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Biochemistry

Esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Il biosensing ad effetto di campo (FEB) è una tecnica senza etichetta per rilevare le interazioni biomolecolari. Misura la corrente elettrica attraverso il biosensore di grafene a cui sono immobilizzati i bersagli leganti. La tecnologia FEB è stata utilizzata per valutare le interazioni biomolecolari tra Hsp90 e Cdc37 ed è stata rilevata una forte interazione tra le due proteine.

Abstract

Le interazioni biomolecolari svolgono ruoli versatili in numerosi processi cellulari regolando e coordinando eventi biologici funzionalmente rilevanti. Biomolecole come proteine, carboidrati, vitamine, acidi grassi, acidi nucleici ed enzimi sono elementi fondamentali degli esseri viventi; si assemblano in reti complesse nei biosistemi per sincronizzare una miriade di eventi della vita. Le proteine utilizzano tipicamente reti interatomiche complesse per svolgere le loro funzioni; quindi è obbligatorio valutare tali interazioni per svelare la loro importanza nelle cellule sia a livello cellulare che a livello di organismo. Verso questo obiettivo, introduciamo una tecnologia in rapida ascesa, il biosensing ad effetto di campo (FEB), per determinare specifiche interazioni biomolecolari. FEB è una tecnica di rilevamento biomolecolare da banco, senza etichette e affidabile per determinare interazioni specifiche e utilizza biosensori elettronici di alta qualità. La tecnologia FEB può monitorare le interazioni nell'intervallo nanomolare a causa dei nanomateriali biocompatibili utilizzati sulla superficie del biosensore. Come prova di concetto, è stata chiarita l'interazione proteina-proteina (PPI) tra la proteina da shock termico 90 (Hsp90) e il ciclo di divisione cellulare 37 (Cdc37). Hsp90 è un chaperone molecolare dipendente dall'ATP che svolge un ruolo essenziale nel ripiegamento, nella stabilità, nella maturazione e nel controllo di qualità di molte proteine, regolando così molteplici funzioni cellulari vitali. Cdc37 è considerato un chaperone molecolare specifico della proteina chinasi, in quanto riconosce e recluta specificamente le chinasi proteiche a Hsp90 per regolare le loro vie di trasduzione del segnale a valle. Come tale, Cdc37 è considerato un co-chaperone di Hsp90. La via chaperone-chinasi (complesso Hsp90/Cdc37) è iper-attivata in tumori maligni multipli che promuovono la crescita cellulare; pertanto, è un potenziale bersaglio per la terapia del cancro. Il presente studio dimostra l'efficienza della tecnologia FEB utilizzando il sistema modello Hsp90/Cdc37. FEB ha rilevato un forte PPI tra le due proteine (valori KD di 0,014 μM, 0,053 μM e 0,072 μM in tre esperimenti indipendenti). In sintesi, FEB è una piattaforma di rilevamento PPI senza etichette ed economica, che offre misurazioni rapide e accurate.

Introduction

Interazioni biomolecolari:
Le proteine sono parti essenziali degli organismi e partecipano a numerosi percorsi molecolari come il metabolismo cellulare, la struttura cellulare, la segnalazione cellulare, le risposte immunitarie, l'adesione cellulare e altro ancora. Mentre alcune proteine svolgono le loro funzioni in modo indipendente, la maggior parte delle proteine interagisce con altre proteine utilizzando un'interfaccia di legame per coordinare la corretta attività biologica1.

Le interazioni biomolecolari possono essere classificate principalmente in base alle distinte caratteristiche strutturali e funzionali delle proteine coinvolte2, ad esempio in base alle superfici proteiche, alla stabilità complessa o alla persistenza delle interazioni3. Identificare le proteine essenziali e il loro ruolo nelle interazioni biomolecolari è vitale per comprendere i meccanismi biochimici a livello molecolare4. Attualmente, ci sono vari approcci per rilevare queste interazioni5: in vitro6, in silico7, in cellule vive8, ex vivo9 e in vivo10 con ciascuno con i propri punti di forza e di debolezza.

I saggi in vivo vengono eseguiti utilizzando l'intero animale come strumento sperimentale11 e i saggiex vivo vengono eseguiti su estratti di tessuto o organi interi (ad esempio, cuore, cervello, fegato) in un ambiente esterno controllato fornendo alterazioni minime in condizioni naturali. L'applicazione più comune degli studi in vivo ed ex vivo è quella di valutare gli effetti di farmacocinetica, farmacodinamica e tossicità dei potenziali agenti farmacologici prima degli studi sull'uomo, garantendone la sicurezza e l'efficacia complessive12.

Le interazioni biomolecolari possono anche essere rilevate all'interno delle cellule viventi. L'imaging di cellule vive ci consente di osservare le interazioni dinamiche mentre eseguono le reazioni di un particolare percorso biochimico13. Inoltre, le tecniche di rilevamento, come la bioluminescenza o il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza, possono fornire informazioni su dove e quando queste interazioni si verificano all'interno della cellula14. Sebbene il rilevamento in cellule vive offra dettagli cruciali, queste metodologie di rilevamento si basano su ottiche ed etichette, che potrebbero non riflettere la biologia nativa; sono anche meno controllati rispetto ai metodi in vitro e richiedono competenze specializzate per eseguire15.

I metodi computazionali in silico sono utilizzati principalmente per lo screening su larga scala delle molecole bersaglio prima degli esperimenti in vitro . Metodi di previsione computazionale, database basati su computer, docking molecolare, relazioni quantitative struttura-attività e altri approcci di simulazione della dinamica molecolare sono tra gli strumenti consolidati in silico 16. Rispetto alle laboriose tecniche sperimentali, gli strumenti in silico possono facilmente fare previsioni con alta sensibilità, ma con precisione ridotta nelle prestazioni predittive17.

I saggi in vitro vengono eseguiti con microrganismi o molecole biologiche al di fuori del loro contesto biologico standard. Ritrarre le interazioni biomolecolari attraverso metodi in vitro è fondamentale per comprendere le funzioni proteiche e la biologia alla base della complessa rete di funzionamento cellulare. La metodologia di analisi preferita viene scelta in base alle proprietà intrinseche della proteina, ai valori cinetici e alla modalità e intensità delle interazioni18,19.

L'interazione Hsp90/Cdc37:
La via chaperone-chinasi, che collega Hsp90 e Cdc37, è un obiettivo terapeutico promettente nella biologia tumorale20. Hsp90 svolge un ruolo centrale nel controllo del ciclo cellulare, nell'assemblaggio delle proteine, nella sopravvivenza cellulare e nelle vie di segnalazione. Le proteine che si basano su Hsp90 per le loro funzioni vengono consegnate a Hsp90 per la complessazione attraverso un co-chaperone, come Cdc37. Il complesso Hsp90/Cdc37 controlla il ripiegamento della maggior parte delle protein chinasi e funge da hub per una moltitudine di reti di segnalazione intracellulare21. È un promettente bersaglio antitumorale grazie alla sua elevata espressione in varie neoplasie maligne, tra cui la leucemia mieloblastica acuta, il mieloma multiplo e il carcinoma epatocellulare22,23.

Tecniche di rilevamento dell'interazione biomolecolare in vitro comunemente usate
La co-immunoprecipitazione (co-IP) è una tecnica che si basa sulla specificità antigene-anticorpo per identificare interazioni biologicamente rilevanti24. Lo svantaggio principale di questo metodo è la sua incapacità di rilevare interazioni a bassa affinità e valori cinetici24. I metodi biofisici come la calorimetria a titolazione isotermica (ITC), la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria a biostrato (BLI) e la tecnologia FEB sono preferiti per determinare i valori cinetici.

