Summary

Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Published: August 02, 2021
doi:

Summary

Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.

Abstract

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent changer leur expression et leur profil de cytokines en fonction de stimuli externes. Cette plasticité remarquable permet à TAM de s’adapter aux changements en cours dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages peuvent avoir des attributs principalement pro-inflammatoires (de type M1) ou anti-inflammatoires (de type M2) et peuvent basculer continuellement entre ces deux états principaux. Les macrophages de type M2 dans l’environnement tumoral sont associés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancer. De nombreuses méthodes différentes pour induire la différenciation et la polarisation des cellules THP-1 sont utilisées pour étudier les mécanismes cellulaires et intercellulaires et les effets du TAM dans le microenvironnement des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle établi pour la polarisation des macrophages de type M2 utilisant la lignée cellulaire THP-1, et les résultats de l’expression et des profils de cytokines des macrophages dus à certains stimuli in vitro varient d’une étude à l’autre. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages M0 et pour polariser davantage les cellules en un phénotype de type M2 dans les 14 jours. Nous démontrons les changements morphologiques des cellules de type monocytaire THP-1, des macrophages différenciés et des macrophages polarisés de type M2 à l’aide de la microscopie optique. Ce modèle est à la base de modèles de lignées cellulaires étudiant les effets anti-inflammatoires du TAM et leurs interactions avec d’autres populations cellulaires du microenvironnement tumoral.

Introduction

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et leur rôle dans l’inflammation chronique, l’apparition du cancer et le développement de tumeurs sont des cibles importantes dans les recherches récentes1,2. Les monocytes du sang périphérique qui sont recrutés dans le microenvironnement tissulaire de la tumeur en développement se différencient en macrophages et peuvent être polarisés en deux sous-types principaux de macrophages3. Le macrophage activé classiquement représente le phénotype de type M1 principalement pro-inflammatoire et le sous-type de type M2 activé alternativement présente principalement des caractéristiques anti-inflammatoires4. Les macrophages peuvent basculer dynamiquement entre ces deux phénotypes principaux en fonction de leur métabolisme cellulaire, les sous-types intermédiaires ayant à la fois des attributs inflammatoires et anti-inflammatoires5. TAM représente une population hétérogène des deux phénotypes. Une fonction favorisant la tumeur et un mauvais pronostic dans différents types de cancers sont cependant particulièrement associés aux macrophages de type M26,7,8.

Les profils fonctionnels des macrophages et leur interaction avec d’autres cellules dans le microenvironnement tumoral sont complexes et difficiles à capturer dans un environnement en constante évolution pendant le développement continu de la tumeur. Les lignées cellulaires peuvent fournir une population cellulaire homogène avec une viabilité stable en culture, ce qui peut faciliter le processus de démonstration de mécanismes cellulaires et intercellulaires définis. La lignée cellulaire THP-1 de type monocyte est un système modèle légitime pour les monocytes humains primaires9. Cette lignée cellulaire spontanément immortalisée a été obtenue à partir du sang périphérique d’un nourrisson d’un an atteint de leucémie monocytaire aiguë9,10. La différenciation et la polarisation des cellules THP-1 ont été rapportées par plusieurs études et ont été réalisées de multiples manières différentes11,12,13,14. L’activation et, par conséquent, la polarisation des macrophages en un phénotype de type M1 est suivie d’un mécanisme de rebond anti-inflammatoire compensatoire, favorisant un phénotype de type M2 à travers des cytokines produites par des macrophages inflammatoires, tels que l’interleukine 6 (IL-6) ou l’itaconate15,16. Cela pourrait servir de mécanisme de rupture pour atténuer une réponse inflammatoire de dépassement après l’activation cellulaire17. Le processus de différenciation et de polarisation des monocytes et des cellules de type monocyte THP-1 en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 s’accompagne lui-même de stimuli pro-inflammatoires qui doivent être surmontés. Une réponse inflammatoire aux cytokines peut être causée par un stress mécanique18, tel que le changement de milieu pour réalimenter les cellules, ou l’ajout de composés chimiques pour différencier les cellules THP-1, tels que le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), et induire la production de facteur de nécrose tumorale α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) ou IL-619. Cette altération du profil d’expression des cytokines en réponse à la PMA peut affecter et prévenir la polarisation ultérieure des macrophages20. Des périodes de repos adéquates, comme indiqué précédemment après le traitement par PMA, permettent à ces réponses inflammatoires de diminuer et facilitent la polarisation cellulaire en un phénotype 21 distinct de typeM2.

