Summary
Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.
Abstract
Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent changer leur expression et leur profil de cytokines en fonction de stimuli externes. Cette plasticité remarquable permet à TAM de s’adapter aux changements en cours dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages peuvent avoir des attributs principalement pro-inflammatoires (de type M1) ou anti-inflammatoires (de type M2) et peuvent basculer continuellement entre ces deux états principaux. Les macrophages de type M2 dans l’environnement tumoral sont associés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancer. De nombreuses méthodes différentes pour induire la différenciation et la polarisation des cellules THP-1 sont utilisées pour étudier les mécanismes cellulaires et intercellulaires et les effets du TAM dans le microenvironnement des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle établi pour la polarisation des macrophages de type M2 utilisant la lignée cellulaire THP-1, et les résultats de l’expression et des profils de cytokines des macrophages dus à certains stimuli in vitro varient d’une étude à l’autre. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages M0 et pour polariser davantage les cellules en un phénotype de type M2 dans les 14 jours. Nous démontrons les changements morphologiques des cellules de type monocytaire THP-1, des macrophages différenciés et des macrophages polarisés de type M2 à l’aide de la microscopie optique. Ce modèle est à la base de modèles de lignées cellulaires étudiant les effets anti-inflammatoires du TAM et leurs interactions avec d’autres populations cellulaires du microenvironnement tumoral.
Introduction
Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et leur rôle dans l’inflammation chronique, l’apparition du cancer et le développement de tumeurs sont des cibles importantes dans les recherches récentes1,2. Les monocytes du sang périphérique qui sont recrutés dans le microenvironnement tissulaire de la tumeur en développement se différencient en macrophages et peuvent être polarisés en deux sous-types principaux de macrophages3. Le macrophage activé classiquement représente le phénotype de type M1 principalement pro-inflammatoire et le sous-type de type M2 activé alternativement présente principalement des caractéristiques anti-inflammatoires4. Les macrophages peuvent basculer dynamiquement entre ces deux phénotypes principaux en fonction de leur métabolisme cellulaire, les sous-types intermédiaires ayant à la fois des attributs inflammatoires et anti-inflammatoires5. TAM représente une population hétérogène des deux phénotypes. Une fonction favorisant la tumeur et un mauvais pronostic dans différents types de cancers sont cependant particulièrement associés aux macrophages de type M26,7,8.
Les profils fonctionnels des macrophages et leur interaction avec d’autres cellules dans le microenvironnement tumoral sont complexes et difficiles à capturer dans un environnement en constante évolution pendant le développement continu de la tumeur. Les lignées cellulaires peuvent fournir une population cellulaire homogène avec une viabilité stable en culture, ce qui peut faciliter le processus de démonstration de mécanismes cellulaires et intercellulaires définis. La lignée cellulaire THP-1 de type monocyte est un système modèle légitime pour les monocytes humains primaires9. Cette lignée cellulaire spontanément immortalisée a été obtenue à partir du sang périphérique d’un nourrisson d’un an atteint de leucémie monocytaire aiguë9,10. La différenciation et la polarisation des cellules THP-1 ont été rapportées par plusieurs études et ont été réalisées de multiples manières différentes11,12,13,14. L’activation et, par conséquent, la polarisation des macrophages en un phénotype de type M1 est suivie d’un mécanisme de rebond anti-inflammatoire compensatoire, favorisant un phénotype de type M2 à travers des cytokines produites par des macrophages inflammatoires, tels que l’interleukine 6 (IL-6) ou l’itaconate15,16. Cela pourrait servir de mécanisme de rupture pour atténuer une réponse inflammatoire de dépassement après l’activation cellulaire17. Le processus de différenciation et de polarisation des monocytes et des cellules de type monocyte THP-1 en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 s’accompagne lui-même de stimuli pro-inflammatoires qui doivent être surmontés. Une réponse inflammatoire aux cytokines peut être causée par un stress mécanique18, tel que le changement de milieu pour réalimenter les cellules, ou l’ajout de composés chimiques pour différencier les cellules THP-1, tels que le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), et induire la production de facteur de nécrose tumorale α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) ou IL-619. Cette altération du profil d’expression des cytokines en réponse à la PMA peut affecter et prévenir la polarisation ultérieure des macrophages20. Des périodes de repos adéquates, comme indiqué précédemment après le traitement par PMA, permettent à ces réponses inflammatoires de diminuer et facilitent la polarisation cellulaire en un phénotype 21 distinct de typeM2.
