Summary
M2様腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がんにおける腫瘍の進行および予後不良に関連している。このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞をM2様マクロファージに再現的に分化し、偏光するための詳細なガイドとして機能します。このモデルは、腫瘍微小環境内におけるTAMの抗炎症効果を調べる基礎となる。
Abstract
腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、外部刺激に応じてそれらの発現およびサイトカインプロファイルを切り替えることができる。この顕著な可塑性はTAMが腫瘍の微小環境の中で進行中の変化に適応することを可能にする。マクロファージは、主に炎症促進(M1様)または抗炎症(M2様)の属性を有し、これら2つの主要な状態を継続的に切り替えることができる。腫瘍環境内のM2様マクロファージは、いくつかのタイプの癌における癌の進行および予後不良に関連している。THP-1細胞の分化と分極化を誘導するための多くの異なる方法は、細胞および細胞間のメカニズムと腫瘍の微小環境におけるTAMの影響を調べるのに使用される。現在、THP-1細胞株を用いたM2様マクロファージ偏極のモデルは確立されていないが、一定のインビトロ刺激によるマクロファージの発現およびサイトカインプロファイルの結果は研究によって異なる。このプロトコルは、THP-1単球様細胞をM0マクロファージに分化し、14日以内に細胞をさらにM2様表現型に分光するための詳細なガイダンスとして機能します。軽顕微鏡を用いて、THP-1単球様細胞、分化マクロファージ、偏光M2様マクロファージの形態変化を実証する。このモデルは、TAMの抗炎症効果と腫瘍微小環境の他の細胞集団との相互作用を調査する細胞株モデルの基礎となる。
Introduction
腫瘍関連マクロファージ(TAM)と慢性炎症におけるそれらの役割、癌の発症、および腫瘍の発達は、最近の研究1,2において重要な標的である。現像腫瘍の組織微小環境にリクルートされた末梢血単球はマクロファージに分化し、マクロファージ3の2つの主要なサブタイプに分極することができる。古典的に活性化されたマクロファージは、主に炎症促進性M1様表現型を表し、代わりに活性化されたM2様サブタイプは主に抗炎症特性4を示す。マクロファージは、細胞代謝に応じてこれら2つの主要なフェノタイプ間で動的に切り替えることができ、中間サブタイプは炎症性および抗炎症属性の両方を有する5。TAMは、両方の表現型の不均一な集団を表す。異なるタイプの癌における腫瘍促進機能と予後不良は、しかし、特にM2様マクロファージ6、7、8と関連している。
マクロファージの機能的プロファイルと腫瘍微小環境内の他の細胞との相互作用は複雑で、進行中の腫瘍の開発中に絶えず変化する環境で捕獲することは困難です。細胞株は、培養中の安定した生存率を有する均質な細胞集団を提供することができ、定義された細胞および細胞間メカニズムを実証するプロセスを容易にすることができる。単球様THP-1細胞株は、ヒト一次単球9の正当なモデルシステムである。この自発的に不死化した細胞株は、急性単球性白血病9,10を有する1歳児の末梢血から得られた。THP-1細胞の分化と分極化は、いくつかの研究によって報告されており、複数の異なる方法で行われてきた11,12,13,14.したがって、M1様表現型へのマクロファージの分極化は、代償性抗炎症反発機構を続け、インターロイキン6(IL-6)またはイタコナーテリンなどの炎症性マクロファージによって産生されるサイトカインを介してM2様表現型を促進する。これは、細胞活性化17に続く過多の炎症反応を減衰させるブレークメカニズムとして役立つ可能性がある。単球とTHP-1単球様細胞を抗炎症性M2様表現型に分化・偏光するプロセスは、それ自体が克服しなければならない炎症促進刺激を伴う。炎症サイトカイン応答は、細胞を再送する培地を変えたり、ファルボル12-ミリステアテン酸塩(PMA)などのTHP-1細胞を分化する化学化合物を添加したり、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン1β(IL-1β)またはIL-699などの機械的ストレスによって引き起こされ得る。PMAに対する応答としてこの変化したサイトカイン発現プロファイルは、マクロファージの後の分極20に影響を及ぼし、また防止することができる。PMA治療後に報告された適切な休止期間は、これらの炎症反応が減少し、細胞分極化を明確なM2様表現型21に促進することを可能にする。
