Summary
A biosensação de efeito de campo (FEB) é uma técnica livre de rótulos para detectar interações biomoleculares. Ele mede a corrente elétrica através do biosensor de grafeno ao qual os alvos de ligação são imobilizados. A tecnologia FEB foi utilizada para avaliar interações biomoleculares entre Hsp90 e Cdc37 e foi detectada uma forte interação entre as duas proteínas.
Abstract
As interações biomoleculares desempenham papéis versáteis em inúmeros processos celulares, regulando e coordenando eventos biológicos funcionalmente relevantes. Biomoléculas como proteínas, carboidratos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos e enzimas são blocos fundamentais de construção de seres vivos; eles se reúnem em redes complexas em biossistemas para sincronizar uma miríade de eventos de vida. As proteínas normalmente utilizam redes interativas complexas para realizar suas funções; por isso é obrigatório avaliar tais interações para desvendar sua importância nas células tanto em níveis celulares quanto de organismos. Em direção a esse objetivo, introduzimos uma tecnologia emergente em rápida inovação, biosensação de efeito de campo (FEB), para determinar interações biomoleculares específicas. FEB é uma técnica de detecção biomolecular sem rótulos e confiável para determinar interações específicas e usa biosensores de alta qualidade à base de eletrônicos. A tecnologia FEB pode monitorar interações na faixa de nanomolar devido aos nanomateriais biocompatíveis usados em sua superfície biosensor. Como prova de conceito, elucidada a interação proteína-proteína (PPI) entre a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) e o ciclo de divisão celular 37 (Cdc37). Hsp90 é um acompanhante molecular dependente de ATP que desempenha um papel essencial no controle de dobra, estabilidade, maturação e qualidade de muitas proteínas, regulando assim múltiplas funções celulares vitais. O Cdc37 é considerado um acompanhante molecular específico da quinase, pois reconhece e recruta especificamente quinases proteicas para Hsp90 para regular suas vias de transdução de sinal a jusante. Como tal, o Cdc37 é considerado co-acompanhante do Hsp90. A via acompanhante-quinase (complexo Hsp90/Cdc37) é hiperativada em múltiplas malignidades que promovem o crescimento celular; portanto, é um alvo potencial para a terapia do câncer. O presente estudo demonstra a eficiência da tecnologia FEB utilizando o sistema modelo Hsp90/Cdc37. A FEB detectou um PPI forte entre as duas proteínas (valores KD de 0,014 μM, 0,053 μM e 0,072 μM em três experimentos independentes). Em resumo, a FEB é uma plataforma de detecção de PPI sem rótulos e econômica, que oferece medições rápidas e precisas.
Introduction
Interações biomoleculares:
As proteínas são partes essenciais dos organismos e participam de inúmeras vias moleculares, como metabolismo celular, estrutura celular, sinalização celular, respostas imunes, adesão celular e muito mais. Enquanto algumas proteínas executam suas funções de forma independente, a maioria das proteínas interagem com outras proteínas usando uma interface de ligação para coordenar a atividade biológica adequada1.
As interações biomoleculares podem ser classificadas principalmente com base nas distintas características estruturais e funcionais das proteínas envolvidas2, por exemplo, com base nas superfícies proteicas, na estabilidade complexa ou na persistência das interações3. Identificar proteínas essenciais e seus papéis nas interações biomoleculares é vital para a compreensão de mecanismos bioquímicos no nível molecular4. Atualmente, existem várias abordagens para detectar essas interações5: in vitro6, no silico7, nas células vivas8, ex vivo9, e in vivo10 com cada um tendo seus próprios pontos fortes e fracos.
Os ensaios in vivo são realizados utilizando todo o animal como ferramenta experimental11, e os ensaiost he ex vivo são realizados em extratos de tecido ou órgãos inteiros (por exemplo, coração, cérebro, fígado) em um ambiente externo controlado, proporcionando alterações mínimas em condições naturais. A aplicação mais comum de estudos in vivo e ex vivo é avaliar a farmacocinética, a farmacodinâmica e os efeitos de toxicidade de potenciais agentes farmacológicos antes dos testes em humanos, garantindo sua segurança e eficácia globais12.
Interações biomoleculares também podem ser detectadas dentro de células vivas. As células vivas de imagem nos permitem observar interações dinâmicas enquanto executam as reações de uma determinada via bioquímica13. Além disso, técnicas de detecção, como bioluminescência ou transferência de ressonância fluorescência, podem fornecer informações sobre onde e quando essas interações ocorrem dentro da célula14. Embora a detecção em células vivas ofereça detalhes cruciais, essas metodologias de detecção dependem de óptica e rótulos, que podem não refletir a biologia nativa; eles também são menos controlados do que os métodos in vitro e requerem especialização especializada para realizar15.
Os métodos computacionais em silico são usados principalmente para a triagem em larga escala de moléculas-alvo antes dos experimentos in vitro . Métodos de previsão computacional, bancos de dados baseados em computador, acoplamento molecular, relações de estrutura-atividade quantitativa e outras abordagens de simulação de dinâmica molecular estão entre os bem estabelecidos nas ferramentas silico 16. Em comparação com técnicas experimentais laboriosas, as ferramentas em silico podem facilmente fazer previsões com alta sensibilidade, mas com menor precisão no desempenho preditivo17.
Ensaios in vitro são realizados com microrganismos ou moléculas biológicas fora de seu contexto biológico padrão. Retratar interações biomoleculares através de métodos in vitro é fundamental para entender as funções proteicas e a biologia por trás da complexa rede de funcionamento celular. A metodologia de ensaio preferencial é escolhida de acordo com as propriedades intrínsecas da proteína, valores cinéticos e o modo e intensidade das interações18,19.
A interação Hsp90/Cdc37:
A via acompanhante-quinase, que conecta Hsp90 e Cdc37, é um alvo terapêutico promissor na biologia tumoral20. O Hsp90 desempenha um papel central no controle do ciclo celular, montagem de proteínas, sobrevivência celular e caminhos de sinalização. Proteínas que dependem do Hsp90 para suas funções são entregues ao Hsp90 para complexação através de um co-acompanhante, como o Cdc37. O complexo Hsp90/Cdc37 controla a dobra da maioria das quinases proteicas e serve como um hub para uma infinidade de redes de sinalização intracelular21. É um alvo anti-tumor promissor devido à sua expressão elevada em várias malignidades, incluindo leucemia mieloblástica aguda, mieloma múltiplo e carcinoma hepatocelular22,23.
Comumente usadas técnicas de detecção de interação biomolecular in vitro
A co-imunoprecipitação (co-IP) é uma técnica que depende da especificidade do anticorpo de antígeno para identificar interações biologicamente relevantes24. A principal desvantagem deste método é sua incapacidade de detectar interações de baixa afinidade e valores cinéticos24. Métodos biofísicos como calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon superficial (SPR), interferometria biocamida (BLI) e tecnologia FEB são preferidos para determinar os valores cinéticos.
