Summary
M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.
Abstract
Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) können ihre Expression und ihr Zytokinprofil entsprechend äußerer Reize umschalten. Diese bemerkenswerte Plastizität ermöglicht es TAM, sich an laufende Veränderungen in der Mikroumgebung des Tumors anzupassen. Makrophagen können entweder primär entzündungsfördernd (M1-ähnlich) oder entzündungshemmend (M2-ähnlich) Eigenschaften aufweisen und können kontinuierlich zwischen diesen beiden Hauptzuständen wechseln. M2-ähnliche Makrophagen innerhalb der Tumorumgebung sind mit Krebsprogression und schlechter Prognose bei verschiedenen Krebsarten verbunden. Viele verschiedene Methoden zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen werden verwendet, um zelluläre und interzelluläre Mechanismen und die Auswirkungen von TAM in der Mikroumgebung von Tumoren zu untersuchen. Derzeit gibt es kein etabliertes Modell für die M2-ähnliche Makrophagenpolarisation mit der THP-1-Zelllinie, und die Ergebnisse von Expressions- und Zytokinprofilen von Makrophagen aufgrund bestimmter In-vitro-Reize variieren zwischen den Studien. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen in M0-Makrophagen zu differenzieren und Zellen innerhalb von 14 Tagen weiter in einen M2-ähnlichen Phänotyp zu polarisieren. Wir zeigen die morphologischen Veränderungen von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen, differenzierten Makrophagen und polarisierten M2-ähnlichen Makrophagen mittels Lichtmikroskopie. Dieses Modell ist die Grundlage für Zelllinienmodelle, die die entzündungshemmende Wirkung von TAM und deren Wechselwirkungen mit anderen Zellpopulationen der Tumormikroumgebung untersuchen.
Introduction
Tumorassoziierte Makrophagen (TAM) und ihre Rolle bei chronischen Entzündungen, dem Auftreten von Krebs und der Tumorentwicklung sind wichtige Ziele in der neueren Forschung1,2. Periphere Blutmonozyten, die in die Gewebemikroumgebung des sich entwickelnden Tumors rekrutiert werden, differenzieren sich zu Makrophagen und können in zwei Hauptsubtypen von Makrophagen polarisiert werden3. Der klassisch aktivierte Makrophage stellt den primär entzündungsfördernden M1-ähnlichen Phänotyp dar und der alternativ aktivierte M2-ähnliche Subtyp zeigt überwiegend entzündungshemmende Eigenschaften4. Makrophagen können dynamisch zwischen diesen beiden Hauptphänotypen wechseln, abhängig von ihrem Zellstoffwechsel, wobei intermediäre Subtypen sowohl entzündliche als auch entzündungshemmende Eigenschaftenaufweisen 5. TAM stellt eine heterogene Population beider Phänotypen dar. Eine tumorfördernde Funktion und schlechte Prognose bei verschiedenen Krebsarten ist jedoch besonders mit M2-ähnlichen Makrophagen verbunden6,7,8.
Die funktionellen Profile von Makrophagen und ihre Interaktion mit anderen Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung sind komplex und schwierig in einer sich ständig verändernden Umgebung während der laufenden Tumorentwicklung zu erfassen. Zelllinien können eine homogene Zellpopulation mit stabiler Lebensfähigkeit in Kultur bieten, was den Prozess des Nachweises definierter zellulärer und interzellulärer Mechanismen erleichtern kann. Die monozytenartige THP-1-Zelllinie ist ein legitimes Modellsystem für primäre humane Monozyten9. Diese spontan verewigte Zelllinie wurde aus dem peripheren Blut eines einjährigen Säuglings mit akuter monozytärer Leukämie gewonnen9,10. Die Differenzierung und Polarisation von THP-1-Zellen wurde in mehreren Studien berichtet und auf verschiedene Arten durchgeführt11,12,13,14. Auf die Aktivierung und damit die Polarisation von Makrophagen in einen M1-ähnlichen Phänotyp folgt ein kompensatorischer entzündungshemmender Rebound-Mechanismus, der einen M2-ähnlichen Phänotyp durch Zytokine fördert, die von entzündlichen Makrophagen wie Interleukin 6 (IL-6) oder Itaconat15,16produziert werden. Dies könnte als Bruchmechanismus dienen, um eine überschießende Entzündungsreaktion nach Zellaktivierung abzuschwächen17. Der Prozess der Differenzierung und Polarisierung von Monozyten und THP-1-monozytenähnlichen Zellen zu einem entzündungshemmenden M2-ähnlichen Phänotyp wird selbst auch von entzündungsfördernden Reizen begleitet, die überwunden werden müssen. Eine entzündliche Zytokinreaktion kann durch mechanischen Stress18verursacht werden, z. B. durch Den Wechsel von Medien, um die Zellen zu refetieren, oder durch Zugabe chemischer Verbindungen zur Differenzierung von THP-1-Zellen, wie Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), und induzieren die Produktion von Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin 1β (IL-1β) oder IL-619. Dieses veränderte Zytokinexpressionsprofil als Reaktion auf PMA kann die nachfolgende Makrophagenpolarisation beeinflussen und verhindern20. Ausreichende Ruhezeiten, wie zuvor nach der PMA-Behandlung berichtet, ermöglichen es diesen Entzündungsreaktionen, die Zellpolarisation in einen ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp21zu verringern und zu erleichtern.
