Summary
M2-liknande tumör-associerade makrofager (TAM) är associerade med tumör progression och dålig prognos i cancer. Detta protokoll fungerar som en detaljerad guide för att reproducerbart skilja och polarisera THP-1 monocytliknande celler i M2-liknande makrofager inom 14 dagar. Denna modell är grunden för att undersöka de antiinflammatoriska effekterna av TAM inom tumörmikromiljön.
Abstract
Tumör-associerade makrofager (TAM) kan byta uttryck och cytokin profil enligt externa stimuli. Denna anmärkningsvärda plasticitet gör det möjligt för TAM att anpassa sig till pågående förändringar inom tumör mikromiljön. Makrofager kan ha antingen främst proinflammatoriska (M1-liknande) eller antiinflammatoriska (M2-liknande) attribut och kan kontinuerligt växla mellan dessa två huvudstater. M2-liknande makrofager i tumörmiljön är förknippade med cancerprogression och dålig prognos i flera typer av cancer. Många olika metoder för att inducera differentiering och polarisering av THP-1 celler används för att undersöka cellulära och intercellulära mekanismer och effekterna av TAM inom mikromiljön av tumörer. För närvarande finns det ingen etablerad modell för M2-liknande makrofagpolarisering med THP-1-cellinjen, och resultaten av uttrycks- och cytokinprofiler av makrofager på grund av vissa in vitro-stimuli varierar mellan studierna. Detta protokoll fungerar som detaljerad vägledning för att skilja THP-1 monocyt-liknande celler till M0 makrofager och att ytterligare polarisera celler till en M2-liknande fenotyp inom 14 dagar. Vi visar morfologiska förändringar av THP-1 monocyt-liknande celler, differentierade makrofager och polariserade M2-liknande makrofager med hjälp av lätta mikroskopi. Denna modell är grunden för cellinjemodeller som undersöker de antiinflammatoriska effekterna av TAM och deras interaktioner med andra cellpopulationer i tumörmikromiljön.
Introduction
Tumör-associerade makrofager (TAM) och deras roll i kronisk inflammation, uppkomsten av cancer och tumörutveckling är viktiga mål i ny forskning1,2. Perifera blod monocyter som rekryteras till vävnad mikromiljön av den utvecklande tumör skilja sig åt i makrofager och kan polariseras till två huvudsakliga subtyper av makrofager3. Den klassiskt aktiverade makrofaget representerar den främst proinflammatoriska M1-liknande fenotypen och den alternativt aktiverade M2-liknande subtypen visar övervägande antiinflammatoriska egenskaper4. Makrofager kan växla dynamiskt mellan dessa två huvudsakliga fenotyper beroende på deras cellulära metabolism, med mellanliggande subtyper som har både inflammatoriska och antiinflammatoriska attribut5. TAM representerar en heterogen population av båda fenotyperna. En tumörfrämjande funktion och dålig prognos i olika typer av cancer är dock särskilt förknippad med M2-liknande makrofager6,7,8.
De funktionella profilerna för makrofager och deras interaktion med andra celler i tumörmikromiljön är komplexa och utmanande att fånga i en ständigt föränderlig miljö under pågående tumörutveckling. Cellinjer kan ge en homogen cellpopulation stabil livskraft i kulturen, vilket kan underlätta processen att demonstrera definierade cellulära och intercellulära mekanismer. Den monocytliknande THP-1-cellinjen är ett legitimt modellsystem för primära mänskliga monocyter9. Denna spontant odödliga cellinje har erhållits från perifert blod av ett ettårigt spädbarn med akut monocytisk leukemi9,10. Differentiering och polarisering av THP-1 celler har rapporterats av flera studier och har utförts på flera olika sätt11,12,13,14. Aktivering och därmed polarisering av makrofager till en M1-liknande fenotyp följs av en kompensatorisk antiinflammatorisk rebound-mekanism, som främjar en M2-liknande fenotyp genom cytokiner som produceras av inflammatoriska makrofager, såsom interleukin 6 (IL-6) eller itakonat15,16. Detta kan fungera som en brytmekanism för att dämpa ett översnynde inflammatoriskt svar efter cellaktivering17. Processen att differentiera och polarisera monocyter och THP-1 monocytliknande celler till en antiinflammatorisk M2-liknande fenotyp åtföljs också av proinflammatoriska stimuli som måste övervinnas. Ett inflammatoriskt cytokinsvar kan orsakas av mekanisk stress18, såsom att byta media för att mata cellerna, eller lägga till kemiska föreningar för att skilja THP-1-celler, såsom phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), och inducera produktion av tumörnekrosfaktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-619. Denna ändrade cytokin uttryck profil som ett svar på PMA kan påverka och förhindra efterföljande makrofag polarisering20. Adekvata viloperioder, som rapporterats före efter PMA behandling, tillåter dessa inflammatoriska svar att minska och underlätta cellpolarisering till en distinkt M2-liknande fenotyp21.