ITC è un metodo di rilevazione biofisica basato sulla determinazione dell'energia di legame insieme a un'analisi termodinamica completa per caratterizzare le interazioni biomolecolari25. Il vantaggio principale dell'ITC è che non richiede alcuna etichettatura o fissazione della proteina bersaglio. Le principali difficoltà incontrate dall'ITC sono l'alta concentrazione di proteine bersaglio richieste per un esperimento e la difficoltà di analizzare complessi non covalenti a causa di piccole entalpie di legame26. Sia SPR che BLI sono tecniche biofisiche label-free che si basano sull'immobilizzazione della molecola bersaglio sulla superficie del sensore, seguita da successive iniezioni dell'analita sul bersaglio immobilizzato27,28. In SPR, le alterazioni dell'indice di rifrazione durante le interazioni biomolecolari sono misurate27; in BLI, l'interferenza nella luce riflessa viene registrata in tempo reale come variazione della lunghezza d'onda in funzione del tempo28. Sia SPR che BLI condividono i vantaggi comuni di offrire elevate funzionalità di specificità, sensibilità e rilevamento29. In entrambi i metodi, la proteina bersaglio è immobilizzata sulle superfici del biosensore e, quindi, potrebbe esserci una certa perdita della conformazione nativa del bersaglio, il che rende difficile discriminare tra interazioni specifiche e non specifiche30. BLI utilizza costosi biosensori monouso in fibra ottica per immobilizzare il bersaglio ed è, quindi, una tecnica costosa31. Rispetto a questi strumenti di rilevamento biomolecolari consolidati, la tecnologia FEB offre una piattaforma affidabile e priva di etichette utilizzando basse concentrazioni nanomolari per il rilevamento biomolecolare in tempo reale con caratterizzazione cinetica. La tecnologia FEB supera anche le sfide spumeggianti affrontate in ITC ed è più conveniente rispetto a SPR o BLI.

I biosensori basati su transistor ad effetto di campo (FET) sono un campo emergente per rilevare interazioni biomolecolari offrendo varie applicazioni biomediche. Nel sistema FET, i bersagli sono immobilizzati ai chip del biosensore e le interazioni vengono rilevate dai cambiamenti nella conduttanza32. La caratteristica unica da considerare nello sviluppo di un biosensore elettronico efficiente sono le proprietà fisico-chimiche come la natura semi-conduttiva e la stabilità chimica del materiale di rivestimento utilizzato per fabbricare la superficie del sensore33. I materiali convenzionali come il silicio utilizzato per il FET hanno limitato la sensibilità dei sensori perché richiede strati di ossido inseriti tra il canale del transistor e un ambiente specifico per il corretto funzionamento34. Inoltre, i transistor al silicio sono sensibili agli ambienti ad alto contenuto di sale, rendendo così difficile misurare le interazioni biologiche nel loro ambiente naturale. Il biosensore a base di grafene si presenta come un'alternativa in quanto offre un'eccellente stabilità chimica e campo elettrico. Poiché il grafene è un singolo strato atomico di carbonio, è sia estremamente sensibile come semiconduttore che chimicamente compatibile con soluzioni biologiche; entrambe queste qualità sono desiderabili per generare biosensori elettronici compatibili35. Il notevole potenziale di carico ultra elevato delle biomolecole offerto dai biosensori rivestiti di grafene ha portato allo sviluppo della tecnologia FEB dei biosensori a base di grafene.

Principio della tecnologia FEB: FEB è una tecnica di rilevamento biomolecolare senza etichetta che misura la corrente elettrica attraverso il biosensore di grafene a cui sono immobilizzati i bersagli di legame. Le interazioni tra la proteina immobilizzata e l'analita provocano alterazioni della corrente che vengono monitorate in tempo reale, consentendo misurazioni cinetiche accurate36.

Strumentazione: Il sistema FEB comprende un chip sensore a transistor a effetto di campo del grafene (gFET) e un lettore elettronico che applica una tensione costante durante l'esperimento (Figura 1). L'analita viene applicato in soluzione alla proteina bersaglio immobilizzata sulla superficie del biosensore. Quando si verifica un'interazione, un'alterazione della corrente viene misurata e registrata in tempo reale. All'aumentare della concentrazione dell'analita, aumenterà anche la frazione di analita legato, causando maggiori alternanze nella corrente. Utilizzando il software di analisi automatizzato fornito con lo strumento (Table of Materials), I-Response viene misurato e registrato in termini di unità di biorilevamento (BU)37. I-Response è definita come l'alterazione della corrente (I) attraverso il chip del biosensore misurata in tempo reale sull'interazione del bersaglio immobilizzato con l'analita. Il software di analisi automatizzata FEB può analizzare sia l'I-Response che il C-Response a eventi di interazione dinamica, dove il C-Response registra le alterazioni della capacità (C). Le variazioni sia in I-Response che in C-Response corrispondono direttamente alla frazione di analita legato e possono essere ulteriormente analizzate per generare valori KD . La preferenza predefinita del software di analisi automatizzata è I-Response.

Figure 1
Figura 1: Panoramica della configurazione sperimentale. (A) Chip a base di grafene e lettore elettronico. (B) Una panoramica dei componenti del chip. Il chip è collegato a due elettrodi che forniscono corrente al sistema. La superficie del chip è ricoperta di grafene, che una volta attivato può legare il bersaglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metodologia:
Inizialmente, il chip del biosensore attivato viene inserito nel dispositivo FEB (Figura 1) seguito dall'esecuzione dei passaggi descritti di seguito: (1) Calibrazione: l'esperimento inizia con la calibrazione del sistema utilizzando 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH = 7,4) per creare la risposta di equilibrio basale. (2) Associazione: l'analita viene introdotto nel chip e l'I-Response viene monitorato fino al raggiungimento della saturazione del legame. (3) Dissociazione: l'analita viene dissociato utilizzando 1x PBS. (4) Rigenerazione: i resti dell'analita vengono rimossi utilizzando 1x PBS. (5) Lavaggio: un totale di cinque lavaggi vengono eseguiti utilizzando 1x PBS per la rimozione completa degli analiti legati e non legati dal chip.

Analisi:
L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software completamente automatizzato fornito con lo strumento. Il software di analisi automatizzato genera un grafico Hill fit con un valore KD . Il diagramma di Hill fit descrive l'associazione di un analita alla proteina bersaglio in funzione delle concentrazioni di analiti. La concentrazione alla quale si ottiene una risposta semi-massimale è proporzionale al valore KD . Un valore KD basso rappresenta un'elevata affinità di legame e viceversa.

Per convalidare i dati ottenuti dall'esperimento FEB, le I-Response vengono estratte da ciascun punto di lettura per ogni concentrazione di analita utilizzando il software di revisione/esportazione dei dati e possono essere esportate in altri software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali) come spiegato di seguito.

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Protocol

NOTA: Le proteine ricombinanti utilizzate in questo studio, Hsp90 e Cdc37, sono state ottenute commercialmente (vedere Tabella dei materiali).

1. Attivazione del chip

NOTA: Tutti i materiali da utilizzare nell'esperimento sono elencati nella Tabella dei materiali. Filtrare tutte le soluzioni preparate attraverso un filtro sterile da 0,2 μm.

