Summary
I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all'interno del microambiente tumorale.
Abstract
I macrofagi associati al tumore (TAM) possono cambiare la loro espressione e il profilo delle citochine in base a stimoli esterni. Questa notevole plasticità consente a TAM di adattarsi ai cambiamenti in corso all'interno del microambiente tumorale. I macrofagi possono avere principalmente attributi pro-infiammatori (M1-like) o anti-infiammatori (M2-like) e possono passare continuamente tra questi due stati principali. I macrofagi simili a M2 all'interno dell'ambiente tumorale sono associati alla progressione del cancro e alla prognosi sfavorevole in diversi tipi di cancro. Molti metodi diversi per indurre la differenziazione e la polarizzazione delle cellule THP-1 sono utilizzati per studiare i meccanismi cellulari e intercellulari e gli effetti del TAM all'interno del microambiente dei tumori. Attualmente, non esiste un modello stabilito per la polarizzazione dei macrofagi M2-like utilizzando la linea cellulare THP-1 e i risultati dell'espressione e i profili delle citochine dei macrofagi a causa di determinati stimoli in vitro variano tra gli studi. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi M0 e per polarizzare ulteriormente le cellule in un fenotipo simile a M2 entro 14 giorni. Dimostriamo i cambiamenti morfologici delle cellule simili ai monociti THP-1, dei macrofagi differenziati e dei macrofagi polarizzati simili a M2 utilizzando la microscopia ottica. Questo modello è la base per modelli di linee cellulari che studiano gli effetti antinfiammatori della TAM e le loro interazioni con altre popolazioni cellulari del microambiente tumorale.
Introduction
I macrofagi associati al tumore (TAM) e il loro ruolo nell'infiammazione cronica, nell'insorgenza del cancro e nello sviluppo del tumore sono obiettivi importanti nella recente ricerca1,2. I monociti del sangue periferico che vengono reclutati nel microambiente tissutale del tumore in via di sviluppo si differenziano in macrofagi e possono essere polarizzati in due sottotipi principali di macrofagi3. Il macrofago attivato classicamente rappresenta il fenotipo M1-like principalmente pro-infiammatorio e il sottotipo M2-like attivato alternativamente mostra caratteristiche prevalentemente antinfiammatorie4. I macrofagi possono passare dinamicamente tra questi due fenotipi principali a seconda del loro metabolismo cellulare, con sottotipi intermedi con attributi sia infiammatori che antinfiammatori5. TAM rappresenta una popolazione eterogenea di entrambi i fenotipi. Una funzione di promozione del tumore e una prognosi sfavorevole in diversi tipi di tumori è, tuttavia, particolarmente associata ai macrofagi M2-like6,7,8.
I profili funzionali dei macrofagi e la loro interazione con altre cellule all'interno del microambiente tumorale sono complessi e difficili da catturare in un ambiente in continua evoluzione durante lo sviluppo tumorale in corso. Le linee cellulari possono fornire una popolazione cellulare omogenea con vitalità stabile in coltura, che può facilitare il processo di dimostrazione di meccanismi cellulari e intercellulari definiti. La linea cellulare THP-1 simile ai monociti è un sistema modello legittimo per i monociti umani primari9. Questa linea cellulare spontaneamente immortalata è stata ottenuta dal sangue periferico di un bambino di un anno con leucemia monocitica acuta9,10. La differenziazione e la polarizzazione delle cellule THP-1 sono state riportate da diversi studi e sono state eseguite in più modi diversi11,12,13,14. L'attivazione e, quindi, la polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M1-like è seguita da un meccanismo di rimbalzo antinfiammatorio compensatorio, promuovendo un fenotipo M2-like attraverso citochine prodotte da macrofagi infiammatori, come l'interleuchina 6 (IL-6) o l'itaconato15,16. Questo potrebbe servire come meccanismo di rottura per attenuare una risposta infiammatoria eccessiva dopo l'attivazione cellulare17. Il processo di differenziazione e polarizzazione dei monociti e delle cellule simili ai monociti THP-1 in un fenotipo antinfiammatorio simile a M2 è a sua volta accompagnato da stimoli pro-infiammatori che devono essere superati. Una risposta infiammatoria delle citochine può essere causata da stress meccanico18, come la modifica dei mezzi per rialimentare le cellule o l'aggiunta di composti chimici per differenziare le cellule THP-1, come il forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), e indurre la produzione di fattore di necrosi tumorale α (TNFα), interleuchina 1β (IL-1β) o IL-619. Questo profilo alterato di espressione delle citochine come risposta alla PMA può influenzare e prevenire la successiva polarizzazione dei macrofagi20. Adeguati periodi di riposo, come riportato in precedenza dopo il trattamento con PMA, consentono a queste risposte infiammatorie di diminuire e facilitare la polarizzazione cellulare in un fenotipo 21 distinto simile aM2.
