Summary
מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.
Abstract
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) יכולים להחליף את הביטוי שלהם ואת פרופיל הציטוקינים שלהם על פי גירויים חיצוניים. פלסטיות יוצאת דופן זו מאפשרת ל- TAM להסתגל לשינויים מתמשכים בתוך מיקרו-סביבה של הגידול. מקרופאגים יכולים להיות בעיקר תכונות פרו דלקתיות (דמויי M1) או אנטי דלקתיות (דמויי M2) ויכולים לעבור ללא הרף בין שתי המדינות העיקריות הללו. מקרופאגים דמויי M2 בסביבת הגידול קשורים להתקדמות הסרטן ופרוגנוזה ירודה במספר סוגים של סרטן. שיטות רבות ושונות לגרימת בידול וקיטוב של תאי THP-1 משמשות לחקירת מנגנונים תאיים ובין תאיים והשפעות TAM בתוך המיקרו-סביבה של גידולים. נכון לעכשיו, אין מודל מבוסס לקיטוב מקרופאגים דמוי M2 באמצעות קו התא THP-1, ותוצאות פרופילי הביטוי והציטוקינים של מקרופאגים בשל גירויים במבחנה מסוימים משתנות בין מחקרים. פרוטוקול זה משמש הדרכה מפורטת כדי להבדיל בין תאים דמויי THP-1 מונוציט למקרופאגים M0 ולקטב עוד יותר תאים לתוך פנוטיפ דמוי M2 בתוך 14 ימים. אנו מדגימים את השינויים המורפולוגיים של תאים דמויי THP-1, מקרופאגים מובחנים ומקרופאגים מקוטבים דמויי M2 באמצעות מיקרוסקופיה קלה. מודל זה הוא הבסיס למודלים של קו התאים החוקרים את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM ואת האינטראקציות שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרות של microenvironment הגידול.
Introduction
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) ותפקידם בדלקת כרונית, תחילת הסרטן והתפתחות הגידול הם מטרות חשובות במחקר האחרון1,2. מונוציטים דם היקפיים המגויסים למיקרו-סביבה של הגידול המתפתח מבדילים למקרופאגים וניתן לקוטב לשני תתי סוגים עיקריים של מקרופאגים3. המקרופאג' המופעל קלאסית מייצג את הפנוטיפ דמוי M1 הפרו-דלקתי בעיקר ותת-סוג דמוי M2 המופעל לחילופין מראה מאפיינים אנטי דלקתיים בעיקר4. מקרופאגים יכולים לעבור באופן דינמי בין שני פנוטיפים עיקריים אלה בהתאם לחילוף החומרים התאי שלהם, עם תת-סוגים ביניים בעלי תכונות דלקתיות ואנטי דלקתיות5. TAM מייצג אוכלוסייה הטרוגנית של שני הפנוטיפים. פונקציה לקידום גידול ופרוגנוזה ירודה בסוגים שונים של סרטן קשורה במיוחד למקרופאגים דמויי M26,7,8.