  1. Preparare la soluzione di 1-etil-3-(3-dimetilammino propil) carbodiimide (EDC) aggiungendo 2 mg di EDC a 2,5 mL di tampone di acido etano solfonico (MES) da 1 M 2-(N-morfolino) (MES) in un tubo da 15 ml. Preparare le soluzioni di N-idrossisulfosuccinimide (sulfo-NHS) aggiungendo 6 mg di sulfo-NHS a 2,5 mL di tampone MES da 1 M (pH = 6,0) in un tubo separato da 15 mL. Aliquota 50 μL di ciascuna soluzione in tubi indipendenti e conservare a -20 °C per un uso futuro.
  2. Mescolare volumi uguali di soluzione di solfo-NHS di sabbia EDC (50 μL di EDC + 50 μL di sulfo-NHS) pipettando su e giù (non vortice).
    NOTA: La soluzione mista di EDC/sulfo-NHS deve essere utilizzata entro 30 minuti per mantenere un'efficace reticolazione per una corretta funzionalizzazione del chip.
  3. Posizionare il chip del biosensore (5,7 cm x 2,4 cm; vedi Tabella dei materiali) fornito dall'azienda in una capsula di Petri di vetro con coperchio montato. Tutte le fasi di funzionalizzazione coinvolte nell'attivazione del chip sono suggerite per essere eseguite all'interno della capsula di Petri. Applicare 50 μL di tampone MES da 1 M (pH = 6,0) sul chip del biosensore, incubare per 1 minuto a temperatura ambiente e quindi aspirare il tampone.
  4. Applicare immediatamente 50 μL di soluzione EDC/sulfo-NHS al chip del sensore. Coprire la capsula di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione EDC/sulfo-NHS dal chip.
  5. Risciacquare il chip una volta con 50 μL di tampone MES da 1 M (pH = 6,0); aspirare il tampone MES.

2. Immobilizzazione delle proteine bersaglio

  1. Risciacquare il chip 2x con 50 μL di 1x PBS (pH = 7,4). Aspirare il PBS dal chip e aggiungere la molecola bersaglio, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
    NOTA: la mancata corrispondenza del buffer potrebbe rovinare l'intero esperimento; quindi, prima dell'esperimento, è importante assicurarsi che la molecola bersaglio si trovi nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione (ad esempio, 1x PBS (pH = 7,4)). Se necessario, eseguire uno scambio di buffer mediante dialisi notturna prima dell'esperimento. In questo esperimento, è stata eseguita la dialisi notturna per entrambe le proteine ricombinanti, Hsp90 e Cdc37, contro 1x PBS (pH = 7,4; vedi Tabella dei materiali) con un adeguato scambio tampone a 4 °C. La concentrazione del materiale bersaglio (Hsp90 in questo caso) può variare a seconda dei diversi protocolli sperimentali e della natura dei materiali bersaglio (proteine/peptidi/ligandi).
  2. Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione contenente la molecola bersaglio e risciacquare 3x con 50 μL di 1x PBS (pH = 7,4). Aspirare la soluzione 1x PBS (pH = 7,4) dal chip.
  3. Aggiungere al chip 50 μL di Quench 1 (3,9 mM di amino-PEG5-alcool in 1x PBS (pH = 7,4)). Coprire la capsula di Petri di vetro e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 1 dal chip.
  4. Aggiungere 50 μL di soluzione di Quench 2 (1 M etanolammina (pH = 8,5)) al chip. Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 2 dal chip e risciacquare il chip 5x utilizzando 50 μL di 1x PBS, lasciando l'ultima goccia PBS sul sensore.

3. Preparazione di campioni di analiti

  1. Preparare la serie di diluizione dell'analita per Cdc37 nell'intervallo di concentrazione desiderato. Per il primo esperimento sono state utilizzate le seguenti concentrazioni: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM e 5.000 nM. Per il secondo esperimento, è stato utilizzato un diverso insieme di concentrazioni che vanno da 0,4 nM a 200 nM.
  2. Progettare l'esperimento in modo da includere almeno otto diverse concentrazioni di analiti per ottenere un valore KD affidabile. Preparare le diverse diluizioni della proteina analitica nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione e la proteina bersaglio; qui è 1x PBS (pH = 7,4).

4. Caricamento del chip biosensore attivato nel dispositivo FEB

NOTA: Il dispositivo FEB è costituito da un lettore dotato di indicazioni luminose a LED e da una cartuccia per inserire il chip del biosensore.

  1. Dopo l'immobilizzazione della proteina bersaglio, inserire il chip attivato nella cartuccia del dispositivo, che è collegata tramite USB a un computer. Dopo l'inserimento del chip, sul lettore verrà visualizzata una luce LED verde che indica che il dispositivo FEB è pronto per l'esperimento. Installare il software automatizzato (vedi Tabella dei Materiali) fornito dall'azienda sul computer, a cui è collegato il dispositivo FEB, per monitorare l'esperimento passo dopo passo come descritto di seguito.

5. Esegui l'esperimento

  1. Premere il modulo Esegui esperimento sul software automatizzato e scegliere 10 punti con rigenerazione o qualsiasi altro protocollo desiderato. Inserisci i seguenti dettagli: nome dell'operatore, nome dell'esperimento, data (ad esempio, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); buffer di rigenerazione (ad esempio, buffer PBS); bersaglio immobilizzato (ad esempio, Hsp90); analita in soluzione (ad esempio, Cdc37). Vedere la Figura supplementare S1 per i dettagli.
  2. Premere il pulsante Inizia l'esperimento visualizzato sul software e seguire le istruzioni visualizzate dal software automatizzato come descritto di seguito.
    NOTA: il software è completamente automatizzato, facile da usare e guida l'utente durante l'esperimento passo dopo passo. Sullo schermo apparirà una finestra pop-up con le istruzioni per procedere ulteriormente in ogni fase dell'esperimento. Il software fornirà istruzioni per ogni passaggio ripetitivo consecutivamente dalla calibrazione, associazione analitica, dissociazione, rigenerazione e lavaggio (5x) per ogni concentrazione di analita durante l'esperimento.
  3. Eseguire la calibrazione dello strumento. Per fare ciò, aspirare la soluzione PBS rimanente dal chip e applicare 50 μL di tampone di calibrazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della fase di calibrazione. Il software visualizza l'endpoint determinato per la fase di calibrazione (5 min) con un allarme di avvertimento da seguire.
  4. Quindi, eseguire un'associazione di analiti. Per fare ciò, aspirare il buffer di calibrazione dal chip e applicare 50 μL della più bassa concentrazione di analita (25 nM di Cdc37). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della fase di associazione. Il software visualizza l'endpoint per la fase di associazione (5 min) con un allarme di avviso per procedere.
  5. Eseguire una dissociazione dell'analita. Per fare ciò, aspirare la soluzione di analita dal chip e applicare 50 μL del tampone di dissociazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della durata della fase di dissociazione (5 minuti). Il software visualizza l'endpoint per la fase di dissociazione (5 min) con un allarme di avvertimento da seguire.
  6. Quindi, eseguire la rigenerazione del chip. Aspirare la soluzione di dissociazione dal chip e applicare 50 μL di tampone di rigenerazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 30 s fino al termine della durata della fase di rigenerazione (30 s). Il software visualizza l'endpoint per la fase di rigenerazione (30 s) con un allarme di avviso da seguire.
  7. Infine, lavare il chip. Aspirare la soluzione di rigenerazione dal chip e applicare 50 μL di tampone di lavaggio (1x PBS; pH = 7,4) al chip. Aspirare la soluzione dal chip e ripetere questo 5x. Lasciare l'ultima goccia di tampone di lavaggio sul chip e premere il pulsante Continua e attendere 30 s fino al termine della durata della fase di lavaggio nel display del software.
    NOTA: il software visualizza l'endpoint per la fase di lavaggio (30 s) con un allarme di avviso per procedere con il ciclo successivo dell'esperimento.
  8. Ripetere i passaggi per ogni concentrazione di analita utilizzata; le cinque fasi di calibrazione, associazione dell'analita, dissociazione, rigenerazione e lavaggio (5x) costituiscono un ciclo. Per l'esperimento qui mostrato, abbiamo eseguito 10 cicli per 10 concentrazioni di analiti (che vanno da 25 nM a 5.000 nM o da 0,4 nM a 200 nM; Figura 2).