このプロトコルは、THP-1単球様細胞を14日以内にM2様のマクロファージに分化し、分極する方法を示す。
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Protocol
注: このプロトコルで説明されている手順の概要を図 1に示します。ヒト単球様白血病細胞株THP-1を購入した。THP-1細胞株を認証するために短いタンデム反復分析を行った。滅菌条件下ですべてのステップを実行します。THP-1単球細胞株は懸濁液で成長し、細胞培養表面に付着しない。付着は、PMAを用いた機械的ストレスまたは特異的治療を介して、単球をマクロファージ様細胞に分化することによって誘導され得る。
1. THP-1単球様細胞の培養と維持
- 150 s のタイマーを設定します。液体窒素からTHP-1細胞株(材料表)を含む冷凍バイアルを取り出し、すぐにきれいな水浴(37°C)で解凍します。バイアルが水浴に入れるとすぐにタイマーを開始します。キャップを緩めて、解凍プロセスによって蓄積される圧力を解放しますが、チューブ開口部が水に接触しないようにして、汚染を避けます。細胞を解凍するための最適な期間は120-150 sの間にあります。約4mmの大きさのアイスチップがバイアル内に残るまで、細胞懸濁液を解凍し続けます。その後、すぐに次のステップに進みます。
- 細胞懸濁液の液相を、9 mLの温暖(37°C)成長培地(材料表)を含む15 mLチューブに移す。次に、温かいミディアムセル懸濁液の1mLをTHP-1バイアルに移し、15mLチューブに戻して残りのアイスチップを溶融し、バイアルをフラッシュして細胞が残らないようにします。
- 1000 μL ピペットで上下にピペットを使用して、サスペンションを軽く混ぜます。小さなサンプル(約10 μL)を取り除き、細胞がスピンしている間に細胞の生存率を数えます(除外のためにトリパンブルーを使用)。37°Cで7分間、200 x g でウォームセルサスペンションをスピンダウンします。
- 上清を完全に取り除き、1定量の温成長培地で再中断して、5 x 105/mLの細胞密度を達成します。サスペンションを軽く混ぜ、22mLの体積をT-75細胞培養フラスコに移す(材料表)。フラスコを37°Cのインキュベーターに直立させて、5%の二酸化炭素(CO2)濃度で保存します。3~4日ごとに成長メディアを交換します。
2. THP-1細胞の播種とM0マクロファージへの分化
- 3 x 105/mL/wellの密度で細胞を24ウェル細胞培養プレートに播種するために、それぞれの細胞密度を有する成長培地を含む細胞を準備する(材料表)。培地を軽く混ぜ、26mLのアリコートを準備し、それぞれ50mLチューブに入れます。各26 mLアリコートを使用して、それぞれのプレートに細胞を播種します。
- 24ウェルプレートの各ウェルに細胞含有培地1mLを移す。転送の間に上下にピペットを介して、メディアを穏やかに混ぜます。
- PMAのストック溶液を調製し(1mgのPMAを100μLのジメチルスルホキシド(DMSO)=DMSO中のPMAの16mM溶液に溶解し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞処理の直前に10ng/μLの最終作業濃度に希釈する(材料表)。氷の上にソリューションを維持し、すぐにそれを使用してください。再凍結しないでください。井戸あたり100 ngのPMAを追加します。各細胞プレートを72時間のさらなる処理をせずにインキュベーターに座らせます。
- 72時間後、成長培地を取り出し、1mLの新鮮な成長培地に交換します。ピペットチップで井戸の底部に触れないでください。細胞をインキュベーターでさらに96時間休ませます。
- 96時間後、ステップ2.4(メディアチェンジ)を繰り返し、セルをさらに24時間休ませます。
