Summary
M2-подобные опухолеациоцировые макрофаги (TAM) связаны с прогрессированием опухоли и плохим прогнозом при раке. Этот протокол служит подробным руководством для воспроизводимой дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобные макрофаги в течение 14 дней. Эта модель является основой для исследования противовоспалительных эффектов ТАМ в микроокружении опухоли.
Abstract
Опухолеассоциированная макрофаги (ТАМ) может переключать свою экспрессию и профиль цитокинов в соответствии с внешними раздражителями. Эта замечательная пластичность позволяет TAM адаптироваться к текущим изменениям в микроокружении опухоли. Макрофаги могут иметь в основном провоспалительные (M1-подобные) или противовоспалительные (M2-подобные) атрибуты и могут постоянно переключаться между этими двумя основными состояниями. M2-подобные макрофаги в опухолевой среде связаны с прогрессированием рака и плохим прогнозом при нескольких типах рака. Многие различные методы индуцирования дифференцировки и поляризации клеток THP-1 используются для исследования клеточных и межклеточных механизмов и эффектов ТАМ в микроокружении опухолей. В настоящее время не существует установленной модели поляризации М2-подобных макрофагов с использованием клеточной линии THP-1, а результаты экспрессии и профилей цитокинов макрофагов из-за определенных стимулов in vitro варьируются между исследованиями. Этот протокол служит подробным руководством для дифференцировки моноцитоподобных клеток THP-1 в макрофаги M0 и дальнейшей поляризации клеток в M2-подобный фенотип в течение 14 дней. Мы демонстрируем морфологические изменения моноцитоподобных клеток THP-1, дифференцированных макрофагов и поляризованных M2-подобных макрофагов с помощью световой микроскопии. Эта модель является основой для моделей клеточных линий, исследующих противовоспалительные эффекты ТАМ и их взаимодействия с другими клеточными популяциями микроокружения опухоли.
Introduction
Опухолеассеоциированные макрофаги (TAM) и их роль в хроническом воспалении, возникновении рака и развитии опухоли являются важными целями в недавних исследованиях1,2. Моноциты периферической крови, которые рекрутируются в тканевую микросреду развивающейся опухоли, дифференцируются в макрофаги и могут быть поляризованы в два основных подтипа макрофагов3. Классически активированный макрофаг представляет собой преимущественно провоспалительный М1-подобный фенотип, а альтернативно активированный М2-подобный подтип проявляет преимущественно противовоспалительные характеристики4. Макрофаги могут динамически переключаться между этими двумя основными фенотипами в зависимости от их клеточного метаболизма, причем промежуточные подтипы имеют как воспалительные, так и противовоспалительные свойства5. TAM представляет собой гетерогенную популяцию обоих фенотипов. Опухоле-продуцирующие функции и плохой прогноз при различных видах рака, однако, особенно связаны с М2-подобными макрофагами6,7,8.
Функциональные профили макрофагов и их взаимодействие с другими клетками в микроокружении опухоли сложны и сложны для захвата в постоянно меняющейся среде во время продолжающегося развития опухоли. Клеточные линии могут обеспечить однородную клеточную популяцию со стабильной жизнеспособностью в культуре, что может облегчить процесс демонстрации определенных клеточных и межклеточных механизмов. Моноцито-подобная клеточная линия THP-1 является законной модельной системой для первичных моноцитов человека9. Эта спонтанно увековеченная клеточная линия была получена из периферической крови годовалого младенца с острым моноцитарным лейкозом9,10. Дифференцировка и поляризация клеток THP-1 были зарегистрированы в нескольких исследованиях и были выполнены несколькими различными способами11, 12,13,14. Активация и, следовательно, поляризация макрофагов в М1-подобный фенотип сопровождается компенсаторным противовоспалительным механизмом отскока, способствующим М2-подобному фенотипу через цитокины, продуцируемые воспалительными макрофагами, такими как интерлейкин 6 (IL-6) или итаконат15,16. Это может служить механизмом разрыва для ослабления чрезмерной воспалительной реакции после активации клеток17. Процесс дифференцировки и поляризации моноцитов и моноцитоподобных клеток THP-1 в противовоспалительный М2-подобный фенотип сам по себе также сопровождается провоспалительными раздражителями, которые необходимо преодолеть. Воспалительный цитокиновый ответ может быть вызван механическим напряжением18,таким как изменение среды для повторного наполнения клеток или добавление химических соединений для дифференцировки клеток THP-1, таких как форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), и индуцировать выработку фактора некроза опухоли α (TNFα), интерлейкина 1β (IL-1β) или IL-619. Этот измененный профиль экспрессии цитокинов в ответ на PMA может влиять и предотвращать последующую поляризацию макрофагов20. Адекватные периоды покоя, как сообщалось ранее после лечения ПМА, позволяют этим воспалительным реакциям уменьшаться и облегчают поляризацию клеток в отдельный M2-подобный фенотип21.