ITC é um método de detecção biofísica baseado na determinação da energia vinculante, juntamente com uma análise termodinâmica completa para caracterizar interações biomoleculares25. A principal vantagem do ITC é que ele não requer nenhuma rotulagem ou fixação da proteína alvo. As principais dificuldades encontradas pelo ITC são a alta concentração de proteína-alvo necessária para um experimento e a dificuldade em analisar complexos não covalentes devido a pequenas indeseçõesde ligação 26. Tanto o SPR quanto o BLI são técnicas biofísicas sem rótulos que dependem da imobilização da molécula alvo na superfície do sensor, seguidas de injeções subsequentes do analito sobre o alvo imobilizado27,28. Em SPR, são medidas alterações no índice refrativo durante interações biomoleculares27; em BLI, a interferência na luz refletida é registrada em tempo real como uma mudança no comprimento de onda em função do tempo28. Tanto o SPR quanto o BLI compartilham vantagens comuns de oferecer altas especificidades, sensibilidade e recursos de detecção29. Em ambos os métodos, a proteína alvo é imobilizada em superfícies biosensoras e, portanto, pode haver alguma perda da conformação nativa do alvo, o que dificulta a discriminação entre interações específicas versus não específicas30. A BLI usa biosensores descartáveis de fibra óptica caros para imobilizar o alvo e, portanto, é uma técnicacara 31. Em comparação com essas ferramentas bem estabelecidas de detecção biomolecular, a tecnologia FEB oferece uma plataforma confiável e livre de rótulos usando baixas concentrações de nanomolar para detecção biomolecular em tempo real com caracterização cinética. A tecnologia FEB também supera os desafios borbulhantes enfrentados no ITC e é mais econômica em comparação com a SPR ou BLI.
O biosensores baseados em transistor de efeito de campo (FET) é um campo emergente para detectar interações biomoleculares, oferecendo aplicações biomédicas variadas. No sistema FET, os alvos são imobilizados para os chips biosensor e as interações são detectadas por alterações na condutância32. A característica única a ser considerada no desenvolvimento de um biosensor eletrônico eficiente são as propriedades físico-químicas, como a natureza semi-condutora e a estabilidade química do material de revestimento usado para fabricar a superfície do sensor33. Materiais convencionais como o silício usado para fet limitaram a sensibilidade dos sensores porque requer camadas de óxido entre o canal do transistor e um ambiente específico para o bom funcionamento34. Além disso, os transistores de silício são sensíveis a ambientes de alto sal, dificultando a mensuração das interações biológicas em seu ambiente natural. O biosensor à base de grafeno é apresentado como uma alternativa, pois oferece excelente estabilidade química e campo elétrico. Uma vez que o grafeno é uma única camada atômica de carbono, é extremamente sensível como um semicondutor e quimicamente compatível com soluções biológicas; ambas as qualidades são desejáveis para gerar biosensores eletrônicos compatíveis35. O notável potencial de carregamento ultra-alto de biomoléculas oferecido por biosensores revestidos de grafeno leva ao desenvolvimento da tecnologia FEB baseada em grafeno.
Princípio da tecnologia FEB: FEB é uma técnica de detecção biomolecular sem rótulos que mede a corrente elétrica através do biosensor de grafeno ao qual os alvos de ligação são imobilizados. As interações entre a proteína imobilizada e o analito resultam em alterações na corrente que são monitoradas em tempo real, permitindo medições cinéticas precisas36.
Instrumentação: O sistema FEB compreende um chip de sensor transistor de efeito de campo de grafeno (gFET) e um leitor eletrônico que aplica uma tensão constante ao longo do experimento (Figura 1). O analito é aplicado em solução para a proteína alvo imobilizada na superfície do biosensor. Quando ocorre uma interação, uma alteração na corrente é medida e registrada em tempo real. À medida que a concentração de analito aumenta, a fração de analito ligado também aumentará, causando maiores alterações na correnteza. Utilizando o software de análise automatizada fornecido com o instrumento (Tabela de Materiais), o I-Response é medido e registrado em termos de unidades de biosensação (BU)37. A I-Resposta é definida como a alteração na corrente (I) através do chip biosensor medido em tempo real após a interação do alvo imobilizado com o analito. O software de análise automatizada FEB pode analisar tanto o I-Response quanto o C-Response para eventos de interação dinâmica, onde o C-Response registra as alterações na capacitância (C). As variações tanto na I-Resposta quanto na Resposta C correspondem diretamente à fração de analito vinculado e podem ser analisadas para gerar valores KD . A preferência padrão do software de análise automatizada é I-Response.
Figura 1: Visão geral da configuração experimental. (A) chip baseado em grafeno e um leitor eletrônico. (B) Uma visão geral dos componentes do chip. O chip está ligado a dois eletrodos que fornecem corrente ao sistema. A superfície do chip é coberta com grafeno, que quando ativado pode ligar o alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Metodologia:
Inicialmente, o chip biosensor ativado é inserido no dispositivo FEB (Figura 1) seguido da execução das etapas abaixo: (1) Calibração: O experimento começa com a calibração do sistema usando 1x salina tamponada de fosfato (PBS; pH = 7,4) para criar a resposta de equilíbrio de linha de base. (2) Associação: O analito é introduzido no chip e o I-Response é monitorado até que a saturação de vinculação seja alcançada. (3) Dissociação: O analito é dissociado utilizando 1x PBS. (4) Regeneração: Os remanescentes do analito são removidos utilizando-se 1x PBS. (5) Lavagem: Um total de cinco lavagens são realizadas utilizando 1x PBS para a remoção completa dos analitos amarrados e desvinculados do chip.
Análise:
A análise de dados é realizada utilizando-se o software totalmente automatizado fornecido com o instrumento. O software de análise automatizada gera um gráfico de ajuste hill com um valor KD . O enredo de ajuste de Hill descreve a associação de um analito à proteína alvo em função de concentrações de analitos. A concentração na qual uma resposta semi-máxima é alcançada é proporcional ao valor KD . Um baixo valor KD representa alta afinidade vinculante e vice-versa.
Para validar os dados obtidos a partir do experimento FEB, as Respostas I são extraídas de cada ponto de leitura para cada concentração de analitos usando o software de revisão/exportação de dados e podem ser exportadas para outros softwares de análise estatística (ver Tabela de Materiais), conforme explicado abaixo.
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Protocol
NOTA: As proteínas recombinantes utilizadas neste estudo, Hsp90 e Cdc37, foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais).
1. Ativação de chips
NOTA: Todos os materiais a serem utilizados no experimento estão listados na Tabela de Materiais. Filtre todas as soluções preparadas através de um filtro estéril de 0,2 μm.
- Prepare a solução de carbodiimídeo de 1-Ethyl-3-3-(3-dimethylamino propyl) (EDC) adicionando 2 mg de EDC a 2,5 mL de 1 M 2-(N-morpholino) tampão de ácido sulfônico de etano (MES) (pH = 6,0) em um tubo de 15 mL. Prepare as soluções N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) adicionando 6 mg de sulfo-NHS a 2,5 mL de tampão mes de 1 M (pH = 6,0) em um tubo separado de 15 mL. Aliquot 50 μL de cada solução em tubos independentes e armazenar a -20 °C para uso futuro.
- Misture volumes iguais de solução EDC e sulfo-NHS (50 μL de EDC + 50 μL de sulfo-NHS) por pipetar para cima e para baixo (não vórtice).
NOTA: A solução mista de EDC/sulfo-NHS deve ser usada dentro de 30 minutos para manter uma ligação cruzada eficaz para uma funcionalidade adequada do chip. - Coloque o chip biosensor (5,7 cm x 2,4 cm; veja Tabela de Materiais) fornecido pela empresa em uma placa de vidro Petri com tampa equipada. Todas as etapas de funcionalização envolvidas na ativação do chip são sugeridas para serem feitas dentro da placa de Petri. Aplique 50 μL de 1 M de tampão MES (pH = 6,0) no chip biosensor, incubar por 1 min em temperatura ambiente e, em seguida, aspirar o buffer.
- Aplique 50 μL de solução EDC/sulfo-NHS imediatamente ao chip do sensor. Cubra a placa de Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspirar solução EDC/sulfo-NHS do chip.
- Enxágüe o chip uma vez com 50 μL de tampão MES de 1 M (pH = 6,0); aspirar o buffer MES.
2. Imobilização de proteínas-alvo
- Enxágüe o chip 2x com 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspire o PBS do chip e adicione a molécula alvo, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
NOTA: A incompatibilidade de buffer pode arruinar todo o experimento; portanto, antes do experimento, é importante ter certeza de que a molécula alvo está no mesmo buffer que a usada para calibração (por exemplo, 1x PBS (pH = 7,4)). Se necessário, realize uma troca de buffer por diálise durante a noite antes do experimento. Neste experimento, foi realizada diálise noturna para ambas as proteínas recombinantes, Hsp90 e Cdc37, contra 1x PBS (pH = 7,4; ver Tabela de Materiais) com troca de tampão adequada a 4 °C. A concentração do material alvo (Hsp90 neste caso) pode variar de acordo com diferentes protocolos experimentais e a natureza dos materiais-alvo (proteína/peptídeo/ligantes). - Cubra a placa de vidro Petri e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução contendo a molécula alvo e enxágue 3x com 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspire a solução 1x PBS (pH = 7,4) do chip.
- Adicione 50 μL de Súsia 1 (3,9 mM amino-PEG5-álcool em 1x PBS (pH = 7,4)) solução ao chip. Cubra a placa de petri de vidro e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente. Aspire a solução Quench 1 do chip.
- Adicione 50 μL de Solução Quench 2 (1 M de etanolamina (pH = 8,5)) ao chip. Cubra a placa de petri de vidro e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspirar a solução Quench 2 do chip e enxaguar o chip 5x usando 50 μL de 1x PBS, deixando a última gota pbs no sensor.
3. Preparando amostras de analito
- Prepare a série de diluição de analito para Cdc37 na faixa de concentração desejada. Para o primeiro experimento, foram utilizadas as seguintes concentrações: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM e 5.000 nM. Para o segundo experimento, utilizou-se um conjunto diferente de concentrações que variavam de 0,4 nM a 200 nM.
- Projete o experimento para incluir pelo menos oito concentrações diferentes de analito para obter um valor KD confiável. Preparar as diferentes diluições da proteína de analito no mesmo tampão que a usada para calibração e proteína-alvo; aqui é 1x PBS (pH = 7,4).
4. Carregamento do chip biosensor ativado no dispositivo FEB
NOTA: O dispositivo FEB consiste em um leitor com indicações de luz LED e um cartucho para inserir o chip biosensor.
- Após a imobilização da proteína alvo, insira o chip ativado no cartucho do dispositivo, que é conectado via USB a um computador. Após a inserção do chip, uma luz LED verde será exibida no leitor indicando que o dispositivo FEB está pronto para o experimento. Instale o software automatizado (ver Tabela de Materiais) fornecido pela empresa no computador, ao qual o dispositivo FEB está conectado, para monitorar o experimento passo a passo conforme descrito abaixo.
5. Execute o experimento
- Pressione o módulo Executar Experimento no software automatizado e escolha 10 pontos com regeneração ou qualquer outro protocolo desejado. Preencha os seguintes detalhes: nome do operador, nome do experimento, data (por exemplo, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); tampão de regeneração (por exemplo, tampão PBS); alvo imobilizado (por exemplo, Hsp90); analito em solução (por exemplo, Cdc37). Consulte a Figura Suplementar S1 para obter detalhes.
- Pressione o botão Iniciar o teste exibido no software e siga as instruções mostradas pelo software automatizado conforme descrito abaixo.
NOTA: O software é totalmente automatizado, fácil de usar e orienta o usuário durante todo o experimento passo a passo. Uma janela pop-up aparecerá na tela com instruções para prosseguir em cada etapa do experimento. O software fornecerá instruções para cada passo repetitivo consecutivamente da calibração, associação de analitos, dissociação, regeneração e lavagem (5x) para cada concentração de analitos ao longo do experimento. - Executar a calibração do instrumento. Para isso, aspire a solução PBS restante do chip e aplique 50 μL de tampão de calibração (1x PBS; pH = 7,4). Pressione o botão Continuar e aguarde por 5 minutos até que a etapa de calibração esteja concluída. O software exibe o ponto final determinado para a etapa de calibração (5 minutos) com um alarme de aviso para acompanhamento.
- Em seguida, faça uma associação de analitos. Para isso, aspire o tampão de calibração do chip e aplique 50 μL da menor concentração de analito (25 nM de Cdc37). Pressione o botão Continuar e aguarde por 5 minutos até que a etapa de associação esteja concluída. O software exibe o ponto final para a etapa de associação (5 min) com um alarme de aviso para prosseguir.
- Faça uma dissociação de analitos. Para isso, aspire a solução de analito do chip e aplique 50 μL do tampão de dissociação (1x PBS; pH = 7,4). Pressione o botão Continuar e aguarde por 5 minutos até que a duração da etapa de dissociação (5 min) esteja concluída. O software exibe o ponto final para a etapa de dissociação (5 min) com um alarme de aviso para acompanhamento.
- Em seguida, realize a regeneração de chips. Aspire a solução de dissociação do chip e aplique 50 μL de tampão de regeneração (1x PBS; pH = 7,4). Pressione o botão Continuar e aguarde por 30 s até que a duração da etapa de regeneração (30 s) esteja concluída. O software exibe o ponto final para a etapa de regeneração (30 s) com um alarme de aviso para acompanhamento.
- Finalmente, lave o chip. Aspire a solução de regeneração do chip e aplique 50 μL de tampão de lavagem (1x PBS; pH = 7,4) no chip. Aspire a solução do chip e repita este 5x. Deixe a última gota de tampão de lavagem no chip e pressione o botão Continuar e aguarde por 30 s até que a duração da etapa de lavagem seja concluída no visor do software.
NOTA: O software exibe o ponto final para a etapa de lavagem (30 s) com um alarme de aviso para prosseguir com o próximo ciclo do experimento. - Repita os passos para cada concentração de analito utilizada; as cinco etapas de calibração, associação de analitos, dissociação, regeneração e lavagem (5x) constituem um ciclo. Para o experimento aqui mostrado, realizamos 10 ciclos para 10 concentrações de analito (variando de 25 nM a 5.000 nM ou 0,4 nM a 200 nM; Figura 2).
6. Análise
- Pressione o botão Análise visto na parte superior do software de análise automatizada no final do experimento. Uma janela de exibição contendo todos os pontos experimentais aparecerá. Na janela, certifique-se de que as concentrações de analito utilizadas para o protocolo prescrito estão corretas.
- Pressione o botão Análise de execução para gerar automaticamente o valor KD . O software gera um gráfico de ajuste de Hill plotando as concentrações de analitos contra as respostas I correspondentes das quais a constante de dissociação em equilíbrio, valor KD , é calculada.
- Exporte os dados brutos para análise em outros softwares de análise estatística usando o software de revisão/exportação de dados descrito abaixo.
- Copie o arquivo R1R criado automaticamente no final do experimento (por exemplo, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) para uma nova pasta na área de trabalho. Abra o software de Análise/Exportação de Dados fornecido pela empresa (ver Figura Suplementar S2A).
- Clique em Arquivos > Process R1R > OK na tela inicial do software de revisão/exportação de dados.