הפרופילים התפקודיים של מקרופאגים והאינטראקציה שלהם עם תאים אחרים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול הם מורכבים ומאתגרים ללכידה בסביבה המשתנה ללא הרף במהלך התפתחות גידול מתמשכת. קווי תאים יכולים לספק לאוכלוסיית תאים הומוגנית יכולת כדאיות יציבה בתרבות, אשר יכולה להקל על תהליך הדגמת מנגנונים תאיים ובין תאיים מוגדרים. קו התאים דמוי מונוציט THP-1 הוא מערכת מודל לגיטימית למונוציטים אנושיים ראשוניים9. קו תאים מונצח באופן ספונטני זה הושג מדם היקפי של תינוק בן שנה עם לוקמיה מונוציטיתחריפה 9,10. הבידול והקיטוב של תאי THP-1 דווחו על ידי מספר מחקרים ובוצעו בדרכים שונות מרובות11,12,13,14. הפעלה, ולכן, הקיטוב של מקרופאגים לתוך פנוטיפ דמוי M1 מלווה מנגנון ריבאונד אנטי דלקתי מפצה, קידום פנוטיפ דמוי M2 באמצעות ציטוקינים המיוצרים על ידי מקרופאגים דלקתיים, כגון אינטרלוקין 6 (IL-6) או itaconate15,16. זה עשוי לשמש כמנגנון שבירה כדי להחלשות תגובה דלקתית overshooting לאחר הפעלת התא17. תהליך ההבחנה והקיטוב של מונוציטים ותאים דמויי THP-1 לפנוטיפ אנטי דלקתי דמוי M2 מלווה בעצמו גם בגירויים פרו דלקתיים שיש להתגבר עליהם. תגובת ציטוקינים דלקתית יכולה להיגרם על ידי מתח מכני18, כגון שינוי מדיה כדי להזין מחדש את התאים, או הוספת תרכובות כימיות כדי להבדיל בין תאי THP-1, כגון פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ולזירוז ייצור של גורם נמק הגידול α (TNFα), אינטרלוקין 1β (IL-1β) או IL-619. פרופיל ביטוי ציטוקינים שונה זה כתגובה ל- PMA יכול להשפיע ולמנוע קיטוב מקרופאגים עוקב20. תקופות מנוחה נאותות, כפי שדווח בעבר לאחר טיפול PMA, לאפשר תגובות דלקתיות אלה כדי להקטין ולהקל על קיטוב התא לתוך פנוטיפ M2-כמו ברור21.
פרוטוקול זה מדגים שיטה להבדיל ולקטב תאים דמויי THP-1 לתוך פנוטיפ דמוי M2 של מקרופאגים בתוך 14 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מבט כולל על השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. קו תאי הלוקמיה דמוי המונוציט האנושי THP-1 נרכש. ניתוח חוזר טנדם קצר בוצע כדי לאמת את קו התא THP-1. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים. קו התא המונוציטי THP-1 גדל בהשעיה ואינו מתחבר למשטחי תרבית התא. דבקות יכולה להיגרם על ידי הבחנה מונוציטים לתאים דמויי מקרופאג 'באמצעות, למשל, מתח מכני או טיפול ספציפי עם PMA.
1. פולחן ותחזוקה של תאים דמויי THP-1 דמויי מונוציט
- הגדר שעון זמן ל- 150 s. הסר את הנקינה הקפואה המכילה את קו התא THP-1(שולחן החומרים)מהחנקן הנוזלי והפשירו אותו מיד באמבט מים נקי (37 מעלות צלזיוס). התחל את שעון השעון ברגע שהנק ויכניסו את הוויאל לאמבטיית המים. לשחרר את המכסה כדי לשחרר את הלחץ כי הוא בונה בשל תהליך ההפשרה אבל להבטיח כי פתיחת הצינור לא ליצור קשר עם המים, כדי למנוע זיהום. פרק הזמן האופטימלי להפשרת התאים נע בין 120-150 s. המשך להפשיר את השעיית התא עד שבב קרח בגודל של כ 4 מ"מ נשאר בתוך המשחקון; לאחר מכן, המשך לשלב הבא באופן מיידי.
- העבר את השלב הנוזלי של השעיית התא לצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיה צמיחה חמה (37 °C)(שולחן החומרים). לאחר מכן, להעביר 1 מ"ל של ההשעיה החמה של תא בינוני לתוך פקיעת THP-1 ובחזרה לתוך צינור 15 mL כדי להמיס את שבב הקרח הנותר לשטוף את הקרבון כדי להבטיח כי אין תאים נשארים מאחור.
- מערבבים את המתלים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפטה 1000 μL. הסר מדגם קטן (כ 10 μL) כדי לספור את התאים עבור הכדאיות (באמצעות טריפן כחול עבור אי הכללה) בזמן שהם הסתובבו. ספין את השעיית התא החם ב 200 x g במשך 7 דקות ב 37 °C (50 °F).
- הסר את supernatant לחלוטין resuspend עם נפח מסוים של מדיום צמיחה חמה כדי להשיג צפיפות תא של 5 x 105/mL. מערבבים את המתלים בעדינות ומעבירים 22 מ"ל של נפח לתוך T-75 תאי תרבית צלוחיות(שולחן החומרים). יש לאחסן צלוחיות זקופות באינקובטור של 37 °C (5%), עם ריכוז של 5% פחמן דו-חמצני (CO2). החלף את מדיה הצמיחה כל 3-4 ימים.