Questo protocollo dimostra un metodo per differenziare e polarizzare le cellule simili ai monociti THP-1 in un fenotipo M2-like di macrofagi entro 14 giorni.
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Protocol
NOTA: una panoramica dei passaggi descritti in questo protocollo è illustrata nella Figura 1. È stata acquistata la linea cellulare di leucemia simile a monociti umani THP-1. È stata eseguita una breve analisi di ripetizione in tandem per autenticare la linea cellulare THP-1. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili. La linea cellulare monocitica THP-1 cresce in sospensione e non si attacca alle superfici di coltura cellulare. L'aderenza può essere indotta differenziando i monociti in cellule simili a macrofagi attraverso, ad esempio, stress meccanico o trattamento specifico conPMA.
1. Coltivazione e mantenimento di cellule simili a monociti THP-1
- Impostare un timer per 150 s. Rimuovere il flaconcino congelato contenente la linea cellulare THP-1 (Tabella dei materiali) dall'azoto liquido e scongelarlo immediatamente in un bagno d'acqua pulita (37 °C). Avviare il timer non appena il flaconcino viene messo a bagnomaria. Allentare il tappo per rilasciare la pressione che si sta accumulando a causa del processo di scongelamento ma assicurarsi che l'apertura del tubo non contatti l'acqua, per evitare la contaminazione. Il periodo di tempo ottimale per scongelare le cellule è compreso tra 120-150 s. Continuare a scongelare la sospensione cellulare fino a quando non viene lasciato un chip di ghiaccio delle dimensioni di circa 4 mm all'interno del flaconcino; quindi, procedere immediatamente al passaggio successivo.
- Trasferire la fase liquida della sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente 9 mL di mezzi di crescita caldi (37 °C) (Tabella dei materiali). Quindi, trasferire 1 mL della sospensione a cellule medie calde nel flaconcino THP-1 e di nuovo nel tubo da 15 ml per sciogliere il chip di ghiaccio rimanente e lavare il flaconcino per assicurarsi che non vengano lasciate indietro le cellule.
- Mescolare delicatamente la sospensione tubando su e giù con una pipetta da 1000 μL. Rimuovere un piccolo campione (circa 10 μL) per contare le cellule per la vitalità (usando il tripano blu per l'esclusione) mentre sono filate. Abbassare la sospensione a celle calde a 200 x g per 7 minuti a 37 °C.
- Rimuovere completamente il surnatante e risospendare con un certo volume di terreno di crescita caldo per ottenere una densità cellulare di 5 x 105/mL. Mescolare delicatamente la sospensione e trasferire 22 mL di volume in palloni di coltura cellulare T-75 (Tabella dei materiali). Conservare i palloni in posizione verticale in un incubatore a 37 °C con una concentrazione di anidride carbonica (CO2)del 5%. Scambia i mezzi di crescita ogni 3-4 giorni.
