Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Alan etkili biyosensing (FEB), biyomoleküler etkileşimleri tespit etmek için etiketsiz bir tekniktir. Elektrik akımını, bağlanma hedeflerinin hareketsiz bırakıldığı grafen biyosensörü aracılığıyla ölçer. Hsp90 ve Cdc37 arasındaki biyomoleküler etkileşimleri değerlendirmek için FEB teknolojisi kullanıldı ve iki protein arasında güçlü bir etkileşim tespit edildi.

Abstract

Biyomoleküler etkileşimler, fonksiyonel olarak ilgili biyolojik olayları düzenleyerek ve koordine ederek çok sayıda hücresel süreçte çok yönlü roller oynar. Proteinler, karbonhidratlar, vitaminler, yağ asitleri, nükleik asitler ve enzimler gibi biyomoleküller canlıların temel yapı taşlarıdır; sayısız yaşam olayını senkronize etmek için biyosistemlerdeki karmaşık ağlarda bir araya gelirler. Proteinler tipik olarak işlevlerini yerine getirmek için karmaşık interaktom ağları kullanırlar; bu nedenle, hem hücresel hem de organizma düzeylerindeki hücrelerdeki önemlerini çözmek için bu tür etkileşimleri değerlendirmek zorunludur. Bu amaç doğrultusunda, spesifik biyomoleküler etkileşimleri belirlemek için hızla gelişen bir teknoloji olan alan etkisi biyosensing'i (FEB) tanıtıyoruz. FEB, belirli etkileşimleri belirlemek için tezgah üstü, etiketsiz ve güvenilir bir biyomoleküler tespit tekniğidir ve yüksek kaliteli elektronik tabanlı biyosensörler kullanır. FEB teknolojisi, biyosensör yüzeyinde kullanılan biyouyumlu nanomalzemeler nedeniyle nanomolar aralıktaki etkileşimleri izleyebilir. Kavramın bir kanıtı olarak, ısı şoku proteini 90 (Hsp90) ve hücre bölünme döngüsü 37 (Cdc37) arasındaki protein-protein etkileşimi (PPI) açıklığa kavuşturulmuştur. Hsp90, birçok proteinin katlanması, stabilitesi, olgunlaşması ve kalite kontrolünde önemli bir rol oynayan, böylece çoklu hayati hücresel fonksiyonları düzenleyen ATP'ye bağımlı bir moleküler şaperondur. Cdc37, protein kinazına özgü bir moleküler şaperon olarak kabul edilir, çünkü protein kinazlarını özellikle tanır ve aşağı akış sinyal iletim yollarını düzenlemek için Hsp90'a alır. Bu nedenle, Cdc37, Hsp90'ın bir ko-şaperonu olarak kabul edilir. Şaperon-kinaz yolu (Hsp90 / Cdc37 kompleksi) hücresel büyümeyi teşvik eden çoklu malignitelerde hiper-aktive edilir; bu nedenle, kanser tedavisi için potansiyel bir hedeftir. Bu çalışma, Hsp90/Cdc37 model sistemini kullanarak FEB teknolojisinin verimliliğini göstermektedir. FEB, iki protein arasında güçlü bir PPI tespit etti (üç bağımsız deneyde 0.014 μM, 0.053 μM ve 0.072 μM KD değerleri). Özetle, FEB, hızlı ve doğru ölçümler sunan, etiketsiz ve uygun maliyetli bir PPI algılama platformudur.

Introduction

Biyomoleküler etkileşimler:
Proteinler organizmaların temel parçalarıdır ve hücre metabolizması, hücre yapısı, hücre sinyalizasyonu, bağışıklık tepkileri, hücre yapışması ve daha fazlası gibi çok sayıda moleküler yola katılırlar. Bazı proteinler işlevlerini bağımsız olarak yerine getirirken, çoğu protein, uygun biyolojik aktiviteyi koordine etmek için bir bağlayıcı arayüz kullanarak diğer proteinlerle etkileşime girer1.

Biyomoleküler etkileşimler esas olarak, örneğin protein yüzeylerine, karmaşık stabiliteye veya etkileşimlerin kalıcılığına bağlı olarak2 ile ilgili proteinlerin farklı yapısal ve fonksiyonel özelliklerine göre sınıflandırılabilir3. Esansiyel proteinleri ve biyomoleküler etkileşimlerdeki rollerini tanımlamak, moleküler düzeyde biyokimyasal mekanizmaları anlamak için hayati önemesahiptir 4. Şu anda, bu etkileşimleri tespit etmek için çeşitli yaklaşımlar vardır5: in vitro6, in siliko7, canlı hücrelerde8, ex vivo 9 ve in vivo10, her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahiptir.

İn vivo tahliller, tüm hayvanı deneysel bir araç olarak kullanarak gerçekleştirilir11 veex vivo tahliller, doğal koşullarda minimum değişiklik sağlayarak kontrollü bir dış ortamda doku ekstraktları veya tüm organlar (örneğin, kalp, beyin, karaciğer) üzerinde gerçekleştirilir. İn vivo ve ex vivo çalışmaların en yaygın uygulaması, potansiyel farmakolojik ajanların farmakokinetik, farmakodinamik ve toksisite etkilerini, genel güvenlik ve etkinliklerini sağlayarak insan denemelerinden önce değerlendirmektir12.

Biyomoleküler etkileşimler canlı hücreler içinde de tespit edilebilir. Canlı hücrelerin görüntülenmesi, belirli bir biyokimyasal yolun reaksiyonlarını yürütürken dinamik etkileşimleri gözlemlememizi sağlar13. Ayrıca, biyolüminesans veya floresan rezonans enerji transferi gibi tespit teknikleri, bu etkileşimlerin hücre14 içinde nerede ve ne zaman gerçekleştiği hakkında bilgi sağlayabilir. Canlı hücrelerde algılama çok önemli ayrıntılar sunsa da, bu tespit metodolojileri yerel biyolojiyi yansıtmayabilecek optik ve etiketlere dayanır; Ayrıca in vitro yöntemlerden daha az kontrollüdürler ve15'i gerçekleştirmek için özel uzmanlık gerektirirler.

In silico hesaplama yöntemleri öncelikle in vitro deneylerden önce hedef moleküllerin büyük ölçekli taranması için kullanılır. Hesaplamalı tahmin yöntemleri, bilgisayar tabanlı veritabanları, moleküler kenetlenme, nicel yapı-aktivite ilişkileri ve diğer moleküler dinamik simülasyon yaklaşımları köklü in silico araçları arasındadır16. Zahmetli deneysel tekniklerle karşılaştırıldığında, in silico aletleri yüksek hassasiyetle kolayca tahminlerde bulunabilir, ancak öngörücü performansta daha düşük doğrulukla17.

In vitro testler, standart biyolojik bağlamlarının dışındaki mikroorganizmalar veya biyolojik moleküllerle gerçekleştirilir. Biyomoleküler etkileşimleri in vitro yöntemlerle tasvir etmek, protein fonksiyonlarını ve karmaşık hücre işleyiş ağının arkasındaki biyolojiyi anlamak için kritik öneme sahiptir. Tercih edilen tahlil metodolojisi, proteinin içsel özelliklerine, kinetik değerlerine ve etkileşimlerin modu ve yoğunluğuna göre seçilir18,19.

Hsp90/Cdc37 etkileşimi:
Hsp90 ve Cdc37'yi birbirine bağlayan şaperon-kinaz yolu, tümör biyolojisi20'de umut verici bir terapötik hedeftir. Hsp90, hücre döngüsü kontrolünde, protein montajında, hücre sağkalımında ve sinyal yollarında merkezi bir rol oynar. İşlevleri için Hsp90'a güvenen proteinler, Cdc37 gibi bir ko-şaperon aracılığıyla kompleksleşme için Hsp90'a verilir. Hsp90 / Cdc37 kompleksi, çoğu protein kinazının katlanmasını kontrol eder ve çok sayıda hücre içi sinyal ağı için bir merkez görevi görür21. Akut miyeloblastik lösemi, multipl miyelom ve hepatosellüler karsinom22,23 gibi çeşitli malignitelerde yüksek ekspresyonu nedeniyle umut verici bir anti-tümör hedefidir.

Yaygın olarak kullanılan in vitro biyomoleküler etkileşim tespit teknikleri
Ko-immünopresipitasyon (co-IP), biyolojik olarak ilgili etkileşimleri tanımlamak için antijen-antikor özgüllüğüne dayanan bir tekniktir24. Bu yöntemin birincil dezavantajı, düşük afiniteli etkileşimleri ve kinetik değerleri tespit edememesidir24. Kinetik değerlerin belirlenmesinde izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyolayer interferometrisi (BLI) ve FEB teknolojisi gibi biyofiziksel yöntemler tercih edilmektedir.

