Summary
M2-lignende tumor-associerede makrofager (TAM) er forbundet med tumor progression og dårlig prognose i kræft. Denne protokol fungerer som en detaljeret guide til reproducerer differentiere og polarisere THP-1 monocyt-lignende celler i M2-lignende makrofager inden for 14 dage. Denne model er grundlaget for at undersøge de antiinflammatoriske virkninger af TAM inden for tumormikromiljøet.
Abstract
Tumor-associerede makrofager (TAM) kan skifte deres udtryk og cytokin profil i henhold til eksterne stimuli. Denne bemærkelsesværdige plasticitet gør det muligt for TAM at tilpasse sig løbende ændringer inden for tumor mikromiljø. Makrofager kan have enten primært pro-inflammatoriske (M1-lignende) eller antiinflammatoriske (M2-lignende) attributter og kan løbende skifte mellem disse to hovedstater. M2-lignende makrofager inden for tumormiljøet er forbundet med kræft progression og dårlig prognose i flere typer af kræft. Mange forskellige metoder til at fremkalde differentiering og polarisering af THP-1 celler bruges til at undersøge cellulære og intercellulære mekanismer og virkningerne af TAM inden for mikromiljøet af tumorer. I øjeblikket er der ingen etableret model for M2-lignende makrofag polarisering ved hjælp af THP-1 celle linje, og resultaterne af udtryk og cytokin profiler af makrofager på grund af visse in vitro stimuli varierer mellem undersøgelser. Denne protokol tjener som detaljeret vejledning til at differentiere THP-1 monocyt-lignende celler i M0 makrofager og yderligere polarisere celler i en M2-lignende fænotype inden for 14 dage. Vi demonstrerer de morfologiske ændringer af THP-1 monocyt-lignende celler, differentierede makrofager og polariserede M2-lignende makrofager ved hjælp af lysmikroskopi. Denne model er grundlaget for cellelinjemodeller, der undersøger de antiinflammatoriske virkninger af TAM og deres interaktioner med andre cellepopulationer af tumormikromiljøet.
Introduction
Tumor-associerede makrofager (TAM) og deres rolle i kronisk inflammation, udbrud af kræft, og tumor udvikling er vigtige mål i nyere forskning1,2. Perifere blodmonocytter, der rekrutteres til vævsmikromiljøet af den udviklende tumor, differentieres til makrofager og kan polariseres i to hovedundertyper afmakrofager 3. Den klassisk aktiverede makrofag repræsenterer den primært proinflammatoriske M1-lignende fænotype, og den alternativt aktiverede M2-lignende undertype viser overvejende antiinflammatoriske egenskaber4. Makrofager kan skifte dynamisk mellem disse to vigtigste fænotyper afhængigt af deres cellulære metabolisme, med mellemliggende undertyper, der har både inflammatoriske og antiinflammatoriske egenskaber5. TAM repræsenterer en heterogen population af begge fænotyper. En tumorfremmende funktion og dårlig prognose i forskellige typer kræftformer er dog især forbundet med M2-lignendemakrofager 6,7,8.
De funktionelle profiler af makrofager og deres interaktion med andre celler i tumormikromiljøet er komplekse og udfordrende at fange i et konstant skiftende miljø under løbende tumorudvikling. Cellelinjer kan give en homogen cellepopulation med stabil levedygtighed i kulturen, hvilket kan lette processen med at demonstrere definerede cellulære og intercellulære mekanismer. Den monocyt-lignende THP-1 celle linje er en legitim model system for primære menneskelige monocytter9. Denne spontant udødeliggjorte cellelinje er opnået fra det perifere blod fra et etårigt spædbarn med akut monocytisk leukæmi9,10. Differentiering og polarisering af BP-1-celler er blevet rapporteret af flere undersøgelser og er blevet udført på flere forskellige måder11,12,13,14. Aktivering og dermed polarisering af makrofager i en M1-lignende fænotype efterfølges af en kompenserende antiinflammatorisk rebound-mekanisme, der fremmer en M2-lignende fænotype gennem cytokiner produceret af inflammatoriske makrofager, såsom interleukin 6 (IL-6) eller itaconate15,16. Dette kan tjene som en pause mekanisme til at dæmpe en overskridelse inflammatorisk respons efter celle aktivering17. Processen med at differentiere og polarisere monocytter og THP-1 monocyt-lignende celler i en antiinflammatorisk M2-lignende fænotype ledsages også af proinflammatoriske stimuli, der skal overvindes. En inflammatorisk cytokin respons kan være forårsaget af mekanisk stress18, såsom at ændre medier til at refeede cellerne, eller tilføje kemiske forbindelser til at differentiere THP-1 celler, såsom phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), og fremkalde produktion af tumornekrose faktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-619. Denne ændrede cytokinudtryksprofil som svar på PMA kan påvirke og forhindre efterfølgende makrofagspolarisering20. Passende hvileperioder, som rapporteret før efter PMA-behandling, tillader disse inflammatoriske reaktioner at falde og lette celle polarisering i en særskilt M2-lignende fænotype21.
Denne protokol demonstrerer en metode til at differentiere og polarisere THP-1 monocyt-lignende celler i en M2-lignende fænotype af makrofager inden for 14 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: En oversigt over de trin, der er beskrevet i denne protokol, vises i figur 1. Den menneskelige monocyt-lignende leukæmi celle linje THP-1 blev købt. Kort tandem gentagen analyse blev udført for at godkende THP-1 cellelinjen. Udfør alle trin under sterile forhold. THP-1 monocytisk cellelinje vokser i suspension og tillægger ikke cellekulturoverflader. Tilslutning kan fremkaldes ved at differentiere monocytter i makrofaglignende celler gennem f.eks. mekanisk stress eller specifik behandling med PMA.
1. Dyrkning og vedligeholdelse af BP-1 monocyt-lignende celler
- Indstil en timer til 150 s. Fjern det frosne hætteglas, der indeholder THP-1-cellelinjen (Materialetabel), fra det flydende nitrogen, og optø det straks i et rent vandbad (37 °C). Start timeren, så snart hætteglasset er sat i vandbadet. Løsn hætten for at frigøre det tryk, der opbygges på grund af optøningsprocessen, men sørg for, at røråbningen ikke kommer i kontakt med vandet for at undgå forurening. Den optimale tidsperiode for optøning af cellerne ligger mellem 120-150 s. Fortsæt optøning af celleaffjedringen, indtil en ischip på størrelse med ca. 4 mm er tilbage i hætteglasset; fortsæt derefter til næste trin med det samme.
- Celleaffjedringens væskefase overføres til et 15 mL rør, der indeholder 9 mL varme (37 °C) vækstmedier (Materialetabel). Overfør derefter 1 mL af den varme mellemcelleophæng til THP-1-hætteglasset og tilbage i 15 mL-røret for at smelte den resterende ischip og skylle hætteglasset for at sikre, at ingen celler efterlades.
- Bland affjedringen forsigtigt ved at pipetter op og ned med en 1000 μL pipette. Fjern en lille prøve (ca. 10 μL) for at tælle cellerne for levedygtighed (ved hjælp af trypanblå til udelukkelse), mens de spindes. Skru ned for den varme celleaffjedring ved 200 x g i 7 min ved 37 °C.
- Fjern supernatanten helt og genbrug med en vis mængde varmt vækstmedium for at opnå en celletæthed på 5 x 105/mL. Affjedringen blandes forsigtigt, og der overføres 22 mL volumen til T-75-cellekulturflasker (Materialetabel). Kolber opbevares oprejst i en inkubator ved 37 °C med 5 % kuldioxid (CO2)koncentration. Børst vækstmedierne hver 3-4. dag.
2. Såning af THP-1 celler og differentiering i M0 makrofager
- Indbered den celle, der indeholder vækstmedium, med den respektive celletæthed til frøceller ved en massefylde på 3 x 105/mL/godt ind i 24-brønds cellekulturplader (Materialetabel). Bland mediet forsigtigt og forberede aliquots på 26 mL, hver sat i en 50 mL rør. Brug hver 26 mL aliquot til såning af cellerne i en respektive plade.
- Overfør 1 mL af det celleholdige medium til hver brønd af en 24-brønds plade. Bland mediet forsigtigt ved at pipetter op og ned mellem overførsler.
- Der fremstilles en bestandsopløsning af PMA (opløs 1 mg PMA i 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) = ~16 mM opløsning af PMA i DMSO) og fortynd den med kold fosfat buffered saltvand (PBS) til en endelig arbejdskoncentration på 10 ng/μL lige før cellebehandling (Materialetabel). Hold opløsningen på is og brug den med det samme. Du må ikke fryse igen. Tilsæt 100 ng PMA pr. Brønd. Lad hver celleplade sidde i inkubatoren uden yderligere behandling i 72 timer.
- Efter 72 timer skal vækstmediet fjernes og erstattes med 1 mL frisk vækstmedium. Rør ikke bunden af brøndene med pipettespidser. Lad cellerne hvile i yderligere 96 timer i inkubatoren.
- Efter 96 timer gentages trin 2.4 (medieskift) og lader cellerne hvile i yderligere 24 timer.
BEMÆRK: Makrofagerne M0 er nu klar til at blive brugt til forsøg (Figur 2). Umiddelbart før behandling af cellerne som en del af yderligere eksperimenter, overveje en medieændring med RPMI kun (Tabel over materialer), da vækst medier kosttilskud kan forårsage interferens med reagenser, der tilføjes til cellebehandling. Hvis der er behov for M2-lignende makrofager, skal du fortsætte med afsnit 3.
3. Polarisering af M0 makrofager i M2-lignende makrofager
- Opløsningen af IL-4 og IL-13 (opløs 20 μg IL-4 eller IL-13 i 200 μL nucleasefrit vand) opløses, og det fortyndes til en endelig arbejdskoncentration på 2 ng/μL med PBS umiddelbart før cellebehandlingen. Hold opløsningen på is og brug den med det samme. Du må ikke fryse igen.
- Fjern vækstmediet og udskift det med 1 mL frisk vækstmedium. Tilsæt 20 ng interleukin 4 (IL-4) og 20 ng interleukin 13 (IL-13) pr. Brønd. Lad cellerne hvile i 48 timer i inkubatoren.
- Efter 48 timer gentages trin 3.2. Lad cellerne hvile i yderligere 48 timer i inkubatoren.
- Fjern vækstmediet og udskift det med 1 mL frisk vækstmedium. Lad cellerne hvile i 48 timer i inkubatoren.
BEMÆRK: M2-lignende makrofager er nu klar til at blive brugt til forsøg (Figur 2). Umiddelbart før behandling af cellerne som en del af yderligere eksperimenter, overveje en medieændring med RPMI kun (Tabel over materialer), da vækst medier kosttilskud kan forårsage interferens.
4. Løsrivning og høst makrofager for flowcytometri
BEMÆRK: Brug en mekanisk metode, der kombinerer kold chokerende og celleskrabning, til at løsne og høste de polariserede makrofager fra plader til flowcytometri.
- Fjern det varme cellemedium og udskift det med en blanding af iskold PBS (uden calcium og magnesium) og 5% fosterkvægsserum (FBS), 1 mL pr. Brønd. Umiddelbart efter dette skal cellepladen placeres på is i 45 minutter. Placer ikke cellepladen på is, før det varme cellemedie fjernes, da dette vil reducere celleens levedygtighed betydeligt. Opbevar først cellerne på is efter at have fremkaldt kuldechok med iskold PBS/5% FBS-blanding.
- Efter 45 min på is, skrabe cellerne ved hjælp af mini celle skrabere (Tabel over materialer). Overfør forsigtigt de fritliggende makrofager i kold PBS/5% FBS til et 15 mL rør. Hold røret på is på alle tidspunkter, indtil cellerne er farves.
BEMÆRK: Pool otte brønde af celler for at nå passende celletal til farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M2-lignende makrofager blev karakteriseret, og M2-polarisering blev valideret ved hjælp af flowcytometri til Cluster of Differentiering markører (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-lignende markør), og CD206 (M2-lignende markør). Flowcytometrifarvning blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Makrofager blev vasket med PBS/5% FBS og inkuberet med Fcγ-receptor blok for at undgå uspecifik binding. Cellerne blev derefter plettet med FITC-konjugerede museanti-humane CD14- og CD80-antistoffer, med PE-konjugerede museanti-humane CD11b antistoffer og med PE-tandem-konjugerede museanti-humane CD206 antistoffer og isotypematchede IgG (Materials tabel) i 30 min ved 4 °C. Fire-farve flow cytometrisk analyse og fluorescens kvantitet blev udført. Gating af celler blev udført, undtagen cellerester i henhold til fremad scatter og side scatter.
Monocyt- og makrofagsmarkørerne CD14 og CD11b blev udtrykt i henholdsvis 70,9 % og 74,7 % af cellerne (figur 3). Celler viste næsten ingen positivitet for den M1-lignende markør CD80 (0,2%) og høje overfladeniveauer af den M2-lignende markør CD206 i 62,6% af cellerne (Figur 4).
De makrofager, der er afledt af den polariseringsmetode, der er beskrevet i denne protokol, viser udtrykket af CD14- og CD11b-markører. Begge markører kan, men behøver ikke at udtrykke sig i makrofager. Der forventes en klar positivitet for CD206 som M2-lignende makrofagsmarkør, mens niveauet for CD80-udtryk som en M1-lignende markør skal være lavt. Raggi et al. demonstrerede lignende resultater ved hjælp af perifere blodmonnukleare celler (PBMC), der blev polariseret i M2-lignendemakrofager 22. Det gennemsnitlige udtryk for CD206 varierede mellem 50%-60 %, mens det gennemsnitlige udtryk for CD80 varierede mellem 20%-25 %22.
Yderligere karakterisering af de M2-lignende makrofager, der blev oprettet af denne protokol, blev udført ved hjælp af kvantitativ pcr i realtid (qRT-PCR). M2-lignende makrofager viste en upregulation af IL-6 og C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) i forhold til THP-1 monocyt-lignende celler, samt en upregulering af antiinflammatoriske markører CD206, Interleukin 10 (IL-10) og C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (resultater ikke vist, der skal offentliggøres).
Figur 1: Oversigt over den M2-lignende makrofagcellelinjemodel. På dag 0 sås cellerne i plader med et vækstmedium og inkuberes med PMA i 72 timer. På dag 3 og dag ændres 7 cellemediet, hvilket lader cellerne hvile uden PMA i alt 120 timer. På dag 8 ændres vækstmediet igen, og cellerne inkuberes med IL-4 og IL-13 for at fremkalde M2-lignende polarisering. Dette trin gentages efter 2 dage, på dag 10. På dag 12 udføres den sidste medium ændring, og M2-lignende celler hviler i vækstmediet i yderligere 48 timer, før de bruges til eksperimenter (PMA = phorbol 12-myristate-13-acetat; IL = interleukin). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cellemorfologi af THP-1-celler, differentierede (M0) makrofager og M2-lignende makrofager ved hjælp af lysmikroskopi. Celler blev seedet ved 3 x 105 pr. brønd i en 24-brønds plade. (A,B) TP-1-celler vises ved baseline. (C,D) De differentierede M0 makrofager fik PMA-behandling i 72 timer, vækstmediumskift og en hvileperiode på 96 timer. (E,F) De M2-lignende makrofager vises efter afsluttet polariseringsbehandling med IL-4 og Il-13 på dag 14 i denne cellemodel (20x og 40x forstørrelse; skala = 100 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flowcytometri fluorescensanalyse for CD14 (FITC, FL1-H) og CD11b (PE, FL2-H). (A) Massefyldestr observationsplot, procentdele af celler vises i hver kvadrant. (B,C) Histogrammerne til CD14 og CD11b i M2-lignende makrofager sammenlignet med en negativ farvningskontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Flowcytometri fluorescensanalyse for CD80 (FITC, FL1-H) og CD206 (PE-tandem konjugat, FL3-H). (A) Massefylde scatter plot, procentdele af celler er vist i hver kvadrant. (B,C) Histogrammerne til CD80 og CD206 i M2-lignende makrofager sammenlignet med en negativ farvningskontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol om differentiering og polarisering AF THP-1 monocytlignende celler inden for 14 dage giver en metode til at opnå makrofager med en særskilt M2-lignende fænotype på grund af lang behandling inkubation af celler med passende hvileperioder mellem trin.
Visse trin er vigtige for denne protokol. Fordoblingstiden for THP-1 monocytter er ca. 26 timer. Celler kan opdeles ved en celletæthed på 9 x 105/mL og skal sås med en massefylde på 3 x 105/mL under hver opdeling. Opdelingen kan udføres uden at fjerne alle de brugte (gamle) cellemedium - genfeeding af cellerne med kun 50% af det friske medium kan faktisk føre til hurtigere cellevækst, fordi vækstfaktorer i konditioneret cellemedium kan øge cellulær spredning. Hvis man ikke udveksler alle cellemedierne, øges risikoen for kulturforurening dog og bør derfor kun udføres under de første passager af nykulturerede celler. Tælle cellerne er vigtigt at være i stand til at kultur celler på den rigtige tæthed og til at bestemme den cellulære levedygtighed efter optøning. Andelen af døde celler efter optøning af celler korrekt bør ikke overstige 15%.
Såning af celler i plader kræver blid, men grundig blanding af celleaffjedringen for at opnå en ensartet celletæthed i hver brønd. Aliquots fremstilles, før de sår cellerne i kulturplader for at sikre, at mængden af det celleholdige medium blandes korrekt. Da THP-1 monocytter i mediet har tendens til at synke til bunden af et hætteglas, er den kontinuerlige blide blanding af overførselsvolumen afgørende for at opnå en ensartet tæthed af celler.
Cellemedierne skal til enhver tid opvarmes til 37 °C for at undgå kuldechok og et proinflammatorisk cellulært stressrespons23. Derfor bør plader ikke udelades i mere end 15 minutter også for medieændringer og cellebehandling. Desuden bør de respektive forbindelser til cellebehandling, såsom PMA, interleukins og PBS til fortynding af lageropløsninger før behandling af cellerne, altid opbevares på is for at undgå nedbrydning.
Levende makrofager, der adskiller sig fra monocytter ved PMA-behandling, klæber til brøndenes overflade. Under medieændringer og andre yderligere behandlingstrin bør pipettespidser ikke røre bunden af en brønd i pladen for at forhindre celleskader.
Ved udførelse af flowcytometri med differentierede eller polariserede makrofager skal de celler, der er fastgjort til pladerne, høstes. Der er enten enzymatiske eller mekaniske teknikker til at løsne celler, herunder trypsinisering, behandling med enzymblandinger med proteolytisk og kollagennolytisk aktivitet eller ethylendiamintetraacesyre (EDTA), koldt stød, celleskrabning eller endda løsrivelse gennem akustisk tryk24,25. Enzymatisk løsrivelse af makrofager kan føre til ændret celleoverflademarkørudtryk og er derfor ikke det første valg til fænotypiske eller funktionelle analyser25. I modsætning til andre rapporter viste de eksperimenter, der blev udført her, at kombinationen af kulde chokerende og skrabning af makrofager viste god celle levedygtighed (>90%) ved hjælp af Trypan Blue farvestof udelukkelse. Derfor anbefales det at bruge denne teknik til at løsne cellerne, med anmærkningen om, at når et koldt chok er induceret, skal cellerne til enhver tid holdes kolde på is.
En begrænsning af denne protokol er brugen af en monocyt-lignende cellelinje som grundlag for at efterligne makrofagsmekanismer in vivo. Cellekulturstudier ved hjælp af primære makrofager kan dog vise variable cellulære reaktioner, og mekanismer kan maskeres på grund af celle heterogenitet26. THP-1 cellelinjen er et etableret modelsystem til primære menneskelige monocytter9. På grund af den homogene THP-1 cellepopulation i en kontrolleret kulturindstilling er cellulære reaktioner potentielt mere præcist reproducerbare. Desuden optimerer visse teknikker THP-1-celler som en model, der ligner primære monocytter. Et vigtigt skridt er hvileperioden på 5 dage efter PMA-behandling, hvilket øger cytoplasmatisk volumen og celleoverfladeafdækning svarende til den differentierede monocyt-afledte celler21.
En anden begrænsning er oprettelsen af en bestemt M2-lignende makrofag fænotype, der har andre egenskaber end M2-lignende makrofager, der blev brugt i tidligere undersøgelser. Mange forskellige teknikker til at differentiere og polarisere THP-1-celler er blevet rapporteret, og en mangel på baseline karakterisering komplicerer interstudy reproducerbarhed11,12,13,14. Derfor er det vigtigt at karakterisere de makrofager, der bruges i en undersøgelse ved baseline, afhængigt af de mekanismer, der undersøges. Derefter skal de cellulære reaktioner efter en respektive behandling påvises.
De M2-lignende makrofager produceret ved at følge denne protokol er et solidt grundlag for undersøgelsen af cellulære reaktioner i tumor debut og progression i forskellige typer af kræft, sårheling, eller fibrose. Med denne protokol kan enten M0-makrofager eller M2-makrofager bruges in vitro, og cellerne er velegnede til at blive brugt i coculture modeller. Dette giver en bred vifte af anvendelser af en særskilt M2-lignende makrofag fænotype, der er robust kontrolleret in vitro over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, er økonomisk støttet af John W. Price og Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskilderne havde ingen rolle i udformningen og gennemførelsen af undersøgelsen samt i indsamlingen, ledelsen, analysen og fortolkningen af dataene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