メモ:M0マクロファージは実験に使用する準備ができました(図2)。細胞をさらなる実験の一部として処理する直前に、成長培地サプリメントが細胞処理のために添加される試薬に干渉を引き起こす可能性があるため、RPMIのみ(表)でのメディア変更を検討してください。M2様マクロファージが必要な場合は、セクション3に進みます。
M0マクロファージをM2様マクロファージに分極
- IL-4およびIL-13のストック溶液(ヌクレアーゼを含まない水の200μLで20μgのIL-4またはIL-13を溶解)し、細胞処理の直前にPBSで2ng/μLの最終作業濃度に希釈します。氷の上にソリューションを維持し、すぐにそれを使用してください。再凍結しないでください。
- 成長培地を取り出し、1mLの新鮮な成長培地に置き換えます。インターロイキン4(IL-4)の20 ngとインターロイキン13(IL-13)の20 ngを追加します。細胞をインキュベーターで48時間休ませます。
- 48時間後、ステップ3.2を繰り返します。細胞をインキュベーターでさらに48時間休ませます。
- 成長培地を取り出し、1mLの新鮮な成長培地に置き換えます。細胞をインキュベーターで48時間休ませます。
注: M2 のようなマクロファージは実験に使用する準備ができました (図 2)。さらなる実験の一部として細胞を処理する直前に、成長培地サプリメントが干渉を引き起こす可能性があるため、RPMIのみ(表)でメディアの変更を検討してください。
4. フローサイトメトリー用のマクロファージの取り外しと収穫
注:冷たい衝撃と細胞の掻き取りを組み合わせた機械的な方法を使用して、偏光マクロファージをプレートから取り外して収穫し、フローサイトメトリーを行います。
- 温かい細胞培地を取り出し、氷冷PBS(カルシウムとマグネシウムなし)と5%のウシ血清(FBS)を1 mLの混合物に置き換えます。その直後に、細胞板を氷の上に45分間置きます。これは、細胞の生存率を大幅に低下させるので、暖かい細胞培地が除去される前に、氷の上に細胞プレートを置かないでください。氷冷PBS/5%FBS混合物でコールドショックを誘発した後にのみ、細胞を氷上に保ちます。
- 氷上で45分を過ぎると、ミニセルスクレーパー(材料表)を使用して細胞を削り取ります。取り外したマクロファージを冷たいPBS/5%FBSで15 mLチューブに静かに移します。細胞が染色されるまで、チューブを常に氷の上に置いてください。
注:染色のための適切なセル数に到達するためにセルの8つのウェルをプールします。
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Representative Results
M2様マクロファージを特徴とし、分化マーカー群(CD)CD14、CD11b、CD80(M1様マーカー)、CD206(M2様マーカー)のフローサイトメトリーを用いてM2偏光を検証した。フローサイトメトリー染色は、メーカーの指示に従って行った。マクロファージをPBS/5%FBSで洗浄し、非特異的結合を避けるためにFcγ受容体ブロックでインキュベートした。次に、FITC結合マウス抗ヒトCD14およびCD80抗体、PE結合マウス抗ヒトCD11b抗体、およびPE-タンデム共役マウス抗ヒトCD206抗体およびアイソタイプ一致IgG(材料表)を4°Cで30分間染色した。 4色流量細胞量分析および蛍光定量を行った。細胞の格子化は、前方散乱及び側面散乱による細胞デブリを除いて行った。
単球およびマクロファージマーカーCD14及びCD11bをそれぞれ70.9%及び74.7%の細胞で発現した(図3)。細胞は、M1様マーカーCD80(0.2%)およびM2様マーカーCD206の高い表面レベルの陽性を62.6%の細胞でほとんど示さなかった(図4)。
このプロトコルに記載された分極法に由来するマクロファージは、CD14およびCD11bマーカーの発現を示す。両方のマーカーはマクロファージで表現できるが、表現する必要はない。M2様マクロファージマーカーとしてのCD206の明瞭な陽性性が期待される一方、M1様マーカーとしてのCD80発現のレベルは低いはずです。Raggiらは、末梢血単核細胞(PBMC)を用いて同様の結果を示し、M2様マクロファージ22に分極した。CD206の平均発現は50%~60%、CD80の平均発現は20%~25%22であった。