Ce protocole démontre une méthode pour différencier et polariser les cellules de type monocytaire THP-1 en un phénotype de macrophages de type M2 dans les 14 jours.
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Protocol
Remarque : Une vue d’ensemble des étapes décrites dans ce protocole est illustrée à la figure 1. La lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 a été achetée. Une courte analyse de répétition en tandem a été effectuée pour authentifier la lignée cellulaire THP-1. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. La lignée cellulaire monocytaire THP-1 se développe en suspension et ne se fixe pas aux surfaces de culture cellulaire. L’adhérence peut être induite en différenciant les monocytes en cellules de type macrophage par, par exemple, un stress mécanique ou un traitement spécifique avecPMA.
1. Culture et entretien des cellules de type monocytaire THP-1
- Réglez une minuterie sur 150 s. Retirer le flacon congelé contenant la lignée cellulaire THP-1 (Table des matières) de l’azote liquide et le décongeler immédiatement dans un bain-marie propre (37 °C). Démarrez la minuterie dès que le flacon est mis au bain-marie. Desserrer le bouchon pour libérer la pression qui s’accumule en raison du processus de décongélation, mais assurez-vous que l’ouverture du tube n’entre pas en contact avec l’eau, afin d’éviter toute contamination. La période optimale pour la décongélation des cellules se situe entre 120 et 150 s. Continuer à décongeler la suspension cellulaire jusqu’à ce qu’un éclat de glace de la taille d’environ 4 mm soit laissé dans le flacon; ensuite, passez immédiatement à l’étape suivante.
- Transférer la phase liquide de la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de milieux de croissance chauds (37 °C) (Table des matériaux). Ensuite, transférez 1 mL de la suspension chaude à cellules moyennes dans le flacon THP-1 et retournez dans le tube de 15 mL pour faire fondre la puce de glace restante et rincer le flacon pour vous assurer qu’aucune cellule n’est laissée derrière.
- Mélanger doucement la suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette de 1000 μL. Retirer un petit échantillon (environ 10 μL) pour compter la viabilité des cellules (en utilisant le bleu de trypan pour l’exclusion) pendant qu’elles sont filées. Faire tourner la suspension de la cellule chaude à 200 x g pendant 7 min à 37 °C.
- Retirez complètement le surnageant et ressuspendez avec un certain volume de milieu de croissance chaud pour obtenir une densité cellulaire de 5 x 105/ mL. Mélanger doucement la suspension et transférer 22 mL de volume dans des flacons de culture cellulaire T-75 (Table des matériaux). Conserver les flacons à la verticale dans un incubateur à 37 °C avec une concentration de dioxyde de carbone (CO2)de 5 %. Échangez le support de croissance tous les 3-4 jours.
2. Ensemencement de cellules THP-1 et différenciation en macrophages M0
- Préparer la cellule contenant le milieu de croissance avec la densité cellulaire respective pour ensemencer les cellules à une densité de 3 x 105/ mL / puits dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits (Table des matériaux). Mélanger doucement le milieu et préparer des aliquotes de 26 mL, chacune placée dans un tube de 50 mL. Utilisez chaque aliquote de 26 mL pour ensemencer les cellules dans une plaque respective.
- Transférer 1 mL du milieu contenant la cellule dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Mélangez doucement le média en pipetant de haut en bas entre les transferts.
- Préparer une solution mère de PMA (dissoudre 1 mg de PMA dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) = ~16 mM de solution de PMA dans du DMSO) et la diluer avec de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à froid jusqu’à une concentration finale de 10 ng/μL juste avant le traitement cellulaire (Table des matériaux). Gardez la solution sur la glace et utilisez-la immédiatement. Ne pas recongeler. Ajouter 100 ng de PMA par puits. Laissez chaque plaque cellulaire reposer dans l’incubateur sans autre traitement pendant 72 h.
- Après 72 h, retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 1 mL de milieu de croissance frais. Ne touchez pas le fond des puits avec des pointes de pipette. Laissez les cellules reposer pendant encore 96 heures dans l’incubateur.
- Après 96 h, répétez l’étape 2.4 (changement de support) et laissez les cellules reposer pendant encore 24 h.
REMARQUE: Les macrophages M0 sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences (Figure 2). Immédiatement avant de traiter les cellules dans le cadre d’autres expériences, envisagez un changement de milieu avec RPMI uniquement(Table des matériaux),car les suppléments de milieu de croissance peuvent provoquer des interférences avec les réactifs ajoutés pour le traitement cellulaire. Dans le cas où des macrophages de type M2 sont nécessaires, passez à la section 3.