6. Analisi

  1. Premere il pulsante Analisi visualizzato nella parte superiore del software di analisi automatizzato alla fine dell'esperimento. Apparirà una finestra di visualizzazione contenente tutti i punti sperimentali. Nella finestra, assicurarsi che le concentrazioni di analita utilizzate per il protocollo prescritto siano corrette.
  2. Premere il pulsante Esegui analisi per generare automaticamente il valore KD . Il software genera un diagramma di Hill fit tracciando le concentrazioni di analiti rispetto alle corrispondenti I-Responses da cui viene calcolata la costante di dissociazione all'equilibrio, il valore KD .
  3. Esportare i dati grezzi per l'analisi in altri software di analisi statistica utilizzando il software di revisione/esportazione dei dati come descritto di seguito.
    1. Copia il file R1R creato automaticamente alla fine dell'esperimento (ad esempio, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) in una nuova cartella sul desktop. Aprire il software di revisione/esportazione dei dati fornito dall'azienda (vedere la figura supplementare S2A).
    2. Fare clic su Elaborazione dati > Elaborare i file R1R > OK nella schermata iniziale del software di revisione / esportazione dei dati.
    3. Selezionare la cartella contenente i file R1R creati sul desktop nel passaggio 6.3.1. e premere il pulsante OK . Questo crea una copia dei dati R1R originali, per rivedere e modificare i dati senza sovrascrivere il file originale.
    4. Premere l'icona di elaborazione dei dati visualizzata nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati. Premere Carica file R1R elaborati > OK. Selezionare la stessa cartella creata nel passaggio 6.3.1 contenente i file R1R elaborati. Premere OK. In questo passaggio, la cartella contenente i file dell'esperimento è pronta per essere esaminata.
    5. Nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati, premere Analisi dati. Selezionare Calibrazione > Calibrare i file R1R modificati > OK (vedere la Figura supplementare S2B). Questo passaggio calibra tutti i punti dati in base al primo passaggio di calibrazione, per creare una linea di base.
    6. Nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati, premere Analisi dati. Selezionare Rivedi e modifica file R1R > OK. Esaminare i punti dati, eliminare punti o aggiungere passaggi utilizzando il pulsante Elimina/Aggiungi passaggio . Assicurarsi che tutti i passaggi siano nella posizione corretta, ad esempio, la fase di calibrazione è sulla linea di base, la fase di associazione è al picco (vedere figura supplementare S3), quindi premere il pulsante Salva per salvare tutte le modifiche apportate.
    7. Nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati, premere Analisi dati. Selezionare Analizza/Traccia dati, scegliere i passaggi da esportare (vedere la Figura supplementare S4). Aggiungere ogni passaggio di associazione (ad esempio, passaggio 2, passaggio 7 e così via) dopo aver sottratto il passaggio di calibrazione (ad esempio, passaggio 1, passaggio 6 e così via) all'elenco di esportazione prima di esportare i dati.
    8. Premere Esporta questi dati. Il software genera un file di foglio di calcolo contenente l'I-Response per ogni punto di dati di concentrazione dell'analita da ciascun transistor (se tutti i transistor funzionano, avremo tre diversi valori di risposta I per ciascun punto di concentrazione). Utilizzare questo file di foglio di calcolo per analizzare ulteriormente i dati nel software statistico.
  4. Aprire il software di analisi statistica. Creare una tabella XY con tre valori Y; premere Crea. I dati per questa tabella (valori X, Y) vengono copiati dal file del foglio di calcolo creato nel passaggio 6.3.8. L'asse x corrisponde alla concentrazione dell'analita (a seconda della concentrazione utilizzata), e i tre valori Y corrispondono alle I-Responses, ottenute dal software Data Review/Export fornito dall'azienda.
  5. Premere Analizza questi dati. Scegliete Analisi XY > Regressione non lineare (Curve Fit) > Saturazione vincolante > un sito > totale. Il software analizzerà automaticamente i dati, genererà il valore KD e creerà un grafico dei punti dati.

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Representative Results

Risultati dell'esperimento 1:
La proteina bersaglio Hsp90 (500 nM) è stata immobilizzata al chip seguendo il protocollo di immobilizzazione target come descritto sopra. Per il primo esperimento, sono state preparate 10 concentrazioni della proteina analita Cdc37, comprese tra 25 nM e 5.000 nM, sulla base dei dati disponibili in letteratura (vedi Tabella 1).

Le fasi dell'esperimento possono essere monitorate in tempo reale seguendo le alterazioni che si verificano nell'I-Response (Figura 3A). Si può visualizzare come ogni passaggio incluso nel protocollo influisce sull'I-Response durante l'esperimento. Ad esempio, l'I-Response è vicino allo zero durante la calibrazione e, nella fase di associazione, l'I-Response aumenta gradualmente con l'aumentare delle concentrazioni di analita (Cdc37). Osservando i dati di questo esperimento (Figura 3A), è stato osservato un improvviso aumento della I-Response in basse concentrazioni di analiti (50 BU a 25 nM). Ci si aspettava una bassa I-Response a bassa concentrazione di analita che aumenterà gradualmente con l'aumentare delle concentrazioni. Questo improvviso aumento ha suggerito che dovrebbe essere progettato un esperimento che includa punti di concentrazione di analiti più bassi.

Seguendo i passaggi del protocollo discussi sopra, i dati sono stati analizzati nel software di analisi automatizzato fornito, che ha generato automaticamente un grafico Hill fit con un valore KD calcolato (Figura 3B). Il valore KD calcolato dal software di analisi automatizzato per il primo esperimento era di 350.000 ± 76.000 μM. La maggior parte delle interazioni biologiche comuni ha mostrato un valore KD nel basso μM o anche nell'intervallo nM; quindi, il valore KD generato per il primo esperimento è molto alto.

Ci possono essere diverse spiegazioni per l'alto valore KD osservato: ci può essere un legame a bassa affinità tra le due proteine specifiche studiate (Hsp90/Cdc37), il che significa che è necessaria un'alta concentrazione di ligando per le interazioni molecolari; l'esperimento potrebbe essere stato progettato con concentrazioni di analiti non ideali e fuori gamma; l'alto valore può essere dovuto ai parametri integrati utilizzati nel modulo di montaggio del software di analisi. Il software di analisi automatizzato utilizza un modulo di analisi dose-risposta per adattarsi ai punti dati, ma alcune interazioni potrebbero non adattarsi bene a questo modello, fornendo così dati falsi, con conseguenti valori KD elevati.

Per ottenere un valore KD accurato con un grafico di Hill saturo, è necessaria la standardizzazione dell'esperimento per tentativi ed errori che include sia punti di concentrazioni di analiti più bassi che superiori, per acquisire il valore KD più basso con un basso tasso di errore.

Considerando tutti questi fattori, i dati del software di analisi sono stati esportati in un software di analisi statistica aggiuntivo. L'I-Response per ogni punto di associazione è stato estratto utilizzando il software automatizzato di revisione/esportazione dei dati ed è riassunto nella Tabella 2 seguendo i passaggi discussi sopra nella fase di analisi (fase 6).