2. Semina di cellule THP-1 e differenziazione in macrofagi M0
- Preparare la cellula contenente il mezzo di crescita con la rispettiva densità cellulare per seminare le cellule ad una densità di 3 x10 5/ mL / pozzetti in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti (Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente il mezzo e preparare aliquote di 26 ml, ciascuna messa in un tubo da 50 ml. Utilizzare ogni aliquota da 26 ml per seminare le cellule in una rispettiva piastra.
- Trasferire 1 mL del mezzo contenente cellule in ciascun pozzettino di una piastra a 24 pozzetti. Mescolare delicatamente il supporto pipettando su e giù tra i trasferimenti.
- Preparare una soluzione madre di PMA (sciogliere 1 mg di PMA in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) = ~16 mM soluzione di PMA in DMSO) e diluirla con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) fino a una concentrazione finale di lavoro di 10 ng/μL subito prima del trattamento cellulare (Tabella dei materiali). Tenere la soluzione sul ghiaccio e utilizzarla immediatamente. Non ricongelare. Aggiungi 100 ng di PMA per pozze. Lasciare che ogni piastra cellulare rimanga nell'incubatrice senza ulteriori trattamenti per 72 ore.
- Dopo 72 ore, rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con 1 mL di terreno di crescita fresco. Non toccare il fondo dei pozzette con punte di pipetta. Lascia riposare le cellule per altre 96 ore nell'incubatrice.
- Dopo 96 ore, ripetere il passaggio 2.4 (cambio del supporto) e lasciare riposare le celle per altre 24 ore.
NOTA: I macrofagi M0 sono ora pronti per essere utilizzati per esperimenti (Figura 2). Immediatamente prima di trattare le cellule come parte di ulteriori esperimenti, considerare un cambiamento del mezzo solo con RPMI(Tabella dei materiali)poiché gli integratori di mezzi di crescita possono causare interferenze con i reagenti aggiunti per il trattamento cellulare. Nel caso in cui siano necessari macrofagi simili a M2, procedere con la sezione 3.
3. Polarizzazione dei macrofagi M0 in macrofagi simili a M2
- Preparare una soluzione madre di IL-4 e IL-13 (sciogliere 20 μg di IL-4 o IL-13 in 200 μL di acqua priva di nucleasi) e diluirla ad una concentrazione finale di lavoro di 2 ng/μL con PBS immediatamente prima del trattamento cellulare. Tenere la soluzione sul ghiaccio e utilizzarla immediatamente. Non ricongelare.
- Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con 1 mL di terreno di crescita fresco. Aggiungere 20 ng di interleuchina 4 (IL-4) e 20 ng di interleuchina 13 (IL-13) per pozzo. Lasciare riposare le cellule per 48 ore nell'incubatrice.
- Dopo 48 ore, ripetere il passaggio 3.2. Lasciare riposare le cellule per altre 48 ore nell'incubatrice.
- Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con 1 mL di terreno di crescita fresco. Lasciare riposare le cellule per 48 ore nell'incubatrice.
NOTA: i macrofagi simili a M2 sono ora pronti per essere utilizzati per gli esperimenti (Figura 2). Immediatamente prima di trattare le cellule come parte di ulteriori esperimenti, prendere in considerazione un cambiamento del supporto solo con RPMI(Tabella dei materiali)poiché i supplementi dei mezzi di crescita possono causare interferenze.
4. Distacco e raccolta di macrofagi per citometria a flusso
NOTA: utilizzare un metodo meccanico che combini lo shock a freddo e il raschiamento cellulare per staccare e raccogliere i macrofagi polarizzati dalle piastre per la citometria a flusso.
- Rimuovere il mezzo cellulare caldo e sostituirlo con una miscela di PBS ghiacciato (senza calcio e magnesio) e siero bovino fetale al 5% (FBS), 1 ml per pozzed. Subito dopo, posizionare la piastra cellulare sul ghiaccio per 45 minuti. Non posizionare la piastra cellulare sul ghiaccio prima che il mezzo cellulare caldo venga rimosso, poiché ciò ridurrà significativamente la vitalità cellulare. Mantenere le cellule sul ghiaccio solo dopo aver indotto shock freddo con miscela PBS/5% FBS ghiacciata.