3. Polarisation des macrophages M0 en macrophages de type M2
- Préparer une solution type d’IL-4 et d’IL-13 (dissoudre 20 μg d’IL-4 ou d’IL-13 dans 200 μL d’eau sans nucléase) et la diluer à une concentration de travail finale de 2 ng/μL avec du PBS immédiatement avant le traitement cellulaire. Gardez la solution sur la glace et utilisez-la immédiatement. Ne pas recongeler.
- Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 1 mL de milieu de croissance frais. Ajouter 20 ng d’interleukine 4 (IL-4) et 20 ng d’interleukine 13 (IL-13) par puits. Laissez les cellules reposer pendant 48 h dans l’incubateur.
- Après 48 h, répétez l’étape 3.2. Laissez les cellules reposer pendant encore 48 heures dans l’incubateur.
- Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 1 mL de milieu de croissance frais. Laissez les cellules reposer pendant 48 h dans l’incubateur.
REMARQUE: Les macrophages de type M2 sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences (Figure 2). Immédiatement avant de traiter les cellules dans le cadre d’autres expériences, envisagez un changement de milieu avec RPMI uniquement(Table des matériaux),car les suppléments de milieu de croissance peuvent causer des interférences.
4. Détachement et récolte des macrophages pour la cytométrie en flux
REMARQUE: Utilisez une méthode mécanique combinant le choc à froid et le grattage cellulaire pour détacher et récolter les macrophages polarisés des plaques pour la cytométrie en flux.
- Retirez le milieu cellulaire chaud et remplacez-le par un mélange de PBS glacé (sans calcium ni magnésium) et de sérum bovin fœtal à 5 %, soit 1 mL par puits. Immédiatement après, placez la plaque cellulaire sur de la glace pendant 45 min. Ne placez pas la plaque cellulaire sur de la glace avant que le milieu cellulaire chaud ne soit retiré, car cela diminuera considérablement la viabilité cellulaire. Gardez les cellules sur la glace seulement après avoir induit un choc froid avec un mélange PBS glacé / FBS à 5%.
- Après 45 min sur glace, grattez les cellules à l’aide de mini grattoirs à cellules (Table des matériaux). Transférer doucement les macrophages détachés dans du PBS froid/5% FBS dans un tube de 15 mL. Gardez le tube sur la glace en tout temps jusqu’à ce que les cellules soient colorées.
REMARQUE: Mettre en commun huit puits de cellules pour atteindre un nombre adéquat de cellules pour la coloration.
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Representative Results
Des macrophages de type M2 ont été caractérisés et la polarisation M2 a été validée à l’aide de la cytométrie en flux pour les marqueurs de type Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marqueur de type M1) et CD206 (marqueur de type M2). La coloration par cytométrie en flux a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. Les macrophages ont été lavés avec du PBS/FBS à 5 % et incubés avec le bloc récepteur Fcγ pour éviter toute liaison non spécifique. Les cellules ont ensuite été colorées avec des anticorps CD14 et CD80 anti-humains conjugués à la souris FITC, avec des anticorps CD11b anti-humains conjugués à la souris CONJUGUÉs au PEC, et avec des anticorps ANTI-humains CD206 de souris conjugués en tandem PE et des IgG(Table des matériaux)appariés à l’isotype pendant 30 min à 4 °C. Une analyse cytométrique en flux quadricolore et une quantification de fluorescence ont été effectuées. La mise en mesure des cellules a été effectuée, à l’exclusion des débris cellulaires en fonction de la dispersion vers l’avant et de la dispersion latérale.
Les marqueurs monocytaires et macrophages CD14 et CD11b ont été exprimés dans 70,9 % et 74,7 % des cellules, respectivement(Figure 3). Les cellules n’ont montré presque aucune positivité pour le marqueur de type M1 CD80 (0,2%) et des niveaux de surface élevés du marqueur de type M2 CD206 dans 62,6% des cellules(Figure 4).
Les macrophages dérivés de la méthode de polarisation décrite dans ce protocole montrent l’expression de marqueurs CD14 ainsi que CD11b. Les deux marqueurs peuvent mais ne doivent pas être exprimés en macrophages. Une nette positivité pour CD206 en tant que marqueur de macrophage de type M2 est attendue, tandis que le niveau d’expression de CD80 en tant que marqueur de type M1 devrait être faible. Raggi et al. ont démontré des résultats similaires en utilisant des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), qui ont été polarisées en macrophages de type M222. L’expression moyenne de CD206 variait entre 50 % et 60 %, tandis que l’expression moyenne de CD80 variait entre 20 % et 25 %22.