ITC, biyomoleküler etkileşimleri karakterize etmek için eksiksiz bir termodinamik analiz ile birlikte bağlanma enerjisinin belirlenmesine dayanan biyofiziksel bir tespit yöntemidir25. ITC'nin birincil avantajı, hedef proteinin herhangi bir etiketlenmesini veya sabitlenmesini gerektirmemesidir. ITC'nin karşılaştığı başlıca zorluklar, bir deney için gereken yüksek hedef protein konsantrasyonu ve küçük bağlayıcı entalpiler nedeniyle kovalent olmayan komplekslerin analizindeki zorluktur26. Hem SPR hem de BLI, sensör yüzeyindeki hedef molekülün immobilizasyonuna dayanan etiketsiz biyofiziksel tekniklerdir, ardından hareketsiz hedef27,28 üzerine analitin daha sonra enjekte edilmesidir. SPR'de, biyomoleküler etkileşimler sırasında kırılma indisindeki değişiklikler ölçülür27; BLI'da, yansıyan ışıktaki girişim,zamanın 28'inin bir fonksiyonu olarak dalga boyundaki bir değişiklik olarak gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Hem SPR hem de BLI, yüksek özgüllük, hassasiyet ve algılama yetenekleri sunmanın ortak avantajlarını paylaşır29. Her iki yöntemde de, hedef protein biyosensör yüzeyleri üzerinde hareketsiz hale getirilir ve bu nedenle, hedefin doğal konformasyonunda bir miktar kayıp olabilir, bu da spesifik ve spesifik olmayan etkileşimler arasında ayrım yapmayı zorlaştırır30. BLI, hedefi hareketsiz hale getirmek için pahalı tek kullanımlık fiber optik biyosensörler kullanır ve bu nedenle pahalı bir tekniktir31. Bu köklü biyomoleküler tespit araçlarıyla karşılaştırıldığında, FEB teknolojisi, kinetik karakterizasyon ile gerçek zamanlı olarak biyomoleküler algılama için düşük nanomolar konsantrasyonlar kullanarak güvenilir ve etiketsiz bir platform sunar. FEB teknolojisi ayrıca ITC'de karşılaşılan köpüren zorlukların üstesinden gelir ve SPR veya BLI'ya kıyasla daha uygun maliyetlidir.

Alan etkili transistör (FET) tabanlı biyosensörler, çeşitli biyomedikal uygulamalar sunarak biyomoleküler etkileşimleri tespit etmek için ortaya çıkan bir alandır. FET sisteminde, hedefler biyosensör çiplerine hareketsiz hale getirilir ve etkileşimler iletkenlikteki değişikliklerle tespit edilir32. Verimli bir elektronik biyosensörün geliştirilmesinde göz önünde bulundurulması gereken benzersiz özellik, sensör yüzeyini imal etmek için kullanılan kaplama malzemesinin yarı iletken doğası ve kimyasal kararlılığı gibi fizikokimyasal özelliklerdir33. FET için kullanılan silikon gibi geleneksel malzemeler, sensörlerin hassasiyetini sınırlamıştır, çünkü transistör kanalı ile düzgün çalışması için belirli bir ortam arasında sıkışmış oksit tabakaları gerektirir34. Dahası, silikon transistörler yüksek tuz ortamlarına duyarlıdır, bu nedenle doğal ortamlarındaki biyolojik etkileşimleri ölçmeyi zorlaştırır. Grafen bazlı biyosensör, mükemmel kimyasal stabilite ve elektrik alanı sunduğu için alternatif olarak sunulmaktadır. Grafen tek bir atomik karbon tabakası olduğundan, hem yarı iletken olarak son derece hassastır hem de biyolojik çözeltilerle kimyasal olarak uyumludur; Bu niteliklerin her ikisi de uyumlu elektronik biyosensörler üretmek için arzu edilir35. Grafen kaplı biyosensörler tarafından sunulan biyomoleküllerin olağanüstü ultra yüksek yükleme potansiyeli, grafen bazlı biyosensörlerin FEB teknolojisinin geliştirilmesine yol açmaktadır.

FEB teknolojisinin prensibi: FEB, bağlanma hedeflerinin hareketsiz bırakıldığı grafen biyosensör aracılığıyla elektrik akımını ölçen etiketsiz bir biyomoleküler tespit tekniğidir. İmmobilize protein ve analit arasındaki etkileşimler, gerçek zamanlı olarak izlenen akımdaki değişikliklere neden olur ve doğru kinetik ölçümler sağlar36.

Enstrümantasyon: FEB sistemi, bir grafen alan etkili transistör (gFET) sensör çipi ve deney boyunca sabit bir voltaj uygulayan bir elektronik okuyucudan oluşur (Şekil 1). Analit, biyosensör yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiş hedef proteine çözelti halinde uygulanır. Bir etkileşim meydana geldiğinde, akımdaki bir değişiklik gerçek zamanlı olarak ölçülür ve kaydedilir. Analit konsantrasyonu arttıkça, bağlı analitin fraksiyonu da artacak ve akımda daha yüksek değişimlere neden olacaktır. Cihazla birlikte verilen otomatik analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanılarak I-Response, biyolojik algılama birimleri (BU)37 cinsinden ölçülür ve kaydedilir. I-Response, hareketsiz hedefin analit ile etkileşimi üzerine gerçek zamanlı olarak ölçülen biyosensör çipi aracılığıyla akımdaki (I) değişiklik olarak tanımlanır. FEB otomatik analiz yazılımı, C-Yanıtının kapasitanstaki (C) değişiklikleri kaydettiği dinamik etkileşim olaylarına hem I-Yanıtını hem de C-Yanıtını analiz edebilir. Hem I-Response hem de C-Response'deki varyasyonlar doğrudan bağlı analitin fraksiyonuna karşılık gelir ve KD değerleri üretmek için daha fazla analiz edilebilir. Otomatik analiz yazılımının varsayılan tercihi I-Response'dir.

Figure 1
Şekil 1: Deney düzeneğine genel bakış . (A) Grafen esaslı çip ve elektronik okuyucu. (B) Çip bileşenlerine genel bakış. Çip, sisteme akım sağlayan iki elektrota bağlanır. Çipin yüzeyi, etkinleştirildiğinde hedefi bağlayabilen grafen ile kaplıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Metodoloji:
Başlangıçta, aktif biyosensör çipi FEB cihazına yerleştirilir (Şekil 1) ve ardından aşağıda özetlenen adımların uygulanması: (1) Kalibrasyon: Deney, temel denge tepkisini oluşturmak için 1x fosfat tamponlu salin (PBS; pH = 7.4) kullanılarak sistem kalibrasyonu ile başlar. (2) İlişkilendirme: Analit, çipe verilir ve bağlanma doygunluğuna ulaşılana kadar I-Response izlenir. (3) Ayrışma: Analit, 1x PBS kullanılarak ayrıştırılır. (4) Rejenerasyon: Analitin kalıntıları 1x PBS kullanılarak çıkarılır. (5) Yıkama: Bağlı ve bağlanmamış analitlerin çipten tamamen çıkarılması için 1x PBS kullanılarak toplam beş yıkama yapılır.

Analiz:
Veri analizi, cihazla birlikte verilen tam otomatik yazılım kullanılarak gerçekleştirilir. Otomatik analiz yazılımı, KD değerine sahip bir Hill fit grafiği oluşturur. Hill fit grafiği, bir analitin hedef proteinle ilişkisini analit konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak tanımlar. Yarım maksimum yanıtın elde edildiği konsantrasyon, KD değeri ile orantılıdır. Düşük bir KD değeri, yüksek bağlanma afinitesini temsil eder ve bunun tersi de geçerlidir.

FEB deneyinden elde edilen verileri doğrulamak için, I-Yanıtları, veri gözden geçirme/dışa aktarma yazılımı kullanılarak her bir analit konsantrasyonu için her okuma noktasından çıkarılır ve aşağıda açıklandığı gibi diğer istatistiksel analiz yazılımlarına (bkz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışmada kullanılan rekombinant proteinler, Hsp90 ve Cdc37, ticari olarak elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Çip aktivasyonu

NOT: Deneyde kullanılacak tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Hazırlanan tüm çözeltileri steril 0,2 μm filtreden süzün.