Этот протокол демонстрирует метод дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобный фенотип макрофагов в течение 14 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор шагов, описанных в этом протоколе, показан на рисунке 1. Была приобретена клеточная линия моноцитоцитарного лейкоза человека THP-1. Был проведен короткий тандемный повторный анализ для аутентификации клеточной линии THP-1. Выполняйте все шаги в стерильных условиях. Моноцитарная клеточная линия THP-1 растет во суспензии и не прикрепляется к поверхностям клеточных культур. Адгезия может быть индуцирована путем дифференцировки моноцитов в макрофагоподобные клетки посредством, например, механического напряжения или специфического леченияПМА.
1. Культивирование и поддержание моноцитоподобных клеток THP-1
- Установите таймер на 150 с. Извлеките замороженный флакон, содержащий клеточную линию THP-1(Таблица материалов),из жидкого азота и немедленно разморозьте его на бане с чистой водой (37 °C). Запустите таймер, как только флакон будет помещен в водяную баню. Ослабьте крышку, чтобы освободить давление, которое накапливается из-за процесса оттаивания, но убедитесь, что отверстие трубы не контактирует с водой, чтобы избежать загрязнения. Оптимальный период времени для оттаивания клеток лежит между 120-150 с. Продолжайте размораживать клеточную суспензию до тех пор, пока во флаконе не останется ледяной чип размером около 4 мм; затем немедленно перейдите к следующему шагу.
- Перенесите жидкую фазу клеточной суспензии в трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл теплой (37 °C) рыхлой среды роста(Таблица материалов). Затем переложите 1 мл теплой среднеклеточной суспензии во флакон THP-1 и обратно в трубку 15 мл, чтобы растопить оставшийся ледяной чипс и промыть флакон, чтобы убедиться, что клетки не останутся позади.
- Осторожно перемешайте суспензию, пипеткой вверх и вниз пипеткой 1000 мкл. Удалите небольшой образец (примерно 10 мкл), чтобы подсчитать клетки на жизнеспособность (используя трипан синий для исключения), пока они вращаются. Открутите теплую клеточную суспензию при 200 х г в течение 7 мин при 37 °C.
- Удалите супернатант полностью и повторно суспендировать с определенным объемом теплой питательной среды для достижения плотности клеток 5 х 105/мл. Аккуратно перемешайте суспензию и переложите 22 мл объема в колбы для культивирования клеток Т-75(Таблица материалов). Храните колбы в вертикальном положении в инкубаторе при 37 °C с концентрацией 5% углекислого газа (CO2). Обменивайся питательными средами каждые 3-4 дня.
2. Посев клеток THP-1 и дифференцировка в макрофаги M0
- Подготовьте клетку, содержащую питательную среду с соответствующей плотностью клеток, к семенным клеткам при плотности 3х 10 5/мл / хорошо в 24-скважинные пластины длякультивовкиклеток ( Таблица материалов ). Аккуратно перемешайте среду и приготовьте аликвоты по 26 мл, каждая из которых помещена в пробирку по 50 мл. Используйте каждую аликвоту 26 мл для посева клеток в соответствующую пластину.
- Перенесите 1 мл клеточно-содержащей среды в каждую скважину 24-скважинной пластины. Осторожно перемешайте жим, пипетируя вверх и вниз между передачами.
- Готовят запасной раствор ПМА (растворяют 1 мг ПМА в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) = ~16 мМ раствора ПМА в ДМСО) и разбавляют его холодным фосфатным буферизованным физиологическим раствором (ПБС) до конечной рабочей концентрации 10 нг/мкл непосредственно перед обработкой клеток(Таблица материалов). Держите раствор на льду и немедленно используйте его. Не замораживая повторно. Добавьте 100 нг PMA на скважину. Оставьте каждую клеточную пластинку в инкубаторе без какой-либо дальнейшей обработки в течение 72 ч.