Une caractérisation plus poussée des macrophages de type M2 créés par ce protocole a été réalisée à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Les macrophages de type M2 ont montré une régulation à la hausse de l’IL-6 et du ligand 10 de chimiokine motif IL-X-C (CXCL10) par rapport aux cellules de type monocytaire THP-1, ainsi qu’une régulation à la hausse des marqueurs anti-inflammatoires CD206, interleukine 10 (IL-10) et C-C Motif chimiokine ligand 18 (CCL18) (résultats non publiés).
Figure 1: Vue d’ensemble du modèle de lignée cellulaire de macrophage de type M2. Le jour 0, les cellules sont ensemencées dans des plaques avec un milieu de croissance et incubées avec du PMA pendant 72 h. Le jour 3 et le jour 7, le milieu cellulaire est changé, ce qui permet aux cellules de se reposer sans PMA pendant un total de 120 h. Le jour 8, le milieu de croissance est modifié une fois de plus, et les cellules sont incubées avec de l’IL-4 et de l’IL-13 pour induire une polarisation de type M2. Cette étape est répétée après 2 jours, le jour 10. Le jour 12, le dernier changement de milieu est effectué et les cellules de type M2 dépendent du milieu de croissance pendant encore 48 heures avant d’être utilisées pour des expériences (PMA = phorbol 12-myristate-13-acétate; IL = interleukine). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Morphologie cellulaire des cellules THP-1, des macrophages différenciés (M0) et des macrophages de type M2 par microscopie optique. Les cellules ont été ensemencées à 3 x10 5 par puits dans une plaque de 24 puits. (A,B) Les cellules THP-1 sont montrées au départ. (C,D) Les macrophages M0 différenciés ont reçu un traitement PMA pendant 72 h, un changement de milieu de croissance et une période de repos de 96 h. (E,F) Les macrophages de type M2 sont montrés après un traitement de polarisation terminé avec IL-4 et Il-13 au jour 14 de ce modèle cellulaire (grossissement de 20x et 40x; échelle = 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Analyse de fluorescence par cytométrie en flux pour CD14 (FITC, FL1-H) et CD11b (PE, FL2-H). (A) Nuage de points de densité, les pourcentages de cellules sont indiqués dans chaque quadrant. (B,C) Les histogrammes pour CD14 et CD11b dans les macrophages de type M2 comparés à un contrôle de coloration négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Analyse de fluorescence par cytométrie en flux pour CD80 (FITC, FL1-H) et CD206 (conjugué PE-tandem, FL3-H). (A) Nuage de points de densité, les pourcentages de cellules sont indiqués dans chaque quadrant. (B,C) Les histogrammes pour CD80 et CD206 dans les macrophages de type M2 par rapport à un contrôle de coloration négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole sur la différenciation et la polarisation des cellules monocytaires THP-1 dans les 14 jours fournit une méthode pour obtenir des macrophages avec un phénotype distinct de type M2 en raison d’une longue incubation de cellules avec des périodes de repos adéquates entre les étapes.
Certaines étapes sont essentielles à ce protocole. Le temps de doublement des monocytes THP-1 est d’environ 26 h. Les cellules peuvent être divisées à une densité cellulaire de 9 x 105/mL et doivent être ensemencées à une densité de 3 x 105/mL lors de chaque fractionnement. La scission peut être effectuée sans enlever tout le (ancien) milieu cellulaire utilisé - réalimenter les cellules avec seulement 50% du milieu frais peut en effet conduire à une croissance cellulaire plus rapide, car les facteurs de croissance dans le milieu cellulaire conditionné peuvent améliorer la prolifération cellulaire. Cependant, le fait de ne pas échanger tous les milieux cellulaires augmente le risque de contamination de la culture et ne doit donc être effectué que lors des premiers passages de cellules fraîchement cultivées. Le comptage des cellules est important pour pouvoir les faire circuler à la bonne densité et déterminer la viabilité cellulaire après décongélation. La proportion de cellules mortes après la décongélation correcte des cellules ne doit pas dépasser 15%.