本プロトコルによって作成されたM2様マクロファージのさらなる特徴付けは、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いて行った。M2様マクロファージは、THP-1単球様細胞と比較してIL-6およびC-X-Cモチーフケモカインリガンド10(CXCL10)のアップレギュレーションを示し、 抗炎症マーカーCD206、インターロイキン10(IL-10)およびC-Cモチーフケモカインリガンド18(CCL18)のアップレギュレーションと同様に(結果は示されていない、公開される)。
図1: M2様マクロファージ細胞線モデルの概要 0日目には、細胞を成長培地でプレートに播種し、PMAで72時間培養します。3日目と7日目の細胞培地が変更され、細胞はPMAなしで合計120時間休む。8日目には、増殖培地が再び変化し、細胞をIL-4およびIL-13でインキュベートしてM2様偏光を誘導する。このステップは、2日後、10日目に繰り返される。12日目には、最後の培地変化が行われ、M2様細胞は実験に使用される前に別の48時間成長培地で休む(PMA = フォルボル12-ミリデン酸-13-アセテート;IL = インターロイキン)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:軽顕微鏡を用いたTHP-1細胞、分化(M0)マクロファージ、およびM2様マクロファージの細胞形態 細胞を24ウェルプレートに3 x105 で播種した。(A,B)THP-1細胞はベースラインで示される。(C,D)分化されたM0マクロファージは、72時間、成長培地変化および96時間休止期間に対してPMA治療を受けた。(E,F)M2様マクロファージは、この細胞モデルの14日目(20倍および40倍の倍率;スケール=100μm)でIL-4およびIl-13で分極処理を完了した後に示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CD14(FITC,FL1-H)及びCD11b(PE,FL2-H)のフローサイトメトリー蛍光分析(A)密度散布プロットは、各象限に細胞の割合を示す。(B,C)M2様マクロファージにおけるCD14およびCD11bのヒストグラムは、陰性染色対照と比較した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CD80(FITC,FL1-H)及びCD206(PEタンデムコンジュゲート,FL3-H)のフローサイトメトリー蛍光分析(A)密度散布プロット、各四分孔に細胞の割合を示す。(B,C)M2様マクロファージにおけるCD80およびCD206のヒストグラムは、陰性染色制御と比較した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞の分化および偏光に関する方法を提供し、ステップ間の十分な休止期間を有する細胞の長い治療インキュベーションによる、明確なM2様表現型を有するマクロファージを得る方法を提供する。
このプロトコルには、特定の手順が不可欠です。THP-1単球の倍加時間は約26時間です。セルは、9 x 105/mL のセル密度で分割でき、各分割の間に 3 x 105/mL の密度でシードする必要があります。分割は、すべての使用された(古い)細胞培地を除去することなく行うことができる - 新鮮な培地のわずか50%で細胞を再供給することは、条件付き細胞培地の成長因子が細胞増殖を増強することができるので、実際に細胞増殖を速くすることができる。しかし、すべての細胞培地を交換しない場合、培養汚染のリスクが高まるため、培養した細胞の最初の通過時にのみ行われるべきです。細胞を数えることは、細胞を適切な密度で培養し、解凍後の細胞生存率を決定することが重要である。細胞を適切に解凍した後の死細胞の割合は15%を超えてはなりません。
プレートへの細胞の播種は、各ウェルで一貫した細胞密度を得るために細胞懸濁液の穏やかだが徹底的な混合を必要とする。アリコートは、培養プレートに細胞を播種する前に調製され、細胞含有培地の体積が適切に混合されることを保証する。媒体中のTHP-1単球はバイアルの底に沈む傾向があるため、細胞の一貫した密度を達成するためには、伝達体積の連続的な穏やかな混合が重要である。