  1. 15 mL'lik bir tüpte 2.5 mL'lik 1 M 2-(N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) tamponuna (pH = 6.0) 2 mg EDC ekleyerek 1-Etil-3-(3-dimetilamino propil) karbodiimid (EDC) çözeltisi hazırlayın. Ayrı bir 15 mL tüp içinde 2,5 mL'lik 1 M MES tamponuna (pH = 6,0) 6 mg sülfosülfo-NHS ekleyerek N-Hidroksisülfosüksinamid (sülfo-NHS) çözeltileri hazırlayın. Aliquot 50 μL bağımsız tüplerde her çözeltinin 50 μL'si ve gelecekte kullanım için -20 ° C'de saklayın.
  2. Eşit hacimlerde EDC kum sülfo-NHS çözeltisini (50 μL EDC + 50 μL sülfo-NHS) yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın (vorteks yapmayın).
    NOT: EDC / sulfo-NHS'nin karışık çözeltisi, uygun çip işlevselliği için etkili çapraz bağlamayı sürdürmek için 30 dakika içinde kullanılmalıdır.
  3. Şirket tarafından sağlanan biyosensör çipini (5,7 cm x 2,4 cm; bakınız Malzeme Tablosu) kapaklı bir cam Petri kabına yerleştirin. Talaş aktivasyonunda yer alan tüm işlevselleştirme adımlarının Petri kabı içinde yapılması önerilmektedir. Biyosensör çipine 50 μL 1 M MES tamponu (pH = 6,0) uygulayın, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin ve ardından tamponu aspire edin.
  4. Sensör çipine hemen 50 μL EDC/sulfo-NHS çözeltisi uygulayın. Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Çipten EDC / sülfo-NHS çözeltisini aspire edin.
  5. Talaş 50 μL 1 M MES tamponu ile bir kez durulayın (pH = 6,0); MES tamponunu aspire edin.

2. Hedef protein immobilizasyonu

  1. Talaş 50 μL 1x PBS (pH = 7,4) ile 2x durulayın. PBS'yi çipten aspire edin ve hedef molekül Hsp90'ı (50 μL; 500 nM) ekleyin.
    NOT: Arabellek uyuşmazlığı tüm denemeyi mahvedebilir; Bu nedenle, deneyden önce, hedef molekülün kalibrasyon için kullanılanla aynı tamponda olduğundan emin olmak önemlidir (örneğin, 1x PBS (pH = 7.4)). Gerekirse, deneyden önce gece diyalizi ile bir tampon değişimi gerçekleştirin. Bu deneyde, her iki rekombinant protein, Hsp90 ve Cdc37 için, 4 ° C'de uygun tampon değişimi ile 1x PBS'ye (pH = 7.4; Malzeme Tablosuna bakınız) karşı gece diyalizi gerçekleştirildi. Hedef materyalin konsantrasyonu (bu durumda Hsp90), farklı deneysel protokollere ve hedef malzemelerin (protein / peptid / ligandlar) doğasına göre değişebilir.
  2. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Hedef molekülü içeren çözeltiyi aspire edin ve 50 μL 1x PBS (pH = 7.4) ile 3x'i durulayın. 1x PBS (pH = 7.4) çözeltisini çipten aspire edin.
  3. Çipe 50 μL Söndürme 1 (1x PBS (pH = 7.4)) çözeltisinde 3.9 mM amino-PEG5-alkol) çözeltisi ekleyin. cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Quench 1 çözeltisini çipten aspire edin.
  4. Çipe 50 μL Söndürme 2 (1 M etanolamin (pH = 8.5)) çözeltisi ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Çipten Söndürme 2 çözeltisini aspire edin ve 50 μL 1x PBS kullanarak çipi 5x durulayın, böylece son PBS damlacığını sensör üzerinde bırakın.

3. Analit numunelerinin hazırlanması

  1. İstenilen konsantrasyon aralığında Cdc37 için analit seyreltme serisi hazırlayın. İlk deney için aşağıdaki konsantrasyonlar kullanıldı: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM ve 5.000 nM. İkinci deney için, 0.4 nM ila 200 nM arasında değişen farklı bir konsantrasyon seti kullanıldı.
  2. Deneyi, güvenilir bir KD değeri elde etmek için en az sekiz farklı analit konsantrasyonu içerecek şekilde tasarlayın. Analit proteininin farklı seyreltimlerini, kalibrasyon ve hedef protein için kullanılanla aynı tamponda hazırlayın; burada 1x PBS'dir (pH = 7.4).

4. Aktif biyosensör çipinin FEB cihazına yüklenmesi

NOT: FEB cihazı, LED ışık göstergelerine sahip bir okuyucu ve biyosensör çipini takmak için bir kartuştan oluşur.

  1. Hedef protein immobilizasyonundan sonra, etkinleştirilen çipi USB üzerinden bir bilgisayara bağlanan cihazın kartuşuna takın. Talaş takıldıktan sonra, okuyucuda FEB cihazının deney için hazır olduğunu gösteren yeşil bir LED ışık görüntülenecektir. Deneyi aşağıda açıklandığı gibi adım adım izlemek için şirket tarafından sağlanan otomatik yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) FEB cihazının bağlı olduğu bilgisayara yükleyin.

5. Denemeyi çalıştırın

  1. Otomatik yazılımdaki Deneyi Çalıştır modülüne basın ve Rejenerasyon veya istenen başka bir protokolle 10 Nokta seçin. Şu ayrıntıları girin: operatör adı, deneme adı, tarih (ör. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); rejenerasyon tamponu (örneğin, PBS tamponu); hareketsiz hedef (örneğin, Hsp90); çözeltideki analit (örneğin, Cdc37). Ayrıntılar için Ek Şekil S1'e bakın.
  2. Yazılımda görüntülenen Denemeyi Başlat düğmesine basın ve aşağıda açıklandığı gibi otomatik yazılım tarafından gösterilen talimatları izleyin.
    NOT: Yazılım tamamen otomatiktir, kullanıcı dostudur ve deneme boyunca kullanıcıyı adım adım yönlendirir. Ekranda, denemenin her adımında ilerlemeye yönelik talimatları içeren bir açılır pencere görünür. Yazılım, deney boyunca her analit konsantrasyonu için kalibrasyon, analit ilişkisi, ayrışma, rejenerasyon ve yıkamadan (5x) ardışık olarak her tekrarlayan adım için talimatlar sağlayacaktır.
  3. Cihaz kalibrasyonu yapın. Bunu yapmak için, kalan PBS çözeltisini çipten aspire edin ve 50 μL kalibrasyon tamponu uygulayın (1x PBS; pH = 7.4). Devam düğmesine basın ve kalibrasyon adımı bitene kadar 5 dakika bekleyin. Yazılım, kalibrasyon adımı (5 dakika) için belirlenen uç noktayı takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.
  4. Ardından, bir analit ilişkilendirmesi gerçekleştirin. Bunu yapmak için, kalibrasyon tamponunu çipten aspire edin ve en düşük analit konsantrasyonunun (25 nM Cdc37) 50 μL'sini uygulayın. Devam düğmesine basın ve ilişkilendirme adımı bitene kadar 5 dakika bekleyin. Yazılım, ilişkilendirme adımının uç noktasını (5 dakika) devam etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.
  5. Bir analit ayrışması gerçekleştirin. Bunu yapmak için, analit çözeltisini çipten aspire edin ve ayrışma tamponunun 50 μL'sini uygulayın (1x PBS; pH = 7.4). Devam düğmesine basın ve ayrışma adımı süresi (5 dakika) bitene kadar 5 dakika bekleyin. Yazılım, ayrışma adımının (5 dakika) uç noktasını takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.
  6. Ardından, çip rejenerasyonu gerçekleştirin. Ayrışma çözeltisini çipten aspire edin ve 50 μL rejenerasyon tamponu uygulayın (1x PBS; pH = 7.4). Devam düğmesine basın ve rejenerasyon adımı süresi (30 sn) bitene kadar 30 s bekleyin. Yazılım, rejenerasyon adımı (30 sn) için uç noktayı takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.
  7. Son olarak, çipi yıkayın. Rejenerasyon çözeltisini talaştan aspire edin ve talaşa 50 μL yıkama tamponu (1x PBS; pH = 7,4) uygulayın. Çözeltiyi çipten aspire edin ve bunu 5x tekrarlayın. Yıkama tamponunun son damlasını çip üzerinde bırakın ve Devam düğmesine basın ve yazılım ekranında yıkama adımı süresi bitene kadar 30 s bekleyin.
    NOT: Yazılım, deneyin bir sonraki döngüsüne devam etmek için yıkama adımının (30 sn) uç noktasını bir uyarı alarmıyla görüntüler.
  8. Kullanılan her analit konsantrasyonu için adımları tekrarlayın; kalibrasyon, analit ilişkisi, ayrışma, rejenerasyon ve yıkamanın beş adımı (5x) bir döngü oluşturur. Burada gösterilen deney için, 10 analit konsantrasyonu için 10 döngü gerçekleştirdik (25 nM ila 5.000 nM veya 0.4 nM ila 200 nM arasında; Şekil 2).

6. Analiz

  1. Deneyin sonundaki otomatik analiz yazılımının üst kısmında görülen Analiz düğmesine basın. Tüm deneme noktalarını içeren bir görüntüleme penceresi görünecektir. Pencerede, öngörülen protokol için kullanılan analit konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olun.
  2. KD değerini otomatik olarak oluşturmak için Analizi Çalıştır düğmesine basın. Yazılım, analit konsantrasyonlarını, dengedeki ayrışma sabitinin, KD değerinin hesaplandığı karşılık gelen I-Yanıtlarına karşı çizerek bir Hill fit grafiği oluşturur.
  3. Aşağıda açıklandığı gibi veri inceleme/dışa aktarma yazılımını kullanarak ham verileri diğer istatistiksel analiz yazılımlarında analiz için dışa aktarın.
    1. Denemenin sonunda otomatik olarak oluşturulan R1R dosyasını (örneğin, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) masaüstündeki yeni bir klasöre kopyalayın. Şirket tarafından sağlanan Veri İnceleme/İhracat yazılımını açın (bkz. Ek Şekil S2A).
    2. Veri işleme > R1R dosyalarını işle > veri inceleme / dışa aktarma yazılımının ana ekranında Tamam'a tıklayın.
    3. Adım 6.3.1'de masaüstünde oluşturulan R1R dosyalarını içeren klasörü seçin. tıklayın ve OK düğmesine basın. Bu, orijinal dosyayı geçersiz kılmadan verileri gözden geçirmek ve düzenlemek için orijinal R1R verilerinin bir kopyasını oluşturur.
    4. Veri inceleme/dışa aktarma yazılımının ana ekranında görülen veri işleme simgesine basın. Tamam'ı > İşlenen R1R dosyalarını yükle'ye basın. İşlenmiş R1R dosyalarını içeren adım 6.3.1'de oluşturulan aynı klasörü seçin. Tamam'a basın. Bu adımda, deneme dosyalarını içeren klasör incelenmeye hazırdır.
    5. Veri inceleme/dışa aktarma yazılımının ana ekranında, Veri Analizi'ne basın. Kalibrasyon > Düzenlenmiş R1R dosyalarını kalibre et > Tamam'ı seçin (Ek Şekil S2B'ye bakın). Bu adım, bir taban çizgisi oluşturmak için tüm veri noktalarını ilk kalibrasyon adımına göre kalibre eder.
    6. Veri inceleme/dışa aktarma yazılımının ana ekranında, Veri Analizi'ne basın. Tamam'> R1R Dosyalarını Gözden Geçir ve Düzenle'yi seçin. Veri noktalarını gözden geçirin, noktaları silin veya Sil/Adım Ekle düğmesini kullanarak adımlar ekleyin. Tüm adımların doğru yerde olduğundan emin olun, örneğin kalibrasyon adımı taban çizgisinde, ilişkilendirme adımı zirvede (Ek Şekil S3'e bakın) ve ardından yapılan tüm değişiklikleri kaydetmek için Kaydet düğmesine basın.
    7. Veri inceleme/dışa aktarma yazılımının ana ekranında, Veri Analizi'ne basın. Verileri Analiz Et/Çiz'i seçin, dışa aktarılacak adımları seçin (bkz. Ek Şekil S4). Verileri dışa aktarmadan önce kalibrasyon adımını (ör. adım 1, adım 6 vb.) dışa aktarma listesine çıkardıktan sonra her ilişkilendirme adımını (ör. adım 2, adım 7 vb.) ekleyin.
    8. Bu Verileri Ver'e basın. Yazılım, her transistörden her analit konsantrasyon veri noktası için I-Response'yi içeren bir elektronik tablo dosyası oluşturur (tüm transistörler çalışıyorsa, her konsantrasyon noktası için üç farklı I-response değerimiz olacaktır). İstatistik yazılımındaki verileri daha fazla analiz etmek için bu elektronik tablo dosyasını kullanın.
  4. İstatistiksel analiz yazılımını açın. Üç Y değeri olan bir XY tablosu oluşturun; Oluştur'a basın. Bu tablonun verileri (X, Y değerleri), adım 6.3.8'de oluşturulan elektronik tablo dosyasından kopyalanır. X ekseni analit konsantrasyonuna karşılık gelir (kullanılan konsantrasyona bağlı olarak) ve üç Y değeri, şirket tarafından sağlanan Veri İnceleme/İhracat yazılımından elde edilen I-Yanıtlarına karşılık gelir.
  5. Bu verileri analiz et düğmesine basın. XY Analizleri > doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) > bir site > toplam > doygunluğu bağlayın. Yazılım verileri otomatik olarak analiz edecek, KD değerini oluşturacak ve veri noktalarının bir grafiğini oluşturacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deney 1'in sonuçları:
Hedef protein Hsp90 (500 nM), yukarıda açıklandığı gibi hedef immobilizasyon protokolünü takiben çipe hareketsiz hale getirildi. İlk deney için, literatürde bulunan verilere dayanarak, 25 nM ila 5.000 nM arasında değişen 10 analit proteini Cdc37 konsantrasyonu hazırlanmıştır (bkz. Tablo 1).

Deneyin adımları, I-Response'da meydana gelen değişiklikler takip edilerek gerçek zamanlı olarak izlenebilir (Şekil 3A). Protokole dahil edilen her adımın deney boyunca I-Response'yi nasıl etkilediğini görselleştirebiliriz. Örneğin, kalibrasyon sırasında I- Yanıtı sıfıra yakındır ve ilişkilendirme adımında, I-Yanıtı artan analit (Cdc37) konsantrasyonları ile kademeli olarak artar. Bu deneyden elde edilen verilere bakıldığında (Şekil 3A), düşük analit konsantrasyonlarında (25 nM'de 50 BU) I-Yanıtında ani bir artış gözlenmiştir. Düşük analit konsantrasyonunda, artan konsantrasyonlarla kademeli olarak artacak düşük bir I-Yanıtı bekleniyordu. Bu ani artış, daha düşük analit konsantrasyon noktalarını içeren bir deneyin tasarlanması gerektiğini düşündürmüştür.

Yukarıda tartışılan protokol adımlarını takiben, veriler, hesaplanan bir KD değerine sahip bir Hill fit grafiğini otomatik olarak oluşturan sağlanan otomatik analiz yazılımında analiz edildi (Şekil 3B). İlk deney için otomatik analiz yazılımından hesaplanan KD değeri 350.000 ± 76.000 μM idi. Yaygın biyolojik etkileşimlerin çoğu, düşük μM veya hatta nM aralığında bir KD değeri gösterdi; bu nedenle, ilk deney için üretilen KD değeri çok yüksektir.

Gözlemlenen yüksek KD değeri için birkaç açıklama olabilir: incelenen iki spesifik protein arasında düşük afiniteli bağlanma olabilir (Hsp90 / Cdc37), bu da moleküler etkileşimler için yüksek bir ligand konsantrasyonunun gerekli olduğu anlamına gelir; deney ideal olmayan, aralık dışı analit konsantrasyonları ile tasarlanmış olabilir; yüksek değer, analiz yazılımının montaj modülünde kullanılan yerleşik parametrelerden kaynaklanabilir. Otomatik analiz yazılımı, veri noktalarına uymak için bir doz-yanıt analiz modülü kullanır, ancak bazı etkileşimler bu modele iyi uymayabilir, bu nedenle yanlış veriler vererek yüksek KD değerlerine neden olur.

Doymuş bir Hill grafiği ile doğru bir K D değeri elde etmek için, düşük hata oranına sahip en düşük KD değerini elde etmek için deneyin hem daha düşük hem de daha yüksek analit konsantrasyon noktalarını içeren deneme yanılma yoluyla standardizasyonu gerekir.

Tüm bu faktörler göz önünde bulundurularak analiz yazılımından elde edilen veriler ek istatistiksel analiz yazılımlarına aktarılmıştır. Her ilişkilendirme noktası için I-Yanıtı, otomatik veri gözden geçirme/dışa aktarma yazılımı kullanılarak ayıklanmıştır ve analiz adımında (adım 6) yukarıda tartışılan adımlar izlenerek Tablo 2'de özetlenmiştir.