Detta protokoll visar en metod för att differentiera och polarisera THP-1 monocyt-liknande celler i en M2-liknande fenotyp av makrofager inom 14 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En översikt över de steg som beskrivs i det här protokollet visas i figur 1. Den mänskliga monocytliknande leukemi cellinjen THP-1 köptes. Kort tandem upprepa analys utfördes för att autentisera THP-1 cellinjen. Utför alla steg under sterila förhållanden. Den monocytiska cellinjen THP-1 växer i suspension och fästs inte på cellodlingsytor. Vidhäftning kan induceras genom att differentiera monocyter till makrofagliknande celler genom t.ex. mekanisk stress eller specifik behandling med PMA.
1. Odling och underhåll av THP-1 monocytliknande celler
- Ställ in en timer på 150 s. Ta bort den frysta injektionsflaskan som innehåller THP-1-cellinjen(Materialförteckningen)från det flytande kvävet och tina upp den omedelbart i ett rent vattenbad (37 °C). Starta timern så snart injektionsflaskan läggs i vattenbadet. Lossa locket för att frigöra trycket som byggs upp på grund av upptiningsprocessen men se till att röröppningen inte kommer i kontakt med vattnet för att undvika förorening. Den optimala tidsperioden för upptining av cellerna ligger mellan 120-150 s. Fortsätt tina upp cellfjädringen tills ett ischip av storleken ca 4 mm lämnas kvar i injektionsflaskan; fortsätt sedan till nästa steg omedelbart.
- Överför cellfjädringens vätskefas till ett 15 ml-rör som innehåller 9 ml varmt (37 °C) tillväxtmedier(materialförteckning). Överför sedan 1 ml av den varma medelcellsupphängningen till THP-1-injektionsflaskan och tillbaka till 15 ml-röret för att smälta det återstående ischipet och spola injektionsflaskan för att säkerställa att inga celler lämnas kvar.
- Blanda fjädringen försiktigt genom att pipettera upp och ner med en 1000 μL pipett. Ta bort ett litet prov (cirka 10 μL) för att räkna cellerna för livskraft (med trypanblått för uteslutning) medan de snurras. Snurra ner den varma cellupphängningen vid 200 x g i 7 min vid 37 °C.
- Ta bort supernaten helt och återanvänd med en viss volym varmt tillväxtmedium för att uppnå en celltäthet på 5 x 105/ml. Blanda fjädringen försiktigt och överför 22 ml volym till T-75 cellkulturkolvar(Materialförteckning). Förvara kolvarna upprätt i en inkubator vid 37 °C med 5 % koldioxidkoncentration (CO2). Byt ut tillväxtmedierna var 3-4:e dag.
2. Sådd av THP-1-celler och differentiering till M0-makrofager
- Förbered cellen som innehåller tillväxtmedium med respektive celltäthet till fröceller med en densitet av 3 x 105/ml/brunn i 24-brunns cellkulturplattor (Materialförteckning). Blanda mediet försiktigt och förbered alikvoter på 26 ml, var och en i ett 50 ml-rör. Använd varje 26 ml alikvot för sådd av cellerna till en respektive platta.
- Överför 1 ml av det cellinnehållande mediet till varje brunn på en 24-brunnsplatta. Blanda mediet försiktigt genom att pipetting upp och ner mellan överföringar.
- Bered en stamlösning av PMA (lös 1 mg PMA i 100 μL Dimetylsulfoxid (DMSO) = ~16 mM lösning av PMA i DMSO) och späd ut den med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig arbetskoncentration på 10 ng/μL precis före cellbehandling (Materialförteckning). Håll lösningen på is och använd den omedelbart. Frys inte igen. Tillsätt 100 ng PMA per brunn. Låt varje cellplatta sitta i inkubatorn utan ytterligare behandling i 72 timmar.
- Efter 72 timmar, ta bort tillväxtmediet och ersätt det med 1 ml färskt tillväxtmedium. Rör inte brunnens botten med pipettspetsar. Låt cellerna vila i ytterligare 96 h i inkubatorn.
- Efter 96 timmar, upprepa steg 2.4 (medieförändring) och låt cellerna vila i ytterligare 24 timmar.
OBS: M0-makrofagerna är nu redo att användas för experiment (figur 2). Omedelbart före behandling av cellerna som en del av ytterligare experiment, överväga en medieförändring med RPMI endast (Table of Materials) eftersom tillväxtmedietillskott kan orsaka interferens med reagenser som tillsätts för cellbehandling. Om M2-liknande makrofager behövs, fortsätt med avsnitt 3.
3. Polarisering av M0-makrofager till M2-liknande makrofager
- Bered en stamlösning av IL-4 och IL-13 (lös 20 μg IL-4 eller IL-13 i 200 μL nukleasfritt vatten) och späd ut det till en slutlig arbetskoncentration på 2 ng/μL med PBS omedelbart före cellbehandling. Håll lösningen på is och använd den omedelbart. Frys inte igen.
- Ta bort tillväxtmediet och ersätt det med 1 ml färskt tillväxtmedium. Tillsätt 20 ng interleukin 4 (IL-4) och 20 ng interleukin 13 (IL-13) per brunn. Låt cellerna vila i 48 timmar i inkubatorn.
- Efter 48 timmar, upprepa steg 3.2. Låt cellerna vila i ytterligare 48 h i inkubatorn.
- Ta bort tillväxtmediet och ersätt det med 1 ml färskt tillväxtmedium. Låt cellerna vila i 48 timmar i inkubatorn.
OBS: M2-liknande makrofager är nu redo att användas för experiment (figur 2). Omedelbart före behandling av cellerna som en del av ytterligare experiment, överväga en medieförändring med RPMI endast (Table of Materials) eftersom tillväxtmedietillskott kan orsaka störningar.
4. Lossning och skörd av makrofager för flödescytometri
OBS: Använd en mekanisk metod som kombinerar kall chockerande och cellskrapning för att lossa och skörda polariserade makrofager från plattor för flödescytometri.
- Ta bort det varma cellmediet och ersätt det med en blandning av iskall PBS (utan kalcium och magnesium) och 5% fetala nötkreatursserum (FBS), 1 ml per brunn. Omedelbart efter detta, placera cellplattan på is i 45 min. Placera inte cellplattan på is innan det varma cellmediet avlägsnas, eftersom detta kommer att minska cellens livskraft avsevärt. Håll cellerna på is först efter att ha framkallat kall chock med iskall PBS/5% FBS-blandning.
- Efter 45 min på is skrapar du av cellerna med minicellsskrapor (Materialförteckning ). Överför försiktigt de fristående makrofagerna i kall PBS/5% FBS till ett 15 ml-rör. Håll röret på is hela tiden tills cellerna är färgade.
OBS: Poola åtta brunnar av celler för att nå tillräckliga cellantal för färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M2-liknande makrofager karakteriserades, och M2-polarisering validerades med hjälp av flödescytometri för cd-markörer (Cluster of Differentiation Markers), CD14, CD11b, CD80 (M1-liknande markör) och CD206 (M2-liknande markör). Flöde cytometri färgning utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Makrofager tvättades med PBS/5% FBS och inkuberades med Fcγ-receptor block för att undvika ospecificerad bindning. Cellerna färgades sedan med FITC-konjugerade musantimänskliga CD14- och CD80-antikroppar, med PE-konjugerade antikroppar mot musen cd11b, och med PE-tandemkonjugerade musantimänska cd206-antikroppar och isotypmatchade IgG (Table of Materials) i 30 min vid 4 °C. Fyra-färg flöde cytometrisk analys och fluorescens kvantifiering utfördes. Gating av celler utfördes, exklusive cellskräp enligt framåtspridning och sidospridning.
Monocyt- och makrofagmarkörerna CD14 och CD11b uttrycktes i 70,9 % respektive 74,7 % av cellerna (figur 3). Cellerna visade nästan ingen positivitet för den M1-liknande markören CD80 (0,2%) och höga ytnivåer för den M2-liknande markören CD206 i 62,6% av cellerna (figur 4).
Makrofager som härletts från polariseringsmetoden som beskrivs i det här protokollet visar uttrycket av CD14 samt CD11b-markörer. Båda markörerna kan men behöver inte uttryckas i makrofager. En tydlig positivitet för CD206 som en M2-liknande makrofagmarkör förväntas, medan cd80-uttrycksnivån som en M1-liknande markör ska vara låg. Raggi et al. visade liknande resultat med perifert blod mononukleära celler (PBMC), som polariserades till M2-liknande makrofager22. Medeluttrycket för CD206 varierade mellan 50%-60%, medan det genomsnittliga uttrycket för CD80 varierade mellan 20%-25%22.
Ytterligare karakterisering av de M2-liknande makrofager som skapats av detta protokoll utfördes med kvantitativ PCR i realtid (qRT-PCR). M2-liknande makrofager visade en uppreglering av IL-6 och C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) jämfört med THP-1 monocytliknande celler, samt en uppreglering av de antiinflammatoriska markörerna CD206, Interleukin 10 (IL-10) och C-C-motivet Chemokine Ligand 18 (CCL18) (resultat som inte visas, som ska publiceras).
Bild 1: Översikt över den M2-liknande makrofatcelllinjemodellen. Dag 0 sås cellerna till plattor med ett tillväxtmedium och inkuberas med PMA i 72 timmar. Dag 3 och dag 7 cellmedium ändras, vilket låter cellerna vila utan PMA i totalt 120 h. Dag 8 ändras tillväxtmediet ännu en gång, och celler inkuberas med IL-4 och IL-13 för att inducera M2-liknande polarisering. Detta steg upprepas efter 2 dagar, på dag 10. På dag 12 utförs den sista medelstora förändringen, och M2-liknande celler vilar i tillväxtmediet i ytterligare 48 timmar innan de används för experiment (PMA = phorbol 12-myristate-13-acetat; IL = interleukin). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Cellmorfologi hos THP-1-celler, differentierade (M0) makrofager och M2-liknande makrofager med lätt mikroskopi. Cellerna såddes vid 3 x 105 per brunn i en 24-brunnsplatta. a,B) THP-1-celler visas vid baslinjen. C,D) De differentierade M0 makrofager fick PMA behandling för 72 h, tillväxt medium förändring och en 96-h-vila period. (E,F) De M2-liknande makrofagerna visas efter avslutad polariseringsbehandling med IL-4 och Il-13 dag 14 i denna cellmodell (20x och 40x förstoring; skala = 100 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Flödescytometrifluorescensanalys för CD14 (FITC, FL1-H) och CD11b (PE, FL2-H). (A) Densitetsspridningsdiagram, procentandelar celler visas i varje kvadrant. B,C) Histogrammen för CD14 och CD11b i M2-liknande makrofager jämfört med en negativ färgningskontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Flödescytometrifluorescensanalys för CD80 (FITC, FL1-H) och CD206 (PE-tandemkonjugat, FL3-H). (A) Densitetsspridningsdiagram, procentandelar celler visas i varje kvadrant. B,C) Histogrammen för CD80 och CD206 i M2-liknande makrofager jämfört med en negativ färgningskontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll om differentiering och polariserande THP-1 monocyt-liknande celler inom 14 dagar ger en metod för att erhålla makrofager med en distinkt M2-liknande fenotyp på grund av lång behandling inkubation av celler med tillräckliga viloperioder mellan steg.
Vissa steg är viktiga för det här protokollet. Fördubblingstiden för THP-1 monocyter är cirka 26 timmar. Cellerna kan delas med en celltäthet på 9 x 105/ml och ska sås med en densitet på 3 x 105/mL under varje delning. Uppdelningen kan utföras utan att ta bort allt använt (gammalt) cellmedium - att återmata cellerna med endast 50% av det färska mediet kan verkligen leda till snabbare celltillväxt eftersom tillväxtfaktorer i konditionerat cellmedium kan förbättra cellulär spridning. Att inte utbyta alla cellmedier ökar dock risken för kulturförorening och bör därför endast utföras under de första passagerna av nykulturerade celler. Att räkna cellerna är viktigt för att kunna odla celler med rätt densitet och för att bestämma cellulär livskraft efter upptining. Andelen döda celler efter upptining av celler bör inte överstiga 15%.
Sådd av celler i plattor kräver en skonsam men noggrann blandning av cellupphängningen för att få en konsekvent celltäthet i varje brunn. Alikvoter bereds innan cellerna sås i odlingsplattor för att säkerställa att volymen på cellinnehållande mediet blandas ordentligt. Eftersom THP-1 monocyter i mediet tenderar att sjunka till botten av en flaska, är den kontinuerliga skonsamma blandningen av överföringsvolym avgörande för att uppnå en konsekvent densitet av celler.
Cellmedier ska alltid värmas upp till 37 °C för att undvika kalla stötar och ett proinflammatoriskt cellulärtstresssvar 23. Därför, även för medieförändringar och cellbehandling, bör plattor inte lämnas utanför inkubatorn i mer än 15 minuter. Dessutom bör respektive föreningar för cellbehandling, såsom PMA, interleukins och PBS för utspädning av stamlösningar före behandling av cellerna, alltid hållas på is för att undvika nedbrytning.
Levande makrofager som skiljer sig från monocyter genom PMA-behandling följer brunnens yta. Vid mediebyten och andra ytterligare behandlingssteg bör pipettspetsarna inte vidröra botten av en brunn i plattan för att förhindra cellskador.
För att utföra flödescytometri med differentierade eller polariserade makrofager måste de celler som är fästa vid plattorna skördas. Det finns antingen enzymatiska eller mekaniska tekniker för att lossa celler, inklusive trypsinisering, behandling med enzymblandningar med proteolytisk och kollagenolytisk aktivitet, eller etylendiamintetraacetsyra (EDTA), kall chock, cellskrapning eller till och med lösgöring genomakustiskt tryck 24,25. Enzymatisk lösgöring av makrofager kan leda till förändrad cellyta markör uttryck och är därför inte förstahandsvalet för fenotypiska eller funktionella analyser25. I motsats till andra rapporter visade de experiment som utfördes här att kombinationen av kall chockerande och skrapa bort makrofager visade god cell livskraft (>90%) med trypan blå färg exkludering. Därför rekommenderas att använda denna teknik för att lossa cellerna, med anteckningen att när en kall chock induceras måste cellerna alltid hållas kalla på is.
En begränsning av detta protokoll är användningen av en monocytliknande cellinje som grund för att efterlikna makrofagmekanismer in vivo. Cellkulturstudier med primära makrofager kan dock visa variabla cellulära svar och mekanismer kan maskeras på grund av cell heterogenitet26. THP-1-cellinjen är ett etablerat modellsystem för primära mänskliga monocyter9. På grund av den homogena THP-1-cellpopulationen i en kontrollerad kulturinställning är cellulära svar potentiellt mer exakt reproducerbara. Dessutom optimerar vissa tekniker THP-1-celler som en modell för att likna primära monocyter. Ett viktigt steg är viloperioden 5 dagar efter PMA-behandlingen, vilket ökar cytoplasmatisk volym och cellytans vidhäftning som liknar den för differentierade monocyt-härledda celler21.
En annan begränsning är skapandet av en viss M2-liknande makrofag fenotyp som har andra egenskaper än M2-liknande makrofager som användes i tidigare studier. Många olika tekniker för att differentiera och polarisera THP-1-celler har rapporterats, och brist på baslinjekarakterisering komplicerar interstudy reproducerbarhet11,12,13,14. Därför är det viktigt att karakterisera de makrofager som används i en studie vid baslinjen, beroende på vilka mekanismer som undersöks. Därefter ska de cellulära svaren efter en respektive behandling påvisas.
De M2-liknande makrofager som produceras genom att följa detta protokoll är en solid grund för undersökning av cellulära svar i tumör intag och progression i olika typer av cancer, sårläkning eller fibros. Med detta protokoll kan antingen M0-makrofager eller M2-makrofager användas in vitro, och cellerna är lämpliga att användas i kokulturmodeller. Detta ger ett brett utbud av applikationer av en distinkt M2-liknande makrofag fenotyp som är robust kontrollerad in vitro över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, stöds ekonomiskt av John W. Price och Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskällorna hade ingen roll i studiens utformning och genomförande samt i insamling, förvaltning, analys och tolkning av uppgifterna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