2. זריעת תאי THP-1 ובידול למקרופאגים M0
- הכן את התא המכיל מדיום גדילה עם צפיפות התא המתאימה לתאי זרע בצפיפות של 3 x 105/ mL / גם לתוך לוחות תרבית תאים 24-well (שולחן החומרים). מערבבים את המדיום בעדינות ומכינים עליקוטים של 26 מ"ל, כל אחד לשים לתוך צינור 50 מ"ל. השתמש בכל 26 mL aliquot עבור זריעת התאים לתוך צלחת בהתאמה.
- מעבירים 1 מ"ל של המדיום המכיל תאים לכל באר של צלחת 24-well. מערבבים את המדיה בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה בין העברות.
- הכן פתרון מלאי של PMA (להמיס 1 מ"ג של PMA ב 100 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) = ~ 16 mM פתרון של PMA ב- DMSO) ולדלל אותו עם תמיסת מלח חוצץ פוספט קר (PBS) לריכוז עבודה סופי של 10 ננוגרם / μL ממש לפני טיפול בתא(טבלה של חומרים). שמור את הפתרון על קרח ולהשתמש בו מיד. אל תפשיר מחדש. הוסף 100 ננוגרם של PMA לבאר. תן לכל צלחת תא לשבת באינקובטור ללא כל טיפול נוסף במשך 72 שעות.
- לאחר 72 שעות, להסיר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. אין לגעת בתחתית הבארות עם טיפים פיפטה. תן לתאים לנוח עוד 96 שעות באינקובטור.
- לאחר 96 שעות, חזור על שלב 2.4 (שינוי מדיה) ותן לתאים לנוח למשך 24 שעות נוספות.
הערה: המקרופאגים M0 מוכנים כעת לשימוש לניסויים(איור 2). מיד לפני הטיפול בתאים כחלק מניסויים נוספים, שקול שינוי מדיה עם RPMI בלבד (טבלה של חומרים) מאז תוספי מדיה צמיחה יכול לגרום להפרעה עם ריאגנטים המתווספים לטיפול בתא. במקרה שיש צורך במקרו-אג'ים דמויי M2, המשך בסעיף 3.
3. קיטוב מקרופאגים M0 למקרופאגים דמויי M2
- הכן פתרון מלאי של IL-4 ו- IL-13 (להמיס 20 מיקרוגרם של IL-4 או IL-13 ב 200 μL של מים ללא גרעין) ולדלל אותו לריכוז עבודה סופי של 2 ננוגרם / μL עם PBS מיד לפני הטיפול בתא. שמור את הפתרון על קרח ולהשתמש בו מיד. אל תפשיר מחדש.
- הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. הוסיפו 20 ננוגרם של אינטרלוקין 4 (IL-4) ו-20 ננוגרם של אינטרלוקין 13 (IL-13) לבאר. תן לתאים לנוח 48 שעות באינקובטור.
- לאחר 48 שעות, חזור על שלב 3.2. תן לתאים לנוח עוד 48 שעות באינקובטור.
- הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. תן לתאים לנוח 48 שעות באינקובטור.
הערה: מקרופאגים דמויי M2 מוכנים כעת לשימוש לניסויים (איור 2). מיד לפני הטיפול בתאים כחלק מניסויים נוספים, שקול שינוי מדיה עם RPMI בלבד (טבלה של חומרים) מאז תוספי מדיה צמיחה יכול לגרום להפרעה.
4. ניתוק וקצירת מקרופאגים לציטומטריית זרימה
הערה: השתמש בשיטה מכנית המשלבת הלם קר ושריטת תאים כדי לנתק ולקצור את המקרופאגים המקוטבים מלוחות לציטומטריית זרימה.
- הסר את התא החם בינוני ולהחליף אותו עם תערובת של PBS קר כקרח (ללא סידן ומגנזיום) ו 5% סרום בקר עוברי (FBS), 1 מ"ל לבאר. מיד לאחר מכן, מניחים את צלחת התא על קרח במשך 45 דקות. אין להניח את צלחת התא על קרח לפני המדיום התא החם מוסר, שכן זה יקטין את הכדאיות התא באופן משמעותי. שמור את התאים על קרח רק לאחר גרימת הלם קר עם תערובת PBS קר כקרח / 5% FBS.