İstatistiksel analiz yazılımı sonuçları (Şekil 3C), yüksek standart sapma (0.011 ± 0.494 μM) ve düşük R2 değeri 0.78 ile nispeten düşük bir KD değeri göstermiştir. KD değerinde ve düşük R2 değerinde gözlenen önemli varyasyon, bu deney için seçilen konsantrasyon noktalarının optimal olmadığını göstermiştir. Ek olarak, bazı grafik noktalarının arsa eğilim çizgisine iyi uymadığı da fark edilmiştir (Şekil 3C); bu, farklı analit konsantrasyon noktalarını dahil ederek ikinci bir deney tasarlama ihtiyacını güçlendirdi.

İki analiz yazılımı tarafından kullanılan yerleşik parametreler tamamen farklıdır ve KD değerleri oluşturma sürecine yansır. İki analiz yazılımından elde edilen KD değerlerindeki farklılıklar (350.000 ± 76.000 μM ve 0.011 ± 0.494 μM), hesaplama için farklı analiz modüllerinin kullanıldığı gerçeğine bağlanabilir. İstatistiksel analiz yazılımında yapılan analiz, bu etkileşim için daha uygun olabilir, böylece daha düşük bir KD değeri verir.

Bununla birlikte, her iki analizden elde edilen sonuçlar birleştirilirse (350.000 ± 76.000 μM ve 0.011 ± 0.494 μM), ilk deneyin optimal olmadığı ve ek konsantrasyon noktalarının gerekli olacağı sonucuna varılabilir.

Bu noktayı doğrulamak için, ilişkisiz grafik noktası, 3.000 nM hariç tutulmuştur (bkz. Ek Şekil S5). Analiz sonuçları, 0.006 ± 0.081 μM KD değerini ve R2 değerini 0.98 olarak gösterdi. Bu sonuçlar, bir sonraki deneyin daha alakalı konsantrasyonlara odaklanarak tasarlanması gerektiğini göstermiştir. Bu nedenle, Hsp90 / Cdc37 PPI'yı, tahmin edilen KD'nin altında ve üstünde konsantrasyonlara sahip farklı test noktaları kullanarak değerlendirmek için ikinci bir deney yapılmıştır.

Deney 2'nin sonuçları:
Hedef protein, Hsp90 (500 nM), yukarıda açıklandığı gibi protokol kullanılarak çipe hareketsiz hale getirildi. Toplam 10 konsantrasyonda analit (Cdc37) aşağıdaki gibi hazırlanmıştır: 0.4 nM, 0.8 nM, 1.6 nM, 3.2 nM, 6.4 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM ve 200 nM. İkinci deney, yukarıda belirtildiği gibi önceki deneyden elde edilen tüm içgörüler göz önünde bulundurularak, farklı analit konsantrasyon noktaları dahil edilerek tasarlanmıştır.

Deney sırasında, her adım gerçek zamanlı olarak izlendi (Şekil 4A). Burada, gerçek zamanlı I-Response grafiği (analit-0.4 nM, 0.6 nM, 1.6 nM'nin düşük konsantrasyonlarından türetilmiştir) başlangıçta sıfırdan başlar ve ilk deneyde gözlemlenen I-Response'nin ani artışına kıyasla, deneyin her döngüsünde analit konsantrasyonlarının artması üzerine kademeli olarak artar.

Yukarıda belirtilen protokolü takiben, veriler otomatik analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir (Şekil 4B). Bu deney için otomatik analiz yazılımından hesaplanan KD değeri, hedef protein Hsp90 ve analit Cdc37 arasında güçlü bir etkileşim olduğunu öne süren 0.0673 ± 0.0002 μM idi. 0.0002 μM'lik standart sapma, ilk deneyde elde edilenden çok daha küçüktü ve bu da yeni verilerin çok daha güvenilir olduğuna dair güven veriyor.

Bu sonucu doğrulamak için, veri noktalarını (Tablo 3) daha önce açıklandığı gibi başka bir istatistiksel analiz yazılımına aktardık; Analizden elde edilen sonuçlar Şekil 4C'de özetlenmiştir.

İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak Hsp90/Cdc37 PPI için KD değerinin 0,014 ± 0,005 μM olduğu bulunmuştur (Şekil 4C). Düşük KD değerleri ve standart sapma, iki protein, Hsp90 ve Cdc37 arasında güçlü bir etkileşim olduğunu gösterir. Ayrıca, 0,99'luk R2 değeri, analizin deneysel grafik noktalarına mükemmel bir şekilde uyduğunu gösterir. Her iki analiz yazılımı da sonuçlarda tutarlılık gösterdi ve sırasıyla yaklaşık 0.0673 μM ± 0.0002 μM ve 0.014 ± 0.005 μM düşük KD değerleri elde etti.

Deneyin tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu doğrulamak için, aynı deney, hedef protein olarak Hsp90 (500 nM) ve ikinci deneyde kullanılanla 0.4 nm ila 200 nm arasında değişen aynı konsantrasyonlara sahip analit olarak Cdc37 kullanılarak iki kopyada gerçekleştirildi. Deney sırasında, her adım gerçek zamanlı olarak izlendi (Ek Şekil S6A ve Ek Şekil S7A). Otomatik analiz yazılımından hesaplanan KD değeri, Ek Şekil S6B ve Ek Şekil S7B'de gösterilmiştir (sırasıyla 0,053 ± 0,002 μM ve 0,0719 ± 0,0007 μM). Daha önce de belirtildiği gibi, veri noktaları başka bir istatistiksel analiz yazılımına (Ek Tablo S1 ve Ek Tablo S2) aktarılmıştır ve sonuçlar Ek Şekil S6C ve Ek Şekil S7C'de gösterilmiştir (Ek Şekil S6C: KD 0,003 ± 0,009 μM ve R2 0,99; Ek Şekil S7C: KD 0,004 ± 0,009 μM ve R2 0,99'dur). Her iki analiz yazılımından elde edilen iki kopyanın sonuçları iyi bir şekilde doğrulandı ve Hsp90 / Cdc37 FEB deneysel verilerinin doğruluğunu, tekrarlanabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini doğruladı.

Hsp90 ile bir kontrol proteini olan sığır serum albümini (BSA) arasındaki biyomoleküler etkileşimin aydınlatıldığı bir kontrol çalışması da yapıldı. BSA'yı bir analit olarak kullanan kontrol çalışması, ikinci deneyde kullanılan aynı deney düzeni ve analit konsantrasyonları kullanılarak yapıldı. 1x PBS'de (pH = 7.4) 0.4 nM ila 200 nM arasında değişen toplam 10 kontrol proteini BSA konsantrasyonu hazırlandı ve deneyin her adımı gerçek zamanlı olarak izlendi.

Hsp90 ve Cdc37 ile yapılan deneye benzer şekilde, gerçek zamanlı I-Response grafiği başlangıçta 0'dan başlar; Bununla birlikte, kontrol çalışmasında, I-Yanıtı, analit konsantrasyonlarının artması üzerine kademeli olarak artmamıştır (Ek Şekil S8A). Veriler ayrıca otomatik analiz yazılımı (Ek Şekil S8B) kullanılarak analiz edildi ve yazılım bu deneyin veri noktalarından KD değerini hesaplayamadı. Yazılımdan üretilen Hill Plot'tan, Hsp90 ile kontrol BSA analiti arasında bir etkileşim olmadığı kanıtlanmıştır. Bu sonucu doğrulamak için, veri noktalarını (Ek Tablo S3) daha önce açıklandığı gibi başka bir istatistiksel analiz yazılımına aktardık. İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak Hsp90/BSA ÜFE için KD değerinin negatif olduğu bulunmuştur (Ek Şekil S8C; KD , -0.009 ± -0.0003 μM) olup, yine iki protein, Hsp90 ve BSA arasında etkileşim olmadığını gösterir. Ayrıca, R2 değeri (0.82), analizin deneysel grafik noktalarına uymadığını gösterir. Her iki analiz yazılımı da Hsp90 ve BSA'nın etkileşime girmediği sonuçlarda tutarlılık gösterdi.

Hsp90/Cdc37 FEB deney verileri literatürde mevcut olan diğer deneysel verilerle karşılaştırıldığında, bu çalışmada elde edilen K D değerlerinin (K D = 0.014 ± 0.005 μM, K D = 0.053 ± 0.002 μM ve K D = 0.072 ± 0.001 μM) daha önce yayınlanmış verilerden iki büyüklük sırasına göre daha düşük olduğu bulunmuştur (K D = 1.46 μM 38 veya 6 μM 39 ). Bu farklılıklar, mevcut deneylerde tam uzunlukta insan Hsp90 ve Cdc37 yapılarının kullanımına bağlanabilir. Daha önce sadece kısmi protein 38 veya C. elegans homolog proteinleri39 içeren maya Hsp90 yapıları üzerinde çalışmalar yapılmıştır (Tablo 1). FEB sisteminde elde edilen sonuçları doğrulamak için ITC deneyleri yapıldı.

ITC sistemini kullanarak Hsp90/Cdc37 PPI'nın değerlendirilmesi:
ITC, biyomoleküler etkileşimleri araştırmak için altın standart olarak kabul edilir. Ayrıca, Hsp90 / Cdc37 PPI'nın termodinamik kinetiğini belirlemek ve FEB deneyi için doğrulama olarak ITC gerçekleştirdik. Hsp90 ve Cdc37, ITC'den önce PBS'ye (pH = 7.0) karşı diyalize tabi tutulur. Kalorimetrik titrasyonlar için PBS'de hedef proteinin (Hsp90) yaklaşık 0,25 μM çözeltisi ve 2,5 μM analit proteini (Cdc37) çözeltisi hazırlanmıştır. Ardışık aralıklarla toplam 80 μL Cdc37 çözeltisi hacmi, dönen şırıngadan 298.15 K'da 150 μL Hsp90 çözeltisi içeren hücreye titre edildi. Her enjeksiyon 4 sn süre boyunca gerçekleşti ve ardışık enjeksiyonlar arasındaki zaman aralığı 150 s idi. Her biri sırasıyla 500 rpm karıştırma hızı ve 41.9 μW referans gücü ile 2 μL'lik toplam 19 enjeksiyon yapıldı. Hsp90/Cdc37 etkileşiminden kaynaklanan ısı değişimi izlendi ve Cdc37 analit enjeksiyonlarının sonunda elde edilen nihai veriler, şirket tarafından sağlanan ITC analiz yazılımı kullanılarak takıldı. Molar entalpi değişimi (ΔH), entropi değişimi (ΔS), bağlanma bölgelerinin sayısı (n) ve Hsp90/Cdc37 PPI arasındaki denge ayrışma sabiti (KD) gibi termodinamik parametrelerle birlikte ısı değişimleri tahmin edildi. Gibbs serbest enerji değişimi (ΔG), ITC termogramından termal parametreler elde edildikten sonra ΔG = ΔH - TΔS denkleminden de hesaplanmıştır.

ITC grafiği, PPI40'ı yöneten etkileşimlerin ve moleküller arası kuvvetlerin doğasını aydınlatmak için biyolojik etkileşimler sırasında kullanılan veya serbest bırakılan ısı miktarını ortaya koymaktadır. Cdc37 (2.5 μM) Hsp90'a (0.25 μM) titre edildi ve karşılık gelen eğriler Şekil 5A, B'de gösterilmiştir. Elde edilen ITC grafiğinin ekzotermik olduğu bulundu ve bir, bağlanma enerjisi, ΔG = -45.9 kJ / mol ve KD değeri = 0.009 μM'nin bağlayıcı stokiyometrisini (n) sergileyen tek bir bağlanma bölgesi modeline yerleştirildi. ITC termogramının başlangıcında endotermik kayma şeklinde gözlenen hafif tutarsızlık (Şekil 5A), analit proteinini ölçüm hücresi 41,42'ye titre ederken kabarcıkların oluşumunu göstermektedir. Hsp90 / Cdc37 PPI arasında, daha düşük ve daha yüksek konsantrasyonlarda gerçekleştirilen ITC deneyleri, Cdc37'nin 10 kat fazlalığı (Hsp90 konsantrasyonu = 0.25 μM ve Cdc37 konsantrasyonu = 2.5 μM), bir doygunluk eğrisi elde ederek kabul edilebilir bağlanma parametreleri sergiledi. ITC'den elde edilen K D değeri (K D = 0.009 μM), FEB teknolojisi kullanılarak hesaplanan K D değeri (K D = 0.014 μM, 0.053 μM ve 0.072 μM) ile iyi bir şekilde ilişkili olup, FEB'nin Hsp90 / Cdc37 PPI'yı tespit etmedeki hassasiyetini ve doğruluğunu güçlü bir şekilde desteklemektedir.

Figure 2
Şekil 2: Protokol özeti. (A) Çip etkinleştirme işlemi için adımların özeti. (B) Protokoldeki beş tekrarlanan adımın grafiksel gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Deneyden oluşturulan veri dosyaları 1 . (A) Gerçek zamanlı olarak izlenen deney verileri. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki (BU) I-Yanıtına karşılık gelir ve x ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu rakam ilk deneydeki verilere karşılık gelir. (B) Otomatik analiz yazılımından oluşturulan Hill Fit grafiği. Y ekseni I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni nM'deki analit konsantrasyonlarına (Cdc37) karşılık gelir. Bu deney için KD değeri 350.000 ± 76.000 μM'dir. (C) İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan İlişkilendirme grafiği. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni farklı analit, Cdc37, konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu grafik, Tablo 2'de sağlanan veri noktaları kullanılarak oluşturulmuştur. Analiz sonuçlarının özeti grafikte verilmiştir; Bu deney için KD değeri 0,011 ± 0,494 μM ve R2 değeri 0,78'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Deneyden oluşturulan veri dosyaları 2 . (A) Gerçek zamanlı olarak izlenen deney verileri. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki (BU) I-Yanıtına karşılık gelir ve x ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu rakam ikinci deneydeki verilere karşılık gelir. (B) Otomatik analiz yazılımından oluşturulan Hill Fit grafiği. Y ekseni I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni nM'deki analit konsantrasyonuna (Cdc37) karşılık gelir. Bu deney için KD değeri 0.0673 ± istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan 0.0002 μM (C) İlişkilendirme grafiğidir. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni farklı analit Cdc37 konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu çizim, Tablo 3'te sağlanan veri noktaları kullanılarak oluşturulmuştur. Analiz sonuçlarının özeti grafikte verilmiştir; Bu deney için KD değeri 0,014 ± 0,005 μM ve R2 değeri 0,99'dur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Hsp90 ve Cdc37 etkileşiminin ITC termogramı. (A) Üst panel, Cdc37'nin (2.5 μM) 298.15 K'da Hsp90'a (0.25 μM) ardışık enjeksiyonları nedeniyle elde edilen karşılık gelen ısı evrimleşen eğrileri temsil eder. Diferansiyel güç (DP), zamanın bir fonksiyonu olarak diferansiyel gücü temsil eder. (B) Alt paneldeki entegre veri noktaları, Hsp90 / Cdc37'nin molar oranına karşılık gelen normalleştirilmiş ısıyı belirtir.

Yapılan tahliller Şubat analizi KD Prizma analizi KD Yapı Kökeni Amino Asitler Başvuru
ITC 1,46 μM ve 1,32 μM NA Maya Hsp90 Hsp90'ın N-terminal etki alanı 36
İnsan Cdc37
SPR 6 μM NA C. elegans · Tam uzunluk 37
ŞUBAT - İlk tekrarlama 0,014 μM 0,067 μM İnsan Hsp90 Tam uzunluk Bu çalışmada gerçekleştirilen
İnsan Cdc37
ŞUBAT - İkinci tekrar 0,053 μM 0,003 μM İnsan Hsp90 Tam uzunluk Bu çalışmada gerçekleştirilen
İnsan Cdc37
ŞUBAT - Üçüncü tekrar 0,072 μM 0,004 μM İnsan Hsp90 Tam uzunluk Bu çalışmada gerçekleştirilen
İnsan Cdc37
ITC 0,009 μM NA İnsan Hsp90 Tam uzunluk Bu çalışmada gerçekleştirilen
İnsan Cdc37
FEB- Kontrol çalışması Veri yok (KD'yi hesaplamak için yeterli veri yoktu) -0.009 μM (negatif değerlere sahip KD değeri etkileşim olmadığını gösterir) İnsan Hsp90 Tam uzunluk Bu çalışmada gerçekleştirilen
BSA

Tablo 1: Bu çalışmada ve literatürde bildirilen farklı yöntemler kullanılarak Hsp90/Cdc37 ÜFE değerlendirmesi.

Analit konsantrasyonları (nM) I-Response transistör 1 I-Response transistör 2 I-Response transistör 3 Ortalama
I-Yanıt
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tablo 2: İlk deneyin her konsantrasyon noktasında her çipin üç farklı transistöründen üretilen I-Response değerlerinin özeti.

Analit konsantrasyonları (nM) I-Response transistör 1 I-Response transistör 2 I-Response transistör 3 Ortalama I-Yanıtı
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tablo 3: İkinci deneyin her konsantrasyon noktasında her çipin üç farklı transistöründen üretilen I-Response değerlerinin özeti.