Ce protocole démontre une méthode pour différencier et polariser les cellules de type monocytaire THP-1 en un phénotype de macrophages de type M2 dans les 14 jours.

Protocol

Remarque : Une vue d’ensemble des étapes décrites dans ce protocole est illustrée à la figure 1. La lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 a été achetée. Une courte analyse de répétition en tandem a été effectuée pour authentifier la lignée cellulaire THP-1. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. La lignée cellulaire monocytaire THP-1 se développe en suspension et ne se fixe pas aux surfaces de culture cellulaire. L’adhérence peut ?…

Representative Results

Des macrophages de type M2 ont été caractérisés et la polarisation M2 a été validée à l’aide de la cytométrie en flux pour les marqueurs de type Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marqueur de type M1) et CD206 (marqueur de type M2). La coloration par cytométrie en flux a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. Les macrophages ont été lavés avec du PBS/FBS à 5 % et incubés avec le bloc récepteur Fcγ pour éviter toute liaison non spécifique. Les cellules ont ensuit…

Discussion

Ce protocole sur la différenciation et la polarisation des cellules monocytaires THP-1 dans les 14 jours fournit une méthode pour obtenir des macrophages avec un phénotype distinct de type M2 en raison d’une longue incubation de cellules avec des périodes de repos adéquates entre les étapes.

Certaines étapes sont essentielles à ce protocole. Le temps de doublement des monocytes THP-1 est d’environ 26 h. Les cellules peuvent être divisées à une densité cellulaire de 9 x 105…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le Price Institute of Surgical Research de l’Université de Louisville est soutenu financièrement par le John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust. Les sources de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception et la réalisation de l’étude ainsi que dans la collecte, la gestion, l’analyse et l’interprétation des données.

Materials

0.4% trypan blue VWR, Radnor, USA 152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific, Ocala, USA 1615-5510
10 mL serological pipet VWR, Radnor, USA  89130-898
1000 μL TipOne pipet tips USA Scientific, Ocala, USA 1111-2821
15 mL  Centrifuge tube VWR, Radnor, USA 89039-664
20 μL TipOne pipet tips USA Scientific, Ocala, USA 1120-1810
200 μL TipOne pipet tips USA Scientific, Ocala, USA 1120-8810
25 mL serological pipet VWR, Radnor, USA  89130-900
5 mL serological pipet VWR, Radnor, USA  89130-896
50 mL Centrifuge tube VWR, Radnor, USA 89039-662
Accutase solution 500 mL Sigma, St. Louis, USA A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized Sigma, St. Louis, USA A5955-100 mL with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator VWR, Radnor, USA C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap USA Scientific, Ocala, USA CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma, St. Louis, USA D8537-500 mL PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) Eppendorf, Enfield, USA
Ethyl alcohol (70%)
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences, San Diego, USA The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate VWR, Radnor, USA 353504
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC, Manassas, USA 30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14 BD Biosciences, San Diego, USA 555397 Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80 BD Pharmingen, San Diego, USA 557226 Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control BD Pharmingen, San Diego, USA 555748 Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences, San Diego, USA 553456 Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block BD Biosciences, San Diego, USA 564220 Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13) R&D, Minneapolis, USA IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4) R&D, Minneapolis, USA SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) Labconco, Kansas City, USA
L-Glutamine Solution, 200 mM ATCC, Manassas, USA 30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 Sigma, St. Louis, USA L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers Biotium, Fremont, USA 22003
Neubauer hemocytometer Fisher Scientific, Waltham, USA 02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100 Nikon, Melville, USA
Nuclease-free water Invitrogen, Carlsbad, USA AM9937
Olympus Light Microscope RH-2 Microscope Central, Feasterville, USA 40888
P10 variable pipet- Gilson VWR, Radnor, USA 76180-014
P1000 variable pipet-Gilson VWR, Radnor, USA 76177-990
P200 variable pipet- Gilson VWR, Radnor, USA 76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b BD Biosciences, San Diego, USA 555388 Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences, San Diego, USA 555749 Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 BD Pharmingen, San Diego, USA 551136 Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control BD Pharmingen, San Diego, USA 555750 Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma, St. Louis, USA P8139
Powerpette Plus pipettor VWR, Radnor, USA 75856-448
Precision Water bath (model 183) Precision Scientific, Chicago, USA 66551
RPMI-1640 Medium ATCC, Manassas, USA 30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) ATCC, Manassas, USA TIB-202

References

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Scheurlen, K. M., Snook, D. L., Gardner, S. A., Eichenberger, M. R., Galandiuk, S. Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line. J. Vis. Exp. (174), e62652, doi:10.3791/62652 (2021).

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