- Selecione a pasta contendo arquivos R1R criados na área de trabalho na etapa 6.3.1. e pressione o botão OK . Isso cria uma cópia dos dados R1R originais, para revisar e editar os dados sem substituir o arquivo original.
- Pressione o ícone de processamento de dados visto na tela inicial do software de revisão/exportação de dados. Pressione os arquivos R1R processados de carga > OK. Selecione a mesma pasta criada na etapa 6.3.1 contendo arquivos R1R processados. Pressione ok. Nesta etapa, a pasta que contém os arquivos de experimento está pronta para ser revisada.
- Na tela inicial do software de revisão/exportação de dados, pressione a Análise de Dados. Selecione Calibração > Calibrar arquivos R1R editados > OK (ver Figura Suplementar S2B). Esta etapa calibra todos os pontos de dados de acordo com a primeira etapa de calibração, para criar uma linha de base.
- Na tela inicial do software de revisão/exportação de dados, pressione a Análise de Dados. Selecione 'Revisão e editar arquivos R1R > OK. Revise os pontos de dados, exclua pontos ou adicione etapas usando o botão Excluir/Adicionar Passo . Certifique-se de que todas as etapas estão no lugar correto, por exemplo, a etapa de calibração está na linha de base, a etapa de associação está no pico (ver Figura Suplementar S3) e, em seguida, pressione o botão Salvar para salvar todas as alterações feitas.
- Na tela inicial do software de revisão/exportação de dados, pressione a Análise de Dados. Selecione Analisar/Plot Data, escolha as etapas para exportar (consulte Figura Suplementar S4). Adicione cada etapa de associação (por exemplo, passo 2, passo 7 e assim por diante) depois de subtrair a etapa de calibração (por exemplo, passo 1, passo 6 e assim por diante) à lista de exportação antes de exportar os dados.
- Pressione exportar esses dados. O software gera um arquivo de planilha contendo o I-Response para cada ponto de dados de concentração analito de cada transistor (se todos os transistores estiverem trabalhando, teremos três valores diferentes de resposta I para cada ponto de concentração). Use este arquivo de planilha para analisar melhor os dados no software estatístico.
- Abra o software de análise estatística. Criar uma tabela XY com três valores Y; pressione Criar. Os dados desta tabela (valores X, Y) são copiados do arquivo de planilha criado na etapa 6.3.8. O eixo x corresponde à concentração de analito (dependendo da concentração utilizada), e os três valores Y correspondem às Respostas I, obtidas a partir do software de Análise/Exportação de Dados fornecido pela empresa.
- Pressione Analisar esses dados. Escolha análises XY > regressão não linear (ajuste de curva) > saturação de ligação > Um Local > Total. O software analisará automaticamente os dados, gerará o valor KD e criará um gráfico dos pontos de dados.
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Representative Results
Resultados do experimento 1:
A proteína alvo Hsp90 (500 nM) foi imobilizada para o chip seguindo o protocolo de imobilização de alvo, conforme descrito acima. Para o primeiro experimento, foram elaboradas 10 concentrações da proteína analito, Cdc37, variando de 25 nM a 5.000 nM, com base nos dados disponíveis na literatura (ver Tabela 1).
As etapas do experimento podem ser monitoradas em tempo real, seguindo as alterações ocorridas na I-Resposta (Figura 3A). Pode-se visualizar como cada passo incluído no protocolo afeta a I-Response durante todo o experimento. Por exemplo, a resposta i é próxima de zero durante a calibração, e na etapa de associação, a I-Resposta aumenta gradualmente com o aumento das concentrações de analito (Cdc37). Olhando para os dados deste experimento (Figura 3A), observou-se um aumento repentino na I-Resposta em baixas concentrações de analito (50 BU a 25 nM). Esperava-se uma baixa resposta à baixa concentração de analitos que aumentará gradualmente com o aumento das concentrações. Esse aumento repentino sugeriu que um experimento incluindo pontos de concentração de analitos mais baixos deveria ser projetado.
Seguindo as etapas de protocolo discutidas acima, os dados foram analisados no software de análise automatizado fornecido, que gerou automaticamente um gráfico de ajuste hill com um valor KD calculado (Figura 3B). O valor KD calculado a partir do software de análise automatizada para o primeiro experimento foi de 350.000 ± 76.000 μM. A maioria das interações biológicas comuns mostrou um valor KD no baixo μM ou mesmo na faixa nM; assim, o valor KD gerado para o primeiro experimento é muito alto.
Pode haver várias explicações para o alto valor KD observado: pode haver baixa afinidade entre as duas proteínas específicas estudadas (Hsp90/Cdc37), o que significa que é necessária uma alta concentração de ligantes para as interações moleculares; o experimento pode ter sido projetado com concentrações de analitos não ideais e fora de alcance; o alto valor pode ser devido aos parâmetros incorporados utilizados no módulo de montagem do software de análise. O software de análise automatizada usa um módulo de análise dose-resposta para se adequar aos pontos de dados, mas algumas interações podem não se encaixar bem neste modelo, dando dados falsos, resultando em altos valores KD .
Para obter um valor KD preciso com um gráfico de Hill saturado, é necessária a padronização do experimento por tentativa e erro, o que inclui pontos de concentrações de analitos mais baixos e mais altos, para adquirir o menor valor KD com uma baixa taxa de erro.
Considerando todos esses fatores, os dados do software de análise foram exportados para software de análise estatística adicional. A I-Resposta para cada ponto de associação foi extraída utilizando o software automatizado de revisão/exportação de dados e é resumida na Tabela 2 , seguindo as etapas discutidas acima na etapa de análise (etapa 6).
Os resultados do software de análise estatística (Figura 3C) mostraram um valor KD relativamente baixo com um desvio padrão elevado (0,011 ± 0,494 μM) e um baixo valor de R2 de 0,78. A variação significativa observada no valor KD e o baixo valor R2 sugeriram que os pontos de concentração escolhidos para este experimento não são ideais. Além disso, também foi notado que alguns pontos gráficos não estavam encaixando bem com a linha de tendência da trama (Figura 3C); isso fortaleceu a necessidade de projetar um segundo experimento, incluindo diferentes pontos de concentração de analitos.
Os parâmetros incorporados utilizados pelos dois softwares de análise são totalmente diferentes, e se refletem no processo de geração de valores KD . As diferenças nos valores KD obtidos a partir dos dois softwares de análise (350.000 ± 76.000 μM vs. 0,011 ± 0,494 μM) podem ser atribuídas ao fato de que diferentes módulos de análise foram utilizados para o cálculo. A análise realizada no software de análise estatística pode ser mais adequada para essa interação, dando assim um valor KD menor.
No entanto, se os resultados de ambas as análises forem combinados (350.000 ± 76.000 μM e 0,011 ± 0,494 μM), pode-se concluir que o primeiro experimento não foi o ideal e que seriam necessários pontos adicionais de concentração.
Para validar esse ponto, foi excluído o ponto gráfico não corrigido, 3.000 nM (ver Figura Suplementar S5). Os resultados da análise mostraram um valor KD de 0,006 ± 0,081 μM com valor de R2 de 0,98. Esses resultados indicaram que o próximo experimento deve ser projetado com foco em concentrações mais relevantes. Assim, foi realizado um segundo experimento para avaliar o PPI Hsp90/Cdc37 utilizando diferentes pontos de teste com concentrações abaixo e acima do KD previsto.
Resultados do experimento 2:
A proteína alvo, Hsp90 (500 nM) foi imobilizada para o chip usando o protocolo como descrito acima. Foram preparadas 10 concentrações do analito (Cdc37) da seguinte forma: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM. O segundo experimento foi projetado por incluir diferentes pontos de concentração de analitos, considerando todos os insights obtidos com o experimento anterior, como mencionado acima.
Durante o experimento, cada etapa foi monitorada em tempo real (Figura 4A). Aqui, o gráfico I-Response em tempo real (derivado das baixas concentrações do analito-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) começa inicialmente a partir de zero e aumenta gradualmente após o aumento das concentrações de analito em cada ciclo do experimento em comparação com o aumento repentino da I-Resposta observado no primeiro experimento.
Seguindo o protocolo mencionado acima, os dados foram analisados utilizando-se o software de análise automatizada (Figura 4B). O valor KD calculado a partir do software de análise automatizada para este experimento foi de 0,0673 ± 0,0002 μM, o que sugeriu uma forte interação entre a proteína alvo Hsp90 e o Analyte Cdc37. O desvio padrão de 0,0002 μM foi muito menor do que o obtido no primeiro experimento, o que dá confiança de que os novos dados são muito mais confiáveis.
Para validar esse resultado, exportamos os pontos de dados (Tabela 3) para outro software de análise estatística, conforme explicado anteriormente; os resultados da análise são resumidos na Figura 4C.
Utilizando o software de análise estatística, verificou-se que o valor KD para Hsp90/Cdc37 PPI é de 0,014 ± 0,005 μM (Figura 4C). Os baixos valores de KD e desvio padrão indicam uma forte interação entre as duas proteínas, Hsp90 e Cdc37. Além disso, o valor R2 de 0,99 indica que a análise se encaixa perfeitamente nos pontos gráficos experimentais. Ambos os softwares de análise mostraram consistência nos resultados, com baixos valores KD de cerca de 0,0673 ± 0,0002 μM e 0,014 ± 0,005 μM, respectivamente.
Para confirmar a reprodutibilidade e a precisão do experimento, o mesmo experimento foi realizado em duas réplicas usando Hsp90 (500 nM) como proteína alvo e Cdc37 como analito com as mesmas concentrações que variam de 0,4 nm a 200 nm como usado no segundo experimento. Durante o experimento, cada etapa foi monitorada em tempo real (Figura Suplementar S6A e Figura Suplementar S7A). O valor KD calculado a partir do software de análise automatizada é retratado em Figura Suplementar S6B e Figura Suplementar S7B (0,053 ± 0,002 μM e 0,0719 ± 0,0007 μM, respectivamente). Como mencionado anteriormente, os pontos de dados foram exportados (Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2) para outro software de análise estatística, e os resultados são apresentados em Figura Suplementar S6C e Figura Suplementar S7C (Figura Suplementar S6C: KD é 0,003 ± 0,009 μM e R2 é de 0,99; Figura suplementar S7C: KD é 0,004 ± 0,009 μM e R2 é 0,99). Os resultados das duas réplicas do software de análise corroboraram bem e confirmaram a precisão, repetibilidade e reprodutibilidade dos dados experimentais Hsp90/Cdc37 FEB.
Também foi realizado um estudo de controle no qual a interação biomolecular entre Hsp90 e uma proteína de controle, a albumina de soro bovino (BSA) foi elucidada. O estudo de controle utilizando BSA como analito foi feito utilizando uma configuração experimental idêntica e concentrações de analito utilizadas no segundo experimento. Foram preparadas 10 concentrações da proteína de controle, BSA, variando de 0,4 nM a 200 nM em 1x PBS (pH = 7,4) e cada etapa do experimento foi monitorada em tempo real.
Semelhante ao experimento com Hsp90 e Cdc37, o gráfico I-Response em tempo real começa inicialmente a partir de 0; no entanto, no estudo de controle, a I-Resposta não aumentou gradualmente após o aumento das concentrações de analito (Figura Suplementar S8A). Os dados também foram analisados utilizando-se o software de análise automatizada (Figura Suplementar S8B), e o software não conseguiu calcular o valor KD dos pontos de dados deste experimento. Evidencia-se, a partir de Hill Plot gerado a partir do software, que não há interação entre Hsp90 e o analito BSA de controle. Para validar esse resultado, exportamos os pontos de dados (Tabela Suplementar S3) para outro software de análise estatística, conforme explicado anteriormente. Utilizando o software de análise estatística, verificou-se que o valor KD para Hsp90/BSA PPI é negativo (Figura Suplementar S8C; KD é -0,009 ± -0,0003 μM), indicando novamente que não há interação entre as duas proteínas, Hsp90 e BSA. Além disso, o valor R2 (0,82) indica que a análise não se encaixava nos pontos gráficos experimentais. Ambos os softwares de análise mostraram consistência nos resultados que o Hsp90 e o BSA não interagem.
Ao comparar os dados experimentais de Hsp90/Cdc37 FEB com outros dados experimentais disponíveis na literatura, verificou-se que os valores KD obtidos neste estudo (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM e KD = 0,072 ± 0,001 μM) foram em duas ordens de magnitude inferiores aos dados publicados anteriormente (KD = 1,46 μM38 ou 6 μM39 ). Essas diferenças podem ser atribuídas ao uso de construções humanas Hsp90 e Cdc37 nos experimentos atuais. Estudos anteriores foram realizados em construtos de leveduras Hsp90 que continham apenas proteína parcial38 ou C. elegans proteínas homólogos39 (Tabela 1). Para validar os resultados obtidos no sistema FEB, foram realizados experimentos itc.
Avaliação do PPI Hsp90/Cdc37 utilizando o sistema ITC:
O ITC é considerado o padrão-ouro para investigar interações biomoleculares. Realizamos ainda o ITC para determinar a cinética termodinâmica do PPI Hsp90/Cdc37, e como validação para o experimento FEB. O Hsp90 e o Cdc37 são submetidos à diálise contra PBS (pH = 7,0) antes do ITC. Cerca de 0,25 μM solução da proteína alvo (Hsp90) e 2,5 μM solução de proteína de analito (Cdc37) foram preparados em PBS para as titulações calorimétricas. Um volume total de 80 μL de solução Cdc37 em intervalos consecutivos foi titulado da seringa rotativa para a célula contendo 150 μL de solução Hsp90 a 298,15 K. Cada injeção ocorreu ao longo de 4 s de duração, e o intervalo de tempo entre injeções consecutivas foi de 150 s. Um total de 19 injeções de 2 μL cada foram feitas com uma velocidade de agitação de 500 rpm e um poder de referência de 41,9 μW, respectivamente. A variação de calor resultante da interação Hsp90/Cdc37 foi monitorada, e os dados finais obtidos ao final das injeções de analito cdc37 foram instalados utilizando-se software de análise ITC fornecido pela empresa. As variações de calor juntamente com os parâmetros termodinâmicos como a mudança deenthalpy molar (ΔH), a alteração da entropia (ΔS), o número de locais de ligação (n) e a constante de dissociação de equilíbrio (KD) entre Hsp90/Cdc37 PPI foram estimadas. A mudança de energia livre de Gibbs (ΔG) também foi calculada a partir da equação ΔG = ΔH - TΔS após a obtenção de parâmetros térmicos a partir do termograma ITC.
O enredo do ITC revela a quantidade de calor utilizado ou liberado durante as interações biológicas para elucidar a natureza das interações e forças intermoleculares que regem o PPI40. O Cdc37 (2,5 μM) foi titulado em Hsp90 (0,25 μM), e as curvas correspondentes são retratadas na Figura 5A,B. O lote ITC obtido foi encontrado como exotémico e foi instalado em um único modelo de local de ligação exibindo uma estoquiometria de ligação (n) de uma, energia de ligação, ΔG = -45,9 kJ/mol, e valor KD = 0,009 μM. A ligeira inconsistência observada na forma de uma mudança endotérmica no início do termograma ITC (Figura 5A) sugere a formação de bolhas ao mesmo tempo em que titula a proteína analito à célula de medição41,42. Entre os PPI Hsp90/Cdc37, os experimentos de ITC realizados em concentrações cada vez maiores, o excesso de 10 vezes do Cdc37 (concentração de Hsp90 = 0,25 μM e concentração de Cdc37 = 2,5 μM) apresentaram parâmetros de ligação aceitáveis ao atingir uma curva de saturação. O valor KD obtido do ITC (KD = 0,009 μM) correlaciona-se bem com o valor KD calculado utilizando a tecnologia FEB (KD = 0,014 μM, 0,053 μM e 0,072 μM), apoiando fortemente a sensibilidade e a precisão da FEB na detecção de Hsp90/Cdc37 PPI.
Figura 2: Resumo do protocolo. (A) Resumo das etapas do processo de ativação do chip. (B) Representação gráfica das cinco etapas repetindo no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Arquivos de dados gerados a partir do experimento 1. (A) Dados do experimento monitorados em tempo real. O eixo y corresponde à I-Resposta em unidades biosensoras (BU), e o eixo x corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. Este número corresponde aos dados do primeiro experimento. (B) Gráfico Hill Fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo y corresponde à I-Resposta, o eixo x corresponde a concentrações de analito (Cdc37) em nM. Para este experimento, o valor KD é de 350.000 ± 76.000 μM. (C) lote de associação gerado usando o software de análise estatística. O eixo y corresponde à I-Resposta no final da fase de associação, o eixo x corresponde às diferentes concentrações de analito, Cdc37. Este plot foi gerado utilizando os pontos de dados fornecidos na Tabela 2. Resumo dos resultados da análise são fornecidos no gráfico; para este experimento, o valor KD é de 0,011 ± 0,494 μM e o valor R2 é de 0,78. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Arquivos de dados gerados a partir de dados do experimento 2. (A) Experimento monitorados em tempo real. O eixo y corresponde à I-Resposta em unidades biosensoras (BU), e o eixo x corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. Este número corresponde aos dados do segundo experimento. (B) Gráfico Hill Fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo y corresponde à I-Resposta, o eixo x corresponde à concentração de analito (Cdc37) em nM. Para este experimento, o valor KD é de 0,0673 ± gráfico de associação de 0,0002 μM (C) gerado pelo software de análise estatística. O eixo y corresponde à I-Resposta no final da fase de associação, o eixo x corresponde às diferentes concentrações de Analyte Cdc37. Este lote foi gerado utilizando os pontos de dados fornecidos na Tabela 3. Resumo dos resultados da análise são fornecidos no gráfico; para este experimento, o valor KD é de 0,014 ± 0,005 μM e o valor R2 é de 0,99. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Termograma ITC de interação Hsp90 e Cdc37. (A) O painel superior representa as curvas correspondentes de evolução de calor obtidas devido a injeções consecutivas de Cdc37 (2,5 μM) em Hsp90 (0,25 μM) a 298,15 K. O poder diferencial (DP) representa o poder diferencial em função do tempo. (B) Os pontos de dados integrados no painel inferior designam o calor normalizado correspondente versus a razão molar de Hsp90/Cdc37. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ensaios realizados | Análise FEB KD | Análise prisma KD | Construir Origem | Aminoácidos | Referências |
| ITC | 1,46 μM e 1,32 μM | NA | Levedura Hsp90 | Domínio n-terminal de Hsp90 | 36 |
| Cdc37 humano | |||||
| SPR | 6 μM | NA | C. elegans | Comprimento completo | 37 |
| FEB - Primeiro repetição | 0,014 μM | 0,067 μM | Hsp90 humano | Comprimento completo | Realizado neste estudo |
| Cdc37 humano | |||||
| FEB - Segunda repetição | 0,053 μM | 0,003 μM | Hsp90 humano | Comprimento completo | Realizado neste estudo |
| Cdc37 humano | |||||
| FEB - Terceira repetição | 0,072 μM | 0,004 μM | Hsp90 humano | Comprimento completo | Realizado neste estudo |
| Cdc37 humano | |||||
| ITC | 0,009 μM | NA | Hsp90 humano | Comprimento completo | Realizado neste estudo |
| Cdc37 humano | |||||
| FEB- Estudo de controle | Sem dados (não havia dados suficientes para calcular o KD) | -0,009 μM (valor KD com valores negativos indica que não há interação) | Hsp90 humano | Comprimento completo | Realizado neste estudo |
| BSA |
Tabela 1: Avaliação do PPI Hsp90/Cdc37 utilizando diferentes métodos relatados neste estudo e na literatura.
| Concentrações de analito (nM) | Transistor I-Response 1 | Transistor I-Response 2 | Transistor I-Response 3 | Média |
| Resposta I | ||||
| 25.00 | 53.540 | 49.406 | 50.590 | 51.178 |
| 50.00 | 71.427 | 65.943 | 67.568 | 68.313 |
| 100.00 | 85.305 | 79.226 | 81.074 | 81.868 |
| 200.00 | 106.652 | 99.320 | 101.502 | 102.491 |
| 400.00 | 122.572 | 114.837 | 117.128 | 118.179 |
| 800.00 | 144.293 | 136.374 | 138.872 | 139.846 |
| 1000.00 | 135.165 | 128.657 | 130.425 | 131.416 |
| 2000.00 | 164.487 | 159.401 | 161.697 | 161.862 |
| 3000.00 | 109.997 | 106.705 | 107.205 | 107.969 |
| 5000.00 | 282.637 | 274.207 | 276.247 | 278.422 |
Tabela 2: Resumo dos valores de I-Response gerados a partir de três transistores diferentes de cada chip em cada ponto de concentração do primeiro experimento.
| Concentrações de analito (nM) | Transistor I-Response 1 | Transistor I-Response 2 | Transistor I-Response 3 | Resposta média de I |
| 0.40 | 13.097 | 14.721 | 11.714 | 13.177 |
| 0.80 | 10.183 | 8.861 | 13.240 | 10.762 |
| 1.60 | 24.826 | 20.377 | 25.240 | 23.481 |
| 3.20 | 40.746 | 41.047 | 40.783 | 40.858 |
| 6.40 | 54.938 | 54.224 | 54.913 | 54.691 |
| 12.80 | 83.057 | 81.452 | 82.596 | 82.369 |
| 25.60 | 110.440 | 109.152 | 110.343 | 109.978 |
| 51.20 | 141.161 | 140.363 | 141.125 | 140.883 |
| 102.40 | 164.215 | 162.679 | 164.572 | 163.822 |
| 200.00 | 196.373 | 197.007 | 198.495 | 197.292 |
Tabela 3: Resumo dos valores de I-Resposta gerados a partir de três transistores diferentes de cada chip em cada ponto de concentração do segundo experimento.
Figura suplementar S1: Captura de tela da tela principal do software automatizado antes do início do experimento. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S2: Captura de tela da tela principal do software automatizado para processamento e análise de dados. (A) Exibição de tela principal do software de revisão/exportação de dados mostrando opções de processamento de dados. (B) A tela principal do software de revisão/exportação de dados mostrando opções de análise de dados. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura Suplementar S3: Os pontos de dados de revisão obtidos a partir do software de revisão/exportação. Nesta etapa, revise o experimento e adicione ou exclua pontos de dados. Certifique-se de que o ponto de associação (2, 7, 12, 17, 22, e assim por diante) esteja sempre na escolha. Por exemplo, a primeira escolha da esquerda é o ponto de dados número 2 e, em seguida, o data point número 10 (mas deve ser o número 7). Para resolver isso basta excluir os pontos 3, 4 e 5. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S4: Lista de dados de exportação, por exemplo. Nesta etapa, escolheu quais pontos de experiência a serem exportados. Escolheu um ponto de associação (2, 7, 12, 17, 22, e assim por diante) e subtrai as etapas de calibração anteriores (1, 6, 11, 16, 21, e assim por diante). Adicione todos os pontos à lista de exportação e exporte esses dados para obter uma planilha com o I-Response para cada ponto de dados. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S5: Parcela de associação gerada utilizando o software de análise estatística. O eixo y corresponde à I-Resposta no final da fase de associação, o eixo x corresponde às diferentes concentrações de Analyte Cdc37. Esse plot foi gerado utilizando os pontos de dados do primeiro experimento e excluiu o ponto de dados de concentração de 3.000 nM. Resumo dos resultados da análise são fornecidos no gráfico; para este experimento, o valor KD é de 0,006 ± 0,081 μM e o valor R2 é de 0,98. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S6: Arquivos de dados gerados a partir do experimento 2 replicam 1. (A) Dados do experimento monitorados em tempo real. O eixo y corresponde à I-Resposta em unidades biosensoras (BU), e o eixo x corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. Esse número corresponde aos dados da segunda repetição realizada no segundo experimento em que o Hsp90 foi imobilizado no chip (500 nM) e foram preparadas 10 concentrações de analito cdc37 (0,4-200 nM). O gráfico I-Response em tempo real começa inicialmente a partir de 0 e aumenta gradualmente após o aumento das concentrações de analitos em cada ciclo do experimento, sugerindo que o experimento é bem sucedido. (B) Gráfico Hill Fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo y corresponde à I-Resposta, o eixo x corresponde a concentrações de analito (Cdc37) em nM. Os resultados da análise automatizada mostraram um valor KD relativamente baixo e baixo desvio padrão de 0,0531 ± 0,0002 μM, sugerindo uma forte interação entre Hsp90 e Cdc37. (C) O enredo de associação gerado utilizando o software de análise estatística. O eixo y corresponde à I-Resposta no final da fase de associação, o eixo x corresponde às diferentes concentrações de Analyte Cdc37. Este plot foi gerado utilizando os pontos de dados fornecidos na Tabela S1. Resumo dos resultados da análise são fornecidos no gráfico; para este experimento, o valor KD é de 0,003 ± 0,009 μM e o valor R2 é de 0,99. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S7: Arquivos de dados gerados a partir do experimento 2 replicam 1. (A) Dados do experimento monitorados em tempo real. O eixo y corresponde à I-Resposta em unidades biosensoras (BU), e o eixo x corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. Esse número corresponde aos dados da terceira repetição no segundo experimento em que o Hsp90 foi imobilizado no chip (500 nM) e foram preparadas 10 concentrações de analito cdc37 (0,4-200 nM). (B) Gráfico Hill Fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo y corresponde à I-Resposta, o eixo x corresponde a concentrações de analito (Cdc37) em nM. Os resultados da análise automatizada mostraram um valor KD relativamente baixo e um baixo desvio padrão de 0,0719 ± 0,0007 μM, sugerindo uma forte interação entre o gráfico da Associação Hsp90 e Cdc37. (C) gerado pelo software de análise estatística. O eixo y corresponde à I-Resposta no final da fase de associação. O eixo x corresponde às diferentes concentrações de Analito Cdc37. Este plot foi gerado utilizando os pontos de dados fornecidos na Tabela S2. Resumo dos resultados da análise são fornecidos no gráfico; para este experimento, o valor KD é de 0,004 ± 0,009 μM e o valor R2 é de 0,99. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S8: Arquivos de dados gerados a partir do experimento de controle. (A) Dados do experimento monitorados em tempo real. O eixo y corresponde à I-Resposta em unidades biosensoras (BU), e o eixo x corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. Esse número corresponde aos dados do experimento de controle onde o Hsp90 foi imobilizado no chip (500 nM) e foram preparadas 10 concentrações de analito BSA (proteína de controle) (0,4-200 nM). O gráfico I-Response em tempo real começa a partir de baixa I-Response em torno de 10-15 BU e não aumenta após um aumento nas concentrações de analito em cada ciclo do experimento, sugerindo que não há interação entre o Hsp90 e o BSA. (B) Gráfico Hill Fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo y corresponde à I-Response; o eixo x corresponde às concentrações de analito (BSA) em nM. Os resultados da análise automatizada mostraram que não há dados suficientes para calcular o valor KD sugerindo que não há interação entre Hsp90 e BSA. (C) Parcela de associação gerada utilizando o software de análise estatística. O eixo y corresponde à I-Resposta no final da fase de associação, o eixo x corresponde às diferentes concentrações de BSA analitos. Este plot foi gerado utilizando os pontos de dados fornecidos na Tabela S4. Resumo dos resultados da análise são fornecidos no gráfico; para este experimento, o valor KD é de -0,009 ± -0,0003 μM e o valor R2 é de 0,82. Um valor KD negativo perto de zero indica que não há interação entre Hsp90 e BSA. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabela Suplementar S1: Resumo dos valores de I-Response gerados em cada ponto de concentração e lidos a partir dos transistores de cada chip (três transistores diferentes para cada chip). Esta tabela corresponde aos dados extraídos da segunda repetição realizada para o segundo experimento em que hsp90 foi imobilizado no chip (500 nM) e 10 concentrações de analito Cdc37 foram preparadas (0,4-200 nM). Os pontos de dados desta tabela foram utilizados para análise no software de análise estatística. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar S2: Resumo dos valores de I-Response gerados em cada ponto de concentração e lidos a partir dos transistores de cada chip (três transistores diferentes para cada chip). Esta tabela corresponde aos dados extraídos da terceira repetição realizada para o segundo experimento em que o Hsp90 foi imobilizado no chip (500 nM) e foram preparadas 10 concentrações de analito Cdc37 (0,4-200 nM). Os pontos de dados desta tabela foram utilizados para análise no software de análise estatística. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar S3: Resumo dos valores de I-Response gerados em cada ponto de concentração e lidos a partir do transistor de cada chip (três transistores diferentes para cada chip). Esta tabela corresponde aos dados do experimento de controle onde hsp90 foi imobilizado no chip (500 nM) e 10 concentrações de analito BSA foram preparadas (0,4-200 nM). Os pontos de dados desta tabela foram utilizados para análise no software de análise estatística. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Neste estudo, foi avaliada a viabilidade do uso da tecnologia FEB (abordagem de caracterização cinética em tempo real) para determinar a interação biomolecular entre Hsp90 e Cdc37. O experimento exploratório inicial (primeiro experimento) sugeriu que a escolha das concentrações adequadas de analito é uma parte crítica do experimento e que o experimento deve ser projetado por incluir pontos de concentração acima e abaixo do valor KD , que foram previstos com base nos dados disponíveis na literatura.
No entanto, se não houver informações preliminares sobre a interação, sugerimos projetar um experimento preliminar, incluindo uma ampla gama de pontos de concentração em ambos menores (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) e maiores (1.000 nM, 2.500 nM, 5.000 nM) faixas. O experimento preliminar fornece uma estimativa aproximada do valor KD e permite planejar os experimentos subsequentes usando as faixas de concentração certas para obter um valor KD preciso. O sistema FEB oferece uma função de protocolo de edição na qual é livre para escolher o número de pontos de concentração para o experimento.
Pela nossa experiência, os passos mais críticos envolvidos no protocolo FEB são os seguintes. A proteína alvo e o tampão de analito devem ser os mesmos do tampão de calibração. Mesmo uma pequena incompatibilidade de buffer pode causar flutuações no I-Response e dar resultados não confiáveis. Assim, sugerimos a realização da diálise durante a noite pela troca de buffer adequada. A pipetação cuidadosa no chip biosensor ao aspirar ou aplicar uma solução é fundamental durante todo o experimento. A pipetação descuidada pode levar a transistores ou flutuações quebradas na I-Resposta; durante a pipetação, certifique-se de não tocar na superfície sensível do chip. A solução EDC/sulfo-NHS utilizada no processo de ativação do chip deve ser misturada novamente antes de cada uso. O uso de uma mistura antiga pode resultar em um chip não funcionalizado. Certifique-se de usar o mesmo buffer para todas as cinco etapas repetitivas (calibração, associação, dissociação, regeneração e lavagem) envolvidas em todos os ciclos do experimento.
Ao comparar a FEB com sistemas de detecção biomolecular bem estabelecidos no campo, como bli ou SPR, descobrimos que todos os três métodos compartilham vantagens semelhantes 43,44,45 que são: são sistemas livres de rótulos, que não exigem corantes fluorescentes caros para detectar as interações; eles podem detectar interações mesmo em pequenas faixas de NM; os chips são reutilizáveis tanto em SPR quanto em FEB e podem ser regenerados e reutilizados eficientemente para até 10 experimentos, e todos os três métodos fornecem dados cinéticos em tempo real, e o tempo de experiência é curto.
A principal vantagem da SPR é que ele fornece dados mais extensos do experimento para que se possa calcular KD, Kon, Koff, estoquisometria e parâmetros termodinâmicos44. A maior vantagem da BLI é sua capacidade de testar múltiplas concentrações em um experimento. As medidas cinéticas podem ser feitas simultaneamente para até oito concentrações usando diferentes sensores. No entanto, os sensores BLI não são reutilizáveis, tornando o custo do experimento extremamente alto43.
A principal vantagem da FEB é seu software automatizado e fácil de usar que guia o usuário durante todo o experimento, e sua plataforma de pipetação de mão aberta que permite ao usuário adicionar o analito ao alvo imobilizado a cada etapa. Esta abordagem de tubulação aberta combinada juntamente com um software simples torna o FEB fácil de aprender e requer pouco ou mesmo nenhum treinamento. No entanto, exige que o usuário tenha um domínio básico da pipetação manual, e a falta de manuseio líquido automatizado significa que a reprodutibilidade do tempo de etapa depende inteiramente do usuário. Essa mesma falta de manuseio líquido integrado significa que os chips e instrumentos são econômicos em comparação com SPR ou BLI. A FEB também apresenta alta reprodutibilidade e confiabilidade na detecção de interações biomoleculares devido ao processo de fabricação definido envolvido na preparação do chip biosensor35.
Em comparação com o método de detecção de ITC bem estabelecido e padrão, a FEB utiliza apenas 50 μL de volume de analito em concentrações nanomolar para todo o experimento, diminuindo a chance de nucleação ou agregação de proteínas. Um dos maiores problemas com o ITC é desgasear as proteínas antes de carregar para evitar bolhas de ar. Durante o experimento itc, há uma chance de desenvolver bolhas dentro da célula de medição devido à agitação contínua e purgação intensa, o que pode espirrar negativamente a solução amostral ou causar perda de amostra42. A tecnologia FEB supera esses desafios do ITC ao oferecer uma robusta química de imobilização de alvos, reduzindo a agregação e borbulhando, aumentando a estabilidade e melhorando os problemas dependentes de concentração enfrentados pelo ITC.
Uma possível desvantagem dos dispositivos FEB é sua suscetibilidade às alterações de composição e concentração de buffer, o que pode causar uma deriva na linha de base que deve ser corrigida durante a montagem e análise dos resultados. O chip biosensor também é sensível ao pH e ao sal, por isso os buffers usados durante a calibração e medição do analito devem ser os mesmos durante todo o experimento. Produtos químicos usados como conservantes (por exemplo, azida de sódio) e moléculas hidrofóbicas podem danificar o sensor e podem até causar um aumento na ligação não específica. Essas desvantagens podem ser atenuadas com atenção à consistência tampão ao longo das etapas de medição, diálise de compostos interferentes do estoque de analitos e passivação apropriada da superfície (por exemplo, uso de detergentes, bloqueadores de proteínas ou diferentes moléculas de PEG).
Em resumo, demonstramos com sucesso um forte PPI entre hsp90/Cdc37 usando a tecnologia FEB e validamos sua interação usando o ITC, fornecendo dados encorajadores para apoiar a FEB como um método alternativo inovador para detecção de PPI. A tecnologia FEB oferece uma ampla gama de aplicações em diversos campos de descoberta de medicamentos, produtos farmacêuticos, análise biomolecular de pequenas moléculas, peptídeos e proteínas, desenvolvimento de anticorpos, validação de medicamentos e otimização de chumbo em nossas mãos traduzindo a atividade biológica in vitro prontamente para a eficácia in vivo . Considerando as vantagens da tecnologia FEB e suas imensas aplicações na exploração de interações de PPI, proteínas e DNA ou RNA, bem como interações de proteínas e pequenas moléculas (por exemplo, drogas), propomos que seja uma tecnologia única e promissora na caixa de ferramentas de detecção de PPI. Em nosso caso, a tecnologia FEB oferece uma ferramenta valiosa para avaliar prontamente a eficácia vinculante dos antagonistas candidatos do PPI Hsp90/Cdc37, que então auxilia na seleção de candidatos promissores para avaliações in vitro e in vivo relativas a várias doenças nas quais este PPI é crítico.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse, financeiros ou não.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Binational Science Foundation (BSF) para s.K.S. e N.Q.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated analysis software | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis. |
| COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
biosensor chip |
| Data review software | Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points. |
| Dialysis bag | CelluSep, Membrane filtration products | T2-10-15 CAS number: NA |
T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m) |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) | Cardea (Nanomed) | EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8 |
White powder |
| ITC (Isothermal titration calorimetry) system | Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) | NA CAS number: NA |
|
| MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer | Merck | M3671-50G CAS number: 4432-31-9 |
White powder |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips | Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Graphene-based chip |
| PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 | Bio-Lab | 001623237500 CAS number: 7758-11-4 |
Liquid transparent solution |
| Pipete | Thermo Scientific | 11855231 CAS number: NA |
Finnpipette F3 5-50 µL, yellow |
| Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-002-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-003-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Recombinant protein Cdc37 | Abcam | ab256157 CAS number: NA |
|
| Recombinant protein Hsp90 beta | Abcam | ab80033 CAS number: NA |
|
| Spreadsheet | Excel, Microsoft office | NA CAS number: NA |
|
| Statistical software | GraphPad, Prism | NA CAS number: NA |
Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used |
| Sulfo-NHS | Cardea (Nanomed) | NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7 |
White powder |
| Tips | Alex red | LC 1093-800-000 CAS number: NA |
Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs |
References
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