- Через 72 ч удалить питательную среду и заменить ее 1 мл свежей питательной среды. Не прикасайтесь к дну колодцев наконечниками пипеток. Дайте клеткам отдохнуть еще 96 ч в инкубаторе.
- Через 96 ч повторите шаг 2.4 (смена носителя) и дайте ячейкам отдохнуть еще 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаги M0 теперь готовы к использованию для экспериментов(рисунок 2). Непосредственно перед обработкой клеток в рамках дальнейших экспериментов рассмотрите изменение среды только с RPMI(Таблица материалов),поскольку добавки питательных сред могут вызывать помехи реагентам, которые добавляются для обработки клеток. В случае, если необходимы М2-подобные макрофаги, переходите к разделу 3.
3. Поляризация макрофагов М0 в М2-подобные макрофаги
- Готовят запасной раствор IL-4 и IL-13 (растворяют 20 мкг IL-4 или IL-13 в 200 мкл воды без нуклеазы) и разбавляют его до конечной рабочей концентрации 2 нг/мкл с PBS непосредственно перед обработкой клеток. Держите раствор на льду и немедленно используйте его. Не замораживая повторно.
- Удалите питательную среду и замените ее 1 мл свежей питательной среды. Добавьте 20 нг интерлейкина 4 (IL-4) и 20 нг интерлейкина 13 (IL-13) на скважину. Дайте клеткам отдохнуть в течение 48 ч в инкубаторе.
- Через 48 ч повторите шаг 3.2. Дайте клеткам отдохнуть еще 48 ч в инкубаторе.
- Удалите питательную среду и замените ее 1 мл свежей питательной среды. Дайте клеткам отдохнуть в течение 48 ч в инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: M2-подобные макрофаги теперь готовы к использованию для экспериментов(рисунок 2). Непосредственно перед обработкой клеток в рамках дальнейших экспериментов рассмотрите изменение среды только с RPMI(Таблица материалов),поскольку добавки питательных сред могут вызывать помехи.
4. Отсоединение и сбор макрофагов для проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте механический метод, сочетающий холодное шокирование и соскоб клеток для отсоединения и сбора поляризованных макрофагов из пластин для проточной цитометрии.
- Удалить теплую клеточную среду и заменить ее смесью ледяного PBS (без кальция и магния) и 5% фетальной бытовой сыворотки (FBS), 1 мл на скважину. Сразу после этого поместите клеточную пластину на лед на 45 мин. Не помещайте клеточную пластину на лед до удаления теплой клеточной среды, так как это значительно снизит жизнеспособность клеток. Держите клетки на льду только после того, как индуцирует холодный шок ледяной смесью PBS/5% FBS.
- Через 45 мин на льду соскоблите ячейки с помощью мини-скребков(Таблица материалов). Осторожно перенесите отделивые макрофаги в холодном PBS/5% FBS в пробирку с 15 мл. Держите трубку на льду все время, пока клетки не будут окрашены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините восемь колодцев клеток для достижения адекватного количества клеток для окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были охарактеризованы M2-подобные макрофаги, и M2-поляризация была подтверждена с использованием проточной цитометрии для cluster of Differentiation markers (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-подобный маркер) и CD206 (M2-подобный маркер). Окрашивание проточной цитометрией проводилось в соответствии с инструкциями производителя. Макрофаги промывали PBS/5% FBS и инкубировали с блоком Fcγ-рецепторов, чтобы избежать неспецифического связывания. Затем клетки окрашивали FITC-конъюгированных мышиными античеловеческими антителами CD14 и CD80, PE-конъюгированными мышиными античеловеческими антителами CD11b и PE-тандем-конъюгированными мышиными античеловеческими античеловеческими антителами CD206 и изотип-соответствием IgG(Таблица материалов)в течение 30 мин при 4 °C. Выполнен четырехцветный проточный цитометрический анализ и флуоресцентное количественное зачет. Проводили засорение клеток, исключая клеточный мусор по прямому рассеянию и боковому рассеянию.
Моноцитарные и макрофаговые маркеры CD14 и CD11b экспрессировались в 70,9% и 74,7% клеток соответственно(Рисунок 3). Клетки почти не показали положительности для M1-подобного маркера CD80 (0,2%) и высоких поверхностных уровней M2-подобного маркера CD206 в 62,6% клеток(Рисунок 4).
Макрофаги, полученные из метода поляризации, описанного в этом протоколе, показывают экспрессию маркеров CD14, а также CD11b. Оба маркера могут, но не обязательно должны быть выражены в макрофагах. Ожидается явный позитив для CD206 как маркера макрофагов, подобного M2, в то время как уровень экспрессии CD80 в качестве M1-подобного маркера должен быть низким. Raggi et al. продемонстрировали аналогичные результаты с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), которые были поляризованы в M2-подобные макрофаги22. Средняя экспрессия CD206 варьировалась в пределах 50%-60%, в то время как средняя экспрессия CD80 варьировалась между 20%-25%22.
Дальнейшая характеристика М2-подобных макрофагов, созданных по этому протоколу, проводилась с использованием количественной ПЦР реального времени (qRT-PCR). M2-подобные макрофаги показали повышение регуляции IL-6 и C-X-C Мотива Хемокина Лиганда 10 (CXCL10) по сравнению с моноцитоподобными клетками THP-1, а также регуляцию противовоспалительных маркеров CD206, Интерлейкина 10 (IL-10) и C-C Мотива Хемокина Лиганда 18 (CCL18) (результаты не показаны, будут опубликованы).
Рисунок 1:Обзор M2-подобной модели клеточной линии макрофагов. На 0 день клетки высевают в пластины со питательной средой и инкубируют с ПМА в течение 72 ч. На 3-й и 7-й день клеточная среда изменяется, что позволяет клеткам отдыхать без ПМА в общей сложности 120 ч. На 8-й день питательная среда снова изменяется, и клетки инкубируются с IL-4 и IL-13, чтобы индуцировать M2-подобную поляризацию. Этот шаг повторяют через 2 дня, на 10 день. На 12-й день выполняется последнее изменение среды, и М2-подобные клетки покоятся в питательной среде еще 48 ч перед использованием для экспериментов (ПМА = форбол 12-миристат-13-ацетат; IL = интерлейкин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Морфология клеток THP-1, дифференцированных (M0) макрофагов и M2-подобных макрофагов с использованием световой микроскопии. Клетки были посеяны по 3 х10 5 на скважину в 24-скважинной пластине. (А,Б) Клетки THP-1 показаны на исходном уровне. (C,D) Дифференцированные макрофаги М0 получали лечение ПМА в течение 72 ч, изменение среды роста и 96-ч периода покоя. (E,F) М2-подобные макрофаги показаны после завершения поляризационной обработки IL-4 и Il-13 на 14-й день этой клеточной модели (20-кратное и 40-кратное увеличение; масштаб = 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Флуоресцентный анализ проточной цитометрии для CD14 (FITC, FL1-H) и CD11b (PE, FL2-H). (A)Диаграмма рассеяния плотности, процентное содержание клеток показаны в каждом квадранте. (В,В) Гистограммы для CD14 и CD11b в M2-подобных макрофагах по сравнению с отрицательным контролем окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Флуоресцентный анализ проточной цитометрии для CD80 (FITC, FL1-H) и CD206 (PE-тандемный конъюгат, FL3-H). (A)Диаграмма рассеяния плотности, процентное содержание клеток показаны в каждом квадранте. (В,В) Гистограммы для CD80 и CD206 в M2-подобных макрофагах по сравнению с контролем отрицательного окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в течение 14 дней обеспечивает метод получения макрофагов с отчетливым М2-подобным фенотипом за счет длительной инкубации клеток с адекватными периодами покоя между этапами.
Определенные шаги имеют решающее значение для этого протокола. Время удвоения моноцитов THP-1 составляет примерно 26 ч. Клетки могут быть разделены при плотности клеток 9 x 105/mL и должны быть засеяны при плотности 3 x 105/mL во время каждого разделения. Расщепление может быть выполнено без удаления всей используемой (старой) клеточной среды - повторное заполнение клеток только 50% свежей среды действительно может привести к более быстрому росту клеток, потому что факторы роста в кондиционированной клеточной среде могут усиливать клеточную пролиферацию. Однако не обмен всеми клеточными средами увеличивает риск загрязнения культуры и поэтому должен выполняться только во время первых проходов свежевыкушенных клеток. Подсчет клеток важен для того, чтобы иметь возможность культивировать клетки нужной плотности и определять жизнеспособность клеток после оттаивания. Доля мертвых клеток после правильного оттаивания клеток не должна превышать 15%.
Посев клеток в пластины требует мягкого, но тщательного перемешивания клеточной суспензии для получения постоянной плотности клеток в каждой скважине. Аликвоты готовят перед посевом клеток в культурально-пластички, чтобы убедиться, что объем клеточной среды перемешан должным образом. Поскольку моноциты THP-1 в среде имеют тенденцию опускаться на дно флакона, непрерывное мягкое перемешивание трансферного объема имеет решающее значение для достижения постоянной плотности клеток.
Клеточные среды должны быть нагреты до 37 °C в любое время, чтобы избежать холодных ударов и провоспалительной клеточной реакции на стресс23. Поэтому также для изменения среды и обработки клеток пластины не следует оставлять вне инкубатора более чем на 15 минут. Кроме того, соответствующие соединения для обработки клеток, такие как PMA, интерлейкины и PBS для разбавления стоковых растворов перед обработкой клеток, должны всегда храниться на льду, чтобы избежать деградации.
Живые макрофаги, дифференцированные от моноцитов обработкой ПМА, прилипают к поверхности колодцев. Во время смены среды и других дальнейших этапов лечения наконечники пипеток не должны касаться дна колодца внутри пластины, чтобы предотвратить повреждение клеток.
Для выполнения проточной цитометрии с дифференцированными или поляризованными макрофагами необходимо собрать клетки, которые прикреплены к пластинам. Существуют либо ферментативные, либо механические методы отделения клеток, включая трипсинизацию, обработку ферментными смесями с протеолитической и коллагенолитической активностью или этилендиаминеттрауксусной кислотой (ЭДТА), холодный шок, соскоб клеток или даже отслоение через акустическое давление24,25. Ферментативная отслойка макрофагов может привести к изменению экспрессии маркеров клеточной поверхности и поэтому не является первым выбором для фенотипического или функционального анализа25. В отличие от других отчетов, эксперименты, проведенные здесь, показали, что комбинация холодного шокирования и соскабливания макрофагов показала хорошую жизнеспособность клеток (>90%) с использованием исключения красителя Trypan Blue. Поэтому рекомендуется использовать эту технику для отсоединения клеток с пометкой, что после того, как холодовой шок индуцирован, клетки должны постоянно оставаться холодными на льду.
Ограничением этого протокола является использование моноцитоподобной клеточной линии в качестве основы для имитации механизмов макрофагов in vivo. Исследования клеточных культур с использованием первичных макрофагов, однако, могут показать, что переменные клеточные реакции и механизмы могут быть замаскированы из-за неоднородности клеток26. Клеточная линия THP-1 является установленной модельной системой для первичных моноцитов человека9. Из-за однородной популяции клеток THP-1 в контролируемой культуре клеточные реакции потенциально более точно воспроизводимы. Кроме того, некоторые методы оптимизируют клетки THP-1 в качестве модели, чтобы напоминать первичные моноциты. Важным этапом является период покоя в 5 дней после лечения ПМА, который увеличивает цитоплазматический объем и адгезию клеточной поверхности, аналогичные таковой у дифференцированных моноцитарных клеток21.
Другим ограничением является создание определенного фенотипа M2-подобных макрофагов, который имеет другие характеристики, чем M2-подобные макрофаги, которые использовались в предыдущих исследованиях. Сообщалось о многих различных методах дифференцировки и поляризации клеток THP-1, и отсутствие базовой характеристики усложняет воспроизводимость интерсюда11,12,13,14. Поэтому важно охарактеризовать макрофаги, которые используются в исследовании на исходном уровне, в зависимости от механизмов, которые исследуются. После этого должны быть продемонстрированы клеточные реакции после соответствующего лечения.
M2-подобные макрофаги, полученные в результате следования этому протоколу, являются прочной основой для исследования клеточных реакций при возникновении и прогрессировании опухоли при различных типах рака, заживлении ран или фиброзе. С помощью этого протокола могут использоваться либо M0-макрофаги, либо M2-макрофаги in vitro,и клетки пригодны для использования в моделях кокультуры. Это обеспечивает широкий спектр применений отчетливого M2-подобного фенотипа макрофагов, который надежно контролируется in vitro с течением времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии потенциальных конфликтов интересов.
Acknowledgments
Институт хирургических исследований Прайса, Университет Луисвилля, финансово поддерживается Фондом Джона У. Прайса и Барбары Трастон Этвуд Прайс. Источники финансирования не играют никакой роли в разработке и проведении исследования, а также в сборе, управлении, анализе и интерпретации данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
