Summary
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.
Abstract
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden cambiar su expresión y perfil de citoquinas de acuerdo con los estímulos externos. Esta notable plasticidad permite a TAM adaptarse a los cambios en curso dentro del microambiente tumoral. Los macrófagos pueden tener principalmente atributos proinflamatorios (similares a M1) o antiinflamatorios (similares a M2) y pueden cambiar continuamente entre estos dos estados principales. Los macrófagos similares a M2 dentro del entorno tumoral se asocian con la progresión del cáncer y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Se utilizan muchos métodos diferentes para inducir la diferenciación y polarización de las células THP-1 para investigar los mecanismos celulares e intercelulares y los efectos de TAM dentro del microambiente de los tumores. Actualmente, no existe un modelo establecido para la polarización de macrófagos similares a M2 utilizando la línea celular THP-1, y los resultados de la expresión y los perfiles de citoquinas de los macrófagos debido a ciertos estímulos in vitro varían entre los estudios. Este protocolo sirve como guía detallada para diferenciar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos M0 y para polarizar aún más las células en un fenotipo similar a M2 dentro de los 14 días. Demostramos los cambios morfológicos de células similares a monocitos THP-1, macrófagos diferenciados y macrófagos polarizados similares a M2 utilizando microscopía de luz. Este modelo es la base para los modelos de línea celular que investigan los efectos antiinflamatorios de TAM y sus interacciones con otras poblaciones celulares del microambiente tumoral.
Introduction
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la inflamación crónica, la aparición del cáncer y el desarrollo de tumores son objetivos importantes en investigaciones recientes1,2. Los monocitos de sangre periférica que se reclutan en el microambiente tisular del tumor en desarrollo se diferencian en macrófagos y pueden polarizarse en dos subtipos principales de macrófagos3. El macrófago activado clásicamente representa el fenotipo M1 principalmente proinflamatorio y el subtipo similar a M2 activado alternativamente muestra características predominantemente antiinflamatorias4. Los macrófagos pueden cambiar dinámicamente entre estos dos fenotipos principales dependiendo de su metabolismo celular, con subtipos intermedios que tienen atributos inflamatorios y antiinflamatorios5. TAM representa una población heterogénea de ambos fenotipos. Sin embargo, una función promotora de tumores y un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer se asocian particularmente con macrófagos similares a M26,7,8.
Los perfiles funcionales de los macrófagos y su interacción con otras células dentro del microambiente tumoral son complejos y difíciles de capturar en un entorno en constante cambio durante el desarrollo continuo del tumor. Las líneas celulares pueden proporcionar una población celular homogénea con viabilidad estable en cultivo, lo que puede facilitar el proceso de demostración de mecanismos celulares e intercelulares definidos. La línea celular THP-1 similar a un monocitos es un sistema modelo legítimo para monocitos humanos primarios9. Esta línea celular inmortalizada espontáneamente se ha obtenido de la sangre periférica de un lactante de un año con leucemia monocítica aguda9,10. La diferenciación y polarización de las células THP-1 han sido reportadas por varios estudios y se han realizado de múltiples maneras diferentes11,12,13,14. La activación y, por tanto, la polarización de los macrófagos en un fenotipo tipo M1 es seguida por un mecanismo de rebote antiinflamatorio compensatorio, promoviendo un fenotipo tipo M2 a través de citoquinas producidas por macrófagos inflamatorios, como la interleucina 6 (IL-6) o el itaconato15,16. Esto podría servir como un mecanismo de ruptura para atenuar una respuesta inflamatoria excesiva después de la activación celular17. El proceso de diferenciar y polarizar monocitos y células similares a monocitos THP-1 en un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 también se acompaña de estímulos proinflamatorios que deben superarse. Una respuesta inflamatoria de citoquinas puede ser causada por estrés mecánico18,como cambiar los medios para realimentar las células, o agregar compuestos químicos para diferenciar las células THP-1, como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e inducir la producción de factor de necrosis tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) o IL-619. Este perfil alterado de expresión de citoquinas como respuesta a la PMA puede afectar y prevenir la polarización posterior de los macrófagos20. Los períodos de descanso adecuados, como se informó antes después del tratamiento con PMA, permiten que estas respuestas inflamatorias disminuyan y faciliten la polarización celular en un fenotipo 21 distinto similar aM2.
Este protocolo demuestra un método para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en un fenotipo de macrófagos similar a M2 en un plazo de 14 días.
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Protocol
Nota : una descripción general de los pasos descritos en este protocolo se muestra en la figura 1. Se compró la línea celular de leucemia similar a monocitos humanos THP-1. Se realizó un breve análisis de repetición en tándem para autenticar la línea celular THP-1. Realice todos los pasos en condiciones estériles. La línea celular monocítica THP-1 crece en suspensión y no se adhiere a las superficies de cultivo celular. La adherencia se puede inducir diferenciando los monocitos en células similares a los macrófagos a través de, por ejemplo, estrés mecánico o tratamiento específico conPMA.
1. Cultivo y mantenimiento de células similares a monocitos THP-1
- Establezca un temporizador para 150 s. Retire el vial congelado que contiene la línea celular THP-1(Tabla de materiales)del nitrógeno líquido y descongele inmediatamente en un baño de agua limpia (37 °C). Inicie el temporizador tan pronto como el vial se coloque en el baño de agua. Afloje la tapa para liberar la presión que se está acumulando debido al proceso de descongelación, pero asegúrese de que la abertura del tubo no entre en contacto con el agua, para evitar la contaminación. El período de tiempo óptimo para descongelar las células se encuentra entre 120-150 s. Continúe descongelando la suspensión celular hasta que quede una viruta de hielo del tamaño de aproximadamente 4 mm dentro del vial; luego, continúe con el siguiente paso inmediatamente.
- Transfiera la fase líquida de la suspensión celular a un tubo de 15 ml que contenga 9 ml de medios de crecimiento calientes (37 °C) (Tabla de materiales). Luego, transfiera 1 ml de la suspensión de células medias calientes al vial de THP-1 y vuelva al tubo de 15 ml para derretir la viruta de hielo restante y enjuague el vial para asegurarse de que no queden células.
- Mezcle la suspensión suavemente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 μL. Retire una muestra pequeña (aproximadamente 10 μL) para contar la viabilidad de las células (usando azul tripano para la exclusión) mientras se hilan. Gire hacia abajo la suspensión de celda caliente a 200 x g durante 7 min a 37 °C.
- Retire el sobrenadante por completo y vuelva a sususpend con un cierto volumen de medio de crecimiento caliente para lograr una densidad celular de 5 x 105/ ml. Mezclar la suspensión suavemente y transferir 22 ml de volumen a matraces de cultivo celular T-75 (Tabla de materiales). Guarde los matraces en posición vertical en una incubadora a 37 °C con una concentración de dióxido de carbono (CO2) del 5%. Intercambie los medios de crecimiento cada 3-4 días.
2. Siembra de células THP-1 y diferenciación en macrófagos M0
- Preparar la célula que contiene el medio de crecimiento con la densidad celular respectiva para sembrar células a una densidad de 3 x 105/mL/pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos (Tabla de Materiales). Mezclar el medio suavemente y preparar alícuotas de 26 mL, cada una puesta en un tubo de 50 mL. Use cada alícuota de 26 ml para sembrar las células en una placa respectiva.
- Transfiera 1 ml del medio que contiene la célula a cada pozo de una placa de 24 pozos. Mezcle los medios suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo entre transferencias.
- Preparar una solución madre de PMA (disolver 1 mg de PMA en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) = ~ 16 mM de solución de PMA en DMSO) y diluirla con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) a una concentración final de trabajo de 10 ng / μL justo antes del tratamiento celular (Tabla de materiales). Mantenga la solución en hielo y úselo inmediatamente. No vuelva a congelar. Agregue 100 ng de PMA por pozo. Deje que cada placa celular se asiente en la incubadora sin ningún tratamiento adicional durante 72 h.
- Después de 72 h, retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. No toque el fondo de los pozos con puntas de pipeta. Deje reposar las células durante otras 96 h en la incubadora.
- Después de 96 h, repita el paso 2.4 (cambio de medios) y deje que las células descansen durante otras 24 h.
NOTA: Los macrófagos M0 ya están listos para ser utilizados en experimentos (Figura 2). Inmediatamente antes de tratar las células como parte de experimentos adicionales, considere un cambio de medios solo con RPMI(Tabla de materiales)ya que los suplementos de medios de crecimiento pueden causar interferencia con los reactivos que se agregan para el tratamiento celular. En caso de que se necesiten macrófagos similares a M2, continúe con la sección 3.
3. Polarización de macrófagos M0 en macrófagos similares a M2
- Preparar una solución madre de IL-4 e IL-13 (disolver 20 μg de IL-4 o IL-13 en 200 μL de agua libre de nucleasa) y diluirla a una concentración final de trabajo de 2 ng/μL con PBS inmediatamente antes del tratamiento celular. Mantenga la solución en hielo y úselo inmediatamente. No vuelva a congelar.
- Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. Añadir 20 ng de interleucina 4 (IL-4) y 20 ng de interleucina 13 (IL-13) por pozo. Deje reposar las células durante 48 h en la incubadora.
- Después de 48 h, repita el paso 3.2. Deje reposar las células durante otras 48 h en la incubadora.
- Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. Deje reposar las células durante 48 h en la incubadora.
NOTA: Los macrófagos similares a M2 ahora están listos para ser utilizados en experimentos (Figura 2). Inmediatamente antes de tratar las células como parte de experimentos adicionales, considere un cambio de medios solo con RPMI(Tabla de materiales)ya que los suplementos de medios de crecimiento pueden causar interferencias.
4. Desprendimiento y recolección de macrófagos para citometría de flujo
NOTA: Utilice un método mecánico que combine el choque en frío y el raspado celular para separar y cosechar los macrófagos polarizados de las placas para la citometría de flujo.
- Retire el medio de células calientes y reemplácelo con una mezcla de PBS helado (sin calcio y magnesio) y suero bovino fetal (FBS) al 5%, 1 ml por pozo. Inmediatamente después de esto, coloque la placa celular sobre hielo durante 45 minutos. No coloque la placa celular sobre hielo antes de que se retire el medio celular caliente, ya que esto disminuirá significativamente la viabilidad celular. Mantenga las células en hielo solo después de inducir el choque frío con la mezcla de PBS / FBS al 5% helada.
- Después de 45 minutos en hielo, raspe las celdas usando mini raspadores de celdas(Tabla de Materiales). Transfiera suavemente los macrófagos desprendidos en PBS frío / 5% FBS en un tubo de 15 ml. Mantenga el tubo en hielo en todo momento hasta que las células se tiñen.
NOTA: Auna ocho pozos de células para alcanzar recuentos celulares adecuados para la tinción.
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Representative Results
Se caracterizaron macrófagos similares a M2 y se validó la polarización M2 mediante citometría de flujo para marcadores de grupo de diferenciación (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcador similar a M1) y CD206 (marcador similar a M2). La tinción por citometría de flujo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los macrófagos se lavaron con PBS/5% FBS y se incubaron con el bloqueo del receptor Fcγ para evitar la unión inespecífica. Las células se tiñeron con anticuerpos CD14 y CD80 antihumanos conjugados con FITC, con anticuerpos CD11b antihumanos de ratón conjugados con PE y con anticuerpos CD206 antihumanos conjugados con ratón en tándem y anticuerpos IgG(Tabla de materiales)emparejados con isotipos durante 30 min a 4 °C. Se realizó análisis citométricos de flujo de cuatro colores y cuantificación de fluorescencia. Se llevó a cabo la gating de las células, excluyendo los restos celulares de acuerdo con la dispersión hacia adelante y la dispersión lateral.
Los marcadores de monocitos y macrófagos CD14 y CD11b se expresaron en el 70,9% y 74,7% de las células, respectivamente (Figura 3). Las células casi no mostraron positividad para el marcador similar a M1 CD80 (0,2%) y altos niveles superficiales del marcador similar a M2 CD206 en el 62,6% de las células(Figura 4).
Los macrófagos derivados del método de polarización descrito en este protocolo muestran la expresión de los marcadores CD14 y CD11b. Ambos marcadores pueden, pero no tienen que ser expresados en macrófagos. Se espera una positividad clara para CD206 como un marcador de macrófagos similar a M2, mientras que el nivel de expresión de CD80 como un marcador similar a M1 debe ser bajo. Raggi et al. demostraron resultados similares utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que se polarizaron en macrófagos similares a M222. La expresión media de CD206 varió entre 50%-60%, mientras que la expresión media de CD80 varió entre 20%-25%22.
La caracterización adicional de los macrófagos similares a M2 creados por este protocolo se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los macrófagos similares a M2 mostraron una regulación al alza de IL-6 y C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) en comparación con las células similares a monocitos THP-1, así como una regulación al alza de los marcadores antiinflamatorios CD206, Interleucina 10 (IL-10) y C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (los resultados no se muestran, se publicarán).
Figura 1: Descripción general del modelo de línea celular de macrófagos tipo M2. El día 0, las células se siembran en placas con un medio de crecimiento y se incuban con PMA durante 72 h. El día 3 y el día 7 se cambia el medio celular, lo que permite que las células descansen sin PMA durante un total de 120 h. En el día 8, el medio de crecimiento se cambia una vez más, y las células se incuban con IL-4 e IL-13 para inducir una polarización similar a M2. Este paso se repite después de 2 días, el día 10. El día 12, se realiza el último cambio de medio, y las células similares a M2 descansan en el medio de crecimiento durante otras 48 h antes de ser utilizadas para experimentos (PMA = forbol 12-miristato-13-acetato; IL = interleucina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología celular de células THP-1, macrófagos diferenciados (M0) y macrófagos similares a M2 mediante microscopía de luz. Las células se sembraron a 3 x 105 por pozo en una placa de 24 pozos. (A,B) Las células THP-1 se muestran al inicio del estudio. (C,D) Los macrófagos M0 diferenciados recibieron tratamiento con PMA durante 72 h, cambio de medio de crecimiento y un período de reposo de 96 h. (E,F) Los macrófagos similares a M2 se muestran después de completar el tratamiento de polarización con IL-4 e Il-13 en el día 14 de este modelo celular (aumento de 20x y 40x; escala = 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de fluorescencia de citometría de flujo para CD14 (FITC, FL1-H) y CD11b (PE, FL2-H). (A) Diagrama de dispersión de densidad, se muestran porcentajes de células en cada cuadrante. (B,C) Los histogramas para CD14 y CD11b en macrófagos similares a M2 en comparación con un control de tinción negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de fluorescencia de citometría de flujo para CD80 (FITC, FL1-H) y CD206 (PE-tandem conjugado, FL3-H). (A) Diagrama de dispersión de densidad, se muestran porcentajes de células en cada cuadrante. (B,C) Los histogramas para CD80 y CD206 en macrófagos similares a M2 en comparación con un control de tinción negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo sobre la diferenciación y polarización de células similares a monocitos THP-1 en 14 días proporciona un método para obtener macrófagos con un fenotipo distinto similar a M2 debido a la incubación de células de tratamiento prolongado con períodos de descanso adecuados entre pasos.
Ciertos pasos son críticos para este protocolo. El tiempo de duplicación de los monocitos THP-1 es de aproximadamente 26 h. Las células se pueden dividir a una densidad celular de 9 x10 5/ mL y deben sembrarse a una densidad de 3 x 105/ mL durante cada división. La división se puede realizar sin eliminar todo el medio celular utilizado (viejo): la realimentación de las células con solo el 50% del medio fresco puede conducir a un crecimiento celular más rápido porque los factores de crecimiento en el medio celular condicionado pueden mejorar la proliferación celular. Sin embargo, no intercambiar todos los medios celulares aumenta el riesgo de contaminación del cultivo y, por lo tanto, solo debe realizarse durante los primeros pasajes de células recién cultivadas. Contar las células es importante para poder cultivar células a la densidad correcta y determinar la viabilidad celular después de la descongelación. La proporción de células muertas después de descongelar las células adecuadamente no debe exceder el 15%.
La siembra de células en placas requiere una mezcla suave pero completa de la suspensión celular para obtener una densidad celular consistente en cada pozo. Las alícuotas se preparan antes de sembrar las células en placas de cultivo para asegurar que el volumen del medio que contiene la célula se mezcle correctamente. Como los monocitos THP-1 en el medio tienden a hundirse en el fondo de un vial, la mezcla suave y continua del volumen de transferencia es crucial para lograr una densidad constante de células.
Los medios celulares deben calentarse a 37 °C en todo momento para evitar choques fríos y una respuesta de estrés celular proinflamatoria23. Por lo tanto, también para los cambios de medios y el tratamiento celular, las placas no deben dejarse fuera de la incubadora durante más de 15 minutos. Además, los compuestos respectivos para el tratamiento celular, como PMA, interleucinas y pbS para diluir soluciones madre antes de tratar las células, deben mantenerse siempre en hielo para evitar la degradación.
Los macrófagos vivos que se diferencian de los monocitos por tratamiento con PMA se adhieren a la superficie de los pozos. Durante los cambios de medios y otros pasos de tratamiento adicionales, las puntas de la pipeta no deben tocar el fondo de un pozo dentro de la placa para evitar el daño celular.
Para realizar la citometría de flujo con macrófagos diferenciados o polarizados, se deben cosechar las células que están unidas a las placas. Existen técnicas enzimáticas o mecánicas para separar las células, incluida la tripsinización, el tratamiento con mezclas enzimáticas con actividad proteolítica y colagenolítica, o el ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), el choque frío, el raspado celular o incluso el desprendimiento a través de presión acústica24,25. El desprendimiento enzimático de macrófagos puede conducir a una alteración de la expresión de marcadores de superficie celular y, por lo tanto, no es la primera opción para los análisis fenotípicos o funcionales25. A diferencia de otros informes, los experimentos realizados aquí mostraron que la combinación de choque en frío y raspado de macrófagos mostró una buena viabilidad celular (>90%) utilizando la exclusión del tinte Trypan Blue. Por lo tanto, se recomienda utilizar esta técnica para separar las células, con la anotación de que una vez que se induce un choque frío, las células deben mantenerse frías sobre hielo en todo momento.
Una limitación de este protocolo es el uso de una línea celular similar a un monocitos como base para imitar los mecanismos de los macrófagos in vivo. Los estudios de cultivo celular con macrófagos primarios, sin embargo, pueden mostrar respuestas celulares variables y los mecanismos pueden enmascararse debido a la heterogeneidad celular26. La línea celular THP-1 es un sistema modelo establecido para monocitos humanos primarios9. Debido a la población homogénea de células THP-1 en un entorno de cultivo controlado, las respuestas celulares son potencialmente reproducibles con mayor precisión. Además, ciertas técnicas optimizan las células THP-1 como modelo para parecerse a los monocitos primarios. Un paso importante es el período de reposo de 5 días después del tratamiento con PMA, que aumenta el volumen citoplasmático y la adherencia a la superficie celular similar a la de las células derivadas de monocitos diferenciados21.
Otra limitación es la creación de un cierto fenotipo de macrófagos similar a M2 que tiene otras características que los macrófagos similares a M2 que se utilizaron en estudios anteriores. Se han reportado muchas técnicas diferentes para diferenciar y polarizar las células THP-1, y la falta de caracterización basal complica la reproducibilidad entre estudios11,12,13,14. Por lo tanto, es importante caracterizar los macrófagos que se utilizan en un estudio al inicio del estudio, dependiendo de los mecanismos que se investiguen. Después de eso, se deben demostrar las respuestas celulares después de un tratamiento respectivo.
Los macrófagos tipo M2 producidos al seguir este protocolo son una base sólida para la investigación de las respuestas celulares en el inicio y la progresión del tumor en diferentes tipos de cáncer, cicatrización de heridas o fibrosis. Con este protocolo, se pueden utilizar in vitromacrófagos M0 o macrófagos M2, y las células son adecuadas para ser utilizadas en modelos de cocultivo. Esto proporciona una amplia variedad de aplicaciones de un fenotipo de macrófagos distinto similar a M2 que se controla de manera robusta in vitro a lo largo del tiempo.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
El Instituto Price de Investigación Quirúrgica de la Universidad de Louisville, cuenta con el apoyo financiero de John W. Price y Barbara Thruston Atwood Price Trust. Las fuentes de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño y la realización del estudio, así como en la recopilación, gestión, análisis e interpretación de los datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
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