L’ensemencement des cellules dans des plaques nécessite un mélange doux mais minutieux de la suspension cellulaire pour obtenir une densité cellulaire constante dans chaque puits. Les aliquotes sont préparées avant l’ensemencement des cellules dans des plaques de culture pour s’assurer que le volume du milieu contenant la cellule est mélangé correctement. Comme les monocytes THP-1 dans le milieu ont tendance à couler au fond d’un flacon, le mélange doux et continu du volume de transfert est crucial pour obtenir une densité constante de cellules.
Les milieux cellulaires doivent être réchauffés à 37 °C en tout temps pour éviter les chocs froids et une réponse au stress cellulaire pro-inflammatoire23. Par conséquent, même pour les changements de milieu et le traitement cellulaire, les plaques ne doivent pas être laissées hors de l’incubateur pendant plus de 15 minutes. En outre, les composés respectifs pour le traitement cellulaire, tels que le PMA, les interleukines et le PBS pour diluer les solutions mères avant le traitement des cellules, doivent toujours être conservés sur la glace pour éviter toute dégradation.
Les macrophages vivants qui se différencient des monocytes par le traitement PMA adhèrent à la surface des puits. Lors des changements de support et d’autres étapes de traitement, les embouts de pipette ne doivent pas toucher le fond d’un puits à l’intérieur de la plaque pour éviter d’endommager les cellules.
Pour effectuer une cytométrie en flux avec des macrophages différenciés ou polarisés, les cellules attachées aux plaques doivent être récoltées. Il existe des techniques enzymatiques ou mécaniques pour détacher les cellules, y compris la trypsinisation, le traitement avec des mélanges enzymatiques à activité protéolytique et collagénolytique, ou l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), le choc froid, le grattage cellulaire, ou même le détachement par pression acoustique24,25. Le détachement enzymatique des macrophages peut entraîner une altération de l’expression des marqueurs de surface cellulaire et n’est donc pas le premier choix pour les analyses phénotypiques ou fonctionnelles25. Contrairement à d’autres rapports, les expériences effectuées ici ont montré que la combinaison de chocs à froid et de grattage des macrophages montrait une bonne viabilité cellulaire (>90%) en utilisant l’exclusion du colorant Trypan Blue. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser cette technique pour détacher les cellules, avec l’annotation qu’une fois qu’un choc froid est induit, les cellules doivent être maintenues froides sur la glace en tout temps.
Une limitation de ce protocole est l’utilisation d’une lignée cellulaire de type monocyte comme base pour imiter les mécanismes des macrophages in vivo. Les études de culture cellulaire utilisant des macrophages primaires, cependant, peuvent montrer des réponses cellulaires variables et des mécanismes peuvent être masqués en raison de l’hétérogénéité cellulaire26. La lignée cellulaire THP-1 est un système modèle établi pour les monocytes humains primaires9. En raison de la population homogène de cellules THP-1 dans un contexte de culture contrôlée, les réponses cellulaires sont potentiellement reproductibles plus précisément. De plus, certaines techniques optimisent les cellules THP-1 comme modèle pour ressembler aux monocytes primaires. Une étape importante est la période de repos de 5 jours après le traitement PMA, qui augmente le volume cytoplasmique et l’adhérence de la surface cellulaire similaire à celle des cellules différenciées dérivées de monocytes21.
Une autre limitation est la création d’un certain phénotype de macrophages de type M2 qui présente d’autres caractéristiques que les macrophages de type M2 qui ont été utilisés dans des études antérieures. De nombreuses techniques différentes pour différencier et polariser les cellules THP-1 ont été rapportées, et un manque de caractérisation de base complique la reproductibilité de l’intertude11,12,13,14. Par conséquent, il est important de caractériser les macrophages utilisés dans une étude au départ, en fonction des mécanismes étudiés. Après cela, les réponses cellulaires après un traitement respectif doivent être démontrées.
Les macrophages de type M2 produits en suivant ce protocole sont une base solide pour l’étude des réponses cellulaires dans l’apparition et la progression de la tumeur dans différents types de cancers, la cicatrisation des plaies ou la fibrose. Avec ce protocole, les macrophages M0 ou les macrophages M2 peuvent être utilisés in vitro, et les cellules conviennent à des modèles de coculture. Cela fournit une grande variété d’applications d’un phénotype de macrophage de type M2 distinct qui est robustement contrôlé in vitro au fil du temps.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Le Price Institute of Surgical Research de l’Université de Louisville est soutenu financièrement par le John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust. Les sources de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception et la réalisation de l’étude ainsi que dans la collecte, la gestion, l’analyse et l’interprétation des données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
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