Summary
M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.
Abstract
Tümörle ilişkili makrofajlar (TAM) dış uyaranlara göre ekspresyonlarını ve sitokin profillerini değiştirebilir. Bu olağanüstü plastisite, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içinde devam eden değişikliklere uyum sağlamasını sağlar. Makrofajlar öncelikle pro-enflamatuar (M1 benzeri) veya antienflamatuar (M2 benzeri) özelliklere sahip olabilir ve bu iki ana durum arasında sürekli geçiş yapabilir. Tümör ortamındaki M2 benzeri makrofajlar, çeşitli kanser türlerinde kanser ilerlemesi ve zayıf prognoz ile ilişkilidir. THP-1 hücrelerinin farklılaşmasını ve polarizasyonunu teşvik etmek için hücresel ve hücreler arası mekanizmaları ve TAM'ın tümörlerin mikroçevrasyonu içindeki etkilerini araştırmak için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Şu anda, THP-1 hücre hattı kullanılarak M2 benzeri makrofaj polarizasyonu için belirlenmiş bir model yoktur ve bazı in vitro uyaranlara bağlı makrofajların ekspresyon ve sitokin profillerinin sonuçları çalışmalar arasında değişmektedir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri M0 makrofajlarına ayırt etmek ve hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri bir fenotipe daha da polarize etmek için ayrıntılı rehberlik görevi görür. Işık mikroskopisi kullanarak THP-1 monosit benzeri hücrelerin, farklılaştırılmış makrofajların ve polarize M2 benzeri makrofajların morfolojik değişimlerini gösteriyoruz. Bu model, TAM'ın antienflamatuar etkilerini ve tümör mikroçevresinin diğer hücre popülasyonlarıyla etkileşimlerini araştıran hücre hattı modellerinin temelidir.
Introduction
Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) ve kronik inflamasyondaki rolleri, kanserin başlangıcı ve tümör gelişimi son araştırmalarda önemli hedeflerdir1,2. Gelişmekte olan tümörün doku mikroçevresine alınan periferik kan monositleri makrofajlara farklılık gösteren ve makrofajların iki ana alt tipine polarize edilebilen3. Klasik olarak aktive edilen makrofaj, öncelikle pro-enflamatuar M1 benzeri fenotipi temsil eder ve alternatif olarak aktive edilen M2 benzeri alt tip ağırlıklı olarak antienflamatuar özellikler gösterir4. Makrofajlar, hücresel metabolizmalarına bağlı olarak bu iki ana fenotip arasında dinamik olarak geçiş yapabilir, ara alt tipler hem enflamatuar hem de antienflamatuar özelliklere sahiptir5. TAM, her iki fenotipin heterojen popülasyonunu temsil eder. Bununla birlikte, farklı kanser türlerinde tümör teşvik edici bir işlev ve zayıf prognoz, özellikle M2 benzeri makrofajlar6,7,8ile ilişkilidir.
Makrofajların fonksiyonel profilleri ve tümör mikroçevrİmİ içindeki diğer hücrelerle etkileşimleri, devam eden tümör gelişimi sırasında sürekli değişen bir ortamda yakalanması karmaşık ve zordur. Hücre hatları, tanımlanmış hücresel ve hücreler arası mekanizmaları gösterme sürecini kolaylaştırabilen, kültürde istikrarlı canlılığa sahip homojen bir hücre popülasyonu sağlayabilir. Monosit benzeri THP-1 hücre hattı, birincil insan monositleri9için meşru bir model sistemidir. Kendiliğinden ölümsüzleşen bu hücre hattı, akut monositik lösemi9,10olan bir yaşındaki bir bebeğin periferik kanından elde edilmiştir. THP-1 hücrelerinin farklılaşması ve polarizasyonu çeşitli çalışmalarla rapor edilmiş ve birden fazla farklı şekilde gerçekleştİrilmiştir11,12,13,14. Aktivasyon ve bu nedenle, makrofajların M1 benzeri bir fenotipe polarizasyonunu, interleukin 6 (IL-6) veya itaconate15,16gibi enflamatuar makrofajlar tarafından üretilen