- לאחר 45 דקות על קרח, לגרד את התאים באמצעות מגרדי תאים מיני(שולחן החומרים). מעבירים בעדינות את המקרופאגים המנותקים ב-PBS/5% FBS קרים לצינור 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח בכל עת עד שהתאים מוכתמים.
הערה: מאגר שמונה בארות של תאים כדי להגיע ספירת תאים נאותה עבור כתמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מקרופאגים דמויי M2 אופיינו, וקיטוב M2 אומת באמצעות ציטומטריית זרימה עבור אשכול של סמני בידול (CD) CD14, CD11b, CD80 (סמן דמוי M1) ו- CD206 (סמן דמוי M2). כתמי ציטומטריה זרימה בוצעו על פי הוראות היצרן. מקרופאגים נשטפו עם PBS / 5% FBS ודגרו עם בלוק קולטן Fcγ כדי למנוע כריכה לא מוגדרת. התאים הוכתמו אז בנוגדנים נגד CD14 ו-CD80 של עכברים מצומדים של PE, עם נוגדני CD11b אנטי-אנושיים מצומדים של PE, ועם נוגדני CD206 אנטי-אנושיים עם עכבר מצומדים PE-טנדם ו- IgG(טבלת חומרים) תואמתאיזוטיפ למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בוצעו ניתוח ציטומטרי של זרימה בארבעה צבעים וכמות פלואורסצנטיות. גינג של תאים בוצע, למעט פסולת תאים על פי פיזור קדימה ופיזור בצד.
סמני המונוציט והמקרופיג' CD14 ו-CD11b באו לידי ביטוי ב-70.9% וב-74.7% מהתאים, בהתאמה (איור 3). התאים כמעט ולא הראו חיוביות עבור CD80 סמן דמוי M1 (0.2%) ורמות פני השטח הגבוהות של CD206 סמן דמוי M2 ב 62.6% של תאים(איור 4).
המקרופאגים הנגזרים משיטת הקיטוב המתוארת בפרוטוקול זה מציגים את הביטוי של סמני CD14 וכן של CD11b. שני הסמנים יכולים אך לא חייבים לבוא לידי ביטוי במקרופות. צפויה חיוביות ברורה עבור CD206 כסמן מקרופאג' דמוי M2, בעוד שרמת ביטוי CD80 כסמן דמוי M1 צריכה להיות נמוכה. Raggi et al. הדגימו תוצאות דומות באמצעות תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC), שהיו מקוטבים למקרופאגים דמויי M222. הביטוי הממוצע של CD206 השתנה בין 50%-60%, בעוד הביטוי הממוצע של CD80 נע בין 20%-25%22.
אפיון נוסף של מקרופאגים דמויי M2 שנוצרו על ידי פרוטוקול זה בוצע באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). מקרופאגים דמויי M2 הראו עלייה של IL-6 ו- C-X-C מוטיב כימין ליגנד 10 (CXCL10) בהשוואה לתאים דמויי מונוציטים THP-1, כמו גם עלייה בסמנים האנטי דלקתיים CD206, אינטרלוקין 10 (IL-10) ו- C-C מוטיף כימין ליגנד 18 (CCL18) (תוצאות שלא הוצגו, לפרסום).