I risultati del software di analisi statistica (Figura 3C) hanno mostrato un valore KD relativamente basso con una deviazione standard elevata (0,011 ± 0,494 μM) e un basso valore R2 di 0,78. La variazione significativa osservata nel valore KD e nel basso valore R2 ha suggerito che i punti di concentrazione scelti per questo esperimento non sono ottimali. Inoltre, è stato anche notato che alcuni punti del grafico non si adattavano bene alla linea di tendenza del grafico (Figura 3C); ciò ha rafforzato la necessità di progettare un secondo esperimento includendo diversi punti di concentrazione dell'analita.

I parametri integrati utilizzati dai due software di analisi sono completamente diversi e si riflettono nel processo di generazione dei valori KD . Le differenze nei valori KD ottenuti dai due software di analisi (350.000 ± 76.000 μM contro 0,011 ± 0,494 μM) possono essere attribuite al fatto che per il calcolo sono stati utilizzati diversi moduli di analisi. L'analisi eseguita nel software di analisi statistica può essere più adatta a questa interazione, dando così un valore KD inferiore.

Tuttavia, se i risultati di entrambe le analisi sono combinati (350.000 ± 76.000 μM e 0,011 ± 0,494 μM), si può concludere che il primo esperimento non è stato ottimale e che sarebbero necessari ulteriori punti di concentrazione.

Per convalidare questo punto, è stato escluso il punto grafico non correlato, 3.000 nM (vedi Figura supplementare S5). I risultati dell'analisi hanno mostrato un valore KD di 0,006 ± 0,081 μM con un valore R2 di 0,98. Questi risultati hanno indicato che il prossimo esperimento dovrebbe essere progettato concentrandosi su concentrazioni più rilevanti. Pertanto, è stato eseguito un secondo esperimento per valutare Hsp90 / Cdc37 PPI utilizzando diversi punti di prova con concentrazioni inferiori e superiori al KD previsto.

Risultati dell'esperimento 2:
La proteina bersaglio, Hsp90 (500 nM) è stata immobilizzata al chip utilizzando il protocollo come descritto sopra. Un totale di 10 concentrazioni dell'analita (Cdc37) sono state preparate come segue: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM. Il secondo esperimento è stato progettato includendo diversi punti di concentrazione dell'analita, considerando tutte le intuizioni acquisite dall'esperimento precedente come menzionato sopra.

Durante l'esperimento, ogni fase è stata monitorata in tempo reale (Figura 4A). Qui, il grafico I-Response in tempo reale (derivato dalle basse concentrazioni dell'analita-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) inizia inizialmente da zero e aumenta gradualmente all'aumentare delle concentrazioni di analita ad ogni ciclo dell'esperimento rispetto all'improvviso aumento di I-Response osservato nel primo esperimento.

Seguendo il protocollo sopra menzionato, i dati sono stati analizzati utilizzando il software di analisi automatizzata (Figura 4B). Il valore KD calcolato dal software di analisi automatizzato per questo esperimento era 0,0673 ± 0,0002 μM, il che suggeriva una forte interazione tra la proteina bersaglio Hsp90 e l'analita Cdc37. La deviazione standard di 0,0002 μM era molto più piccola di quella ottenuta nel primo esperimento, il che dà fiducia che i nuovi dati siano molto più affidabili.

Per convalidare questo risultato, abbiamo esportato i punti dati (Tabella 3) in un altro software di analisi statistica come spiegato in precedenza; i risultati dell'analisi sono riassunti nella Figura 4C.

Utilizzando il software di analisi statistica, è stato riscontrato che il valore KD per Hsp90 / Cdc37 PPI è 0,014 ± 0,005 μM (Figura 4C). I bassi valori di KD e la deviazione standard indicano una forte interazione tra le due proteine, Hsp90 e Cdc37. Inoltre, il valore R2 di 0,99 indica che l'analisi si adatta perfettamente ai punti del grafico sperimentale. Entrambi i software di analisi hanno mostrato coerenza nei risultati, con bassi valori KD di circa 0,0673 ± 0,0002 μM e 0,014 ± 0,005 μM, rispettivamente.

Per confermare la riproducibilità e l'accuratezza dell'esperimento, lo stesso esperimento è stato eseguito in due replicature utilizzando Hsp90 (500 nM) come proteina bersaglio e Cdc37 come analita con le stesse concentrazioni che vanno da 0,4 nm a 200 nm utilizzate nel secondo esperimento. Durante l'esperimento, ogni fase è stata monitorata in tempo reale (Figura supplementare S6A e Figura supplementare S7A). Il valore KD calcolato dal software di analisi automatizzato è illustrato nella Figura supplementare S6B e nella Figura supplementare S7B (rispettivamente 0,053 ± 0,002 μM e 0,0719 ± 0,0007 μM). Come accennato in precedenza, i punti dati sono stati esportati (Tabella supplementare S1 e Tabella supplementare S2) in un altro software di analisi statistica, e i risultati sono mostrati nella Figura supplementare S6C e nella Figura supplementare S7C (Figura supplementare S6C: KD è 0,003 ± 0,009 μM e R2 è 0,99; Figura supplementare S7C: KD è 0,004 ± 0,009 μM e R2 è 0,99). I risultati delle due repliche da entrambi i software di analisi hanno confermato bene e confermato l'accuratezza, la ripetibilità e la riproducibilità dei dati sperimentali FEB Hsp90 / Cdc37.

È stato inoltre condotto uno studio di controllo in cui è stata chiarita l'interazione biomolecolare tra Hsp90 e una proteina di controllo, l'albumina sierica bovina (BSA). Lo studio di controllo utilizzando BSA come analita è stato fatto utilizzando una configurazione sperimentale identica e concentrazioni di analiti utilizzate nel secondo esperimento. Un totale di 10 concentrazioni della proteina di controllo, BSA, che vanno da 0,4 nM a 200 nM sono state preparate in 1x PBS (pH = 7,4) e ogni fase dell'esperimento è stata monitorata in tempo reale.

Simile all'esperimento con Hsp90 e Cdc37, il grafico I-Response in tempo reale parte inizialmente da 0; tuttavia, nello studio di controllo, l'I-Response non è aumentata gradualmente con l'aumento delle concentrazioni di analiti (Figura supplementare S8A). I dati sono stati analizzati anche utilizzando il software di analisi automatizzato (Figura supplementare S8B) e il software non è stato in grado di calcolare il valore KD dai punti dati di questo esperimento. È evidenziato, da Hill Plot generato dal software, che non vi è alcuna interazione tra Hsp90 e l'analita BSA di controllo. Per convalidare questo risultato, abbiamo esportato i punti dati (tabella supplementare S3) in un altro software di analisi statistica come spiegato in precedenza. Utilizzando il software di analisi statistica, è stato riscontrato che il valore KD per Hsp90/BSA PPI è negativo (Figura supplementare S8C; KD è -0,009 ± -0,0003 μM), indicando ancora una volta che non vi è alcuna interazione tra le due proteine, Hsp90 e BSA. Inoltre, il valore R2 (0,82) indica che l'analisi non si adattava ai punti del grafico sperimentale. Entrambi i software di analisi hanno mostrato coerenza nei risultati che Hsp90 e BSA non interagiscono.

Confrontando i dati sperimentali Hsp90/Cdc37 FEB con altri dati sperimentali disponibili in letteratura, si è riscontrato che i valori KD ottenuti in questo studio (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM e KD = 0,072 ± 0,001 μM) erano in due ordini di grandezza inferiori ai dati pubblicati in precedenza (KD = 1,46 μM38 o 6 μM39 ). Queste differenze possono essere attribuite all'uso di costrutti umani Hsp90 e Cdc37 a lunghezza intera negli esperimenti attuali. Studi precedenti sono stati condotti su costrutti Hsp90 del lievito che contenevano solo proteineparziali 38 o C. elegans omolog proteine39 (Tabella 1). Per convalidare i risultati ottenuti nel sistema FEB, sono stati eseguiti esperimenti ITC.