- Dopo 45 minuti sul ghiaccio, raschiare via le celle usando mini raschietti per celle (Tabella dei materiali). Trasferire delicatamente i macrofagi staccati in PBS freddo/ 5% FBS in un tubo da 15 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio in ogni momento fino a quando le cellule non sono macchiate.
NOTA: Pool otto pozzetto di cellule per raggiungere un numero adeguato di cellule per la colorazione.
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Representative Results
Sono stati caratterizzati macrofagi simili a M2 e la polarizzazione M2 è stata convalidata utilizzando la citometria a flusso per i marcatori Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcatore M1-like) e CD206 (marcatore M2-like). La colorazione della citometria a flusso è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore. I macrofagi sono stati lavati con PBS/5% FBS e incubati con blocco del recettore Fcγ per evitare un legame aspecifico. Le cellule sono state quindi colorate con anticorpi CD14 e CD80 anti-umani di topo coniugati con FITC, con anticorpi CD11b anti-topo coniugati con PE e con anticorpi CD206 anti-umano coniugato con PE-tandem-coniugato e IgG(Tabella dei materiali)abbinati all'isotipo per 30 minuti a 4 °C. Sono state eseguite analisi citometriche a flusso a quattro colori e quantificazione della fluorescenza. È stata effettuata la gating delle cellule, escludendo i detriti cellulari in base alla dispersione in avanti e alla dispersione laterale.
I marcatori monociti e macrofagi CD14 e CD11b sono stati espressi rispettivamente nel 70,9% e nel 74,7% delle cellule (Figura 3). Le cellule non hanno mostrato quasi alcuna positività per il marcatore M1-like CD80 (0,2%) e alti livelli superficiali del marcatore M2-like CD206 nel 62,6% delle cellule (Figura 4).
I macrofagi derivati dal metodo di polarizzazione descritto in questo protocollo mostrano l'espressione di marcatori CD14 e CD11b. Entrambi i marcatori possono, ma non devono essere espressi in macrofagi. Ci si aspetta una chiara positività per CD206 come marcatore macrofagico simile a M2, mentre il livello di espressione di CD80 come marcatore simile a M1 dovrebbe essere basso. Raggi et al. hanno dimostrato risultati simili utilizzando cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), che sono state polarizzate in macrofagi simili a M222. L'espressione media di CD206 variava tra il 50% e il 60%, mentre l'espressione media di CD80 variava tra il 20% e il 25%22.
Un'ulteriore caratterizzazione dei macrofagi M2-like creati da questo protocollo è stata eseguita utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). I macrofagi simili a M2 hanno mostrato una sovraregolazione di IL-6 e C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) rispetto alle cellule simili ai monociti THP-1, nonché una sovraregolazione dei marcatori antinfiammatori CD206, Interleuchina 10 (IL-10) e C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (risultati non mostrati, da pubblicare).