Dieses Protokoll demonstriert eine Methode, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen in einen M2-ähnlichen Phänotyp von Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Eine Übersicht über die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte finden Sie in Abbildung 1. Die humane monozytenähnliche Leukämiezelllinie THP-1 wurde gekauft. Zur Authentifizierung der THP-1-Zelllinie wurde eine kurze Tandem-Wiederholungsanalyse durchgeführt. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch. Die monozytäre Zelllinie THP-1 wächst in Suspension und haftet nicht an Zellkulturoberflächen. Die Adhärenz kann durch Differenzierung von Monozyten in makrophagenähnliche Zellen induziert werden, z.B. durch mechanische Belastung oder spezifische Behandlung mitPMA.
1. Kultivierung und Erhaltung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen
- Stellen Sie einen Timer für 150 s ein. Die gefrorene Durchstechflasche mit der THP-1-Zelllinie ( Materialtabelle ) aus demflüssigenStickstoff entfernen und sofort in einem Reinwasserbad (37 °C) auftauen. Starten Sie den Timer, sobald die Durchstechflasche in das Wasserbad gelegt wird. Lösen Sie die Kappe, um den Druck freizusetzen, der sich aufgrund des Auftauvorgangs aufbaut, aber stellen Sie sicher, dass die Rohröffnung nicht mit dem Wasser in Kontakt kommt, um eine Kontamination zu vermeiden. Der optimale Zeitraum für das Auftauen der Zellen liegt zwischen 120-150 s. Fahren Sie mit dem Auftauen der Zellsuspension fort, bis ein Eischip von etwa 4 mm Größe in der Durchstechflasche verbleibt. Fahren Sie dann sofort mit dem nächsten Schritt fort.
- Die flüssige Phase der Zellsuspension wird in ein 15 mL Röhrchen mit 9 mL warmem (37 °C) Wachstumsmedium überführen (Materialtabelle). Anschließend 1 ml der warmen mittelzelligen Suspension in die THP-1-Durchstechflasche und zurück in das 15-ml-Röhrchen geben, um den verbleibenden Eischip zu schmelzen und die Durchstechflasche zu spülen, um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.
- Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mit einer 1000 μL Pipette. Entfernen Sie eine kleine Probe (ca. 10 μL), um die Zellen auf Lebensfähigkeit zu zählen (mit Trypanblau zum Ausschluss), während sie gesponnen werden. Drehen Sie die warmzellige Suspension bei 200 x g für 7 min bei 37 °C herunter.
- Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie mit einem bestimmten Volumen des warmen Wachstumsmediums, um eine Zelldichte von 5 x 105/ml zu erreichen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig und geben Sie 22 ml Volumen in T-75-Zellkulturkolben (Materialtabelle). Lagern Sie die Kolben aufrecht in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid (CO2) Konzentration. Tauschen Sie die Wachstumsmedien alle 3-4 Tage aus.
2. Aussaat von THP-1-Zellen und Differenzierung in M0-Makrophagen
- Bereiten Sie die Zelle, die das Wachstumsmedium mit der jeweiligen Zelldichte enthält, um Zellen mit einer Dichte von 3 x 105/ml/well in 24-Well-Zellkulturplatten zu säen (Materialtabelle). Mischen Sie das Medium vorsichtig und bereiten Sie Aliquoten von 26 ml vor, die jeweils in ein 50-ml-Röhrchen gegeben werden. Verwenden Sie jeweils 26 ml Aliquot, um die Zellen in eine entsprechende Platte zu säen.
- 1 ml des zellhaltigen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte geben. Mischen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie zwischen den Übertragungen auf und ab pipettieren.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von PMA vor (lösen Sie 1 mg PMA in 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) = ~16 mM Lösung von PMA in DMSO) und verdünnen Sie sie mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 10 ng / μL kurz vor der Zellbehandlung (Materialtabelle). Halten Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie sie sofort. Nicht wieder einfrieren. Fügen Sie 100 ng PMA pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie jede Zellplatte ohne weitere Behandlung für 72 h im Inkubator sitzen.
- Nach 72 h das Wachstumsmedium entfernen und durch 1 ml frisches Wachstumsmedium ersetzen. Berühren Sie den Boden der Vertiefungen nicht mit Pipettenspitzen. Lassen Sie die Zellen weitere 96 h im Inkubator ruhen.
- Wiederholen Sie nach 96 h Schritt 2.4 (Medienwechsel) und lassen Sie die Zellen weitere 24 h ruhen.
HINWEIS: Die M0-Makrophagen sind jetzt bereit für Experimente (Abbildung 2). Unmittelbar vor der Behandlung der Zellen im Rahmen weiterer Experimente sollten Sie einen Medienwechsel nur mit RPMI (Materialtabelle) in Betracht ziehen, da Wachstumsmedienergänzungen Interferenzen mit Reagenzien verursachen können, die zur Zellbehandlung hinzugefügt werden. Falls M2-ähnliche Makrophagen benötigt werden, fahren Sie mit Abschnitt 3 fort.
3. Polarisation von M0-Makrophagen in M2-ähnliche Makrophagen
- Bereiten Sie eine Stammlösung von IL-4 und IL-13 vor (lösen Sie 20 μg IL-4 oder IL-13 in 200 μL nukleasefreiem Wasser auf) und verdünnen Sie sie unmittelbar vor der Zellbehandlung mit PBS auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 2 ng / μL. Halten Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie sie sofort. Nicht wieder einfrieren.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Wachstumsmedium. Fügen Sie 20 ng Interleukin 4 (IL-4) und 20 ng Interleukin 13 (IL-13) pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie die Zellen 48 h im Inkubator ruhen.
- Wiederholen Sie nach 48 h Schritt 3.2. Lassen Sie die Zellen weitere 48 h im Inkubator ruhen.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Wachstumsmedium. Lassen Sie die Zellen 48 h im Inkubator ruhen.
HINWEIS: M2-ähnliche Makrophagen sind jetzt bereit für Experimente (Abbildung 2). Unmittelbar vor der Behandlung der Zellen im Rahmen weiterer Experimente sollten Sie einen Medienwechsel nur mit RPMI (Table of Materials) in Betracht ziehen, da Wachstumsmedienergänzungen Interferenzen verursachen können.
4. Ablösen und Entnehmen von Makrophagen für die Durchflusszytometrie
HINWEIS: Verwenden Sie eine mechanische Methode, die Kälteschälte und Zellabkratzen kombiniert, um die polarisierten Makrophagen von Platten für die Durchflusszytometrie zu lösen und zu ernten.
- Entfernen Sie das warme Zellmedium und ersetzen Sie es durch eine Mischung aus eiskaltem PBS (ohne Kalzium und Magnesium) und 5% fetalem Rinderserum (FBS), 1 ml pro Vertiefung. Unmittelbar danach legen Sie die Zellplatte für 45 Minuten auf Eis. Legen Sie die Zellplatte nicht auf Eis, bevor das warme Zellmedium entfernt wird, da dies die Zelllebensfähigkeit erheblich verringert. Halten Sie die Zellen erst auf Eis, nachdem Sie einen Kälteschock mit eiskaltem PBS / 5% FBS-Gemisch induziert haben.
- Nach 45 Minuten auf Eis die Zellen mit Mini-Zellschabern abkratzen (Materialtabelle). Die abgelösten Makrophagen in kaltem PBS/5% FBS vorsichtig in ein 15 mL Rohr geben. Halten Sie das Röhrchen immer auf Eis, bis die Zellen gefärbt sind.
HINWEIS: Poolen Sie acht Zellschächte, um eine ausreichende Zellzahl für die Färbung zu erreichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M2-ähnliche Makrophagen wurden charakterisiert und die M2-Polarisation wurde mittels Durchflusszytometrie für Cluster of Differentiation Marker (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-like Marker) und CD206 (M2-like marker) validiert. Die Durchflusszytometrie-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Makrophagen wurden mit PBS/5% FBS gewaschen und mit Fcγ-Rezeptorblock inkubiert, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Die Zellen wurden dann mit FITC-konjugierten Maus-Anti-Human-CD14- und CD80-Antikörpern, mit PE-konjugierten Maus-Anti-Human-CD11b-Antikörpern und mit PE-Tandem-konjugierten Maus-Anti-Human-CD206-Antikörpern und isotyp-abgestimmtem IgG (Table of Materials) für 30 min bei 4 °C gefärbt. Es wurden vierfarbige durchflusszytometrische Analysen und Fluoreszenzquantifizierungen durchgeführt. Es wurde ein Gating von Zellen durchgeführt, wobei Zelltrümmer nach Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung ausgeschlossen wurden.
Die Monozyten- und Makrophagenmarker CD14 und CD11b wurden in 70,9% bzw. 74,7% der Zellen exprimiert (Abbildung 3). Die Zellen zeigten fast keine Positivität für den M1-ähnlichen Marker CD80 (0,2%) und hohe Oberflächenniveaus des M2-ähnlichen Markers CD206 in 62,6% der Zellen (Abbildung 4).
Die Makrophagen, die von der in diesem Protokoll beschriebenen Polarisierungsmethode abgeleitet sind, zeigen die Expression von CD14- sowie CD11b-Markern. Beide Marker können, müssen aber nicht in Makrophagen exprimiert werden. Eine deutliche Positivität für CD206 als M2-ähnlichen Makrophagenmarker wird erwartet, während das Niveau der CD80-Expression als M1-like Marker niedrig sein sollte. Raggi et al. zeigten ähnliche Ergebnisse mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), die zu M2-ähnlichen Makrophagen polarisiert wurden22. Die mittlere Expression von CD206 variierte zwischen 50%-60%, während die mittlere Expression von CD80 zwischen 20%-25%22lag.
Die weitere Charakterisierung der durch dieses Protokoll erzeugten M2-ähnlichen Makrophagen wurde mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) durchgeführt. M2-ähnliche Makrophagen zeigten eine Hochregulation von IL-6 und C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) im Vergleich zu THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen sowie eine Hochregulation der entzündungshemmenden Marker CD206, Interleukin 10 (IL-10) und C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (Ergebnisse nicht gezeigt, werden noch veröffentlicht).
Abbildung 1: Überblick über das M2-ähnliche Makrophagen-Zelllinienmodell. Am Tag 0 werden die Zellen in Platten mit einem Wachstumsmedium eingesät und 72 h lang mit PMA inkubiert. An Tag 3 und Tag 7 wird das Zellmedium gewechselt, wodurch die Zellen ohne PMA für insgesamt 120 h ruhen können. An Tag 8 wird das Wachstumsmedium erneut gewechselt und die Zellen werden mit IL-4 und IL-13 inkubiert, um eine M2-ähnliche Polarisation zu induzieren. Dieser Schritt wird nach 2 Tagen am Tag 10 wiederholt. An Tag 12 wird die letzte Mediumsänderung durchgeführt, und M2-ähnliche Zellen ruhen weitere 48 Stunden im Wachstumsmedium, bevor sie für Experimente verwendet werden (PMA = Phorbol 12-Myristat-13-acetat; IL = Interleukin). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zellmorphologie von THP-1-Zellen, differenzierten (M0) Makrophagen und M2-ähnlichen Makrophagen mittels Lichtmikroskopie. Die Zellen wurden mit 3 x 105 pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte ausgesät. (A,B) THP-1-Zellen werden zu Studienbeginn angezeigt. (C,D) Die differenzierten M0-Makrophagen erhielten eine PMA-Behandlung für 72 h, Wachstumsmediumwechsel und eine 96-h-Ruhephase. (E,F) Die M2-ähnlichen Makrophagen werden nach abgeschlossener Polarisationsbehandlung mit IL-4 und Il-13 am Tag 14 dieses Zellmodells gezeigt (20- und 40-fache Vergrößerung; Skala = 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Durchflusszytometrie-Fluoreszenzanalyse für CD14 (FITC, FL1-H) und CD11b (PE, FL2-H). (A) Dichtestreudiagramm, Zellanteile sind in jedem Quadranten dargestellt. (B,C) Die Histogramme für CD14 und CD11b bei M2-ähnlichen Makrophagen im Vergleich zu einer negativen Färbekontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrie-Fluoreszenzanalyse für CD80 (FITC, FL1-H) und CD206 (PE-Tandemkonjugat, FL3-H). (A) Dichtestreudiagramm, Prozentsätze der Zellen sind in jedem Quadranten dargestellt. (B,C) Die Histogramme für CD80 und CD206 in M2-ähnlichen Makrophagen im Vergleich zu einer negativen Färbekontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll zur Differenzierung und Polarisierung von THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen innerhalb von 14 Tagen bietet eine Methode, um Makrophagen mit einem ausgeprägten M2-ähnlichen Phänotyp aufgrund einer langen Behandlungsinkubation von Zellen mit ausreichenden Ruhezeiten zwischen den Schritten zu erhalten.
Bestimmte Schritte sind für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Die Verdopplungszeit der THP-1-Monozyten beträgt ca. 26 h. Zellen können mit einer Zelldichte von 9 x 105/ml gespalten werden und sollten bei jedem Split mit einer Dichte von 3 x 105/ml gesät werden. Die Spaltung kann durchgeführt werden, ohne das gesamte verwendete (alte) Zellmedium zu entfernen - die Rückspende der Zellen mit nur 50% des frischen Mediums kann in der Tat zu einem schnelleren Zellwachstum führen, da Wachstumsfaktoren in konditioniertem Zellmedium die Zellproliferation verstärken können. Der Nichtaustausch aller Zellmedien erhöht jedoch das Risiko einer Kulturkontamination und sollte daher nur während der ersten Passagen frisch kultivierter Zellen durchgeführt werden. Das Zählen der Zellen ist wichtig, um Zellen mit der richtigen Dichte kulturieren zu können und die Zelllebensfähigkeit nach dem Auftauen zu bestimmen. Der Anteil der abgestorbenen Zellen nach dem ordnungsgemäßen Auftauen der Zellen sollte 15% nicht überschreiten.
Die Aussaat von Zellen in Platten erfordert ein sanftes, aber gründliches Mischen der Zellsuspension, um eine konsistente Zelldichte in jeder Vertiefung zu erhalten. Aliquoten werden vor der Aussaat der Zellen in Kulturplatten vorbereitet, um sicherzustellen, dass das Volumen des zellhaltigen Mediums richtig gemischt wird. Da THP-1-Monozyten im Medium dazu neigen, auf den Boden einer Durchstechflasche zu sinken, ist die kontinuierliche sanfte Durchmischung des Transfervolumens entscheidend, um eine gleichbleibende Dichte der Zellen zu erreichen.
Zellmedien sollten jederzeit auf 37 °C erwärmt werden, um Kälteschocks und eine entzündungsfördernde zelluläre Stressreaktion zu vermeiden23. Daher sollten auch bei Medienwechseln und Zellbehandlung platten nicht mehr als 15 min aus dem Inkubator gelassen werden. Darüber hinaus sollten die jeweiligen Verbindungen für die Zellbehandlung, wie PMA, Interleukine und das PBS zur Verdünnung von Stammlösungen vor der Behandlung der Zellen, immer auf Eis gehalten werden, um einen Abbau zu vermeiden.
Lebende Makrophagen, die sich durch PMA-Behandlung von Monozyten unterscheiden, haften an der Oberfläche der Vertiefungen. Bei Medienwechseln und anderen weiteren Behandlungsschritten sollten Pipettenspitzen nicht den Boden eines Brunnens innerhalb der Platte berühren, um Zellschäden zu vermeiden.
Für die Durchführung der Durchflusszytometrie mit differenzierten oder polarisierten Makrophagen müssen die Zellen, die an den Platten befestigt sind, entnommen werden. Es gibt entweder enzymatische oder mechanische Techniken, um Zellen zu lösen, einschließlich Trypsinisierung, Behandlung mit Enzymmischungen mit proteolytischer und kollagenolytischer Aktivität oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Kälteschock, Zellabkratzen oder sogar Ablösung durch schallenden Druck24,25. Die enzymatische Ablösung von Makrophagen kann zu einer veränderten Zelloberflächenmarkerexpression führen und ist daher nicht die erste Wahl für phänotypische oder funktionelle Analysen25. Im Gegensatz zu anderen Berichten zeigten die hier durchgeführten Experimente, dass die Kombination aus Kälteschreckung und Abkratzen von Makrophagen eine gute Zelllebensfähigkeit (>90%) unter Ausschluss von Trypan Blue-Farbstoffen zeigte. Daher wird empfohlen, diese Technik zu verwenden, um die Zellen zu lösen, mit der Anmerkung, dass, sobald ein Kälteschock induziert wird, die Zellen jederzeit auf Eis kalt gehalten werden müssen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung einer monozytenähnlichen Zelllinie als Grundlage, um Makrophagenmechanismen in vivo nachzuahmen. Zellkulturstudien mit primären Makrophagen können jedoch variable zelluläre Reaktionen zeigen und Mechanismen können aufgrund der Zellheterogenität maskiert werden26. Die THP-1 Zelllinie ist ein etabliertes Modellsystem für primäre humane Monozyten9. Aufgrund der homogenen THP-1-Zellpopulation in einer kontrollierten Kulturumgebung sind zelluläre Reaktionen potenziell genauer reproduzierbar. Darüber hinaus optimieren bestimmte Techniken THP-1-Zellen als Modell, um primären Monozyten zu ähneln. Ein wichtiger Schritt ist die Ruhezeit von 5 Tagen nach der PMA-Behandlung, die das zytoplasmatische Volumen und die Zelloberflächenadhärenz ähnlich wie bei differenzierten Monozytenzellen erhöht21.
Eine weitere Einschränkung ist die Schaffung eines bestimmten M2-ähnlichen Makrophagenphänotyps, der andere Eigenschaften aufweist als M2-ähnliche Makrophagen, die in früheren Studien verwendet wurden. Viele verschiedene Techniken zur Differenzierung und Polarisierung von THP-1-Zellen wurden berichtet, und ein Mangel an Baseline-Charakterisierung erschwert die Reproduzierbarkeit zwischen den Studien11,12,13,14. Daher ist es wichtig, die Makrophagen, die in einer Studie verwendet werden, zu Studienbeginn zu charakterisieren, abhängig von den untersuchten Mechanismen. Danach sollten die zellulären Reaktionen nach einer entsprechenden Behandlung nachgewiesen werden.
Die M2-ähnlichen Makrophagen, die nach diesem Protokoll erzeugt werden, sind eine solide Grundlage für die Untersuchung zellulärer Reaktionen bei Tumorbeginn und -progression bei verschiedenen Krebsarten, Wundheilung oder Fibrose. Mit diesem Protokoll können entweder M0-Makrophagen oder M2-Makrophagen in vitroverwendet werden, und die Zellen eignen sich für die Verwendung in Kokulturmodellen. Dies bietet eine Vielzahl von Anwendungen eines ausgeprägten M2-ähnlichen Makrophagenphänotyps, der im Laufe der Zeit in vitro robust kontrolliert wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Das Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, wird vom John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust finanziell unterstützt. Die Finanzierungsquellen spielten keine Rolle bei der Konzeption und Durchführung der Studie sowie bei der Erhebung, Verwaltung, Analyse und Interpretation der Daten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