Valutazione di Hsp90/Cdc37 PPI utilizzando il sistema ITC:
ITC è considerato il gold standard per studiare le interazioni biomolecolari. Abbiamo inoltre eseguito ITC per determinare la cinetica termodinamica del PPI Hsp90 / Cdc37 e come convalida per l'esperimento FEB. Hsp90 e Cdc37 sono sottoposti a dialisi contro PBS (pH = 7,0) prima dell'ITC. Circa 0,25 μM di soluzione della proteina bersaglio (Hsp90) e 2,5 μM di soluzione di proteina analita (Cdc37) sono state preparate in PBS per le titolazioni calorimetriche. Un volume totale di 80 μL di soluzione di Cdc37 a intervalli consecutivi è stato titolato dalla siringa rotante alla cella contenente 150 μL di soluzione di Hsp90 a 298,15 K. Ogni iniezione si è verificata per una durata di 4 s e l'intervallo di tempo tra le iniezioni consecutive è stato di 150 s. Un totale di 19 iniezioni di 2 μL ciascuna sono state effettuate con una velocità di agitazione di 500 giri / min e una potenza di riferimento di 41,9 μW, rispettivamente. La variazione di calore risultante dall'interazione Hsp90/Cdc37 è stata monitorata e i dati finali ottenuti alla fine delle iniezioni di analita Cdc37 sono stati montati utilizzando il software di analisi ITC fornito dall'azienda. Sono state stimate le variazioni di calore insieme ai parametri termodinamici come il cambiamento di entalpia molare (ΔH), il cambiamento di entropia (ΔS), il numero di siti di legame (n) e la costante di dissociazione di equilibrio (KD) tra Hsp90 / Cdc37 PPI. La variazione di energia libera di Gibbs (ΔG) è stata calcolata anche dall'equazione ΔG = ΔH - TΔS dopo aver ottenuto parametri termici dal termogramma ITC.

Il grafico ITC rivela la quantità di calore consumato o liberato durante le interazioni biologiche per chiarire la natura delle interazioni e delle forze intermolecolari che governano il PPI40. Cdc37 (2,5 μM) è stato titolato in Hsp90 (0,25 μM) e le curve corrispondenti sono rappresentate nella Figura 5A,B. Il grafico ITC ottenuto è risultato esotermico ed è stato inserito in un singolo modello di sito di legame che presenta una stechiometria di legame (n) di uno, energia di legame, ΔG = -45,9 kJ / mol e valore KD = 0,009 μM. La leggera incoerenza osservata sotto forma di uno spostamento endotermico all'inizio del termogramma ITC (Figura 5A) suggerisce la formazione di bolle durante la titolazione della proteina analitica alla cella di misura41,42. Tra i PPI Hsp90/Cdc37, gli esperimenti ITC eseguiti a concentrazioni sempre più basse, l'eccesso di 10 volte di Cdc37 (concentrazione Hsp90 = 0,25 μM e concentrazione Cdc37 = 2,5 μM) ha mostrato parametri di legame accettabili raggiungendo una curva di saturazione. Il valore KD ottenuto da ITC (KD = 0,009 μM) è correlato bene con il valore KD calcolato utilizzando la tecnologia FEB (KD = 0,014 μM, 0,053 μM e 0,072 μM), supportando fortemente la sensibilità e l'accuratezza di FEB nel rilevare PPI Hsp90 / Cdc37.

Figure 2
Figura 2: Riepilogo del protocollo. (A) Riepilogo dei passaggi per il processo di attivazione del chip. (B) Rappresentazione grafica dei cinque passaggi ripetuti nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: File di dati generati dall'esperimento 1. (A) Dati dell'esperimento monitorati in tempo reale. L'asse y corrisponde all'I-Response nelle unità del biosensore (BU) e l'asse x corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. Questa cifra corrisponde ai dati del primo esperimento. (B) Grafico Hill Fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse y corrisponde a I-Response, l'asse x corrisponde alle concentrazioni di analita (Cdc37) in nM. Per questo esperimento, il valore KD è 350.000 ± 76.000 μM. (C) Grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse y corrisponde a I-Response alla fine della fase di associazione, l'asse x corrisponde alle diverse concentrazioni di analita, Cdc37. Questo grafico è stato generato utilizzando i punti dati forniti nella Tabella 2. Il riepilogo dei risultati dell'analisi è fornito nel grafico; per questo esperimento, il valore KD è 0,011 ± 0,494 μM e il valore R2 è 0,78. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: File di dati generati dall'esperimento 2. (A) Dati dell'esperimento monitorati in tempo reale. L'asse y corrisponde all'I-Response nelle unità del biosensore (BU) e l'asse x corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. Questa cifra corrisponde ai dati del secondo esperimento. (B) Grafico Hill Fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse y corrisponde a I-Response, l'asse x corrisponde alla concentrazione di analita (Cdc37) in nM. Per questo esperimento, il valore KD è 0,0673 ± grafico di associazione 0,0002 μM (C) generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse y corrisponde a I-Response alla fine della fase di associazione, l'asse x corrisponde alle diverse concentrazioni di analita Cdc37. Questo grafico è stato generato utilizzando i punti dati forniti nella Tabella 3. Il riepilogo dei risultati dell'analisi è fornito nel grafico; per questo esperimento, il valore KD è 0,014 ± 0,005 μM e il valore R2 è 0,99. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Termogramma ITC dell'interazione Hsp90 e Cdc37. (A) Il pannello superiore rappresenta le corrispondenti curve di evoluzione del calore ottenute a causa di iniezioni consecutive di Cdc37 (2,5 μM) in Hsp90 (0,25 μM) a 298,15 K. La potenza differenziale (DP) rappresenta la potenza differenziale in funzione del tempo. (B) I punti dati integrati nel pannello inferiore designano il corrispondente calore normalizzato rispetto al rapporto molare di Hsp90/Cdc37. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Saggi eseguiti Analisi FEB KD Analisi prismatica KD Costruisci origine Aminoacidi Referenze
ITC 1,46 μM e 1,32 μM NA Lievito Hsp90 Dominio N-terminale di Hsp90 36
Cdc umano37
SPR 6 μM NA C. elegans Lunghezza intera 37
FEB - Prima ripetizione 0,014 μM 0,067 μM Hsp90 umano Lunghezza intera Eseguito in questo studio
Cdc umano37
FEB - Seconda ripetizione 0,053 μM 0,003 μM Hsp90 umano Lunghezza intera Eseguito in questo studio
Cdc umano37
FEB - Terza ripetizione 0,072 μM 0,004 μM Hsp90 umano Lunghezza intera Eseguito in questo studio
Cdc umano37
ITC 0,009 μM NA Hsp90 umano Lunghezza intera Eseguito in questo studio
Cdc umano37
FEB- Studio di controllo Nessun dato (non c'erano dati sufficienti per calcolare il KD) -0,009 μM (il valore KD con valori negativi indica che non c'è interazione) Hsp90 umano Lunghezza intera Eseguito in questo studio
BSA

Tabella 1: Valutazione del PPI Hsp90/Cdc37 utilizzando diversi metodi riportati in questo studio e in letteratura.

Concentrazioni di analiti (nM) Transistor I-Response 1 Transistor I-Response 2 Transistor I-Response 3 Nella media
I-Risposta
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tabella 2: Riepilogo dei valori di I-Response generati da tre diversi transistor di ciascun chip in ogni punto di concentrazione del primo esperimento.

Concentrazioni di analiti (nM) Transistor I-Response 1 Transistor I-Response 2 Transistor I-Response 3 Risposta I media
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tabella 3: Riepilogo dei valori di I-Response generati da tre diversi transistor di ciascun chip in ciascun punto di concentrazione del secondo esperimento.

Figura supplementare S1: Screenshot della schermata principale del software automatizzato prima dell'inizio dell'esperimento. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Screenshot della schermata principale del software automatizzato per l'elaborazione e l'analisi dei dati. (A) Visualizzazione della schermata principale del software di revisione/esportazione dei dati che mostra le opzioni di elaborazione dei dati. (B) La schermata principale del software di revisione/esportazione dei dati che mostra le opzioni di analisi dei dati. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: I punti dati di revisione ottenuti dal software di revisione/esportazione. In questo passaggio esaminare l'esperimento e aggiungere o eliminare punti dati. Assicurati che il punto di associazione (2, 7, 12, 17, 22 e così via) sia sempre a portata di mano. Ad esempio, la prima scelta da sinistra è il punto dati numero 2 e quindi il punto dati numero 10 (ma dovrebbe essere il numero 7). Per risolvere questo problema basta eliminare i punti 3, 4 e 5. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S4: Ad esempio, Esporta l'elenco dei dati. In questo passaggio, scegli quali punti dell'esperimento esportare. Scegliere un punto di associazione (2, 7, 12, 17, 22 e così via) e sottrarre i passaggi di calibrazione precedenti (1, 6, 11, 16, 21 e così via). Aggiungi tutti i punti all'elenco di esportazione ed esporta questi dati per ottenere un foglio di calcolo con I-Response per ogni punto dati. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S5: Grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse y corrisponde a I-Response alla fine della fase di associazione, l'asse x corrisponde alle diverse concentrazioni di analita Cdc37. Questo grafico è stato generato utilizzando i punti dati del primo esperimento ed escluso il punto dati di concentrazione di 3.000 nM. Il riepilogo dei risultati dell'analisi è fornito nel grafico; per questo esperimento, il valore KD è 0,006 ± 0,081 μM e il valore R2 è 0,98. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S6: I file di dati generati dall'esperimento 2 replicano 1. (A) Dati degli esperimenti monitorati in tempo reale. L'asse y corrisponde all'I-Response nelle unità del biosensore (BU) e l'asse x corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. Questa cifra corrisponde ai dati della seconda ripetizione eseguita nel secondo esperimento in cui Hsp90 è stato immobilizzato sul chip (500 nM) e sono state preparate 10 concentrazioni di analita Cdc37 (0,4-200 nM). Il grafico I-Response in tempo reale inizia inizialmente da 0 e aumenta gradualmente all'aumentare delle concentrazioni di analiti ad ogni ciclo dell'esperimento, suggerendo che l'esperimento ha successo. (B) Grafico Hill Fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse y corrisponde a I-Response, l'asse x corrisponde alle concentrazioni di analita (Cdc37) in nM. I risultati dell'analisi automatizzata hanno mostrato un valore KD relativamente basso e una bassa deviazione standard di 0,0531 ± 0,0002 μM, suggerendo una forte interazione tra Hsp90 e Cdc37. (C) Il grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse y corrisponde a I-Response alla fine della fase di associazione, l'asse x corrisponde alle diverse concentrazioni di analita Cdc37. Questo grafico è stato generato utilizzando i punti dati forniti nella tabella S1. Il riepilogo dei risultati dell'analisi è fornito nel grafico; per questo esperimento, il valore KD è 0,003 ± 0,009 μM e il valore R2 è 0,99. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S7: I file di dati generati dall'esperimento 2 replicano 1. (A) Dati degli esperimenti monitorati in tempo reale. L'asse y corrisponde all'I-Response nelle unità del biosensore (BU) e l'asse x corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. Questa cifra corrisponde ai dati della terza ripetizione nel secondo esperimento in cui Hsp90 è stato immobilizzato sul chip (500 nM) e sono state preparate 10 concentrazioni di analita Cdc37 (0,4-200 nM). (B) Grafico Hill Fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse y corrisponde a I-Response, l'asse x corrisponde alle concentrazioni di analita (Cdc37) in nM. I risultati dell'analisi automatizzata hanno mostrato un valore KD relativamente basso e una deviazione standard bassa di 0,0719 ± 0,0007 μM, suggerendo una forte interazione tra Hsp90 e Cdc37. (C) Grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse y corrisponde a I-Response alla fine della fase di associazione. L'asse x corrisponde alle diverse concentrazioni di analita Cdc37. Questo grafico è stato generato utilizzando i punti dati forniti nella tabella S2. Il riepilogo dei risultati dell'analisi è fornito nel grafico; per questo esperimento, il valore KD è 0,004 ± 0,009 μM e il valore R2 è 0,99. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S8: File di dati generati dall'esperimento di controllo. (A) Dati degli esperimenti monitorati in tempo reale. L'asse y corrisponde all'I-Response nelle unità del biosensore (BU) e l'asse x corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. Questa cifra corrisponde ai dati dell'esperimento di controllo in cui Hsp90 è stato immobilizzato sul chip (500 nM) e sono state preparate 10 concentrazioni di analita BSA (proteina di controllo) (0,4-200 nM). Il grafico I-Response in tempo reale parte da un basso I-Response intorno a 10-15 BU e non aumenta con un aumento delle concentrazioni di analiti ad ogni ciclo dell'esperimento, suggerendo che non vi è alcuna interazione tra Hsp90 e BSA. (B) Grafico Hill Fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse y corrisponde a I-Response; l'asse x corrisponde alle concentrazioni di analita (BSA) in nM. I risultati dell'analisi automatizzata hanno mostrato che non ci sono dati sufficienti per calcolare il valore KD suggerendo che non vi è alcuna interazione tra Hsp90 e BSA. (C) Grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse y corrisponde a I-Response alla fine della fase di associazione, l'asse x corrisponde alle diverse concentrazioni di BSA dell'analita. Questo grafico è stato generato utilizzando i punti dati forniti nella tabella S4. Il riepilogo dei risultati dell'analisi è fornito nel grafico; per questo esperimento, il valore KD è -0,009 ± -0,0003 μM e il valore R2 è 0,82. Un valore KD negativo vicino allo zero indica che non vi è alcuna interazione tra Hsp90 e BSA. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Riepilogo dei valori di I-Response generati in ciascun punto di concentrazione e letti dai transistor di ciascun chip (tre diversi transistor per ciascun chip). Questa tabella corrisponde ai dati estratti dalla seconda ripetizione eseguita per il secondo esperimento in cui Hsp90 è stato immobilizzato sul chip (500 nM) e sono state preparate 10 concentrazioni di analita Cdc37 (0,4-200 nM). I punti dati di questa tabella sono stati utilizzati per l'analisi nel software di analisi statistica. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S2: Riepilogo dei valori di I-Response generati in ciascun punto di concentrazione e letti dai transistor di ciascun chip (tre diversi transistor per ciascun chip). Questa tabella corrisponde ai dati estratti dalla terza ripetizione eseguita per il secondo esperimento in cui Hsp90 è stato immobilizzato sul chip (500 nM) e sono state preparate 10 concentrazioni di analita Cdc37 (0,4-200 nM). I punti dati di questa tabella sono stati utilizzati per l'analisi nel software di analisi statistica. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S3: Riepilogo dei valori di I-Response generati in ogni punto di concentrazione e letti dal transistor di ciascun chip (tre diversi transistor per ogni chip). Questa tabella corrisponde ai dati dell'esperimento di controllo in cui Hsp90 è stato immobilizzato sul chip (500 nM) e sono state preparate 10 concentrazioni di analita BSA (0,4-200 nM). I punti dati di questa tabella sono stati utilizzati per l'analisi nel software di analisi statistica. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

In questo studio, è stata valutata la fattibilità dell'utilizzo della tecnologia FEB (un approccio di caratterizzazione cinetica in tempo reale) per determinare l'interazione biomolecolare tra Hsp90 e Cdc37. L'esperimento esplorativo iniziale (primo esperimento) ha suggerito che la scelta delle concentrazioni di analiti corrette è una parte critica dell'esperimento e che l'esperimento dovrebbe essere progettato includendo punti di concentrazione sopra e sotto il valore KD , che sono stati previsti sulla base dei dati disponibili in letteratura.

Tuttavia, se non ci sono informazioni preliminari sull'interazione, suggeriamo di progettare un esperimento preliminare includendo un'ampia gamma di punti di concentrazione in entrambi gli intervalli inferiori (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) e superiori (1.000 nM, 2.500 nM, 5.000 nM). L'esperimento preliminare fornisce una stima approssimativa del valore KD e consente di pianificare gli esperimenti successivi utilizzando i giusti intervalli di concentrazione per ottenere un valore KD accurato. Il sistema FEB offre una funzione di protocollo di modifica in cui si è liberi di scegliere il numero di punti di concentrazione per l'esperimento.

Dalla nostra esperienza, i passaggi più critici coinvolti nel protocollo FEB sono i seguenti. La proteina bersaglio e il tampone analitico devono essere gli stessi del tampone di calibrazione. Anche una piccola mancata corrispondenza del buffer può causare fluttuazioni nell'I-Response e dare risultati inaffidabili. Pertanto, suggeriamo di eseguire la dialisi durante la notte mediante un adeguato scambio di buffer. Un'attenta pipettaggio sul chip del biosensore durante l'aspirazione o l'applicazione di una soluzione è fondamentale durante l'esperimento. Il pipettaggio incurante può portare a transistor rotti o fluttuazioni nell'I-Response; durante il pipettaggio, assicurarsi di non toccare la superficie sensibile del chip. La soluzione EDC/sulfo-NHS utilizzata nel processo di attivazione del chip deve essere miscelata fresca prima di ogni utilizzo. L'uso di una vecchia miscela può comportare un chip non funzionalizzato. Assicurati di utilizzare lo stesso buffer per tutti e cinque i passaggi ripetitivi (calibrazione, associazione, dissociazione, rigenerazione e lavaggio) coinvolti in tutti i cicli dell'esperimento.

Confrontando FEB con sistemi di rilevamento biomolecolari ben consolidati sul campo, come BLI o SPR, abbiamo scoperto che tutti e tre i metodi condividono vantaggi simili 43,44,45 che sono: sono sistemi privi di etichette, che non richiedono costosi coloranti fluorescenti per rilevare le interazioni; sono in grado di rilevare interazioni anche in piccoli intervalli nM; i chip sono riutilizzabili sia in SPR che in FEB e possono essere rigenerati e riutilizzati in modo efficiente per un massimo di 10 esperimenti, e tutti e tre i metodi forniscono dati cinetici in tempo reale e il tempo dell'esperimento è breve.

Il vantaggio principale di SPR è che fornisce dati più estesi dall'esperimento in modo da poter calcolare KD, Kon, Koff, stechiometria e parametri termodinamici44. Il principale vantaggio di BLI è la sua capacità di testare più concentrazioni in un unico esperimento. Le misurazioni cinetiche possono essere eseguite simultaneamente per un massimo di otto concentrazioni utilizzando diversi sensori. Tuttavia, i sensori BLI non sono riutilizzabili, rendendo così il costo dell'esperimento estremamente alto43.

Il vantaggio principale di FEB è il suo software automatizzato e intuitivo che guida l'utente durante l'esperimento e la sua piattaforma di pipettaggio a mano aperta che consente all'utente di aggiungere l'analita al bersaglio immobilizzato in ogni fase. Questo approccio di open pipettaggio combinato con un semplice software rende il FEB facile da imparare e richiede poca o addirittura nessuna formazione. Tuttavia, richiede che l'utente abbia una padronanza di base del pipettaggio manuale e la mancanza di gestione automatizzata dei liquidi significa che la riproducibilità della temporizzazione dei passi dipende interamente dall'utente. Questa stessa mancanza di gestione integrata dei liquidi significa che i chip e gli strumenti sono convenienti rispetto a SPR o BLI. Il FEB mostra anche un'elevata riproducibilità e affidabilità nel rilevare interazioni biomolecolari a causa del processo di fabbricazione definito coinvolto nella preparazione del chip del biosensore35.

Rispetto al metodo di rilevamento ITC ben consolidato e standard, FEB utilizza solo 50 μL di volume di analiti a concentrazioni nanomolari per l'intero esperimento, diminuendo la possibilità di nucleazione o aggregazione di proteine. Uno dei maggiori problemi con ITC è il degasaggio delle proteine prima del caricamento per evitare bolle d'aria. Durante l'esperimento ITC, c'è la possibilità di sviluppare bolle all'interno della cella di misurazione a causa di agitazione continua e spurgo intenso, che possono schizzare negativamente la soluzione del campione o causare la perdita del campione42. La tecnologia FEB supera queste sfide dell'ITC offrendo una robusta chimica di immobilizzazione del bersaglio, riducendo l'aggregazione e il gorgogliamento, aumentando la stabilità e migliorando i problemi dipendenti dalla concentrazione affrontati dall'ITC.

Un potenziale svantaggio dei dispositivi FEB è la loro suscettibilità alla composizione del tampone e ai cambiamenti di concentrazione, che possono causare una deriva nella linea di base che dovrebbe essere corretta durante il montaggio e l'analisi dei risultati. Il chip del biosensore è anche sensibile al pH e al sale, quindi i tamponi utilizzati durante la calibrazione e la misurazione dell'analita devono essere gli stessi durante l'esperimento. Le sostanze chimiche utilizzate come conservanti (ad esempio, azide di sodio) e molecole idrofobiche possono danneggiare il sensore e possono persino causare un aumento del legame non specifico. Questi inconvenienti possono essere mitigati con attenzione alla coerenza del tampone durante le fasi di misurazione, alla dialisi dei composti interferenti dal materiale analitico e all'appropriata passivazione della superficie (ad esempio, uso di detergenti, bloccanti proteici o diverse molecole PEG).

In sintesi, abbiamo dimostrato con successo un forte PPI tra Hsp90 / Cdc37 utilizzando la tecnologia FEB e convalidato la loro interazione utilizzando ITC, fornendo dati incoraggianti a supportare FEB come metodo alternativo innovativo per il rilevamento PPI. La tecnologia FEB offre una vasta gamma di applicazioni in diversi campi della scoperta di farmaci, prodotti farmaceutici, analisi biomolecolare di piccole molecole, peptidi e proteine, sviluppo di anticorpi, convalida di farmaci e ottimizzazione del piombo a portata di mano traducendo prontamente l'attività biologica in vitro in efficacia in vivo . Considerando i vantaggi della tecnologia FEB e le sue immense applicazioni nell'esplorazione di interazioni PPI, proteine e DNA o RNA, nonché interazioni di proteine e piccole molecole (ad esempio, farmaci), proponiamo che si tratti di una tecnologia unica e promettente nella cassetta degli attrezzi di rilevamento PPI. Nel nostro caso, la tecnologia FEB offre uno strumento prezioso per valutare prontamente l'efficacia di legame dei candidati antagonisti PPI Hsp90 / Cdc37, che quindi aiuta a selezionare candidati promettenti per ulteriori valutazioni in vitro e in vivo relative a varie malattie in cui questo PPI è critico.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Binational Science Foundation (BSF) a S.K.S. e N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

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Esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo
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Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

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