Figura 1: Panoramica del modello di linea cellulare macrofagica simile a M2. Il giorno 0, le cellule vengono seminate in piastre con un terreno di crescita e incubate con PMA per 72 ore. Il giorno 3 e il giorno 7 viene cambiato il mezzo cellulare, che consente alle cellule di riposare senza PMA per un totale di 120 ore. Il giorno 8, il mezzo di crescita viene cambiato ancora una volta e le cellule vengono incubate con IL-4 e IL-13 per indurre la polarizzazione M2-like. Questo passaggio viene ripetuto dopo 2 giorni, il giorno 10. Il giorno 12, viene eseguito l'ultimo cambiamento del mezzo e le cellule simili a M2 riposano nel terreno di crescita per altre 48 ore prima di essere utilizzate per esperimenti (PMA = phorbol 12-myristate-13-acetato; IL = interleuchina). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Morfologia cellulare di cellule THP-1, macrofagi differenziati (M0) e macrofagi simili a M2 mediante microscopia ottica. Le cellule sono state seminate a 3 x 105 per pozzetti in un piatto da 24 pozzetti. (A,B) Le cellule THP-1 sono mostrate al basale. (C,D) I macrofagi M0 differenziati hanno ricevuto un trattamento PMA per 72 ore, un cambiamento del mezzo di crescita e un periodo di riposo di 96 ore. (E,F) I macrofagi simili a M2 sono mostrati dopo il completamento del trattamento di polarizzazione con IL-4 e Il-13 al giorno 14 di questo modello cellulare (ingrandimento 20x e 40x; scala = 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi di fluorescenza della citometria a flusso per CD14 (FITC, FL1-H) e CD11b (PE, FL2-H). ( A )Diagrammadi dispersione della densità, le percentuali di cellule sono mostrate in ciascun quadrante. (B,C) Gli istogrammi per CD14 e CD11b in macrofagi simili a M2 rispetto a un controllo di colorazione negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi di fluorescenza della citometria a flusso per CD80 (FITC, FL1-H) e CD206 (coniugato PE-tandem, FL3-H). ( A )Graficoa dispersione di densità, le percentuali di cellule sono mostrate in ciascun quadrante. (B,C) Gli istogrammi per CD80 e CD206 in macrofagi simili a M2 rispetto a un controllo di colorazione negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo sulla differenziazione e polarizzazione delle cellule simili ai monociti THP-1 entro 14 giorni fornisce un metodo per ottenere macrofagi con un fenotipo M2 distinto a causa della lunga incubazione del trattamento delle cellule con adeguati periodi di riposo tra i passaggi.
Alcuni passaggi sono fondamentali per questo protocollo. Il tempo di raddoppio dei monociti THP-1 è di circa 26 ore. Le cellule possono essere divise ad una densità cellulare di 9 x10 5/mL e devono essere seminate ad una densità di 3 x 105/mL durante ogni scissione. La scissione può essere eseguita senza rimuovere tutto il (vecchio) mezzo cellulare usato - rialiere le cellule con solo il 50% del mezzo fresco può infatti portare a una crescita cellulare più rapida perché i fattori di crescita nel mezzo cellulare condizionato possono migliorare la proliferazione cellulare. Non scambiare tutti i mezzi cellulari, tuttavia, aumenta il rischio di contaminazione della coltura e dovrebbe quindi essere eseguito solo durante i primi passaggi di cellule appena coltivate. Il conteggio delle cellule è importante per essere in grado di colturare le cellule alla giusta densità e per determinare la vitalità cellulare dopo lo scongelamento. La percentuale di cellule morte dopo lo scongelamento corretto delle cellule non deve superare il 15%.
La semina delle cellule in piastre richiede una miscelazione delicata ma accurata della sospensione cellulare per ottenere una densità cellulare coerente in ciascun pozzetti. Le aliquote vengono preparate prima di seminare le cellule in piastre di coltura per garantire che il volume del mezzo contenente la cellula sia miscelato correttamente. Poiché i monociti THP-1 nel mezzo tendono ad affondare sul fondo di una fiala, la miscelazione continua e delicata del volume di trasferimento è fondamentale per ottenere una densità costante di cellule.
I mezzi cellulari devono essere riscaldati a 37 °C in ogni momento per evitare shock da freddo e una risposta allo stress cellulare pro-infiammatorio23. Pertanto, anche per i cambiamenti dei media e il trattamento cellulare, le piastre non devono essere lasciate fuori dall'incubatore per più di 15 minuti. Inoltre, i rispettivi composti per il trattamento cellulare, come PMA, interleuchine e PBS per diluire le soluzioni stock prima di trattare le cellule, devono essere sempre tenuti sul ghiaccio per evitare la degradazione.
I macrofagi vivi che si differenziano dai monociti mediante trattamento PMA aderiscono alla superficie dei pozzezze. Durante i cambi di supporto e altre ulteriori fasi di trattamento, le punte delle pipette non devono toccare il fondo di un pozzo all'interno della piastra per prevenire danni alle cellule.
Per eseguire la citometria a flusso con macrofagi differenziati o polarizzati, le cellule attaccate alle piastre devono essere raccolte. Esistono tecniche enzimatiche o meccaniche per staccare le cellule, tra cui la tripsinizzazione, il trattamento con miscele enzimatiche con attività proteolitica e collagenolitica, o l'acido etilendiamminatoacetico (EDTA), lo shock freddo, il raschiamento cellulare o persino il distacco attraverso la pressione acustica24,25. Il distacco enzimatico dei macrofagi può portare a un'alterata espressione del marcatore della superficie cellulare e non è quindi la prima scelta per le analisi fenotipiche o funzionali25. In contrasto con altri rapporti, gli esperimenti condotti qui hanno dimostrato che la combinazione di shock a freddo e raschiatura dei macrofagi ha mostrato una buona vitalità cellulare (>90%) utilizzando l'esclusione del colorante Trypan Blue. Pertanto, si consiglia di utilizzare questa tecnica per staccare le cellule, con l'annotazione che una volta indotto uno shock freddo, le cellule devono essere mantenute fredde sul ghiaccio in ogni momento.
Una limitazione di questo protocollo è l'uso di una linea cellulare simile a un monocita come base per imitare i meccanismi dei macrofagi in vivo. Gli studi di coltura cellulare che utilizzano macrofagi primari, tuttavia, possono mostrare risposte cellulari variabili e meccanismi possono essere mascherati a causa dell'eterogeneità cellulare26. La linea cellulare THP-1 è un sistema modello consolidato per monociti umani primari9. A causa della popolazione cellulare omogenea di THP-1 in un ambiente di coltura controllato, le risposte cellulari sono potenzialmente riproducibili in modo più preciso. Inoltre, alcune tecniche ottimizzano le cellule THP-1 come modello per assomigliare ai monociti primari. Un passo importante è il periodo di riposo di 5 giorni dopo il trattamento con PMA, che aumenta il volume citoplasmatico e l'aderenza della superficie cellulare simile a quella delle cellule derivate da monociti differenziati21.
Un'altra limitazione è la creazione di un certo fenotipo macrofagico simile a M2 che ha altre caratteristiche rispetto ai macrofagi simili a M2 che sono stati utilizzati in studi precedenti. Sono state riportate molte tecniche diverse per differenziare e polarizzare le cellule THP-1 e una mancanza di caratterizzazione al basale complica la riproducibilità interstudy11,12,13,14. Pertanto, è importante caratterizzare i macrofagi utilizzati in uno studio al basale, a seconda dei meccanismi studiati. Successivamente, devono essere dimostrate le risposte cellulari dopo un rispettivo trattamento.
I macrofagi M2-like prodotti seguendo questo protocollo sono una solida base per lo studio delle risposte cellulari nell'insorgenza e nella progressione del tumore in diversi tipi di tumori, guarigione delle ferite o fibrosi. Con questo protocollo, sia M0-macrofagi che M2-macrofagi possono essere utilizzati in vitroe le cellule sono adatte per essere utilizzate in modelli di cocoltura. Ciò fornisce un'ampia varietà di applicazioni di un fenotipo macrofagico distinto simile a M2 che è robustamente controllato in vitro nel tempo.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il Price Institute of Surgical Research, Università di Louisville, è sostenuto finanziariamente dal John W. Price e Barbara Thruston Atwood Price Trust. Le fonti di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione e nella conduzione dello studio, nonché nella raccolta, gestione, analisi e interpretazione dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
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