelse av makrofager kan føre til endret celleoverflatemarkøruttrykk og er derfor ikke førstevalget for fenotypiske eller funksjonelle analyser25. I motsetning til andre rapporter viste eksperimentene som ble utført her at kombinasjonen av kuldes sjokkerende og skraping av makrofager viste god celle levedyktighet (>90%) ved hjelp av Trypan Blue fargestoffekskludering. Derfor anbefales det å bruke denne teknikken for å løsne cellene, med merknaden om at når et kaldt støt er indusert, må cellene holdes kalde på is til enhver tid.
En begrensning i denne protokollen er bruken av en monocyttlignende cellelinje som grunnlag for å etterligne makrofagmekanismer in vivo. Cellekulturstudier som bruker primære makrofager, kan imidlertid vise variable cellulære responser og mekanismer kan maskeres på grunn av celle heterogenitet26. THP-1-cellelinjen er et etablert modellsystem for primære menneskelige monocytter9. På grunn av den homogene THP-1-cellepopulasjonen i en kontrollert kulturinnstilling, er cellulære responser potensielt mer presist reproduserbare. Videre optimaliserer visse teknikker THP-1-celler som en modell som ligner primære monocytter. Et viktig skritt er hvileperioden på 5 dager etter PMA-behandling, noe som øker cytoplasmatisk volum og overholdelse av celleoverflate som ligner på differensierte monocyttavledede celler21.
En annen begrensning er opprettelsen av en viss M2-lignende makrofagfenotype som har andre egenskaper enn M2-lignende makrofager som ble brukt i tidligere studier. Mange forskjellige teknikker for å differensiere og polarisere THP-1-celler er rapportert, og mangel på baseline-karakterisering kompliserer interstudy reproduserbarhet11,12,13,14. Derfor er det viktig å karakterisere makrofagene som brukes i en studie ved baseline, avhengig av mekanismene som undersøkes. Deretter bør de cellulære responsene etter en respektive behandling demonstreres.
M2-lignende makrofager produsert ved å følge denne protokollen er et solid grunnlag for undersøkelse av cellulære responser i tumor utbrudd og progresjon i ulike typer kreft, sårheling eller fibrose. Med denne protokollen kan enten M0-makrofager eller M2-makrofager brukes in vitro, og cellene er egnet til å brukes i kokulturmodeller. Dette gir et bredt spekter av anvendelser av en distinkt M2-lignende makrofag fenotype som er robust kontrollert in vitro over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potensielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, støttes økonomisk av John W. Price og Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskildene hadde ingen rolle i utformingen og gjennomføringen av studien, så vel som i innsamling, ledelse, analyse og tolkning av dataene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