איור 1: מבט כולל על מודל שורת התאים דמוי מקרופאג' דמוי M2. ביום 0, תאים נזרעים לתוך לוחות עם מדיום צמיחה ודגרה עם PMA עבור 72 שעות. ביום 3 ויום 7 בינוני תא משתנה, אשר מאפשר לתאים לנוח ללא PMA בסך הכל 120 שעות. ביום 8, מדיום הצמיחה משתנה פעם נוספת, והתאים מדגירים עם IL-4 ו- IL-13 כדי לגרום לקיטוב דמוי M2. שלב זה חוזר על עצמו לאחר יומיים, ביום 10. ביום 12, השינוי הבינוני האחרון מבוצע, ותאים דמויי M2 נחים במדיום הצמיחה למשך 48 שעות נוספות לפני שהם משמשים לניסויים (PMA = phorbol 12-myristate-13-אצטט; IL = אינטרלוקין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2:מורפולוגיה של תאים של תאי THP-1, מקרופאגים מובחנים (M0) ומקרופות דמויות M2 באמצעות מיקרוסקופיה קלה. תאים נזרעו ב 3 x 105 לבאר בצלחת 24-well. (A,B) תאי THP-1 מוצגים בקו הבסיס. (C,D) המקרופאגים המובחנים M0 קיבלו טיפול PMA עבור 72 שעות, שינוי בינוני צמיחה ותקופת מנוחה של 96 שעות. (E,F) המקרופאגים דמויי ה-M2 מוצגים לאחר סיום טיפול הקיטוב עם IL-4 ו-Il-13 ביום 14 של מודל תא זה (הגדלה של פי 20 ו-40x; קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח פלואורסצנטיות ציטומטריה של זרימה עבור CD14 (FITC, FL1-H) ו- CD11b (PE, FL2-H). (A)התפלגות פיזור צפיפות, אחוזי תאים מוצגים בכל רבע. (B,C) ההיסטוגרמה עבור CD14 ו- CD11b במקרופות דמויות M2 בהשוואה לבקרת כתמים שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח פלואורסצנטיות ציטומטריה של זרימה עבור CD80 (FITC, FL1-H) ו- CD206 (מצומד PE-טנדם, FL3-H). (A)התפלגות פיזור צפיפות, אחוזי תאים מוצגים בכל רבע. (B,C) ההיסטוגרמה עבור CD80 ו- CD206 במקרופות דמויות M2 בהשוואה לבקרת כתמים שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה על הבחנה וקיטוב תאים דמויי THP-1 בתוך 14 ימים מספק שיטה להשיג מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2 נפרד עקב דגירה טיפול ארוכה של תאים עם תקופות מנוחה נאותה בין שלבים.
שלבים מסוימים הם קריטיים לפרוטוקול זה. זמן ההכפלה של מונוציטים THP-1 הוא כ 26 שעות. תאים יכולים להיות מפוצלים בצפיפות תא של 9 x 105/mL ויש לזרוע בצפיפות של 3 x 105/mL במהלך כל פיצול. הפיצול יכול להתבצע מבלי להסיר את כל הבינוניות (הישנות) של התאים - הזנה מחדש של התאים עם רק 50% מהמדיום הטרי אכן יכולה להוביל לצמיחת תאים מהירה יותר מכיוון שגורמי גדילה במדיום תאים מותנים יכולים לשפר את התפשטות התאים. עם זאת, אי החלפת כל אמצעי התקשורת הסלולריים מגבירה את הסיכון לזיהום תרבותי ולכן יש לבצעה רק במהלך הקטעים הראשונים של תאים בעלי תרבית טרייה. ספירת התאים חשובה כדי להיות מסוגל תרבית תאים בצפיפות הנכונה ולקבוע את הכדאיות התאית לאחר הפשרה. שיעור התאים המתים לאחר הפשרת תאים כראוי לא יעלה על 15%.
זריעת תאים ללוחות דורשת ערבוב עדין אך יסודי של השעיית התא כדי להשיג צפיפות תאים עקבית בכל באר. Aliquots מוכנים לפני זריעת התאים לתוך לוחות תרבות כדי להבטיח כי נפח של התא המכיל את המדיום מעורבב כראוי. כמו THP-1 מונוציטים במדיום נוטים לשקוע לתחתית של מינה, ערבוב עדין מתמשך של נפח ההעברה הוא חיוני כדי להשיג צפיפות עקבית של תאים.
מדיה סלולרית צריכה להיות מחוממת ל 37 °C (50 °F) בכל עת, כדי למנוע זעזועים קרים ותגובת מתח תאי פרו דלקתי23. לכן, גם עבור שינויים בתקשורת וטיפול בתא, צלחות לא צריך להישאר מחוץ לחממה במשך יותר מ 15 דקות. יתר על כן, יש לשמור תמיד על הקרח על התרכובות המתאימות לטיפול בתאים, כגון PMA, interleukins ו- PBS לדילול פתרונות מלאי לפני הטיפול בתאים, כדי למנוע השפלה.