細胞培地は、コールドショックと炎症促進細胞ストレス応答23を避けるために、常に37°Cに温めるべきである。したがって、また、培地の変化や細胞処理のために、プレートは15分以上インキュベーターから取り残されるべきではありません。さらに、PMA、インターロイキン、および細胞を処理する前にストック溶液を希釈するためのPBSなどの細胞処理のためのそれぞれの化合物は、分解を避けるために常に氷上に保たれるべきである。
PMA処理によって単球と区別された生きたマクロファージは、ウェルの表面に付着する。メディアの変更やその他の処理ステップ中に、ピペットの先端は、細胞の損傷を防ぐためにプレート内のウェルの底部に触れてはならない。
分化または偏光マクロファージを用いてフローサイトメトリーを行う場合、プレートに取り付けられた細胞を収穫する必要があります。トリプシンゼーション、タンパク質分解およびコラージュ分解活性を有する酵素混合物による処理、またはエチレンジアミネトラ酢酸(EDTA)、コールドショック、細胞掻き取り、あるいは音響圧24、25を介した剥離を含む、細胞を切り離す酵素的または機械的な技術があります。マクロファージの酵素剥離は、細胞表面マーカー発現の変化につながる可能性があるため、表現型または機能的解析25の第一選択ではない。他の報告とは対照的に、ここで行われた実験は、冷たい衝撃的なとマクロファージの掻き取りの組み合わせがトリパンブルー染料除外を使用して良好な細胞生存率(>90%)を示したことを示した。したがって、冷たいショックが誘発されると、細胞は常に氷の上で冷たく保たなければならないという注釈を持つ細胞を取り外すために、この技術を使用することをお勧めします。
このプロトコルの制限は、生体内のマクロファージ機構を模倣する基礎として単球様細胞株を用いるという点である。しかし、一次マクロファージを用いた細胞培養研究は、細胞異質性26に起因する可変細胞応答およびメカニズムを示し、マスクすることができる。THP-1細胞株は、ヒトの原発単球9に対して確立されたモデルシステムである。制御された培養環境における均質なTHP-1細胞集団のために、細胞応答はより正確に再現可能である可能性がある。さらに、特定の技術は、THP-1細胞を原本単球に似たモデルとして最適化する。重要なステップは、PMA処理後5日目の休止期間であり、分化した単球由来細胞21と同様に細胞血漿体積および細胞表面付着率が増加する。
また、これまでの研究で用いたM2様マクロファージ以外の特徴を持つ、あるM2様マクロファージ表現型の作成も制限されている。THP-1細胞を分化し偏光する多くの異なる技術が報告されており、ベースライン特性の欠如は、相互研究再現性11、12、13、14を複雑にする。したがって、調査されるメカニズムに応じて、ベースラインでの研究で使用されるマクロファージを特徴付ける必要があります。その後、それぞれの治療後の細胞応答を実証する必要があります。
このプロトコルに従って産生されるM2様マクロファージは、異なるタイプの癌、創傷治癒、または線維症における腫瘍発症および進行における細胞応答の調査のための確固たる基礎である。このプロトコルを使用すると、M0マクロファージまたはM2マクロファージのいずれかを in vitroで使用することができ、細胞は共培養モデルで使用するのに適しています。これは、時間の経過とともに強く インビトロで 制御される明確なM2様マクロファージ表現型の多種多様なアプリケーションを提供します。
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Disclosures
著者らは、潜在的な利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
ルイビル大学の外科研究所は、ジョン・W・プライスとバーバラ・スラスターン・アトウッド・プライス・トラストによって財政的に支援されています。資金源は、調査の設計と実施、およびデータの収集、管理、分析、解釈において何の役割も持っていませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