sitokinler yoluyla M2 benzeri bir fenotip teşvik eden telafi edici bir anti-enflamatuar ribaund mekanizması izler. Bu, hücre aktivasyonundan sonra aşırı çekim enflamatuar yanıtı zayıflamak için bir kesme mekanizması olarak hizmet edebilir17. Monositleri ve THP-1 monosit benzeri hücreleri anti-enflamatuar M2 benzeri bir fenotipe ayırma ve polarize etme sürecine, üstesinden gelinmesi gereken pro-enflamatuar uyaranlar da eşlik eder. Enflamatuar sitokin yanıtı mekanik stresten kaynaklanabilir18Hücreleri yeniden beslenmek için ortam değiştirmek gibi, veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) gibi THP-1 hücrelerini ayırt etmek için kimyasal bileşikler eklemek ve tümör nekroz faktörü α (TNFα), interlökin 1β (IL-1β) veya IL-619üretimine neden olmak. PMA'ya yanıt olarak bu değiştirilmiş sitokin ekspresyon profili, sonraki makrofaj polarizasyonunu etkileyebilir ve önleyebilir20. PMA tedavisinden önce bildirildiği gibi yeterli istirahat süreleri, bu enflamatuar yanıtların azalmasına izin verir ve hücre polarizasyonunu farklı bir M2 benzeri fenotip21'ekolaylaştırır.
Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde makrofajların M2 benzeri bir fenotipine ayırt etmek ve polarize etmek için bir yöntem göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu iletişim kuralında açıklanan adımlara genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. İnsan monosit benzeri lösemi hücre hattı THP-1 satın alındı. THP-1 hücre hattının kimliğini doğrulamak için kısa tandem tekrar analizi yapıldı. Tüm adımları steril koşullar altında gerçekleştirin. THP-1 monositik hücre hattı süspansiyonda büyür ve hücre kültürü yüzeylerine bağlanmaz. Bağlılık, monositlerin makrofaj benzeri hücrelere ayırt edilmesiyle, örneğin mekanik stres veya PMA ile spesifik tedavi yoluyla indüklenebilir.
1. THP-1 monosit benzeri hücrelerin kültleme ve bakımı
- 150 sn için bir zamanlayıcı ayarlayın. THP-1 hücre hattını(Malzeme Masası)içeren donmuş şişeyi sıvı azottan çıkarın ve temiz bir su banyosunda (37 °C) hemen çözün. Şişe su banyosuna konur konulmaz zamanlayıcıyı başlatın. Çözülme işlemi nedeniyle biriken basıncı serbest bırakmak için kapağı gevşetin, ancak kirlenmeyi önlemek için tüp açıklığın suya temas etmediğinden emin olun. Hücrelerin çözülmesi için en uygun zaman dilimi 120-150 s arasındadır. Şişenin içinde yaklaşık 4 mm büyüklüğünde bir buz parçası kalana kadar hücre süspansiyonunun çözülmesine devam edin; ardından, hemen bir sonraki adıma geçin.
- Hücre süspansiyonunun sıvı fazını 9 mL sıcak (37 °C) büyüme ortamı (Malzeme Tablosu) içeren 15 mL'lik birtüpe aktarın. Daha sonra, sıcak orta hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını THP-1 şişesine aktarın ve kalan buz çipini eritmek ve geride hücre kalmamasını sağlamak için şişeyi yıkamak için 15 mL'lik tüpe geri aktarın.
- Süspansiyonu 1000 μL pipetle yukarı ve aşağı pipetle yukarı ve aşağı borulayarak hafifçe karıştırın. Hücreleri canlılık için saymak için küçük bir örnek (yaklaşık 10 μL) çıkarın (dışlama için trippan mavisi kullanarak) döndürülürken. 200 x g'daki sıcak hücre süspansiyonu 37 °C'de 7 dakika boyunca aşağı çevirin.
- 5 x 105/mL hücre yoğunluğu elde etmek için süpernatant tamamen çıkarın ve belirli bir hacimde sıcak büyüme ortamı ile yeniden dirilin. Süspansiyonu hafifçe karıştırın ve 22 mL hacmi T-75 hücre kültürü şişelerine(Malzeme Masası) aktarın. Şişeleri % 5 karbondioksit (CO2)konsantrasyonu ile 37 °C'de bir inkübatörde dik olarak saklayın. Büyüme medyasını her 3-4 günde bir değiştirin.
2. THP-1 hücrelerinin tohumlanması ve M0 makrofajlarına farklılaştırılması
- İlgili hücre yoğunluğuna sahip büyüme ortamını içeren hücreyi 3 x 105/mL/well yoğunluğunda tohum hücrelerine 24 kuyu hücre kültürü plakalarınahazırlayın( Malzeme Tablosu ). Ortayı hafifçe karıştırın ve her biri 50 mL'lik bir tüpe konulan 26 mL'lik aliquots hazırlayın. Hücreleri ilgili bir tabağa tohumlamak için her 26 mL aliquot kullanın.
- Hücre içeren ortamın 1 mL'lik kısmını 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Aktarımlar arasında yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ortamı hafifçe karıştırın.
- Bir PMA stok çözeltisi hazırlayın (100 μL Dimetil Sülfit (DMSO) = DMSO'da ~16 mM PMA çözeltisinde 1 mg PMA çözün) ve hücre tedavisinden hemen önce 10 ng/μL'lik son çalışma konsantrasyonuna kadar soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ileseyreltin. Çözeltiyi buzda tutun ve hemen kullanın. Tekrar donma. Kuyu başına 100 ng PMA ekleyin. Her hücre plakasının 72 saat boyunca başka bir tedaviye yer vermeden inkübatörde oturmasına izin verin.
- 72 saat sonra, büyüme ortamını çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Pipet uçları ile kuyuların dibine dokunmayın. Hücrelerin inkübatörde 96 saat daha dinlenmesine izin verin.
- 96 saat sonra, 2.4 adımını (ortam değişikliği) tekrarlayın ve hücrelerin 24 saat daha dinlenmesine izin verin.
NOT: M0 makrofajları artık denemeler için kullanılmaya hazırdır (Şekil 2). Hücrelerin diğer deneylerin bir parçası olarak ele alınmasından hemen önce, büyüme ortamı takviyeleri hücre tedavisi için eklenen reaktiflerle parazite neden olabileceğinden, yalnızca RPMI (Malzeme Tablosu)ile bir medya değişikliği düşünün. M2 benzeri makrofajlara ihtiyaç duyulması durumunda bölüm 3'e geçin.
3. M0 makrofajlarının M2 benzeri makrofajlara polarizasyonu
- IL-4 ve IL-13 stok çözeltisi hazırlayın (200 μL çekirdeksiz suda 20 μg IL-4 veya IL-13 çözün) ve hücre tedavisinden hemen önce PBS ile 2 ng/μL'lik son çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Çözeltiyi buzda tutun ve hemen kullanın. Tekrar donma.
- Büyüme ortamını çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Kuyu başına 20 ng interleukin 4 (IL-4) ve 20 ng interleukin 13 (IL-13) ekleyin. Hücrelerin inkübatörde 48 saat dinlenmesine izin verin.
- 48 saat sonra, 3.2 adımlarını yineleyin. Hücrelerin inkübatörde 48 saat daha dinlenmesine izin verin.
- Büyüme ortamını çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Hücrelerin inkübatörde 48 saat dinlenmesine izin verin.
NOT: M2 benzeri makrofajlar artık denemeler için kullanılmaya hazırdır (Şekil 2). Hücrelerin diğer deneylerin bir parçası olarak ele alınmasından hemen önce, büyüme ortamı takviyeleri parazite neden olabileceğinden, yalnızca RPMI (Malzeme Tablosu) ile bir medya değişikliği düşünün.
4. Akış sitometrisi için makrofajların derli ve hasat
NOT: Akış sitometrisi için polarize makrofajları plakalardan ayırmak ve toplamak için soğuk şoklama ve hücre kazıma birleştirmek için mekanik bir yöntem kullanın.
- Ilık hücre ortamını çıkarın ve buz gibi PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ve% 5 fetal sığır serumu (FBS), kuyu başına 1 mL karışımı ile değiştirin. Bundan hemen sonra, hücre plakasını 45 dakika boyunca buza yerleştirin. Sıcak hücre ortamı çıkarılmadan önce hücre plakasını buza yerleştirmeyin, çünkü bu hücre canlılığını önemli ölçüde azaltacaktır. Hücreleri sadece buz gibi PBS/%5 FBS karışımı ile soğuk şoka neden olduktan sonra buzda tutun.