Ek Şekil S1: Deneyin başlamasından önce otomatik yazılımın ana ekranının ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Veri işleme ve analiz için otomatik yazılımın ana ekranının ekran görüntüsü. (A) Veri işleme seçeneklerini gösteren veri inceleme/dışa aktarma yazılımının ana ekran görüntüsü. (B) Veri analizi seçeneklerini gösteren veri inceleme/dışa aktarma yazılımının ana ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S3: İnceleme/dışa aktarma yazılımından elde edilen inceleme veri noktaları. Bu adımda, denemeyi gözden geçirin ve veri noktaları ekleyin veya silin. İlişkilendirme noktasının (2, 7, 12, 17, 22 vb.) her zaman seçimde olduğundan emin olun. Örneğin, soldan ilk seçim 2 numaralı veri noktasıdır ve ardından 10 numaralı veri noktasıdır (ancak 7 numaralı olmalıdır). Bunu çözmek için sadece 3, 4 ve 5. noktaları silin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S4: Örneğin veri listesini dışa aktarın. Bu adımda, hangi deneme noktalarının dışa aktarılacağını seçin. Bir ilişkilendirme noktası seçin (2, 7, 12, 17, 22 vb.) ve önceki kalibrasyon adımlarını çıkarın (1, 6, 11, 16, 21 vb.). Tüm noktaları dışa aktarma listesine ekleyin ve her veri noktası için I-Response içeren bir elektronik tablo almak üzere bu verileri dışa aktarın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S5: İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan ilişkilendirme grafiği. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni farklı analit Cdc37 konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu grafik, ilk deneydeki veri noktaları kullanılarak oluşturuldu ve 3.000 nM konsantrasyon veri noktasını hariç tuttu. Analiz sonuçlarının özeti grafikte verilmiştir; Bu deney için KD değeri 0,006 ± 0,081 μM ve R2 değeri 0,98'dir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S6: Deney 2'den oluşturulan veri dosyaları çoğaltma 1. (A) Gerçek zamanlı olarak izlenen deney verileri. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki (BU) I-Yanıtına karşılık gelir ve x ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu rakam, Hsp90'ın çip üzerinde hareketsiz hale getirildiği (500 nM) ve 10 konsantrasyonda Cdc37 analitinin hazırlandığı (0.4-200 nM) ikinci deneyde yapılan ikinci tekrardan elde edilen verilere karşılık gelir. Gerçek zamanlı I-Response grafiği başlangıçta 0'dan başlar ve deneyin her döngüsünde analit konsantrasyonlarının artmasıyla kademeli olarak artar, bu da deneyin başarılı olduğunu gösterir. (B) Otomatik analiz yazılımından oluşturulan Hill Fit grafiği. Y ekseni I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni nM'deki analit konsantrasyonlarına (Cdc37) karşılık gelir. Otomatik analizden elde edilen sonuçlar, nispeten düşük bir KD değeri ve 0.0531 ± 0.0002 μM'lik düşük standart sapma gösterdi, bu da Hsp90 ve Cdc37 arasında güçlü bir etkileşim olduğunu düşündürdü. (C) İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan ilişkilendirme grafiği. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni farklı analit Cdc37 konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu grafik, Tablo S1'de sağlanan veri noktaları kullanılarak oluşturulmuştur. Analiz sonuçlarının özeti grafikte verilmiştir; Bu deney için KD değeri 0,003 ± 0,009 μM ve R2 değeri 0,99'dur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S7: Deney 2'den oluşturulan veri dosyaları çoğaltma 1. (A) Gerçek zamanlı olarak izlenen deney verileri. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki (BU) I-Yanıtına karşılık gelir ve x ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu rakam, Hsp90'ın çip üzerinde hareketsiz hale getirildiği (500 nM) ve 10 konsantrasyonda Cdc37 analitinin hazırlandığı (0.4-200 nM) ikinci deneydeki üçüncü tekrardan elde edilen verilere karşılık gelir. (B) Otomatik analiz yazılımından oluşturulan Hill Fit grafiği. Y ekseni I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni nM'deki analit konsantrasyonlarına (Cdc37) karşılık gelir. Otomatik analizden elde edilen sonuçlar, nispeten düşük bir KD değeri ve 0.0719 ± 0.0007 μM'lik düşük bir standart sapma gösterdi, bu da Hsp90 ve Cdc37 arasında güçlü bir etkileşim olduğunu düşündürdü. (C) İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan İlişkilendirme grafiği. Y ekseni, ilişkilendirme aşamasının sonundaki I-Response'ye karşılık gelir. X ekseni, farklı analit Cdc37 konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu grafik, Tablo S2'de sağlanan veri noktaları kullanılarak oluşturulmuştur. Analiz sonuçlarının özeti grafikte verilmiştir; Bu deney için KD değeri 0,004 ± 0,009 μM ve R2 değeri 0,99'dur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S8: Kontrol deneyinden oluşturulan veri dosyaları. (A) Gerçek zamanlı olarak izlenen deney verileri. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki (BU) I-Yanıtına karşılık gelir ve x ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu rakam, Hsp90'ın çip üzerinde (500 nM) hareketsiz hale getirildiği ve 10 konsantrasyonda BSA (kontrol proteini) analitinin (0.4-200 nM) hazırlandığı kontrol deneyinden elde edilen verilere karşılık gelir. Gerçek zamanlı I-Response grafiği, 10-15 BU civarındaki düşük I-Response'den başlar ve deneyin her döngüsünde analit konsantrasyonlarındaki bir artış üzerine artmaz, bu da Hsp90 ve BSA arasında bir etkileşim olmadığını gösterir. (B) Otomatik analiz yazılımından oluşturulan Hill Fit grafiği. Y ekseni I-Response'ye karşılık gelir; x ekseni, nM'deki analit (BSA) konsantrasyonlarına karşılık gelir. Otomatik analizden elde edilen sonuçlar, Hsp90 ve BSA arasında bir etkileşim olmadığını düşündüren KD değerini hesaplamak için yeterli veri olmadığını göstermiştir. (C) İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan ilişkilendirme grafiği. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-Yanıtına karşılık gelir, x ekseni farklı analit BSA konsantrasyonlarına karşılık gelir. Bu grafik, Tablo S4'te sağlanan veri noktaları kullanılarak oluşturulmuştur. Analiz sonuçlarının özeti grafikte verilmiştir; Bu deney için KD değeri -0,009 ± -0,0003 μM ve R2 değeri 0,82'dir. Sıfıra yakın negatif bir KD değeri, Hsp90 ve BSA arasında etkileşim olmadığını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Her konsantrasyon noktasında üretilen I-Response değerlerinin özeti ve her çipin transistörlerinden okunur (her çip için üç farklı transistör). Bu tablo, Hsp90'ın çip üzerinde hareketsiz hale getirildiği (500 nM) ve 10 konsantrasyonda Cdc37 analitinin hazırlandığı (0.4-200 nM) ikinci deney için yapılan ikinci tekrardan elde edilen verilere karşılık gelir. İstatistiksel analiz yazılımında analiz için bu tablodaki veri noktaları kullanılmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: Her konsantrasyon noktasında üretilen I-Response değerlerinin özeti ve her çipin transistörlerinden okunur (her çip için üç farklı transistör). Bu tablo, Hsp90'ın çip üzerinde hareketsiz hale getirildiği (500 nM) ve 10 konsantrasyonda Cdc37 analitinin hazırlandığı (0.4-200 nM) ikinci deney için yapılan üçüncü tekrardan elde edilen verilere karşılık gelir. İstatistiksel analiz yazılımında analiz için bu tablodaki veri noktaları kullanılmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S3: Her konsantrasyon noktasında üretilen I-Response değerlerinin özeti ve her çipin transistöründen okunur (her çip için üç farklı transistör). Bu tablo, Hsp90'ın çip üzerinde hareketsiz hale getirildiği (500 nM) ve 10 konsantrasyonda BSA analitinin (0.4-200 nM) hazırlandığı kontrol deneyinden elde edilen verilere karşılık gelir. İstatistiksel analiz yazılımında analiz için bu tablodaki veri noktaları kullanılmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, Hsp90 ve Cdc37 arasındaki biyomoleküler etkileşimi belirlemek için FEB teknolojisinin (gerçek zamanlı kinetik karakterizasyon yaklaşımı) kullanılmasının fizibilitesi değerlendirilmiştir. İlk keşif deneyi (ilk deney), uygun analit konsantrasyonlarının seçilmesinin deneyin kritik bir parçası olduğunu ve deneyin, literatürde bulunan verilere dayanarak tahmin edilen KD değerinin üstünde ve altında konsantrasyon noktaları dahil edilerek tasarlanması gerektiğini öne sürdü.