מקרופאגים חיים שהבדילו ממונוציטים על ידי טיפול PMA לדבוק על פני השטח של בארות. במהלך שינויים בתקשורת וצעדי טיפול נוספים אחרים, טיפים pipette לא צריך לגעת בתחתית של באר בתוך הצלחת כדי למנוע נזק לתא.
לביצוע ציטומטריית זרימה עם מקרופאגים מובחנים או מקוטבים, יש לקצור את התאים המחוברים ללוחות. ישנן טכניקות אנזימטיות או מכניות לנתק תאים, כולל טריפסיניזציה, טיפול בתערובות אנזימים עם פעילות פרוטאוליטית וקולנולית, או חומצה אתילנדיאמינאטראטראצטית (EDTA), הלם קר, גירוד תאים, או אפילו ניתוק באמצעות לחץ אקוסטי24,25. ניתוק אנזימטי של מקרופאגים יכול להוביל לביטוי סמן משטח תא שונה ולכן אינו הבחירה הראשונה עבור ניתוחים פנוטיפיים או פונקציונליים25. בניגוד לדיווחים אחרים, הניסויים שבוצעו כאן הראו כי השילוב של הלם קר ושריטת מקרופאגים הראה כדאיות תאים (>90%) באמצעות אי הכללת צבע כחול טריפן. לכן, מומלץ להשתמש בטכניקה זו כדי לנתק את התאים, עם ביאור כי ברגע הלם קר מושרה, התאים צריכים להישמר קר על קרח בכל עת.
מגבלה של פרוטוקול זה היא השימוש בקו תאים דמוי מונוציט כבסיס לחיקוי מנגנוני מקרופאג' ב- vivo. מחקרי תרבית תאים באמצעות מקרופאגים ראשוניים, עם זאת, יכולים להראות תגובות סלולריות משתנות ומנגנונים יכולים להיות מוסווים עקב הטרוגניות תאים26. קו התא THP-1 הוא מערכת מודל הוקמה עבור מונוציטים אנושיים ראשוניים9. בשל אוכלוסיית תאי THP-1 הומוגנית בסביבת תרבות מבוקרת, תגובות הסלולר הן בעלות פוטנציאל לשחזור מדויק יותר. יתר על כן, טכניקות מסוימות לייעל תאי THP-1 כמודל להידמות מונוציטים ראשיים. צעד חשוב הוא תקופת המנוחה של 5 ימים לאחר טיפול PMA, אשר מגביר נפח ציטופלסמטי ודבקות פני התא דומה לזה של תאים מונוציטים מובחנים21.
מגבלה נוספת היא יצירת פנוטיפ מקרופאג' מסוים דמוי M2 בעל מאפיינים אחרים מאשר מקרופאגים דמויי M2 ששימשו במחקרים קודמים. טכניקות רבות ושונות כדי להבדיל ולקטב תאי THP-1 דווחו, וחוסר אפיון בסיסי מסבך את רבייה interstudy11,12,13,14. לכן, חשוב לאפיין את המקרופאגים המשמשים במחקר בבסיס, בהתאם למנגנונים הנחקרים. לאחר מכן, יש להדגים את התגובות התאיות לאחר טיפול בהתאמה.
המקרופאגים דמויי M2 המיוצרים על ידי ביצוע פרוטוקול זה הם בסיס מוצק לחקירת תגובות תאיות בהתפרצות הגידול והתקדמות בסוגים שונים של סרטן, ריפוי פצעים או פיברוזיס. עם פרוטוקול זה, או M0-מקרופאגים או M2-מקרופאגים ניתן להשתמש במבחנה, ואת התאים מתאימים לשמש במודלים coculture. זה מספק מגוון רחב של יישומים של פנוטיפ מקרופאג' ייחודי דמוי M2 הנשלט בחוזקה במבחנה לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים פוטנציאליים.
Acknowledgments
מכון המחירים למחקר כירורגי, אוניברסיטת לואיוויל, נתמך כלכלית על ידי ג'ון ו. פרייס וברברה דרופון אטווד פרייס טראסט. למקורות המימון לא היה כל תפקיד בעיצוב וביצוע המחקר וכן באיסוף, ניהול, ניתוח ופרשנות הנתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