- Buzda 45 dakika sonra, mini hücre sıyırıcıları (Malzeme Masası) kullanarak hücrelerikazıyın. Soğuk PBS/%5 FBS'deki ayrılmış makrofajları 15 mL'lik bir tüpe hafifçe aktarın. Hücreler lekelenene kadar tüpü her zaman buzda tutun.
NOT: Boyama için yeterli hücre sayısına ulaşmak için sekiz hücre kuyularını bir kenara ayırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M2 benzeri makrofajlar karakterize edildi ve M2 polarizasyonu, Farklılaşma İşaretçileri Kümesi (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1 benzeri işaretleyici) ve CD206 (M2 benzeri işaretleyici) için akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Akış sitometrisi boyama işlemi üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Makrofajlar PBS/%5 FBS ile yıkandı ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için Fcφ-reseptör bloğu ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra FITC konjuge fare anti-insan CD14 ve CD80 antikorları, PE-konjuge fare anti-insan CD11b antikorları ve PE-tandem konjuge fare anti-insan CD206 antikorları ve izotiple eşleşen IgG (Malzeme Tablosu)ile 4 °C'de 30 dakika boyunca lekelendi. Dört renkli akış sitometrik analizi ve floresan nicelasyonu yapıldı. Hücrelerin gatingi, ileri saçılma ve yan dağılıma göre hücre kalıntıları hariç gerçekleştirildi.
CD14 ve CD11b monosit ve makrofaj belirteçleri sırasıyla hücrelerin %70,9'u ve %74,7'si ile ifade edilmiştir (Şekil 3). Hücreler, hücrelerin %62,6'sında M2 benzeri işaretleyici CD80 (%0,2) ve M2 benzeri işaretleyici CD206'nın yüksek yüzey seviyeleri için neredeyse hiç pozitiflik göstermedi(Şekil 4).
Bu protokolde açıklanan polarizasyon yönteminden türetilen makrofajlar, CD11b işaretleyicilerinin yanı sıra CD14 ifadesini de gösterir. Her iki işaretleyici de makrofajlarla ifade edilebilir, ancak ifade edilmesi gerekmez. M2 benzeri bir makrofaj işaretçisi olarak CD206 için net bir pozitiflik beklenirken, M1 benzeri bir işaretleyici olarak CD80 ifade düzeyi düşük olmalıdır. Raggi ve ark. M2 benzeri makrofajlar22'yepolarize edilen periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) kullanarak benzer sonuçlar göstermiştir. CD206'nın ortalama ifadesi% 50-% 60 arasında değişirken, CD80'in ortalama ifadesi% 20-% 25%22arasında değişmektedir.
Bu protokol tarafından oluşturulan M2 benzeri makrofajların daha fazla karakterizasyonu nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak gerçekleştirildi. M2 benzeri makrofajlar, IL-6 ve C-X-C Motifi Kemokin Ligand 10'un (CXCL10) THP-1 monosit benzeri hücrelere kıyasla bir artış gösterdiğini göstermiştir. anti-enflamatuar belirteçler CD206, Interleukin 10 (IL-10) ve C-C Motifi Kemokin Ligand 18 (CCL18) (sonuçlar gösterilmez, yayınlanacaktır).
Şekil 1: M2 benzeri makrofaj hücresi çizgi modeline genel bakış. 0. günde, hücreler büyüme ortamına sahip plakalara tohumlanır ve 72 saat boyunca PMA ile inkübe edilir. 3. gün ve 7. 8. günde, büyüme ortamı bir kez daha değiştirilir ve hücreler M2 benzeri polarizasyona neden olmak için IL-4 ve IL-13 ile inkübe edilir. Bu adım 2 gün sonra, 10 gün sonra tekrarlanır. 12. günde, son orta değişim gerçekleştirilir ve M2 benzeri hücreler deneyler için kullanılmadan önce büyüme ortamında 48 saat daha dinlenir (PMA = phorbol 12-myristate-13-asetat; IL = interleukin). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: THP-1 hücrelerinin hücre morfolojisi, farklılaştırılmış (M0) makrofajlar ve ışık mikroskopisi kullanılarak M2 benzeri makrofajlar. Hücreler 24 kuyulu bir tabakta kuyu başına 3 x10 5 oranında tohumlandı. (A,B) THP-1 hücreleri taban çizgisine gösterilir. (C,D) Farklılaştırılmış M0 makrofajları 72 saat PMA tedavisi, büyüme orta değişimi ve 96-h istirahat süresi aldı. (E,F) M2 benzeri makrofajlar, il-4 ve il-13 ile tamamlanan polarizasyon tedavisinden sonra bu hücre modelinin 14. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CD14 (FITC, FL1-H) ve CD11b (PE, FL2-H) için akış sitometri floresan analizi( A) Yoğunluk saçılım grafiği, her çeyrekte hücre yüzdeleri gösterilir. (B,C) Cd14 ve CD11b için histogramlar, negatif boyama kontrolüne kıyasla M2 benzeri makrofajlarda. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CD80 (FITC, FL1-H) ve CD206 (PE-tandem konjuge, FL3-H) için akış sitometri floresan analizi( A) Yoğunluk saçılım grafiği, her çeyrekte hücre yüzdeleri gösterilir. (B,C) M2 benzeri makrofajlarda CD80 ve CD206 histogramları negatif boyama kontrolüne kıyasla. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
THP-1 monosit benzeri hücrelerin 14 gün içinde ayırt edilmesi ve polarize edilmesi ile ilgili bu protokol, adımlar arasında yeterli dinlenme sürelerine sahip hücrelerin uzun tedavi inkübasyonu nedeniyle M2 benzeri belirgin bir fenotip ile makrofaj elde etmek için bir yöntem sağlar.
Bazı adımlar bu protokol için kritik öneme sahiptir. THP-1 monositlerinin iki katına çıkması yaklaşık 26 saattir. Hücreler 9 x 105/mL hücre yoğunluğunda bölünebilir ve her bölme sırasında 3 x 105/mL yoğunlukta tohumlanmalıdır. Bölme, kullanılan tüm (eski) hücre ortamını çıkarmadan gerçekleştirilebilir - hücreleri taze ortamın sadece% 50'si ile yeniden beslemek gerçekten daha hızlı hücre büyümesine yol açabilir, çünkü şartlandırılmış hücre ortamındaki büyüme faktörleri hücresel çoğalmasını artırabilir. Bununla birlikte, tüm hücre ortamlarının değiş tokuş edilmemesi, kültür kirlenmesi riskini arttırır ve bu nedenle sadece taze kültürlü hücrelerin ilk pasajları sırasında yapılmalıdır. Hücreleri saymak, hücreleri doğru yoğunlukta kültürleyebilmek ve çözdükten sonra hücresel canlılığı belirlemek için önemlidir. Hücreleri düzgün bir şekilde çözdükten sonra ölü hücrelerin oranı% 15'i geçmemelidir.
Hücrelerin plakalara tohumlaması, her kuyuda tutarlı bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücre süspansiyonunun nazik ama kapsamlı bir şekilde karıştırılmasını gerektirir. Aliquots, hücre içeren ortamın hacminin düzgün bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için hücreleri kültür plakalarına tohumlamadan önce hazırlanır. Ortamdaki THP-1 monositleri bir şişenin dibine batma eğiliminde olduğundan, sürekli nazik bir hücre yoğunluğu elde etmek için aktarım hacminin sürekli nazik bir şekilde karıştırılması çok önemlidir.
Hücre ortamı, soğuk şokları ve pro-enflamatuar hücresel stres yanıtını önlemek için her zaman 37 ° C'ye ısıtılmalıdır23. Bu nedenle, medya değişiklikleri ve hücre tedavisi için de plakalar 15 dakikadan fazla kuvöz dışında bırakılmamalıdır. Ayrıca, hücreleri tedavi etmeden önce stok çözeltilerini seyreltmek için PMA, interlüsinler ve PBS gibi hücre tedavisi için ilgili bileşikler, bozulmayı önlemek için her zaman buzda tutulmalıdır.
PMA tedavisi ile monositlerden farklılaşmış canlı makrofajlar kuyuların yüzeyine yapışır. Medya değişiklikleri ve diğer diğer tedavi adımları sırasında, pipet uçları hücre hasarını önlemek için plaka içindeki bir kuyunun altına dokunmamalıdır.
Farklılaştırılmış veya polarize makrofajlarla akış sitometrisinin gerçekleştirilmesi için plakalara bağlı hücrelerin toplanması gerekir. Trypsinization, proteolitik ve kollajenolitik aktivite ile enzim karışımları ile tedavi veya etileniamintetraasetik asit (EDTA), soğuk şok, hücre kazıma ve hatta akustik basınç yoluyla ayırma dahil olmak üzere hücreleri ayırmak için enzimatik veya mekanik teknikler vardır24,25. Makrofajların enzimatik olarak birekirilmesi hücre yüzeyi işaretleyici ifadesinin değişmesine neden olabilir ve bu nedenle fenotipik veya fonksiyonel analizler için ilk tercih değildir25. Diğer raporların aksine, burada yapılan deneyler, soğuk şoklama ve makrofajları kazıma kombinasyonunun Trypan Blue boya dışlama kullanılarak iyi hücre canlılığı (%>90) gösterdiğini göstermiştir. Bu nedenle, hücreleri ayırmak için bu tekniğin kullanılması önerilir, bir kez soğuk şok indüklendikten sonra, hücrelerin her zaman buz üzerinde soğuk tutulması gerekir.
Bu protokolün bir sınırlaması, vivo makrofaj mekanizmalarını taklit etmek için temel olarak monosit benzeri bir hücre hattının kullanılmasıdır. Bununla birlikte, birincil makrofajları kullanan hücre kültürü çalışmaları değişken hücresel yanıtlar gösterebilir ve hücre heterojenliği nedeniyle mekanizmalar maskelenebilir26. THP-1 hücre hattı, birincil insan monositleri9için kurulmuş bir model sistemidir. Kontrollü bir kültür ortamında homojen THP-1 hücre popülasyonu nedeniyle, hücresel yanıtlar potansiyel olarak daha hassas bir şekilde tekrarlanabilir. Ayrıca, bazı teknikler THP-1 hücrelerini birincil monositlere benzeyecek şekilde bir model olarak optimize eder. Önemli bir adım, farklılaştırılmış monosit türevi hücrelerinkine benzer sitoplazmatik hacmi ve hücre yüzeyi yapışmasını artıran PMA tedavisinden sonraki 5 günlük dinlenme süresidir21.
Diğer bir sınırlama, önceki çalışmalarda kullanılan M2 benzeri makrofajlardan başka özelliklere sahip belirli bir M2 benzeri makrofaj fenotipinin oluşturulmasıdır. THP-1 hücrelerini ayırt etmek ve polarize etmek için birçok farklı teknik bildirilmiştir ve taban çizgisi karakterizasyon eksikliği,11 , 12,13,14'ükarmaşıklaştırır. Bu nedenle, incelenen mekanizmalara bağlı olarak, bir çalışmada kullanılan makrofajları temel olarak karakterize etmek önemlidir. Bundan sonra, ilgili bir tedaviden sonra hücresel yanıtlar gösterilmelidir.
Bu protokole uyularak üretilen M2 benzeri makrofajlar, tümör başlangıcında hücresel yanıtların araştırılması ve farklı kanser türlerinde ilerleme, yara iyileşmesi veya fibrozis için sağlam bir temel oluşturur. Bu protokol ile M0-makrofajlar veya M2-makrofajlar in vitroolarak kullanılabilir ve hücreler kokültür modellerinde kullanılmaya uygundur. Bu, zaman içinde in vitro olarak güçlü bir şekilde kontrol edilen farklı bir M2 benzeri makrofaj fenotipinin çok çeşitli uygulamalarını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar potansiyel çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Louisville Üniversitesi Cerrahi Araştırma Fiyat Enstitüsü, John W. Price ve Barbara Thruston Atwood Price Trust tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Fon kaynaklarının çalışmanın tasarımında ve yürütülmesinde ve verilerin toplanmasında, yönetiminde, analizinde ve yorumlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