Bununla birlikte, etkileşim hakkında herhangi bir ön bilgi yoksa, hem daha düşük (0.08 nM, 0.16 nM, 0.4 nM, 2 nM) hem de daha yüksek (1.000 nM, 2.500 nM, 5.000 nM) aralıklarda geniş bir konsantrasyon noktası aralığı ekleyerek bir ön deney tasarlamanızı öneririz. Ön deney, KD değerinin kaba bir tahminini sağlar ve doğru bir KD değeri elde etmek için doğru konsantrasyon aralıklarını kullanarak sonraki deneylerin planlanmasını sağlar. FEB sistemi, deney için konsantrasyon noktalarının sayısını seçmekte özgür olan bir düzenleme protokolü işlevi sunar.

Deneyimlerimize göre, FEB protokolünde yer alan en kritik adımlar aşağıdaki gibidir. Hedef protein ve analit tamponu, kalibrasyon tamponu ile aynı olmalıdır. Küçük bir arabellek uyuşmazlığı bile I-Response'da dalgalanmalara neden olabilir ve güvenilmez sonuçlar verebilir. Bu nedenle, uygun tampon değişimi ile gece boyunca diyaliz yapılmasını öneririz. Bir çözeltiyi aspire ederken veya uygularken biyosensör çipi üzerinde dikkatli pipetleme yapılması, deney boyunca kritik öneme sahiptir. Dikkatsiz pipetleme, kırık transistörlere veya I-Response'de dalgalanmalara neden olabilir; pipetleme sırasında çipin hassas yüzeyine dokunmadığınızdan emin olun. Talaş aktivasyon işleminde kullanılan EDC / sulfo-NHS çözeltisi, her kullanımdan önce taze olarak karıştırılmalıdır. Eski bir karışımın kullanılması, işlevselleştirilmemiş bir çipe neden olabilir. Deneyin tüm döngülerinde yer alan beş tekrarlayan adımın (kalibrasyon, ilişkilendirme, ayrışma, rejenerasyon ve yıkama) tümü için aynı tamponu kullandığınızdan emin olun.

FEB'yi BLI veya SPR gibi sahadaki köklü biyomoleküler tespit sistemleriyle karşılaştırırken, her üç yöntemin de benzer avantajları paylaştığını gördük43,44,45: etkileşimleri tespit etmek için pahalı floresan boyalar gerektirmeyen etiketsiz sistemlerdir; küçük nM aralıklarında bile etkileşimleri tespit edebilirler; çipler hem SPR hem de FEB'de yeniden kullanılabilir ve 10 deneye kadar verimli bir şekilde yeniden oluşturulabilir ve yeniden kullanılabilir ve her üç yöntem de gerçek zamanlı olarak kinetik veriler sağlar ve deneme süresi kısadır.

SPR'nin temel avantajı, deneyden daha kapsamlı veriler sağlamasıdır, böylece KD, Kaçık, Kkapalı, stokiyometri ve termodinamik parametreler44 hesaplanabilir. BLI'nın en büyük avantajı, bir deneyde çoklu konsantrasyonları test etme yeteneğidir. Kinetik ölçümler, farklı sensörler kullanılarak sekiz konsantrasyona kadar aynı anda yapılabilir. Bununla birlikte, BLI sensörleri yeniden kullanılamaz, bu nedenle deneyin maliyetini son derece yüksekhale getirir 43.

FEB'in temel avantajı, deney boyunca kullanıcıya rehberlik eden otomatik, kullanıcı dostu yazılımı ve kullanıcının her adımda hareketsiz hedefe analit eklemesini sağlayan açık el pipetleme platformudur. Basit bir yazılımla birleştirilen bu açık pipetleme yaklaşımı, FEB'nin öğrenilmesini kolaylaştırır ve çok az veya hiç eğitim gerektirmez. Bununla birlikte, kullanıcının el pipetlemesinde temel bir ustalığa sahip olmasını gerektirir ve otomatik sıvı işleme eksikliği, adım zamanlamasının tekrarlanabilirliğinin tamamen kullanıcıya bağlı olduğu anlamına gelir. Aynı entegre sıvı işleme eksikliği, talaşların ve cihazların SPR veya BLI'ya kıyasla uygun maliyetli olduğu anlamına gelir. FEB ayrıca, biyosensör çip hazırlamada yer alan tanımlanmış üretim süreci nedeniyle biyomoleküler etkileşimlerin tespitinde yüksek tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik sergiler35.

İyi kurulmuş ve standart ITC tespit yöntemiyle karşılaştırıldığında, FEB, tüm deney için nanomolar konsantrasyonlarda sadece 50 μL analit hacmi kullanır ve proteinlerin çekirdeklenmesi veya toplanması şansını azaltır. ITC ile ilgili en büyük sorunlardan biri, hava kabarcıklarını önlemek için yüklemeden önce proteinlerin gazını açmaktır. ITC deneyi sırasında, sürekli karıştırma ve yoğun temizleme nedeniyle ölçüm hücresi içinde kabarcıklar geliştirme şansı vardır, bu da numune çözeltisini olumsuz yönde sıçratabilir veya numune kaybına neden olabilir42. FEB teknolojisi, sağlam hedef immobilizasyon kimyası sunarak, kümelenmeyi ve köpürmeyi azaltarak, stabiliteyi artırarak ve ITC'nin karşılaştığı konsantrasyona bağlı sorunları iyileştirerek ITC'nin bu zorluklarının üstesinden gelir.

FEB cihazlarının potansiyel bir dezavantajı, tampon bileşimine ve konsantrasyon değişikliklerine duyarlılıklarıdır, bu da sonuçların takılması ve analizi sırasında düzeltilmesi gereken taban çizgisinde bir sapmaya neden olabilir. Biyosensör çipi ayrıca pH ve tuza karşı hassastır, bu nedenle analitin kalibrasyonu ve ölçümü sırasında kullanılan tamponlar deney boyunca aynı olmalıdır. Koruyucu olarak kullanılan kimyasallar (örneğin, sodyum azid) ve hidrofobik moleküller sensöre zarar verebilir ve hatta spesifik olmayan bağlanmada bir artışa neden olabilir. Bu dezavantajlar, ölçüm adımları boyunca tampon tutarlılığına, analit stoğundan müdahale eden bileşiklerin diyalizine ve yüzeyin uygun pasivasyonuna (örneğin, deterjanların, protein blokerlerinin veya farklı PEG moleküllerinin kullanımı) dikkat edilerek hafifletilebilir.

Özetle, FEB teknolojisini kullanarak Hsp90 / Cdc37 arasında güçlü PPI'yı başarıyla gösterdik ve ITC kullanarak etkileşimlerini doğruladık ve FEB'yi PPI tespiti için yenilikçi bir alternatif yöntem olarak desteklemek için cesaret verici veriler sağladık. FEB teknolojisi, in vitro biyolojik aktiviteyi kolayca in vivo etkinliğe dönüştürerek ilaç keşfi, farmasötikler, küçük moleküllerin, peptitlerin ve proteinlerin biyomoleküler analizi, antikor geliştirme, ilaç validasyonu ve kurşun optimizasyonunun çeşitli alanlarında parmaklarımızın ucunda çok çeşitli uygulamalar sunmaktadır. FEB teknolojisinin avantajlarını ve PPI, protein ve DNA veya RNA etkileşimlerinin yanı sıra protein ve küçük molekül (örneğin, ilaç) etkileşimlerini keşfetmedeki muazzam uygulamalarını göz önünde bulundurarak, PPI algılama araç kutusunda benzersiz, umut verici bir teknoloji olduğunu öneriyoruz. Bizim örneğimizde, FEB teknolojisi, Hsp90 / Cdc37 PPI aday antagonistlerinin bağlayıcı etkinliğini kolayca değerlendirmek için değerli bir araç sunar ve bu da daha sonra bu ÜFE'nin kritik olduğu çeşitli hastalıklarla ilgili daha ileri in vitro ve in vivo değerlendirmeler için umut verici adayların seçilmesine yardımcı olur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, finansal veya başka türlü hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu araştırma, İki Uluslu Bilim Vakfı'ndan (BSF) S.K.S. ve N.Q.'ya verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

Biyokimya Sayı 181 Hücre bölünme döngüsü 37 Cdc37 Isı şoku proteini 90 Hsp90 Protein kinaz Grafen biyosensörü Alan etkisi biyoalgılama Kanser Biyomoleküler etkileşimler
Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter