Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استكشاف التفاعل الجزيئي الحيوي بين Molecular Chaperone Hsp90 وبروتين العميل Kinase Cdc37 باستخدام تقنية الاستشعار الحيوي ذات التأثير الميداني

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

الاستشعار الحيوي للتأثير الميداني (FEB) هو تقنية خالية من الملصقات للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية. يقيس التيار الكهربائي من خلال المستشعر الحيوي للجرافين الذي يتم تجميد الأهداف الملزمة له. تم استخدام تقنية FEB لتقييم التفاعلات الجزيئية الحيوية بين Hsp90 و Cdc37 وتم اكتشاف تفاعل قوي بين البروتينين.

Abstract

تلعب التفاعلات الجزيئية الحيوية أدوارا متعددة الاستخدامات في العديد من العمليات الخلوية من خلال تنظيم وتنسيق الأحداث البيولوجية ذات الصلة وظيفيا. الجزيئات الحيوية مثل البروتينات والكربوهيدرات والفيتامينات والأحماض الدهنية والأحماض النووية والإنزيمات هي لبنات أساسية للكائنات الحية. يتجمعون في شبكات معقدة في الأنظمة الحيوية لمزامنة عدد لا يحصى من أحداث الحياة. تستخدم البروتينات عادة شبكات تفاعلية معقدة للقيام بوظائفها. وبالتالي ، من الضروري تقييم مثل هذه التفاعلات للكشف عن أهميتها في الخلايا على المستويين الخلوي والكائنات الحية. ولتحقيق هذا الهدف، نقدم تقنية ناشئة بسرعة، وهي الاستشعار البيولوجي للتأثير الميداني (FEB)، لتحديد التفاعلات الجزيئية الحيوية المحددة. FEB هي تقنية للكشف عن الجزيئات الحيوية على الطاولة وخالية من الملصقات وموثوقة لتحديد تفاعلات محددة وتستخدم أجهزة استشعار حيوية إلكترونية عالية الجودة. يمكن لتقنية FEB مراقبة التفاعلات في نطاق nanomolar بسبب المواد النانوية المتوافقة بيولوجيا المستخدمة على سطح المستشعر الحيوي. وكدليل على المفهوم، تم توضيح التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI) بين بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) ودورة انقسام الخلايا 37 (Cdc37). Hsp90 هو مرافقة جزيئية تعتمد على ATP تلعب دورا أساسيا في طي واستقرار ونضج ومراقبة جودة العديد من البروتينات ، وبالتالي تنظيم وظائف خلوية حيوية متعددة. يعتبر Cdc37 مرافقا جزيئيا خاصا بالبروتين كيناز ، لأنه يتعرف على وجه التحديد على كينازات البروتين ويجندها إلى Hsp90 لتنظيم مسارات نقل الإشارة في المصب. على هذا النحو ، يعتبر Cdc37 مرافقا مشاركا ل Hsp90. يتم تنشيط مسار كيناز المرافق (مجمع Hsp90 / Cdc37) بشكل مفرط في الأورام الخبيثة المتعددة التي تعزز النمو الخلوي. لذلك ، فهو هدف محتمل لعلاج السرطان. توضح هذه الدراسة كفاءة تقنية FEB باستخدام نظام النموذج Hsp90/Cdc37. اكتشف FEB مؤشر PPI قوي بين البروتينين (قيم KD من 0.014 ميكرومتر ، 0.053 ميكرومتر ، و 0.072 ميكرومتر في ثلاث تجارب مستقلة). باختصار ، FEB هي منصة للكشف عن PPI خالية من الملصقات وفعالة من حيث التكلفة ، والتي توفر قياسات سريعة ودقيقة.

Introduction

التفاعلات الجزيئية الحيوية:
البروتينات هي أجزاء أساسية من الكائنات الحية وتشارك في العديد من المسارات الجزيئية مثل استقلاب الخلية ، وبنية الخلية ، وإشارات الخلية ، والاستجابات المناعية ، والتصاق الخلايا ، وأكثر من ذلك. في حين أن بعض البروتينات تؤدي وظيفتها (وظائفها) بشكل مستقل ، فإن معظم البروتينات تتفاعل مع البروتينات الأخرى باستخدام واجهة ملزمة لتنسيق النشاط البيولوجي السليم1.

يمكن تصنيف التفاعلات الجزيئية الحيوية بشكل أساسي بناء على الخصائص الهيكلية والوظيفية المميزة للبروتينات المعنية2 ، على سبيل المثال ، بناء على أسطح البروتين أو الاستقرار المعقد أو استمرار التفاعلات3. يعد تحديد البروتينات الأساسية وأدوارها في التفاعلات الجزيئية الحيوية أمرا حيويا لفهم الآليات الكيميائية الحيوية على المستوى الجزيئي4. حاليا ، هناك طرق مختلفة للكشف عن هذه التفاعلات5: في المختبر6 ، في سيليكو7 ، في الخلايا الحية8 ، خارج الجسم الحي 9 ، وفي الجسم الحي10 مع كل منها نقاط القوة والضعف الخاصة بها.

يتم إجراء الفحوصات في الجسم الحي باستخدام الحيوان بأكمله كأداة تجريبية11 ، ويتم إجراء الفحوصاتخارج الجسم الحي على مستخلصات الأنسجة أو الأعضاء بأكملها (مثل القلب والدماغ والكبد) في بيئة خارجية خاضعة للرقابة من خلال توفير الحد الأدنى من التغييرات في الظروف الطبيعية. التطبيق الأكثر شيوعا للدراسات في الجسم الحي وخارج الجسم الحي هو تقييم الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية وآثار السمية للعوامل الدوائية المحتملة قبل التجارب البشرية من خلال ضمان سلامتها وفعاليتها بشكل عام12.

يمكن أيضا اكتشاف التفاعلات الجزيئية الحيوية داخل الخلايا الحية. يسمح لنا تصوير الخلايا الحية بمراقبة التفاعلات الديناميكية أثناء تنفيذها لتفاعلات مسار كيميائي حيوي معين13. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر تقنيات الكشف ، مثل التلألؤ الحيوي أو نقل طاقة الرنين الفلوري ، معلومات حول مكان وزمان حدوث هذه التفاعلات داخل الخلية14. على الرغم من أن الكشف في الخلايا الحية يقدم تفاصيل حاسمة ، إلا أن منهجيات الكشف هذه تعتمد على البصريات والتسميات ، والتي قد لا تعكس البيولوجيا الأصلية. كما أنها أقل تحكما من الطرق المخبرية وتتطلب خبرة متخصصة لأداء15.

تستخدم الطرق الحسابية في سيليكو في المقام الأول للفحص على نطاق واسع للجزيئات المستهدفة قبل التجارب في المختبر . طرق التنبؤ الحسابي ، وقواعد البيانات القائمة على الكمبيوتر ، والالتحام الجزيئي ، والعلاقات بين البنية الكمية والنشاط ، وغيرها من أساليب محاكاة الديناميكا الجزيئية هي من بين الراسخة في أدوات silico 16. بالمقارنة مع التقنيات التجريبية الشاقة ، يمكن لأدوات silico بسهولة إجراء تنبؤات بحساسية عالية ، ولكن مع دقة منخفضة في الأداء التنبؤي17.

يتم إجراء الفحوصات في المختبر مع الكائنات الحية الدقيقة أو الجزيئات البيولوجية خارج سياقها البيولوجي القياسي. يعد تصوير التفاعلات الجزيئية الحيوية من خلال الطرق المخبرية أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائف البروتين والبيولوجيا الكامنة وراء الشبكة المعقدة لعمل الخلايا. يتم اختيار منهجية الفحص المفضلة وفقا للخصائص الجوهرية للبروتين والقيم الحركية وطريقة وشدة التفاعلات18,19.

تفاعل Hsp90/Cdc37:
يعد مسار المرافق-كيناز ، الذي يربط بين Hsp90 و Cdc37 ، هدفا علاجيا واعدا في بيولوجيا الورم20. يلعب Hsp90 دورا مركزيا في التحكم في دورة الخلية ، وتجميع البروتين ، وبقاء الخلية ، ومسارات الإشارات. يتم تسليم البروتينات التي تعتمد على Hsp90 لوظائفها إلى Hsp90 للتعقيد من خلال مرافق مشارك ، مثل Cdc37. يتحكم مركب Hsp90 / Cdc37 في طي معظم كينازات البروتين ويعمل كمركز للعديد من شبكات الإشارات داخل الخلايا21. وهو هدف واعد مضاد للورم بسبب تعبيره المرتفع في الأورام الخبيثة المختلفة ، بما في ذلك سرطان الدم النقوي الحاد ، والورم النقوي المتعدد ، وسرطان الخلايا الكبدية22,23.

يشيع استخدامها في تقنيات الكشف عن التفاعل الجزيئي الحيوي في المختبر
الترسيب المناعي المشترك (co-IP) هو تقنية تعتمد على خصوصية الأجسام المضادة المستضدية لتحديد التفاعلات ذات الصلة بيولوجيا24. العيب الأساسي لهذه الطريقة هو عدم قدرتها على اكتشاف التفاعلات منخفضة التقارب والقيم الحركية24. ويفضل اتباع طرق فيزيائية حيوية مثل قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC)، ورنين البلازمون السطحي (SPR)، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI)، وتكنولوجيا FEB لتحديد القيم الحركية.

ITC هي طريقة للكشف البيوفيزيائي تعتمد على تحديد طاقة الربط جنبا إلى جنب مع تحليل الديناميكا الحرارية الكامل لتوصيف التفاعلات الجزيئية الحيوية25. الميزة الأساسية ل ITC هي أنه لا يتطلب أي وضع علامات أو تثبيت للبروتين المستهدف. الصعوبات الرئيسية التي يواجهها مركز التجارة الدولية هي التركيز العالي للبروتين المستهدف المطلوب لتجربة واحدة وصعوبة تحليل المجمعات غير التساهمية بسبب المحتوى الحراري الصغير المرتبط26. كل من SPR و BLI هما تقنيتان بيوفيزيائيتان خاليتان من الملصقات تعتمدان على تجميد الجزيء المستهدف على سطح المستشعر ، تليها حقن لاحقة للتحليل فوق الهدفالمعطل 27,28. في SPR ، يتم قياس التغيرات في معامل الانكسار أثناء التفاعلات الجزيئية الحيوية27 ؛ في BLI، يتم تسجيل التداخل في الضوء المنعكس في الوقت الحقيقي كتغيير في الطول الموجي كدالة للوقت28. يشترك كل من SPR و BLI في مزايا مشتركة تتمثل في تقديم قدرات عالية من حيث الخصوصية والحساسية والكشف29. في كلتا الطريقتين ، يتم تجميد البروتين المستهدف على أسطح أجهزة الاستشعار الحيوية ، وبالتالي ، قد يكون هناك بعض الفقدان للتشكيل الأصلي للهدف ، مما يجعل من الصعب التمييز بين التفاعلات المحددة مقابل التفاعلات غير المحددة30. يستخدم BLI أجهزة استشعار حيوية باهظة الثمن من الألياف البصرية يمكن التخلص منها لشل حركة الهدف ، وبالتالي فهي تقنية مكلفة31. بالمقارنة مع أدوات الكشف الجزيئي الحيوي الراسخة هذه ، توفر تقنية FEB منصة موثوقة وخالية من الملصقات باستخدام تركيزات نانومولية منخفضة للكشف عن الجزيئات الحيوية في الوقت الفعلي مع التوصيف الحركي. تتغلب تقنية FEB أيضا على التحديات الفقاعية التي تواجهها ITC وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة ب SPR أو BLI.

تعد المستشعرات الحيوية القائمة على الترانزستور ذو التأثير الميداني (FET) مجالا ناشئا للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية من خلال تقديم تطبيقات طبية حيوية متنوعة. في نظام FET ، يتم تجميد الأهداف إلى رقائق الاستشعار الحيوي ويتم الكشف عن التفاعلات من خلال التغييرات في التوصيل32. الميزة الفريدة التي يجب مراعاتها في تطوير مستشعر حيوي إلكتروني فعال هي الخصائص الفيزيائية والكيميائية مثل الطبيعة شبه الموصلة والاستقرار الكيميائي لمواد الطلاء المستخدمة في تصنيع سطح المستشعر33. المواد التقليدية مثل السيليكون المستخدمة في FET حدت من حساسية أجهزة الاستشعار لأنها تتطلب طبقات أكسيد محصورة بين قناة الترانزستور وبيئة محددة للعمل السليم34. علاوة على ذلك ، فإن ترانزستورات السيليكون حساسة للبيئات عالية الملح ، مما يجعل من الصعب قياس التفاعلات البيولوجية في بيئتها الطبيعية. يتم تقديم المستشعر الحيوي القائم على الجرافين كبديل لأنه يوفر استقرارا كيميائيا ممتازا ومجالا كهربائيا. نظرا لأن الجرافين عبارة عن طبقة ذرية واحدة من الكربون ، فهو حساس للغاية كأشباه موصلات ومتوافق كيميائيا مع المحاليل البيولوجية. كل من هذه الصفات مرغوب فيها لإنشاء أجهزة استشعار حيوية إلكترونية متوافقة35. تؤدي إمكانات التحميل العالية للغاية للجزيئات الحيوية التي توفرها أجهزة الاستشعار الحيوية المغلفة بالجرافين إلى تطوير تقنية FEB لأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الجرافين.

مبدأ تقنية FEB: FEB هي تقنية للكشف الجزيئي الحيوي خالية من الملصقات تقيس التيار الكهربائي من خلال مستشعر الجرافين الحيوي الذي يتم تجميد الأهداف الملزمة له. تؤدي التفاعلات بين البروتين المثبت والتحليل إلى تغيرات في التيار يتم رصدها في الوقت الفعلي ، مما يتيح قياسات حركية دقيقة36.

الأجهزة: يتكون نظام FEB من شريحة مستشعر الترانزستور ذات التأثير الميداني للجرافين (gFET) وقارئ إلكتروني يطبق جهدا ثابتا طوال التجربة (الشكل 1). يتم تطبيق التحليل في محلول على البروتين المستهدف المثبت على سطح المستشعر الحيوي. عند حدوث تفاعل ، يتم قياس تغيير في التيار وتسجيله في الوقت الفعلي. مع زيادة تركيز التحليل ، سيزداد أيضا جزء التحليل المرتبط ، مما يتسبب في حدوث تناوب أعلى في التيار. باستخدام برنامج التحليل الآلي المزود بالأداة (جدول المواد) ، يتم قياس I-Response وتسجيله من حيث وحدات الاستشعار البيولوجي (BU)37. يتم تعريف I-Response على أنه التغيير في التيار (I) من خلال شريحة المستشعر الحيوي التي يتم قياسها في الوقت الفعلي عند تفاعل الهدف المثبت مع التحليل. يمكن لبرنامج التحليل الآلي FEB تحليل كل من I-Response و C-Response لأحداث التفاعل الديناميكي ، حيث يسجل C-Response التغييرات في السعة (C). تتوافق الاختلافات في كل من I-Response و C-Response مباشرة مع جزء التحليل المرتبط ويمكن تحليلها بشكل أكبرلإنشاء قيم K D. التفضيل الافتراضي لبرنامج التحليل الآلي هو I-Response.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على الإعداد التجريبي . (أ) رقاقة قائمة على الجرافين وقارئ إلكتروني. (ب) نظرة عامة على مكونات الشريحة. يتم توصيل الشريحة بقطبين كهربائيين يزودان النظام بالتيار الكهربائي. سطح الشريحة مغطى بالجرافين ، والذي عند تنشيطه يمكن أن يربط الهدف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

منهج:
في البداية ، يتم إدخال شريحة المستشعر الحيوي المنشطة في جهاز FEB (الشكل 1) متبوعا بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه: (1) المعايرة: تبدأ التجربة بمعايرة النظام باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4) لإنشاء استجابة توازن خط الأساس. (2) الاقتران: يتم إدخال التحليل في الشريحة ، ويتم مراقبة I-Response حتى يتم الوصول إلى تشبع الربط. (3) الانفصال: يتم فصل التحليل باستخدام 1x PBS. (4) التجديد: تتم إزالة بقايا التحليل باستخدام 1x PBS. (5) الغسيل: يتم إجراء ما مجموعه خمس غسلات باستخدام 1x PBS لإزالة التحليلات المربوطة وغير المربوطة من الشريحة بشكل شامل.

تحليل:
يتم إجراء تحليل البيانات باستخدام البرنامج الآلي بالكامل المقدم مع الأداة. يقوم برنامج التحليل الآلي بإنشاء قطعة أرض مناسبة لHill بقيمة K D. تصف مؤامرة هيل فيت ارتباط التحليل بالبروتين المستهدف كدالة لتركيزات التحليل. يتناسب التركيز الذي يتم فيه تحقيق استجابة نصف قصوىمع قيمة K D. تمثل قيمة KD المنخفضة تقاربا عاليا للربط والعكس صحيح.

للتحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها من تجربة FEB ، يتم استخراج I-Responses من كل نقطة قراءة لكل تركيز تحليلي باستخدام برنامج مراجعة / تصدير البيانات ويمكن تصديرها إلى برامج التحليل الإحصائي الأخرى (انظر جدول المواد) كما هو موضح أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على البروتينات المؤتلفة المستخدمة في هذه الدراسة، Hsp90 و Cdc37، تجاريا (انظر جدول المواد).

1. تنشيط الشريحة

ملاحظة: يتم سرد جميع المواد التي سيتم استخدامها في التجربة في جدول المواد. قم بتصفية جميع المحاليل المحضرة من خلال مرشح معقم بسعة 0.2 ميكرومتر.

  1. تحضير 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) محلول كاربوديميد (EDC) عن طريق إضافة 2 ملغ من EDC إلى 2.5 مل من 1 M 2-(N-morpholino) حمض سلفونيك الإيثان (MES) المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني = 6.0) في أنبوب 15 مل. تحضير حلول N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) عن طريق إضافة 6 ملغ من السلفو-NHS إلى 2.5 مل من 1 M MES المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني = 6.0) في أنبوب منفصل 15 مل. Aliquot 50 ميكرولتر من كل محلول في أنابيب مستقلة وتخزينها في -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  2. امزج كميات متساوية من محلول السلفو الرملي EDC - NHS (50 ميكرولتر من EDC + 50 ميكرولتر من السلفو-NHS) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل (لا دوامة).
    ملاحظة: يجب استخدام المحلول المختلط ل EDC / sulfo-NHS في غضون 30 دقيقة للحفاظ على الربط المتبادل الفعال لتشغيل الرقاقة بشكل صحيح.
  3. ضع شريحة الاستشعار الحيوي (5.7 سم × 2.4 سم ؛ انظر جدول المواد) التي توفرها الشركة في طبق بتري زجاجي مع غطاء مجهز. يقترح أن تتم جميع خطوات التشغيل الوظيفية التي ينطوي عليها تنشيط الرقاقة داخل طبق Petri. ضع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES 1 M (الرقم الهيدروجيني = 6.0) على شريحة المستشعر الحيوي ، واحتضن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم استطلع المخزن المؤقت.
  4. ضع 50 ميكرولتر من محلول EDC / sulfo-NHS على الفور على شريحة الاستشعار. يغطى طبق بتري ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. شطف الشريحة مرة واحدة مع 50 ميكرولتر من 1 M MES المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني = 6.0) ؛ شفط المخزن المؤقت MES.

2. تجميد البروتين المستهدف

  1. شطف رقاقة 2x مع 50 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4). استنشاق PBS من الشريحة وإضافة الجزيء المستهدف ، Hsp90 (50 ميكرولتر ؛ 500 نانومتر).
    ملاحظة: قد يؤدي عدم تطابق المخزن المؤقت إلى تدمير التجربة بأكملها؛ وبالتالي ، قبل التجربة ، من المهم التأكد من أن الجزيء المستهدف في نفس المخزن المؤقت المستخدم في المعايرة (على سبيل المثال ، 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)). إذا لزم الأمر، قم بإجراء تبادل مؤقت عن طريق غسيل الكلى بين عشية وضحاها قبل التجربة. في هذه التجربة ، تم إجراء غسيل الكلى بين عشية وضحاها لكل من البروتينات المؤتلفة ، Hsp90 و Cdc37 ، مقابل 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4 ؛ انظر جدول المواد) مع تبادل مؤقت مناسب عند 4 درجات مئوية. قد يختلف تركيز المادة المستهدفة (Hsp90 في هذه الحالة) وفقا للبروتوكولات التجريبية المختلفة وطبيعة المواد المستهدفة (البروتين / الببتيد / الليكاندات).
  2. يغطى طبق بتري الزجاجي ويحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشاق المحلول الذي يحتوي على الجزيء المستهدف وشطف 3x مع 50 ميكرولتر من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4). استنشاق محلول 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) من الشريحة.
  3. أضف 50 ميكرولتر من محلول Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)) إلى الشريحة. استنشق محلول Quench 1 من الشريحة.
  4. أضف 50 ميكرولتر من محلول Quench 2 (1 M ethanolamine (الرقم الهيدروجيني = 8.5)) إلى الشريحة. يغطى طبق بتري الزجاجي ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنباط محلول Quench 2 من الشريحة وشطف الشريحة 5x باستخدام 50 ميكرولتر من 1x PBS ، تاركا آخر قطرة PBS على المستشعر.

3. إعداد العينات التحليلية

  1. إعداد سلسلة تخفيف التحليل ل Cdc37 في نطاق التركيز المطلوب. بالنسبة للتجربة الأولى ، تم استخدام التركيزات التالية: 25 نانومتر ، 50 نانومتر ، 100 نانومتر ، 200 نانومتر ، 400 نانومتر ، 800 نانومتر ، 1000 نانومتر ، 2000 نانومتر ، 3000 نانومتر ، و 5000 نانومتر. بالنسبة للتجربة الثانية ، تم استخدام مجموعة مختلفة من التركيزات التي تتراوح من 0.4 نانومتر إلى 200 نانومتر.
  2. صمم التجربة لتشمل ما لا يقل عن ثمانية تركيزات تحليلية مختلفة للحصول على قيمة KD موثوقة. إعداد التخفيفات المختلفة للبروتين التحليلي في نفس المخزن المؤقت المستخدم للمعايرة والبروتين المستهدف ؛ هنا هو 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4).

4. تحميل شريحة الاستشعار الحيوي المنشط في جهاز FEB

ملاحظة: يتكون جهاز FEB من قارئ مميز بمؤشرات ضوء LED وخرطوشة لإدخال شريحة المستشعر الحيوي.

  1. بعد تجميد البروتين المستهدف ، أدخل الشريحة المنشطة في خرطوشة الجهاز ، والتي يتم توصيلها عبر USB بجهاز كمبيوتر. بعد إدخال الشريحة ، سيتم عرض ضوء LED أخضر على القارئ يشير إلى أن جهاز FEB جاهز للتجربة. قم بتثبيت البرنامج الآلي (انظر جدول المواد) الذي توفره الشركة على الكمبيوتر ، الذي يتصل به جهاز FEB ، لمراقبة التجربة خطوة بخطوة كما هو موضح أدناه.

5. قم بتشغيل التجربة

  1. اضغط على وحدة تشغيل التجربة على البرنامج الآلي واختر 10 نقاط مع التجديد أو أي بروتوكول آخر مطلوب. املأ التفاصيل التالية: اسم المشغل واسم التجربة والتاريخ (على سبيل المثال ، Yana ، Hsp90 + Cdc37 ، 14.03.2021) ؛ المخزن المؤقت للتجديد (على سبيل المثال ، المخزن المؤقت PBS) ؛ الهدف المعطل (على سبيل المثال، Hsp90)؛ التحليل في الحل (على سبيل المثال ، Cdc37). انظر الشكل التكميلي S1 للحصول على التفاصيل.
  2. اضغط على الزر بدء التجربة المعروض على البرنامج واتبع الإرشادات الموضحة بواسطة البرنامج الآلي كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: البرنامج مؤتمت بالكامل وسهل الاستخدام ويوجه المستخدم طوال التجربة خطوة بخطوة. ستظهر نافذة منبثقة على الشاشة مع تعليمات للمضي قدما في كل خطوة من خطوات التجربة. سيوفر البرنامج تعليمات لكل خطوة متكررة على التوالي من المعايرة وارتباط التحليل والتفكك والتجديد والغسيل (5x) لكل تركيز تحليلي طوال التجربة.
  3. قم بإجراء معايرة الأداة. للقيام بذلك ، استنشق محلول PBS المتبقي من الشريحة وطبق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمعايرة (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4). اضغط على الزر Continue (متابعة ) وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنتهي خطوة المعايرة. يعرض البرنامج نقطة النهاية المحددة لخطوة المعايرة (5 دقائق) مع إنذار تحذيري للمتابعة.
  4. بعد ذلك ، قم بإجراء اقتران تحليلي. للقيام بذلك ، قم بشفط مخزن المعايرة المؤقت من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من أدنى تركيز تحليلي (25 نانومتر من Cdc37). اضغط على الزر Continue (متابعة ) وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنتهي خطوة الاقتران. يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الاقتران (5 دقائق) مع إنذار تحذير للمتابعة.
  5. إجراء تحليل الانفصال. للقيام بذلك ، استنشق محلول التحليل من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفكك (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4). اضغط على الزر Continue (متابعة ) وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تنتهي مدة خطوة التفكك (5 دقائق). يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الانفصال (5 دقائق) مع إنذار تحذير للمتابعة.
  6. بعد ذلك ، قم بإجراء تجديد الشريحة. استنشق محلول التفكك من الشريحة وطبق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجديد (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4). اضغط على الزر Continue (متابعة ) وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة التجديد (30 ثانية). يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التجديد (30 ثانية) مع إنذار تحذير للمتابعة.
  7. أخيرا ، اغسل الشريحة. استنشق محلول التجديد من الشريحة وطبق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (1x PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4) على الشريحة. استنشق المحلول من الشريحة وكرر هذا 5x. اترك آخر قطرة من المخزن المؤقت للغسيل على الشريحة واضغط على الزر Continue (متابعة ) وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة الغسيل في شاشة البرنامج.
    ملاحظة: يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الغسيل (30 ثانية) مع إنذار تحذيري للمضي قدما في الدورة التالية من التجربة.
  8. كرر الخطوات لكل تركيز تحليلي مستخدم؛ تشكل الخطوات الخمس للمعايرة والارتباط التحليلي والتفكك والتجديد والغسيل (5x) دورة واحدة. بالنسبة للتجربة الموضحة هنا ، أجرينا 10 دورات ل 10 تركيزات تحليلية (تتراوح من 25 نانومتر إلى 5000 نانومتر أو 0.4 نانومتر إلى 200 نانومتر. الشكل 2).

6. التحليل

  1. اضغط على زر التحليل الموجود أعلى برنامج التحليل الآلي في نهاية التجربة. ستظهر نافذة عرض تحتوي على جميع النقاط التجريبية. في النافذة ، تأكد من صحة تركيزات التحليل المستخدمة في البروتوكول المحدد.
  2. اضغط على الزر تشغيل التحليل لإنشاء قيمة KD تلقائيا. يقوم البرنامج بإنشاء مخطط هيل مناسب عن طريق رسم تركيزات التحليل مقابل I-Responses المقابلة التي يتم من خلالها حساب ثابت التفكك عند التوازن، قيمة K D.
  3. تصدير البيانات الخام للتحليل في برامج التحليل الإحصائي الأخرى باستخدام برنامج مراجعة / تصدير البيانات كما هو موضح أدناه.
    1. انسخ ملف R1R الذي تم إنشاؤه تلقائيا في نهاية التجربة (على سبيل المثال، Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) إلى مجلد جديد على سطح المكتب. افتح برنامج مراجعة / تصدير البيانات الذي توفره الشركة (انظر الشكل التكميلي S2A).
    2. انقر فوق معالجة البيانات > معالجة ملفات R1R > موافق على الشاشة الرئيسية لبرنامج مراجعة / تصدير البيانات.
    3. حدد المجلد الذي يحتوي على ملفات R1R التي تم إنشاؤها على سطح المكتب في الخطوة 6.3.1. ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) . يؤدي ذلك إلى إنشاء نسخة من بيانات R1R الأصلية، لمراجعة البيانات وتحريرها دون تجاوز الملف الأصلي.
    4. اضغط على أيقونة معالجة البيانات التي تظهر في الشاشة الرئيسية لبرنامج مراجعة/تصدير البيانات. اضغط على تحميل ملفات R1R المعالجة > موافق. حدد نفس المجلد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.3.1 الذي يحتوي على ملفات R1R التي تمت معالجتها. اضغط على موافق. في هذه الخطوة، يكون المجلد الذي يحتوي على ملفات التجربة جاهزا للمراجعة.
    5. على الشاشة الرئيسية لبرنامج مراجعة/تصدير البيانات، اضغط على تحليل البيانات. حدد المعايرة > معايرة ملفات R1R التي تم تحريرها > موافق (انظر الشكل التكميلي S2B). تقوم هذه الخطوة بمعايرة جميع نقاط البيانات وفقا لخطوة المعايرة الأولى، لإنشاء خط أساس.
    6. على الشاشة الرئيسية لبرنامج مراجعة/تصدير البيانات، اضغط على تحليل البيانات. حدد مراجعة ملفات R1R وتحريرها > موافق. راجع نقاط البيانات أو احذف النقاط أو أضف خطوات باستخدام الزر حذف/إضافة خطوة . تأكد من أن جميع الخطوات في المكان الصحيح، على سبيل المثال، خطوة المعايرة على خط الأساس، وخطوة الاقتران في ذروتها (انظر الشكل التكميلي S3)، ثم اضغط على الزر حفظ لحفظ جميع التغييرات التي تم إجراؤها.
    7. على الشاشة الرئيسية لبرنامج مراجعة/تصدير البيانات، اضغط على تحليل البيانات. حدد تحليل/رسم البيانات، واختر خطوات التصدير (انظر الشكل التكميلي S4). أضف كل خطوة اقتران (على سبيل المثال، الخطوة 2 والخطوة 7 وما إلى ذلك) بعد طرح خطوة المعايرة (على سبيل المثال، الخطوة 1، الخطوة 6، وما إلى ذلك) إلى قائمة التصدير قبل تصدير البيانات.
    8. اضغط على تصدير هذه البيانات. يقوم البرنامج بإنشاء ملف جدول بيانات يحتوي على I-Response لكل نقطة بيانات تركيز تحليلية من كل ترانزستور (إذا كانت جميع الترانزستورات تعمل ، فسيكون لدينا ثلاث قيم استجابة I-مختلفة لكل نقطة تركيز). استخدم ملف جدول البيانات هذا لمزيد من التحليل للبيانات في البرنامج الإحصائي.
  4. افتح برنامج التحليل الإحصائي. إنشاء جدول XY مع ثلاث قيم Y ؛ اضغط على إنشاء. يتم نسخ بيانات هذا الجدول (قيم X وY) من ملف جدول البيانات الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.3.8. يتوافق المحور x مع تركيز التحليل (اعتمادا على التركيز المستخدم) ، وتتوافق قيم Y الثلاث مع I-Responses ، التي تم الحصول عليها من برنامج مراجعة / تصدير البيانات الذي توفره الشركة.
  5. اضغط على تحليل هذه البيانات. اختر تحليلات XY > الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) > تشبع الربط > إجمالي > موقع واحد. سيقوم البرنامج تلقائيا بتحليل البيانات ، وإنشاء قيمة KD ، وإنشاء رسم بياني لنقاط البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نتائج التجربة 1:
تم تجميد البروتين المستهدف Hsp90 (500 نانومتر) إلى الشريحة باتباع بروتوكول تثبيت الهدف كما هو موضح أعلاه. بالنسبة للتجربة الأولى ، تم إعداد 10 تركيزات من البروتين التحليلي ، Cdc37 ، تتراوح من 25 نانومتر إلى 5000 نانومتر ، بناء على البيانات المتاحة في الأدبيات (انظر الجدول 1).

يمكن مراقبة خطوات التجربة في الوقت الفعلي من خلال اتباع التغييرات التي تحدث في I-Response (الشكل 3A). يمكن للمرء أن يتصور كيف تؤثر كل خطوة مضمنة في البروتوكول على I-Response طوال التجربة. على سبيل المثال ، تقترب الاستجابة I- من الصفر أثناء المعايرة ، وفي خطوة الارتباط ، تزداد استجابة I-Response تدريجيا مع زيادة تركيزات التحليل (Cdc37). بالنظر إلى البيانات المستمدة من هذه التجربة (الشكل 3A) ، لوحظت زيادة مفاجئة في I-Response في تركيزات تحليلية منخفضة (50 BU عند 25 نانومتر). ومن المتوقع انخفاض الاستجابة I-Response عند انخفاض تركيز التحليل الذي سيزداد تدريجيا مع زيادة التركيزات. وتشير هذه الزيادة المفاجئة إلى ضرورة تصميم تجربة تتضمن نقاط تركيز تحليلية أقل.

باتباع خطوات البروتوكول التي نوقشت أعلاه ، تم تحليل البيانات في برنامج التحليل الآلي المقدم ، والذي أنشأ تلقائيا قطعة أرض مناسبة ل Hill بقيمة KD محسوبة (الشكل 3B). كانت قيمة KD المحسوبة من برنامج التحليل الآلي للتجربة الأولى 350,000 ± 76,000 ميكرومتر. أظهرت معظم التفاعلات البيولوجية الشائعة قيمة KD في μM المنخفض أو حتى في نطاق nM. وبالتالي ، فإن قيمة KD التي تم إنشاؤها للتجربة الأولى عالية جدا.

يمكن أن يكون هناك عدة تفسيرات لقيمة KD العالية المرصودة: قد يكون هناك ارتباط منخفض التقارب بين البروتينين المحددين اللذين تمت دراستهما (Hsp90 / Cdc37) ، مما يعني أن تركيز الليجند العالي مطلوب للتفاعلات الجزيئية. وربما تكون التجربة قد صممت بتركيزات تحليلية غير مثالية وخارجة عن النطاق؛ يمكن أن تكون القيمة العالية بسبب المعلمات المدمجة المستخدمة في وحدة التركيب لبرنامج التحليل. يستخدم برنامج التحليل الآلي وحدة تحليل الجرعة والاستجابة لتناسب نقاط البيانات ، ولكن بعض التفاعلات قد لا تتناسب بشكل جيد مع هذا النموذج ، مما يعطي بيانات خاطئة ، مما يؤدي إلى ارتفاع قيم KD .

للحصول على قيمة K D دقيقة مع مخطط هيل المشبع ، يلزم توحيد التجربة عن طريق التجربة والخطأ والذي يتضمن نقاط تركيزات تحليلية أقل وأعلى ، للحصول على أدنى قيمة KD بمعدل خطأ منخفض.

وبالنظر إلى كل هذه العوامل، تم تصدير البيانات المستمدة من برمجيات التحليل إلى برمجيات تحليل إحصائي إضافية. تم استخراج I-Response لكل نقطة اقتران باستخدام برنامج مراجعة / تصدير البيانات الآلي ويتم تلخيصه في الجدول 2 باتباع الخطوات التي نوقشت أعلاه في خطوة التحليل (الخطوة 6).

أظهرت نتائج برنامج التحليل الإحصائي (الشكل 3C) قيمة KD منخفضة نسبيا مع انحراف معياري مرتفع (0.011 ± 0.494 μM) وقيمة R2 منخفضة تبلغ 0.78. يشير التباين الكبير الذي لوحظ في قيمة KD وقيمة R2 المنخفضة إلى أن نقاط التركيز المختارة لهذه التجربة ليست مثالية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا أن بعض نقاط الرسم البياني لا تتناسب بشكل جيد مع خط اتجاه المؤامرة (الشكل 3 جيم)؛ وقد عزز ذلك الحاجة إلى تصميم تجربة ثانية من خلال تضمين نقاط تركيز تحليلية مختلفة.

تختلف المعلمات المدمجة التي يستخدمها برنامجا التحليل تماما ، وينعكس ذلك في عمليةتوليد قيم KD. يمكن أن تعزى الاختلافات في قيم KD التي تم الحصول عليها من برنامجي التحليل (350,000 ± 76,000 μM مقابل 0.011 ± 0.494 μM) إلى حقيقة أنه تم استخدام وحدات تحليل مختلفة للحساب. قد يكون التحليل الذي يتم إجراؤه في برنامج التحليل الإحصائي مناسبا بشكل أفضل لهذا التفاعل ، مما يعطي قيمة KD أقل.

ومع ذلك ، إذا تم الجمع بين نتائج كلا التحليلين (350000 ± 76000 ميكرومتر و 0.011 ± 0.494 ميكرومتر) ، يمكن استنتاج أن التجربة الأولى لم تكن مثالية وأن نقاط التركيز الإضافية ستكون مطلوبة.

للتحقق من صحة هذه النقطة ، تم استبعاد نقطة الرسم البياني غير المرتبطة ، 3000 نانومتر (انظر الشكل التكميلي S5). أظهرت نتائج التحليل قيمة KD من 0.006 ± 0.081 μM مع قيمة R2 من 0.98. وأشارت هذه النتائج إلى أنه ينبغي تصميم التجربة التالية مع التركيز على تركيزات أكثر صلة. لذلك ، تم إجراء تجربة ثانية لتقييم Hsp90 / Cdc37 PPI باستخدام نقاط اختبار مختلفة بتركيزات أقل وأعلى من KD المتوقع.

نتائج التجربة 2:
تم تجميد البروتين المستهدف ، Hsp90 (500 نانومتر) إلى الشريحة باستخدام البروتوكول كما هو موضح أعلاه. تم إعداد ما مجموعه 10 تركيزات من التحليل (Cdc37) على النحو التالي: 0.4 نانومتر ، 0.8 نانومتر ، 1.6 نانومتر ، 3.2 نانومتر ، 6.4 نانومتر ، 12.5 نانومتر ، 25 نانومتر ، 50 نانومتر ، 100 نانومتر ، و 200 نانومتر. تم تصميم التجربة الثانية من خلال تضمين نقاط تركيز تحليلية مختلفة ، من خلال النظر في جميع الأفكار المكتسبة من التجربة السابقة كما هو مذكور أعلاه.

خلال التجربة ، تم رصد كل خطوة في الوقت الفعلي (الشكل 4A). هنا ، يبدأ الرسم البياني I-Response في الوقت الفعلي (المشتق من التركيزات المنخفضة للتحليل - 0.4 نانومتر ، 0.6 نانومتر ، 1.6 نانومتر) في البداية من الصفر ويزداد تدريجيا عند زيادة تركيزات التحليل في كل دورة من دورات التجربة مقارنة بالزيادة المفاجئة في I-Response التي لوحظت في التجربة الأولى.

وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه ، تم تحليل البيانات باستخدام برنامج التحليل الآلي (الشكل 4B). كانت قيمة KD المحسوبة من برنامج التحليل الآلي لهذه التجربة 0.0673 ± 0.0002 ميكرومتر ، مما يشير إلى تفاعل قوي بين البروتين المستهدف Hsp90 وتحليل Cdc37. كان الانحراف المعياري 0.0002 μM أصغر بكثير من ذلك الذي تم الحصول عليه في التجربة الأولى ، مما يعطي الثقة في أن البيانات الجديدة أكثر موثوقية.

وللتحقق من صحة هذه النتيجة، قمنا بتصدير نقاط البيانات (الجدول 3) إلى برنامج تحليل إحصائي آخر كما هو موضح سابقا؛ ويرد في الشكل 4 جيم موجز لنتائج التحليل.

باستخدام برنامج التحليل الإحصائي ، وجد أن قيمة KD ل Hsp90 / Cdc37 PPI هي 0.014 ± 0.005 μM (الشكل 4C). تشير القيم المنخفضة ل KD والانحراف المعياري إلى تفاعل قوي بين البروتينين ، Hsp90 و Cdc37. علاوة على ذلك ، تشير قيمة R2 البالغة 0.99 إلى أن التحليل يناسب تماما نقاط الرسم البياني التجريبية. أظهر كلا برنامجي التحليل اتساقا في النتائج ، مع قيم KD منخفضة تبلغ حوالي 0.0673 ± 0.0002 μM و 0.014 ± 0.005 μM ، على التوالي.

وللتأكد من قابلية التجربة للتكرار ودقتها، أجريت التجربة نفسها في نسختين متماثلتين باستخدام Hsp90 (500 نانومتر) كبروتين مستهدف وCdc37 كتحليل بنفس التركيزات التي تتراوح من 0.4 نانومتر إلى 200 نانومتر كما هو مستخدم في التجربة الثانية. وخلال التجربة، رصدت كل خطوة في الوقت الفعلي (الشكل التكميلي S6A والشكل التكميلي S7A). ويردفي الشكل التكميلي S6B والشكل التكميلي S7B (0.053 ± 0.002 μM و 0.0719 ± 0.0007 μM على التوالي). وكما ذكر سابقا، تم تصدير نقاط البيانات (الجدول التكميلي S1 والجدول التكميلي S2) إلى برنامج حاسوبي آخر للتحليل الإحصائي، وترد النتائج في الشكل التكميلي S6C والشكل التكميلي S7C (الشكل التكميلي S6C: K D هو 0.003 ± 0.009 ميكرومتر وR2 هو 0.99؛ والشكل التكميلي S6C: K D هو 0.003 0.009 ميكرومتر وR2 هو 0.99؛ والشكل التكميلي S6C: K D هو 0.003 0.009 ميكرومتر وR2 هو 0.99؛ والشكل التكميلي S6C: K D هو 0.003 0.009 ميكرومتر وR2 هو 0.99؛ والشكل التكميلي S6C: K D هو 0.003 و 0.009 ميكرومتر وR2 هو 0.99؛ و R 2 هو 0.99؛ و R 2 هو الشكل التكميلي S7C: KD هو 0.004 ± 0.009 μM و R2 هو 0.99). وأكدت نتائج النسختين المتماثلتين من كل من برنامج التحليل بشكل جيد وأكدت دقة البيانات التجريبية Hsp90/Cdc37 FEB وقابليتها للتكرار وقابليتها للتكرار.

كما أجريت دراسة تحكم تم فيها توضيح التفاعل الجزيئي الحيوي بين Hsp90 وبروتين التحكم ، ألبومين مصل البقر (BSA). تم إجراء دراسة التحكم باستخدام BSA كتحليل باستخدام إعداد تجريبي متطابق وتركيزات تحليلية مستخدمة في التجربة الثانية. تم تحضير ما مجموعه 10 تركيزات من بروتين التحكم ، BSA ، تتراوح من 0.4 نانومتر إلى 200 نانومتر في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) وتم رصد كل خطوة من التجربة في الوقت الفعلي.

على غرار التجربة مع Hsp90 و Cdc37 ، يبدأ الرسم البياني I-Response في الوقت الفعلي في البداية من 0 ؛ ومع ذلك، في دراسة الرقابة، لم تزد الاستجابة I-Response تدريجيا عند زيادة تركيزات التحليل (الشكل التكميلي S8A). كما تم تحليل البيانات باستخدام برنامج التحليل الآلي (الشكل التكميلي S8B)، ولم يتمكن البرنامج من حساب قيمة KD من نقاط بيانات هذه التجربة. ويتضح من Hill Plot التي تم إنشاؤها من البرنامج أنه لا يوجد تفاعل بين Hsp90 وتحليل BSA للتحكم في ذلك. للتحقق من صحة هذه النتيجة ، قمنا بتصدير نقاط البيانات (الجدول التكميلي S3) إلى برنامج تحليل إحصائي آخر كما هو موضح سابقا. وباستخدام برنامج التحليل الإحصائي، تبين أن قيمة KD ل Hsp90/BSA PPI سالبة (الشكل التكميلي S8C; KD هو -0.009 ± -0.0003 μM) ، مما يشير مرة أخرى إلى أنه لا يوجد تفاعل بين البروتينين ، Hsp90 و BSA. علاوة على ذلك ، تشير قيمة R2 (0.82) إلى أن التحليل لم يتناسب مع نقاط الرسم البياني التجريبية. أظهر كلا برنامجي التحليل اتساقا في النتائج التي لا يتفاعل فيها Hsp90 و BSA.

عند مقارنة البيانات التجريبية Hsp90/Cdc37 FEB مع البيانات التجريبية الأخرى المتاحة في الأدبيات، وجد أن قيم K D التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة (K D = 0.014 ± 0.005 μM، K D = 0.053 ± 0.002 μM، وK D = 0.072 ± 0.001 μM) كانت في مرتبتين من حيث الحجم أقل من البيانات المنشورة سابقا (K D = 1.46 μM 38 أو 6 μM 39 ). يمكن أن تعزى هذه الاختلافات إلى استخدام تركيبات Hsp90 و Cdc37 البشرية الكاملة الطول في التجارب الحالية. أجريت دراسات سابقة على بنى الخميرة Hsp90 التي تحتوي فقط على بروتين جزئي38 أو بروتينات C. elegans المتجانسة39 (الجدول 1). للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها في نظام FEB ، تم إجراء تجارب ITC.

تقييم مؤشر أسعار المنتجين Hsp90/Cdc37 باستخدام نظام مركز التجارة الدولية:
يعتبر ITC المعيار الذهبي للتحقيق في التفاعلات الجزيئية الحيوية. كما أجرينا ITC لتحديد الحركيات الديناميكية الحرارية ل Hsp90 / Cdc37 PPI ، وكتحقق من صحة تجربة FEB. يخضع Hsp90 و Cdc37 لغسيل الكلى ضد PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.0) قبل ITC. تم تحضير حوالي 0.25 ميكرومتر من البروتين المستهدف (Hsp90) ومحلول 2.5 ميكرومتر من البروتين التحليلي (Cdc37) في PBS للمعايرة الحرارية. تمت معايرة حجم إجمالي قدره 80 ميكرولتر من محلول Cdc37 على فترات متتالية من المحقنة الدوارة إلى الخلية التي تحتوي على 150 ميكرولتر من محلول Hsp90 عند 298.15 K. حدثت كل حقنة على مدى 4 ثوان ، وكان الفاصل الزمني بين الحقن المتتالية 150 ثانية. تم إجراء ما مجموعه 19 حقنة من 2 ميكرولتر لكل منها بسرعة تحريك تبلغ 500 دورة في الدقيقة وقوة مرجعية تبلغ 41.9 ميكروواط ، على التوالي. تم رصد التباين الحراري الناتج عن تفاعل Hsp90 / Cdc37 ، وتم تركيب البيانات النهائية التي تم الحصول عليها في نهاية حقن تحليل Cdc37 باستخدام برنامج تحليل ITC الذي قدمته الشركة. تم تقدير التغيرات الحرارية جنبا إلى جنب مع المعلمات الديناميكية الحرارية مثل تغير المحتوى الحراري المولي (ΔH) ، وتغير الإنتروبيا (ΔS) ، وعدد مواقع الارتباط (n) ، وثابت تفكك التوازن (KD) بين Hsp90 / Cdc37 PPI. تم حساب تغير الطاقة الحرة Gibbs (ΔG) أيضا من المعادلة ΔG = ΔH - TΔS بعد الحصول على المعلمات الحرارية من مخطط الحرارة ITC.

تكشف مؤامرة ITC عن كمية الحرارة المستهلكة أو المحررة أثناء التفاعلات البيولوجية لتوضيح طبيعة التفاعلات والقوى بين الجزيئية التي تحكم PPI40. تمت معايرة Cdc37 (2.5 μM) إلى Hsp90 (0.25 μM) ، وتظهر المنحنيات المقابلة في الشكل 5A و B. وتبين أن مخطط مركز التجارة الدولية الذي تم الحصول عليه طارد للحرارة وتم تركيبه في نموذج موقع ربط واحد يعرض قياس ستويشيومتري (ن) لواحد ، طاقة ربط ، ΔG = -45.9 kJ / mol ، وقيمة KD = 0.009 μM. يشير التناقض الطفيف الذي لوحظ في شكل تحول ماص للحرارة في بداية مخطط الحرارة ITC (الشكل 5A) إلى تكوين فقاعات أثناء معايرة البروتين التحليلي إلى خلية القياس41,42. ومن بين مؤشرات القوة البينية للكثافة Hsp90/Cdc37، أجريت تجارب مركز التجارة الدولية بتركيزات أقل وأعلى، وأظهرت الفائض البالغ 10 أضعاف من Cdc37 (تركيز Hsp90 = 0.25 ميكرومتر وتركيز Cdc37 = 2.5 ميكرومتر) بارامترات ربط مقبولة عن طريق تحقيق منحنى تشبع. ترتبط قيمة K D التي تم الحصول عليها من ITC (K D = 0.009 μM) ارتباطا جيدا بقيمة K D المحسوبة باستخدام تقنية FEB (K D = 0.014 μM و 0.053 μM و 0.072 μM) ، مما يدعم بقوة حساسية FEB ودقتها في اكتشاف Hsp90 / Cdc37 PPI.

Figure 2
الشكل 2: ملخص البروتوكول . (أ) ملخص خطوات عملية تنشيط الشريحة. (ب) تمثيل بياني للخطوات الخمس المتكررة في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من التجربة 1 . (أ) بيانات التجربة التي يتم رصدها في الوقت الفعلي. يتوافق المحور y مع I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي (BU) ، ويتوافق المحور x مع النقاط الزمنية والتركيزات المختلفة للتحليل في التجربة. يتوافق هذا الرقم مع البيانات من التجربة الأولى. (ب) مخطط هيل فيت الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور y مع I-Response ، ويتوافق المحور x مع تركيزات التحليل (Cdc37) في nM. بالنسبة لهذه التجربة ، تبلغ قيمة KD 350,000 ± 76,000 μM. (C) مخطط جمعية تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور y مع I-Response في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور x مع تركيزات التحليل المختلفة ، Cdc37. تم إنشاء هذه المؤامرة باستخدام نقاط البيانات الواردة في الجدول 2. ويرد ملخص لنتائج التحليل في الرسم البياني؛ بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD 0.011 ± 0.494 ميكرومتر وقيمة R2 0.78. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من التجربة 2 . (أ) بيانات التجربة التي تم رصدها في الوقت الفعلي. يتوافق المحور y مع I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي (BU) ، ويتوافق المحور x مع النقاط الزمنية والتركيزات المختلفة للتحليل في التجربة. يتوافق هذا الرقم مع البيانات من التجربة الثانية. (ب) مخطط هيل فيت الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور y مع I-Response ، ويتوافق المحور x مع تركيز التحليل (Cdc37) في nM. بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD هي 0.0673 ± 0.0002 μM (C) مخطط اقتران تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور y مع I-Response في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور x مع تركيزات Cdc37 التحليلية المختلفة. تم إنشاء هذه المؤامرة باستخدام نقاط البيانات الواردة في الجدول 3. ويرد ملخص لنتائج التحليل في الرسم البياني؛ بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD 0.014 ± 0.005 ميكرومتر وقيمة R2 0.99. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخطط الحرارة ITC لتفاعل Hsp90 و Cdc37. (A) تمثل اللوحة العلوية منحنيات تطور الحرارة المقابلة التي تم الحصول عليها بسبب الحقن المتتالية ل Cdc37 (2.5 ميكرومتر) في Hsp90 (0.25 ميكرومتر) عند 298.15 كلفن. تمثل القوة التفاضلية (DP) القوة التفاضلية كدالة للوقت. (ب) تحدد نقاط البيانات المدمجة في اللوحة السفلية الحرارة العادية المقابلة مقابل النسبة المولية ل Hsp90/Cdc37.

الفحوص التي أجريت تحليل فبراير د.ك تحليل المنشور دينار كويتي بناء الأصل الأحماض الأمينية مراجع
مركز التجاره الدوليه 1.46 ميكرومتر، و 1.32 ميكرومتر غير متوفر الخميرة Hsp90 المجال الطرفي N ل Hsp90 36
Cdc37 الإنسان
إس بي آر 6 ميكرومتر غير متوفر جيم - إليجانز الطول الكامل 37
فبراير - التكرار الأول 0.014 ميكرومتر 0.067 ميكرومتر الإنسان Hsp90 الطول الكامل أجريت في هذه الدراسة
Cdc37 الإنسان
فبراير - التكرار الثاني 0.053 ميكرومتر 0.003 ميكرومتر الإنسان Hsp90 الطول الكامل أجريت في هذه الدراسة
Cdc37 الإنسان
فبراير - التكرار الثالث 0.072 ميكرومتر 0.004 ميكرومتر الإنسان Hsp90 الطول الكامل أجريت في هذه الدراسة
Cdc37 الإنسان
مركز التجاره الدوليه 0.009 ميكرومتر غير متوفر الإنسان Hsp90 الطول الكامل أجريت في هذه الدراسة
Cdc37 الإنسان
فبراير - دراسة التحكم لا توجد بيانات (لم تكن هناك بيانات كافية لحساب الدينار الكويتي) -0.009 ميكرومتر (تشير قيمة KD ذات القيم السالبة إلى عدم وجود تفاعل) الإنسان Hsp90 الطول الكامل أجريت في هذه الدراسة
جيش صرب البوسنه

الجدول 1: تقييم مؤشر أسعار المنتجين Hsp90/Cdc37 باستخدام أساليب مختلفة تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة والأدبيات.

تركيزات التحليل (نانومتر) ترانزستور I-Response 1 ترانزستور I-Response 2 ترانزستور I-Response 3 متوسط
I-الاستجابة
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

الجدول 2: ملخص قيم I-Response المتولدة من ثلاثة ترانزستورات مختلفة لكل شريحة في كل نقطة تركيز من التجربة الأولى.

تركيزات التحليل (نانومتر) ترانزستور I-Response 1 ترانزستور I-Response 2 ترانزستور I-Response 3 متوسط الاستجابة I-Response
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

الجدول 3: ملخص قيم I-Response المتولدة من ثلاثة ترانزستورات مختلفة لكل شريحة في كل نقطة تركيز في التجربة الثانية.

الشكل التكميلي S1: لقطة شاشة للشاشة الرئيسية للبرامج الآلية قبل بداية التجربة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: لقطة شاشة للشاشة الرئيسية للبرامج الآلية لمعالجة البيانات وتحليلها. (أ) عرض الشاشة الرئيسية لبرنامج استعراض/تصدير البيانات الذي يعرض خيارات معالجة البيانات. (ب) شاشة العرض الرئيسية لبرنامج استعراض/تصدير البيانات الذي يعرض خيارات تحليل البيانات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: نقاط بيانات الاستعراض التي تم الحصول عليها من برمجيات الاستعراض/التصدير. في هذه الخطوة، راجع التجربة وأضف نقاط بيانات أو احذفها. تأكد من أن نقطة الاقتران (2 و 7 و 12 و 17 و 22 وما إلى ذلك) دائما في الاختيار. على سبيل المثال ، الاختيار الأول من اليسار هو نقطة البيانات رقم 2 ، ثم نقطة البيانات رقم 10 (ولكن يجب أن يكون الرقم 7). لحل هذه المشكلة ، ما عليك سوى حذف النقاط 3 و 4 و 5. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: قائمة بيانات التصدير على سبيل المثال. في هذه الخطوة، اختر نقاط التجربة المراد تصديرها. اختر نقطة اقتران (2 و7 و12 و17 و22 وما إلى ذلك) واطرح خطوات المعايرة السابقة (1 و6 و11 و16 و21 وما إلى ذلك). أضف جميع النقاط إلى قائمة التصدير وقم بتصدير هذه البيانات للحصول على جدول بيانات يحتوي على I-Response لكل نقطة بيانات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S5: مخطط الرابطة الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور y مع I-Response في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور x مع تركيزات Cdc37 التحليلية المختلفة. تم إنشاء هذه المؤامرة باستخدام نقاط البيانات من التجربة الأولى واستبعدت نقطة بيانات تركيز 3000 نانومتر. ويرد ملخص لنتائج التحليل في الرسم البياني؛ بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD 0.006 ± 0.081 ميكرومتر وقيمة R2 0.98. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S6: ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من التجربة 2 تكرر 1. (أ) رصد بيانات التجارب في الوقت الحقيقي. يتوافق المحور y مع I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي (BU) ، ويتوافق المحور x مع النقاط الزمنية والتركيزات المختلفة للتحليل في التجربة. يتوافق هذا الرقم مع البيانات المستمدة من التكرار الثاني الذي تم إجراؤه في التجربة الثانية حيث تم تجميد Hsp90 على الشريحة (500 نانومتر) وتم تحضير 10 تركيزات من تحليل Cdc37 (0.4-200 نانومتر). يبدأ الرسم البياني I-Response في الوقت الفعلي في البداية من 0 ويزداد تدريجيا عند زيادة تركيزات التحليل في كل دورة من دورات التجربة ، مما يشير إلى نجاح التجربة. (ب) مخطط هيل فيت الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور y مع I-Response ، ويتوافق المحور x مع تركيزات التحليل (Cdc37) في nM. أظهرت نتائج التحليل الآلي قيمة KD منخفضة نسبيا وانحرافا معياريا منخفضا قدره 0.0531 ± 0.0002 μM ، مما يشير إلى تفاعل قوي بين Hsp90 و Cdc37. (C) تم إنشاء مخطط الارتباط باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور y مع I-Response في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور x مع تركيزات Cdc37 التحليلية المختلفة. تم إنشاء هذا المخطط باستخدام نقاط البيانات الواردة في الجدول S1. ويرد ملخص لنتائج التحليل في الرسم البياني؛ بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD 0.003 ± 0.009 ميكرومتر وقيمة R2 0.99. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S7: ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من التجربة 2 نسخة طبق الأصل 1. (أ) رصد بيانات التجارب في الوقت الحقيقي. يتوافق المحور y مع I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي (BU) ، ويتوافق المحور x مع النقاط الزمنية والتركيزات المختلفة للتحليل في التجربة. يتوافق هذا الرقم مع البيانات المستمدة من التكرار الثالث في التجربة الثانية حيث تم تجميد Hsp90 على الشريحة (500 نانومتر) وتم تحضير 10 تركيزات من تحليل Cdc37 (0.4-200 نانومتر). (ب) مخطط هيل فيت الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور y مع I-Response ، ويتوافق المحور x مع تركيزات التحليل (Cdc37) في nM. أظهرت نتائج التحليل الآلي قيمة KD منخفضة نسبيا وانحرافا معياريا منخفضا قدره 0.0719 ± 0.0007 μM ، مما يشير إلى تفاعل قوي بين Hsp90 و Cdc37. (C) مخطط الارتباط الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور y مع I-Response في نهاية مرحلة الارتباط. يتوافق المحور x مع تركيزات Cdc37 التحليلية المختلفة. تم إنشاء هذه المؤامرة باستخدام نقاط البيانات الواردة في الجدول S2. ويرد ملخص لنتائج التحليل في الرسم البياني؛ بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD 0.004 ± 0.009 ميكرومتر وقيمة R2 0.99. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S8: ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من تجربة التحكم. (أ) رصد بيانات التجارب في الوقت الحقيقي. يتوافق المحور y مع I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي (BU) ، ويتوافق المحور x مع النقاط الزمنية والتركيزات المختلفة للتحليل في التجربة. يتوافق هذا الرقم مع البيانات المستمدة من تجربة التحكم حيث تم تجميد Hsp90 على الشريحة (500 نانومتر) وتم تحضير 10 تركيزات من تحليل BSA (بروتين التحكم) (0.4-200 نانومتر). يبدأ الرسم البياني I-Response في الوقت الفعلي من استجابة I-Response المنخفضة حول 10-15 BU ولا يزداد عند زيادة تركيزات التحليل في كل دورة من دورات التجربة ، مما يشير إلى عدم وجود تفاعل بين Hsp90 و BSA. (ب) مخطط هيل فيت الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور y مع I-Response. يتوافق المحور x مع تركيزات التحليل (BSA) في نانومتر. أظهرت نتائج التحليل الآلي أنه لا توجد بيانات كافية لحساب قيمة KD مما يشير إلى عدم وجود تفاعل بين Hsp90 و BSA. (ج) مخطط الرابطة الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور y مع I-Response في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور x مع تركيزات BSA التحليلية المختلفة. تم إنشاء هذه المؤامرة باستخدام نقاط البيانات الواردة في الجدول S4. ويرد ملخص لنتائج التحليل في الرسم البياني؛ بالنسبة لهذه التجربة، تكون قيمة KD -0.009 ± -0.0003 μM وقيمة R2 هي 0.82. تشير قيمة KD السالبة القريبة من الصفر إلى عدم وجود تفاعل بين Hsp90 و BSA. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي دال-1: ملخص لقيم I-Response التي تم إنشاؤها عند كل نقطة تركيز وقراءتها من ترانزستورات كل شريحة (ثلاثة ترانزستورات مختلفة لكل رقاقة). يتوافق هذا الجدول مع البيانات المستخرجة من التكرار الثاني الذي تم إجراؤه للتجربة الثانية حيث تم تجميد Hsp90 على الشريحة (500 نانومتر) وتم تحضير 10 تركيزات من تحليل Cdc37 (0.4-200 نانومتر). تم استخدام نقاط البيانات من هذا الجدول للتحليل في برنامج التحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي دال-2: ملخص لقيم I-Response التي تم إنشاؤها عند كل نقطة تركيز وقراءتها من ترانزستورات كل شريحة (ثلاثة ترانزستورات مختلفة لكل رقاقة). يتوافق هذا الجدول مع البيانات المستخرجة من التكرار الثالث الذي تم إجراؤه للتجربة الثانية حيث تم تجميد Hsp90 على الشريحة (500 نانومتر) وتم تحضير 10 تركيزات من تحليل Cdc37 (0.4-200 نانومتر). تم استخدام نقاط البيانات من هذا الجدول للتحليل في برنامج التحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي دال-3: ملخص لقيم I-Response التي تم إنشاؤها عند كل نقطة تركيز وقراءتها من ترانزستور كل شريحة (ثلاثة ترانزستورات مختلفة لكل رقاقة). يتوافق هذا الجدول مع البيانات المستمدة من تجربة التحكم حيث تم تجميد Hsp90 على الشريحة (500 نانومتر) وتم تحضير 10 تركيزات من تحليل BSA (0.4-200 نانومتر). تم استخدام نقاط البيانات من هذا الجدول للتحليل في برنامج التحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم تقييم جدوى استخدام تقنية FEB (نهج توصيف حركي في الوقت الفعلي) لتحديد التفاعل الجزيئي الحيوي بين Hsp90 و Cdc37. اقترحت التجربة الاستكشافية الأولية (التجربة الأولى) أن اختيار تركيزات التحليل المناسبة هو جزء حاسم من التجربة وأنه ينبغي تصميم التجربة من خلال تضمين نقاط تركيز أعلى وأسفل قيمة KD ، والتي تم التنبؤ بها بناء على البيانات المتاحة في الأدبيات.

ومع ذلك ، إذا لم تكن هناك معلومات أولية حول التفاعل ، فإننا نقترح تصميم تجربة أولية من خلال تضمين مجموعة واسعة من نقاط التركيز في كل من النطاقات الأقل (0.08 نانومتر ، 0.16 نانومتر ، 0.4 نانومتر ، 2 نانومتر) وأعلى (1000 نانومتر ، 2500 نانومتر ، 5000 نانومتر). توفر التجربة الأولية تقديرا تقريبيا لقيمة K D وتمكن من تخطيط التجارب اللاحقة باستخدام نطاقات التركيز الصحيحة للحصول على قيمة KD دقيقة. يوفر نظام FEB وظيفة بروتوكول تحرير يكون فيها المرء حرا في اختيار عدد نقاط التركيز للتجربة.

من تجربتنا ، فإن أهم الخطوات التي ينطوي عليها بروتوكول FEB هي كما يلي. يجب أن يكون البروتين المستهدف والمخزن المؤقت التحليلي هو نفسه المخزن المؤقت للمعايرة. حتى عدم تطابق المخزن المؤقت الصغير يمكن أن يسبب تقلبات في I-Response ويعطي نتائج غير موثوقة. وبالتالي ، نقترح إجراء غسيل الكلى بين عشية وضحاها عن طريق التبادل العازل المناسب. يعد السحب الدقيق على شريحة المستشعر الحيوي أثناء شفط أو تطبيق حل أمرا بالغ الأهمية طوال التجربة. قد يؤدي السحب المهمل إلى كسر الترانزستورات أو التقلبات في I-Response. أثناء السحب ، تأكد من عدم لمس السطح الحساس للرقاقة. يجب خلط محلول EDC / sulfo-NHS المستخدم في عملية تنشيط الشريحة طازجا قبل كل استخدام. قد يؤدي استخدام خليط قديم إلى شريحة غير وظيفية. تأكد من استخدام نفس المخزن المؤقت لجميع الخطوات الخمس المتكررة (المعايرة والاقتران والتفكك والتجديد والغسيل) المشاركة في جميع دورات التجربة.

عند مقارنة FEB مع أنظمة الكشف الجزيئي الحيوي الراسخة في هذا المجال ، مثل BLI أو SPR ، وجدنا أن جميع الطرق الثلاث تشترك في مزايا مماثلة 43,44,45 وهي: أنها أنظمة خالية من الملصقات ، والتي لا تتطلب أي أصباغ فلورسنت باهظة الثمن للكشف عن التفاعلات. يمكنهم اكتشاف التفاعلات حتى في نطاقات نانومتر صغيرة ؛ الرقائق قابلة لإعادة الاستخدام في كل من SPR و FEB ويمكن إعادة تجديدها وإعادة استخدامها بكفاءة لما يصل إلى 10 تجارب ، وتوفر جميع الطرق الثلاث بيانات حركية في الوقت الفعلي ، ووقت التجربة قصير.

الميزة الرئيسية ل SPR هي أنه يوفر بيانات أكثر شمولا من التجربة بحيث يمكن للمرء حساب KD و Kon و Koff و stoichiometry ومعلمات الديناميكا الحرارية44. الميزة الرئيسية ل BLI هي قدرتها على اختبار تركيزات متعددة في تجربة واحدة. يمكن إجراء القياسات الحركية في وقت واحد لمدة تصل إلى ثمانية تركيزات باستخدام أجهزة استشعار مختلفة. ومع ذلك ، فإن أجهزة استشعار BLI غير قابلة لإعادة الاستخدام ، مما يجعل تكلفة التجربة مرتفعة للغاية43.

الميزة الرئيسية ل FEB هي برنامجها الآلي سهل الاستخدام الذي يوجه المستخدم طوال التجربة ، ومنصة السحب المفتوحة التي تسمح للمستخدم بإضافة التحليل إلى الهدف المعطل في كل خطوة. هذا النهج المفتوح السحب جنبا إلى جنب مع برنامج بسيط يجعل FEB سهل التعلم ويتطلب القليل من التدريب أو حتى لا يتطلب أي تدريب. ومع ذلك ، فإنه يتطلب أن يكون لدى المستخدم إتقان أساسي للسحب اليدوي ، ويعني عدم وجود معالجة تلقائية للسوائل أن قابلية تكرار توقيت الخطوة تعتمد كليا على المستخدم. هذا النقص نفسه في التعامل المتكامل مع السوائل يعني أن الرقائق والأدوات فعالة من حيث التكلفة مقارنة ب SPR أو BLI. يظهر FEB أيضا قابلية عالية للتكرار والموثوقية في الكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية بسبب عملية التصنيع المحددة التي ينطوي عليها إعداد رقاقة الاستشعار الحيوي35.

بالمقارنة مع طريقة الكشف عن ITC الراسخة والقياسية ، يستخدم FEB 50 ميكرولتر فقط من حجم التحليل بتركيزات نانومولية للتجربة بأكملها ، مما يقلل من فرصة التنوي أو تجميع البروتينات. واحدة من أكبر المشاكل مع ITC هي تفريغ البروتينات قبل التحميل لتجنب فقاعات الهواء. خلال تجربة ITC ، هناك فرصة لتطوير فقاعات داخل خلية القياس بسبب التحريك المستمر والتطهير المكثف ، مما قد يؤدي إلى تناثر محلول العينة سلبا أو التسبب في فقدان العينة42. تتغلب تقنية FEB على هذه التحديات التي يواجهها مركز التجارة الدولية من خلال توفير كيمياء قوية لتجميد الأهداف ، والحد من التجميع والفقاعات ، وزيادة الاستقرار ، وتحسين المشاكل المعتمدة على التركيز التي يواجهها مركز التجارة الدولية.

العيب المحتمل لأجهزة FEB هو قابليتها للتغيرات في تكوين المخزن المؤقت وتركيزه ، مما قد يتسبب في انحراف في خط الأساس الذي يجب تصحيحه أثناء تركيب النتائج وتحليلها. شريحة الاستشعار الحيوي حساسة أيضا لدرجة الحموضة والملح ، لذلك يجب أن تكون المخازن المؤقتة المستخدمة أثناء معايرة وقياس التحليل هي نفسها طوال التجربة. المواد الكيميائية المستخدمة كمواد حافظة (على سبيل المثال ، أزيد الصوديوم) والجزيئات الكارهة للماء يمكن أن تلحق الضرر بالمستشعر وقد تسبب زيادة في الربط غير المحدد. يمكن تخفيف هذه العيوب مع الانتباه إلى اتساق المخزن المؤقت طوال خطوات القياس ، وغسيل الكلى للمركبات المتداخلة من مخزون التحليل ، والتخميل المناسب للسطح (على سبيل المثال ، استخدام المنظفات ، حاصرات البروتين ، أو جزيئات PEG المختلفة).

باختصار ، أظهرنا بنجاح مؤشر أسعار المنتجين القوي بين Hsp90 / Cdc37 باستخدام تقنية FEB والتحقق من تفاعلها باستخدام ITC ، مما يوفر بيانات مشجعة لدعم FEB كطريقة بديلة مبتكرة للكشف عن PPI. تقدم تقنية FEB مجموعة واسعة من التطبيقات في مجالات متنوعة من اكتشاف الأدوية ، والمستحضرات الصيدلانية ، والتحليل الجزيئي الحيوي للجزيئات الصغيرة ، والببتيدات ، والبروتينات ، وتطوير الأجسام المضادة ، والتحقق من صحة الأدوية ، وتحسين الرصاص في متناول أيدينا من خلال ترجمة النشاط البيولوجي في المختبر بسهولة إلى فعالية في الجسم الحي . بالنظر إلى مزايا تقنية FEB وتطبيقاتها الهائلة في استكشاف تفاعلات PPI والبروتين والحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى تفاعلات البروتين والجزيئات الصغيرة (مثل الدواء) ، نقترح أنها تقنية فريدة وواعدة في مجموعة أدوات الكشف عن PPI. في حالتنا ، توفر تقنية FEB أداة قيمة لتقييم الفعالية الملزمة بسهولة للخصوم المرشحين ل Hsp90 / Cdc37 PPI ، والتي تساعد بعد ذلك في اختيار المرشحين الواعدين لمزيد من التقييمات في المختبر وفي الجسم الحي المتعلقة بالأمراض المختلفة التي يكون فيها مؤشر أسعار المنتجين هذا أمرا بالغ الأهمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح، سواء كانت مالية أو غير مالية.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من خلال منحة من مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) إلى S.K.S. و N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 181 ، دورة انقسام الخلايا 37 ، Cdc37 ، بروتين الصدمة الحرارية 90 ، Hsp90 ، كيناز البروتين ، المستشعر الحيوي للجرافين ، الاستشعار الحيوي للتأثير الميداني ، السرطان ، التفاعلات الجزيئية الحيوية
استكشاف التفاعل الجزيئي الحيوي بين Molecular Chaperone Hsp90 وبروتين العميل Kinase Cdc37 باستخدام تقنية الاستشعار الحيوي ذات التأثير الميداني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter