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Biochemistry

आणविक चैपरोन Hsp90 और इसके ग्राहक प्रोटीन किनेज Cdc37 के बीच बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन की खोज फील्ड-इफेक्ट बायोसेंसिंग तकनीक का उपयोग करके

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

फील्ड-इफेक्ट बायोसेंसिंग (फेब) बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक लेबल-मुक्त तकनीक है। यह graphene biosensor के माध्यम से विद्युत प्रवाह को मापता है जिसके लिए बाध्यकारी लक्ष्य ों को स्थिर किया जाता है। फेब तकनीक का उपयोग एचएसपी 90 और सीडीसी 37 के बीच बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था और दो प्रोटीनों के बीच एक मजबूत बातचीत का पता लगाया गया था।

Abstract

बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक जैविक घटनाओं को विनियमित और समन्वयित करके कई सेलुलर प्रक्रियाओं में बहुमुखी भूमिका निभाते हैं। प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, विटामिन, फैटी एसिड, न्यूक्लिक एसिड और एंजाइम जैसे बायोमोलेक्यूल्स जीवित प्राणियों के मौलिक निर्माण खंड हैं; वे जीवन की घटनाओं के असंख्य सिंक्रनाइज़ करने के लिए biosystems में जटिल नेटवर्क में इकट्ठा. प्रोटीन आमतौर पर अपने कार्यों को पूरा करने के लिए जटिल इंटरैक्टोम नेटवर्क का उपयोग करते हैं; इसलिए सेलुलर और जीव दोनों स्तरों पर कोशिकाओं में उनके महत्व को उजागर करने के लिए इस तरह की बातचीत का मूल्यांकन करना अनिवार्य है। इस लक्ष्य की ओर, हम विशिष्ट बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन निर्धारित करने के लिए एक तेजी से उभरती हुई तकनीक, फील्ड-इफेक्ट बायोसेंसिंग (एफईबी) पेश करते हैं। FEB एक बेंचटॉप, लेबल-मुक्त, और विश्वसनीय बायोमोलेक्यूलर डिटेक्शन तकनीक है जो विशिष्ट इंटरैक्शन को निर्धारित करने के लिए है और उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉनिक-आधारित बायोसेंसर का उपयोग करता है। FEB तकनीक अपने बायोसेंसर सतह पर उपयोग किए जाने वाले बायोकंपैटिबल नैनोमैटेरियल्स के कारण नैनोमोलर रेंज में इंटरैक्शन की निगरानी कर सकती है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, गर्मी सदमे प्रोटीन 90 (Hsp90) और सेल डिवीजन चक्र 37 (Cdc37) के बीच प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) को स्पष्ट किया गया था। Hsp90 एक एटीपी-निर्भर आणविक चैपरोन है जो कई प्रोटीनों के तह, स्थिरता, परिपक्वता और गुणवत्ता नियंत्रण में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जिससे कई महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों को विनियमित किया जाता है। Cdc37 को प्रोटीन किनेज-विशिष्ट आणविक चैपरोन के रूप में माना जाता है, क्योंकि यह विशेष रूप से अपने डाउनस्ट्रीम सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों को विनियमित करने के लिए Hsp90 में प्रोटीन किनेसेस को पहचानता है और भर्ती करता है। इस प्रकार, Cdc37 को Hsp90 का एक सह-चैपरोन माना जाता है। चैपरोन-किनेज मार्ग (Hsp90/ Cdc37 कॉम्प्लेक्स) सेलुलर विकास को बढ़ावा देने वाले कई दुर्दमताओं में हाइपर-सक्रिय है; इसलिए, यह कैंसर चिकित्सा के लिए एक संभावित लक्ष्य है। वर्तमान अध्ययन Hsp90 / Cdc37 मॉडल प्रणाली का उपयोग करके FEB प्रौद्योगिकी की दक्षता को दर्शाता है। FEB ने दो प्रोटीनों के बीच एक मजबूत PPI का पता लगाया (तीन स्वतंत्र प्रयोगों में 0.014 μM, 0.053 μM, और 0.072 μM केK D मान)। संक्षेप में, FEB एक लेबल-मुक्त और लागत प्रभावी पीपीआई डिटेक्शन प्लेटफ़ॉर्म है, जो तेज़ और सटीक माप प्रदान करता है।

Introduction

Biomolecular इंटरैक्शन:
प्रोटीन जीवों के आवश्यक हिस्से हैं और सेल चयापचय, सेल संरचना, सेल सिग्नलिंग, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, सेल आसंजन, और अधिक जैसे कई आणविक मार्गों में भाग लेते हैं। जबकि कुछ प्रोटीन स्वतंत्र रूप से अपने कार्य (ओं) को निष्पादित करते हैं, अधिकांश प्रोटीन उचित जैविक गतिविधि के समन्वय के लिए एक बाध्यकारी इंटरफ़ेस का उपयोग करके अन्यप्रोटीनों के साथ बातचीत करते हैं।

बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को मुख्य रूप से2 में शामिल प्रोटीन की विशिष्ट संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन सतहों, जटिल स्थिरता, या इंटरैक्शन की दृढ़ता के आधार पर3। बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन में आवश्यक प्रोटीन और उनकी भूमिकाओं की पहचान करना आणविक स्तर4 पर जैव रासायनिक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, इन इंटरैक्शन5 का पता लगाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण हैं: इन विट्रो6 में, सिलिको7 में, लाइव कोशिकाओं में8, पूर्व वीवो9, और विवो10 में प्रत्येक की अपनी ताकत और कमजोरियां हैं।

विवो assays में एक प्रयोगात्मक उपकरण11 के रूप में पूरे जानवर का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं, और टीवह पूर्व vivo assays ऊतक अर्क या पूरे अंगों (जैसे, दिल, मस्तिष्क, जिगर) पर एक नियंत्रित बाहरी वातावरण में प्राकृतिक परिस्थितियों में न्यूनतम परिवर्तन प्रदान करके प्रदर्शन कर रहे हैं. विवो और पूर्व विवो अध्ययनों का सबसे आम अनुप्रयोग उनकी समग्र सुरक्षाऔर प्रभावकारिता सुनिश्चित करके मानव परीक्षणों से पहले संभावित औषधीय एजेंटों के फार्माकोकाइनेटिक्स, फार्माकोडायनेमिक्स और विषाक्तता प्रभावों का मूल्यांकन करना है।

जीवित कोशिकाओं के भीतर बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन का भी पता लगाया जा सकता है। इमेजिंग लाइव कोशिकाएं हमें गतिशील इंटरैक्शन का निरीक्षण करने की अनुमति देती हैं क्योंकि वे एक विशेष जैव रासायनिक मार्ग13 की प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करते हैं। इसके अलावा, पता लगाने की तकनीक, जैसे कि बायोल्यूमिनेसेंस या प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण, इस बारे में जानकारी प्रदान कर सकती है कि ये इंटरैक्शन सेल14 के भीतर कहां और कब होते हैं। यद्यपि लाइव कोशिकाओं में पता लगाने से महत्वपूर्ण विवरण मिलते हैं, ये पहचान के तरीके प्रकाशिकी और लेबल पर भरोसा करते हैं, जो देशी जीव विज्ञान को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं; वे इन विट्रो विधियों की तुलना में भी कम नियंत्रित होते हैं और15 प्रदर्शन करने के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।

सिलिको कम्प्यूटेशनल विधियों में मुख्य रूप से इन विट्रो प्रयोगों से पहले लक्ष्य अणुओं की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है। कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणी के तरीके, कंप्यूटर-आधारित डेटाबेस, आणविक डॉकिंग, मात्रात्मक संरचना-गतिविधि संबंध, और अन्य आणविक गतिशीलता सिमुलेशन दृष्टिकोण सिलिको टूल16 में अच्छी तरह से स्थापित हैं। श्रमसाध्य प्रयोगात्मक तकनीकों की तुलना में, सिलिको टूल्स में आसानी से उच्च संवेदनशीलता के साथ भविष्यवाणियां कर सकते हैं, लेकिन भविष्यवाणी प्रदर्शन में कम सटीकताके साथ 17।

इन विट्रो assays उनके मानक जैविक संदर्भ के बाहर सूक्ष्मजीवों या जैविक अणुओं के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं। इन विट्रो विधियों के माध्यम से बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को चित्रित करना प्रोटीन कार्यों और सेल कामकाज के जटिल नेटवर्क के पीछे जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। पसंदीदा परख पद्धति प्रोटीन के आंतरिक गुणों, गतिज मूल्यों, और मोड और इंटरैक्शनकी तीव्रता 18,19 के अनुसार चुना जाता है।

Hsp90 / Cdc37 इंटरैक्शन:
चैपरोन-किनेज मार्ग, एचएसपी 90 और सीडीसी 37 को जोड़ता है, ट्यूमर जीव विज्ञान20 में एक आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्य है। Hsp90 सेल चक्र नियंत्रण, प्रोटीन असेंबली, सेल अस्तित्व, और सिग्नलिंग मार्गों में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। प्रोटीन जो अपने कार्यों के लिए Hsp90 पर भरोसा करते हैं, उन्हें एक सह-चैपरोन के माध्यम से जटिलता के लिए Hsp90 तक पहुंचाया जाता है, जैसे कि Cdc37। Hsp90 / Cdc37 कॉम्प्लेक्स अधिकांश प्रोटीन किनेसेस की तह को नियंत्रित करता है और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग नेटवर्क21 की भीड़ के लिए एक केंद्र के रूप में कार्य करता है। यह तीव्र मायलोब्लास्टिक ल्यूकेमिया, मल्टीपल मायलोमा और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा22,23 सहित विभिन्न दुर्दमताओं में अपनी उन्नत अभिव्यक्ति के कारण एक आशाजनक एंटी-ट्यूमर लक्ष्य है।

आमतौर पर विट्रो बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन डिटेक्शन तकनीकों में उपयोग किया जाता है
Co-immunoprecipitation (co-IP) एक ऐसी तकनीक है जो जैविक रूप से प्रासंगिक इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए एंटीजन-एंटीबॉडी विशिष्टता पर निर्भरकरती है। इस विधि का प्राथमिक नुकसान कम-आत्मीयता इंटरैक्शन और गतिज मूल्यों का पता लगाने में असमर्थताहै। बायोफिजिकल तरीकों जैसे समतापी अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी), सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई), और फेब तकनीक को गतिज मूल्यों को निर्धारित करने के लिए प्राथमिकता दी जाती है।

आईटीसी एक बायोफिजिकल डिटेक्शन विधि है जो बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए एक पूर्ण थर्मोडायनामिक्स विश्लेषण के साथ बाध्यकारी ऊर्जा के निर्धारण पर आधारितहै। आईटीसी का प्राथमिक लाभ यह है कि इसे लक्ष्य प्रोटीन के किसी भी लेबलिंग या निर्धारण की आवश्यकता नहीं होती है। आईटीसी द्वारा सामना की जाने वाली मुख्य कठिनाइयां एक प्रयोग के लिए आवश्यक लक्ष्य प्रोटीन की उच्च सांद्रता और छोटे बाध्यकारी एंथैल्पी26 के कारण गैर-सहसंयोजक परिसरों का विश्लेषण करने में कठिनाई हैं। एसपीआर और बीएलआई दोनों लेबल-मुक्त बायोफिजिकल तकनीकें हैं जो सेंसर सतह पर लक्ष्य अणु के स्थिरीकरण पर भरोसा करती हैं, इसके बाद स्थिर लक्ष्य27,28 पर विश्लेषक के बाद के इंजेक्शन होते हैं। एसपीआर में, बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन के दौरान अपवर्तक सूचकांक में परिवर्तनको मापा जाता है 27; बीएलआई में, परावर्तित प्रकाश में हस्तक्षेप को वास्तविक समय में समय28 के एक समारोह के रूप में तरंग दैर्ध्य में परिवर्तन के रूप में दर्ज किया जाता है। एसपीआर और बीएलआई दोनों उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और पहचान क्षमताओं की पेशकश करने के सामान्य लाभसाझा करते हैं। दोनों तरीकों में, लक्ष्य प्रोटीन को बायोसेंसर सतहों पर स्थिर किया जाता है, और इसलिए, लक्ष्य की मूल संरचना का कुछ नुकसान हो सकता है, जिससे विशिष्ट बनाम गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन30 के बीच भेदभाव करना मुश्किल हो जाता है। बीएलआई लक्ष्य को स्थिर करने के लिए महंगे डिस्पोजेबल फाइबर-ऑप्टिक बायोसेंसर का उपयोग करता है, और इसलिए, एक महंगी तकनीकहै। इन अच्छी तरह से स्थापित biomolecular पता लगाने के उपकरणों की तुलना में, FEB प्रौद्योगिकी गतिज लक्षण वर्णन के साथ वास्तविक समय में biomolecular पता लगाने के लिए कम nanomolar सांद्रता का उपयोग करके एक विश्वसनीय और लेबल मुक्त मंच प्रदान करता है। FEB प्रौद्योगिकी भी आईटीसी में सामना की जाने वाली बुदबुदाती चुनौतियों को दूर करती है और एसपीआर या बीएलआई की तुलना में अधिक लागत प्रभावी है।

फील्ड-इफेक्ट ट्रांजिस्टर (एफईटी) आधारित बायोसेंसर विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों की पेशकश करके बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक उभरता हुआ क्षेत्र है। एफईटी प्रणाली में, लक्ष्यों को बायोसेंसर चिप्स के लिए स्थिर किया जाता है और चालकता32 में परिवर्तन द्वारा इंटरैक्शन का पता लगाया जाता है। एक कुशल इलेक्ट्रॉनिक बायोसेंसर के विकास में विचार की जाने वाली अद्वितीय विशेषता भौतिक-रासायनिक गुण हैं जैसे कि अर्ध-प्रवाहकीय प्रकृति और सेंसर सतह33 को बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली कोटिंग सामग्री की रासायनिक स्थिरता। एफईटी के लिए उपयोग की जाने वाली सिलिकॉन जैसी पारंपरिक सामग्रियों ने सेंसर की संवेदनशीलता को सीमित कर दिया है क्योंकि इसके लिए ट्रांजिस्टर चैनल और उचित कामकाज के लिए एक विशिष्ट वातावरण के बीच सैंडविच की गई ऑक्साइड परतों की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, सिलिकॉन ट्रांजिस्टर उच्च नमक वातावरण के प्रति संवेदनशील होते हैं, इस प्रकार उनके प्राकृतिक वातावरण में जैविक बातचीत को मापना मुश्किल हो जाता है। Graphene-आधारित बायोसेंसर को एक विकल्प के रूप में प्रस्तुत किया जाता है क्योंकि यह उत्कृष्ट रासायनिक स्थिरता और विद्युत क्षेत्र प्रदान करता है। चूंकि ग्राफीन कार्बन की एक एकल परमाणु परत है, इसलिए यह अर्ध-कंडक्टर के रूप में बेहद संवेदनशील है और जैविक समाधानों के साथ रासायनिक रूप से संगत है; इन गुणों के दोनों संगत इलेक्ट्रॉनिक biosensors35 उत्पन्न करने के लिए वांछनीय हैं. graphene-लेपित biosensors द्वारा की पेशकश biomolecules की उल्लेखनीय ultrahigh लोडिंग क्षमता graphene आधारित biosensors FEB प्रौद्योगिकी के विकास के लिए नेतृत्व करते हैं।

FEB प्रौद्योगिकी का सिद्धांत: FEB एक लेबल-मुक्त बायोमोलेक्यूलर डिटेक्शन तकनीक है जो ग्राफीन बायोसेंसर के माध्यम से विद्युत प्रवाह को मापता है जिसके लिए बाध्यकारी लक्ष्य स्थिर होते हैं। immobilized प्रोटीन और विश्लेषक के बीच बातचीत वर्तमान है कि वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं, सटीक गतिज मापसक्षम 36 में परिवर्तन में परिणाम.

इंस्ट्रूमेंटेशन: फेब सिस्टम में एक ग्राफीन फील्ड-इफेक्ट ट्रांजिस्टर (जीएफईटी) सेंसर चिप और एक इलेक्ट्रॉनिक रीडर शामिल है जो पूरे प्रयोग में एक निरंतर वोल्टेज लागू करता है (चित्रा 1)। विश्लेषक को बायोसेंसर सतह पर स्थिर किए गए लक्ष्य प्रोटीन के समाधान में लागू किया जाता है। जब कोई इंटरैक्शन होता है, तो वर्तमान में एक परिवर्तन मापा जाता है और वास्तविक समय में दर्ज किया जाता है। जैसे-जैसे विश्लेषक एकाग्रता बढ़ती है, बाध्य विश्लेषक का अंश भी बढ़ेगा, जिससे वर्तमान में उच्च परिवर्तन होंगे। उपकरण (सामग्री की तालिका) के साथ प्रदान किए गए स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, आई-रिस्पांस को मापा जाता है और बायोसेंसिंग इकाइयों (बीयू) 37 के संदर्भ में दर्ज किया जाता है। I-Response को विश्लेषण के साथ immobilized लक्ष्य की बातचीत पर वास्तविक समय में मापा गया बायोसेंसर चिप के माध्यम से वर्तमान (I) में परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया है। FEB स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर गतिशील इंटरैक्शन घटनाओं के लिए I-Response और C-Response दोनों का विश्लेषण कर सकता है, जहां C-Response धारिता (C) में परिवर्तन रिकॉर्ड करता है। आई-रिस्पांस और सी-रिस्पांस दोनों में भिन्नताएं सीधे बाध्य विश्लेषक के अंश के अनुरूप हैं और केडी मान उत्पन्न करने के लिए आगे का विश्लेषण किया जा सकता है। स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर की डिफ़ॉल्ट वरीयता I-Response है.

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक सेटअप का अवलोकन. (ए) Graphene-आधारित चिप और एक इलेक्ट्रॉनिक रीडर. (बी) चिप घटकों का एक सिंहावलोकन। चिप दो इलेक्ट्रोड से जुड़ी होती है जो सिस्टम को वर्तमान की आपूर्ति करती है। चिप की सतह को ग्राफीन के साथ कवर किया गया है, जो सक्रिय होने पर लक्ष्य को बांध सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पद्धति:
प्रारंभ में, सक्रिय बायोसेंसर चिप को FEB डिवाइस (चित्रा 1) में डाला जाता है, जिसके बाद नीचे उल्लिखित चरणों का निष्पादन होता है: (1) अंशांकन: प्रयोग बेसलाइन संतुलन प्रतिक्रिया बनाने के लिए 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS; pH = 7.4) का उपयोग करके सिस्टम अंशांकन के साथ शुरू होता है। (2) एसोसिएशन: चिप में विश्लेषक पेश किया जाता है, और बाध्यकारी संतृप्ति तक पहुंचने तक आई-रिस्पांस की निगरानी की जाती है। (3) पृथक्करण: विश्लेषक को 1x PBS का उपयोग करके अलग किया जाता है। (4) पुनर्जनन: 1x PBS का उपयोग करके विश्लेषक के अवशेष ों को हटा दिया जाता है। (5) धुलाई: चिप से बाध्य और अनबाउंड एनालिस्ट को पूरी तरह से हटाने के लिए 1x पीबीएस का उपयोग करके कुल पांच धोने का प्रदर्शन किया जाता है।

विश्लेषण:
डेटा विश्लेषण उपकरण के साथ प्रदान किए गए पूरी तरह से स्वचालित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर एक KD मान के साथ एक हिल फिट प्लॉट उत्पन्न करता है। हिल फिट प्लॉट विश्लेषक सांद्रता के एक समारोह के रूप में लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक विश्लेषक के संबंध का वर्णन करता है। वह सांद्रता जिस पर एक अर्ध-अधिकतम प्रतिक्रिया प्राप्त की जाती है, KD मान के लिए आनुपातिक होती है। एक कम KD मान उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और इसके विपरीत का प्रतिनिधित्व करता है।

FEB प्रयोग से प्राप्त डेटा को मान्य करने के लिए, I-Responses डेटा समीक्षा / निर्यात सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक विश्लेषक एकाग्रता के लिए प्रत्येक रीडआउट बिंदु से निकाले जाते हैं और अन्य सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) को निर्यात किया जा सकता है जैसा कि नीचे बताया गया है।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पुनः संयोजक प्रोटीन, Hsp90 और Cdc37, व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. चिप सक्रियण

नोट: प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं। एक बाँझ 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से सभी तैयार समाधान फ़िल्टर.

  1. 1-एथिल-3-(3-डाइमिथाइलमिनो प्रोपाइल) कार्बोडिमाइड (ईडीसी) समाधान तैयार करें, जिसमें 1 एम 2-(एन-मोर्फोलिनो) एथेन सल्फोनिक एसिड (एमईएस) बफर (पीएच = 6.0) के 2.5 मिलीलीटर में 2 मिलीग्राम ईडीसी को जोड़कर 15 एमएल ट्यूब में। एक अलग 15 mL ट्यूब में 1 M MES बफर (pH = 6.0) के 2.5 mL में सल्फो-NHS के 6 mg को जोड़कर N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) समाधान तैयार करें। स्वतंत्र ट्यूबों में प्रत्येक समाधान का 50 μL एलीकोट करें और भविष्य के उपयोग के लिए -20 °C पर स्टोर करें।
  2. ईडीसी रेत सल्फो-एनएचएस समाधान (ईडीसी के 50 μL + सल्फो-एनएचएस के 50 μL) के बराबर मात्रा को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं (भंवर न करें)।
    नोट: उचित चिप कार्यात्मकता के लिए प्रभावी क्रॉस-लिंकिंग बनाए रखने के लिए EDC / sulfo-NHS के मिश्रित समाधान का उपयोग 30 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए।
  3. बायोसेंसर चिप (5.7 सेमी x 2.4 सेमी; सामग्री की तालिका देखें) को एक फिट ढक्कन के साथ एक ग्लास पेट्री डिश में कंपनी द्वारा आपूर्ति की गई रखें। चिप सक्रियण में शामिल सभी कार्यात्मकता चरणों को पेट्री डिश के भीतर किए जाने का सुझाव दिया जाता है। बायोसेंसर चिप पर 1 एम एमईएस बफर (पीएच = 6.0) के 50 μL लागू करें, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर बफर को एस्पिरेट करें।
  4. सेंसर चिप पर तुरंत ईडीसी / सल्फो-एनएचएस समाधान के 50 μL लागू करें। पेट्री डिश को कवर करें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। चिप से एस्पिरेट ईडीसी / सल्फो-एनएचएस समाधान।
  5. 1 एम एमईएस बफर (पीएच = 6.0) के 50 μL के साथ चिप को एक बार कुल्ला; एमईएस बफर aspirate.

2. लक्ष्य प्रोटीन immobilization

  1. 1x PBS (pH = 7.4) के 50 μL के साथ चिप 2x कुल्ला। चिप से PBS aspirate और लक्ष्य अणु, Hsp90 (50 μL; 500 nM) जोड़ें।
    नोट:: बफ़र बेमेल पूरे प्रयोग को बर्बाद कर सकता है; इसलिए, प्रयोग से पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लक्ष्य अणु उसी बफर में है जो अंशांकन के लिए उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, 1x PBS (pH = 7.4))। यदि आवश्यक हो, तो प्रयोग से पहले रात भर डायलिसिस द्वारा एक बफर एक्सचेंज करें। इस प्रयोग में, रातभर डायलिसिस दोनों पुनः संयोजक प्रोटीन, Hsp90 और Cdc37 के लिए किया गया था, 1x PBS (pH = 7.4; सामग्री की तालिका देखें) के खिलाफ 4 °C पर उचित बफर विनिमय के साथ। लक्ष्य सामग्री की एकाग्रता (इस मामले में Hsp90) विभिन्न प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और लक्ष्य सामग्री (प्रोटीन / पेप्टाइड / लिगैंड) की प्रकृति के अनुसार भिन्न हो सकती है।
  2. ग्लास पेट्री डिश को कवर करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लक्ष्य अणु युक्त समाधान aspirate और 1x PBS (pH = 7.4) के 50 μL के साथ 3x कुल्ला। चिप से 1x PBS (pH = 7.4) समाधान aspirate.
  3. चिप में 50 μL क्वेंच 1 (1x PBS (pH = 7.4)) में 3.9 mM amino-PEG5-alcohol जोड़ें। कांच के पेट्री डिश को कवर करें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। चिप से 1 बुझाने समाधान aspirate.
  4. चिप के लिए 50 μL Quench 2 (1 M इथेनॉलमाइन (pH = 8.5)) समाधान जोड़ें। ग्लास पेट्री डिश को कवर करें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एस्पिरेट चिप से 2 समाधान बुझाएं और 1x पीबीएस के 50 μL का उपयोग करके चिप 5x को कुल्ला करें, सेंसर पर अंतिम पीबीएस बूंद को छोड़ दें।

3. विश्लेषक नमूने तैयार करना

  1. वांछित एकाग्रता सीमा में Cdc37 के लिए विश्लेषक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें। पहले प्रयोग के लिए, निम्नलिखित सांद्रता का उपयोग किया गया था: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1,000 nM, 2,000 nM, 3,000 nM, और 5,000 nM। दूसरे प्रयोग के लिए, 0.4 एनएम से लेकर 200 एनएम तक की सांद्रता के एक अलग सेट का उपयोग किया गया था।
  2. एक विश्वसनीय केडी मान प्राप्त करने के लिए कम से कम आठ अलग-अलग विश्लेषक सांद्रता को शामिल करने के लिए प्रयोग को डिजाइन करें। एक ही बफर में विश्लेषक प्रोटीन के विभिन्न dilutions तैयार करें जो अंशांकन और लक्ष्य प्रोटीन के लिए उपयोग किया जाता है; यहाँ यह 1x PBS (pH = 7.4) है।

4. FEB डिवाइस में सक्रिय बायोसेंसर चिप की लोडिंग

नोट: FEB डिवाइस में एक रीडर होता है जो एलईडी प्रकाश संकेतों और बायोसेंसर चिप डालने के लिए एक कारतूस के साथ चित्रित होता है।

  1. लक्ष्य प्रोटीन immobilization के बाद, डिवाइस के कारतूस में सक्रिय चिप डालें, जो USB के माध्यम से कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है। चिप सम्मिलन के बाद, एक हरे रंग की एलईडी लाइट को पाठक पर प्रदर्शित किया जाएगा जो यह दर्शाता है कि FEB डिवाइस प्रयोग के लिए तैयार है। कंप्यूटर पर कंपनी द्वारा आपूर्ति किए गए स्वचालित सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) स्थापित करें, जिससे FEB डिवाइस जुड़ा हुआ है, नीचे वर्णित के रूप में चरण-दर-चरण प्रयोग की निगरानी करने के लिए।

5. प्रयोग चलाएँ

  1. स्वचालित सॉफ़्टवेयर पर रन एक्सपेरिमेंट मॉड्यूल दबाएं और पुनर्जनन या किसी अन्य वांछित प्रोटोकॉल के साथ 10 अंक चुनें। निम्नलिखित विवरण भरें: ऑपरेटर का नाम, प्रयोग नाम, दिनांक (उदाहरण के लिए, याना, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); पुनर्जनन बफर (उदाहरण के लिए, पीबीएस बफर); immobilized लक्ष्य (उदाहरण के लिए, Hsp90); समाधान में विश्लेषक (उदाहरण के लिए, Cdc37). विवरण के लिए अनुपूरक चित्र S1 देखें.
  2. सॉफ़्टवेयर पर प्रदर्शित प्रयोग प्रारंभ करें बटन दबाएँ और नीचे वर्णित स्वचालित सॉफ़्टवेयर द्वारा दिखाए गए निर्देशों का पालन करें.
    नोट:: सॉफ़्टवेयर पूरी तरह से स्वचालित, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, और चरण-दर-चरण प्रयोग के दौरान उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है। प्रयोग के प्रत्येक चरण में आगे बढ़ने के निर्देशों के साथ स्क्रीन पर एक पॉप-अप विंडो दिखाई देगी। सॉफ्टवेयर अंशांकन, विश्लेषक संघ, पृथक्करण, उत्थान, और प्रयोग के दौरान प्रत्येक विश्लेषक एकाग्रता के लिए धोने (5x) से लगातार प्रत्येक दोहराए जाने वाले चरण के लिए निर्देश प्रदान करेगा।
  3. साधन अंशांकन निष्पादित करें. ऐसा करने के लिए, चिप से शेष पीबीएस समाधान को एस्पिरेट करें और अंशांकन बफर (1x पीबीएस; पीएच = 7.4) के 50 μL लागू करें। जारी रखें बटन दबाएँ और अंशांकन चरण समाप्त होने तक 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें. सॉफ़्टवेयर अंशांकन चरण (5 मिनट) के लिए निर्धारित समापन बिंदु को अनुवर्ती करने के लिए एक चेतावनी अलार्म के साथ प्रदर्शित करता है।
  4. अगला, एक विश्लेषक एसोसिएशन प्रदर्शन करें। ऐसा करने के लिए, चिप से अंशांकन बफर aspirate और सबसे कम विश्लेषक एकाग्रता (Cdc37 के 25 nM) के 50 μL लागू होते हैं। जारी रखें बटन दबाएँ और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि संबद्धता चरण समाप्त नहीं हो जाता है। सॉफ़्टवेयर आगे बढ़ने के लिए एक चेतावनी अलार्म के साथ संबद्धता चरण (5 मिनट) के लिए समापन बिंदु प्रदर्शित करता है।
  5. एक विश्लेषक पृथक्करण निष्पादित करें. ऐसा करने के लिए, चिप से विश्लेषक समाधान aspirate और पृथक्करण बफर (1x PBS; pH = 7.4) के 50 μL लागू होते हैं। जारी रखें बटन दबाएँ और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि पृथक्करण चरण अवधि (5 मिनट) समाप्त न हो जाए। सॉफ़्टवेयर अनुवर्ती करने के लिए एक चेतावनी अलार्म के साथ पृथक्करण चरण (5 मिनट) के लिए समापन बिंदु प्रदर्शित करता है।
  6. इसके बाद, चिप पुनर्जनन करें। चिप से पृथक्करण समाधान aspirate और पुनर्जनन बफर (1x PBS; pH = 7.4) के 50 μL लागू होते हैं। जारी रखें बटन दबाएँ और पुनर्जनन चरण अवधि (30 s) समाप्त होने तक 30 s के लिए प्रतीक्षा करें। सॉफ़्टवेयर अनुवर्ती करने के लिए एक चेतावनी अलार्म के साथ पुनर्जनन चरण (30 s) के लिए समापन बिंदु प्रदर्शित करता है।
  7. अंत में, चिप को धो लें। चिप से पुनर्जनन समाधान aspirate और चिप के लिए धोने बफर (1x PBS; pH = 7.4) के 50 μL लागू होते हैं। चिप से समाधान aspirate और इस 5x दोहराएँ. चिप पर वॉश बफ़र की अंतिम बूंद छोड़ दें और जारी रखें बटन दबाएं और सॉफ़्टवेयर डिस्प्ले में धोने के चरण की अवधि समाप्त होने तक 30 s तक प्रतीक्षा करें।
    नोट:: सॉफ़्टवेयर प्रयोग के अगले चक्र के साथ आगे बढ़ने के लिए एक चेतावनी अलार्म के साथ धोने के चरण (30 s) के लिए समापन बिंदु प्रदर्शित करता है।
  8. उपयोग किए गए प्रत्येक विश्लेषक एकाग्रता के लिए चरणों को दोहराएं; अंशांकन के पांच चरणों, विश्लेषक एसोसिएशन, पृथक्करण, पुनर्जनन, और धोने (5x) एक चक्र का गठन करते हैं। यहां दिखाए गए प्रयोग के लिए, हमने 10 विश्लेषक सांद्रता के लिए 10 चक्रों का प्रदर्शन किया (25 एनएम से 5,000 एनएम या 0.4 एनएम से 200 एनएम तक; चित्र 2)।

6. विश्लेषण

  1. प्रयोग के अंत में स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के शीर्ष पर देखे गए विश्लेषण बटन को दबाएँ. सभी प्रयोगात्मक बिंदुओं वाली एक प्रदर्शन विंडो दिखाई देगी। विंडो में, सुनिश्चित करें कि निर्धारित प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली विश्लेषक सांद्रता सही है।
  2. KD मान स्वचालित रूप से जनरेट करने के लिए विश्लेषण चलाएँ बटन दबाएँ। सॉफ़्टवेयर संबंधित I-Responses के खिलाफ विश्लेषक सांद्रता की साजिश करके एक हिल फिट प्लॉट उत्पन्न करता है जिसमें से संतुलन पर पृथक्करण स्थिरांक, KD मान की गणना की जाती है।
  3. नीचे वर्णित डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अन्य सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा को निर्यात करें.
    1. प्रयोग के अंत में स्वचालित रूप से बनाई गई R1R फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएँ (उदाहरण के लिए, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) डेस्कटॉप पर एक नए फ़ोल्डर में। कंपनी द्वारा आपूर्ति किए गए डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर को खोलें ( अनुपूरक चित्र S2A देखें).
    2. डेटा प्रोसेसिंग > प्रोसेस R1R फ़ाइलें > OK पर क्लिक करें डेटा समीक्षा / निर्यात सॉफ़्टवेयर की होम स्क्रीन पर।
    3. चरण 6.3.1 में डेस्कटॉप पर बनाई गई R1R फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें। और ठीक बटन दबाएँ। यह मूल फ़ाइल को ओवरराइड किए बिना डेटा की समीक्षा और संपादन करने के लिए, मूल R1R डेटा की एक प्रतिलिपि बनाता है।
    4. डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर की होम स्क्रीन पर देखे गए डेटा प्रोसेसिंग आइकन को दबाएँ. दबाएँ लोड संसाधित R1R फ़ाइलें ठीक >। संसाधित R1R फ़ाइलों वाले चरण 6.3.1 में बनाए गए एक ही फ़ोल्डर का चयन करें। ठीक दबाएँ. इस चरण में, प्रयोग फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर की समीक्षा करने के लिए तैयार है।
    5. डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर की होम स्क्रीन पर, डेटा विश्लेषण दबाएँ. अंशांकन > कैलिब्रेट संपादित R1R फ़ाइलें ठीक > का चयन करें ( अनुपूरक चित्र S2B देखें)। यह चरण आधार रेखा बनाने के लिए, पहले अंशांकन चरण के अनुसार सभी डेटा बिंदुओं को कैलिब्रेट करता है।
    6. डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर की होम स्क्रीन पर, डेटा विश्लेषण दबाएँ. समीक्षा करें और R1R फ़ाइलें संपादित करें > ठीक का चयन करें। डेटा बिंदुओं की समीक्षा करें, बिंदु हटाएँ, या चरण हटाएँ/जोड़ें बटन का उपयोग करके चरण जोड़ें. सुनिश्चित करें कि सभी चरण सही स्थान पर हैं, उदाहरण के लिए, अंशांकन चरण आधार रेखा पर है, संबद्धता चरण शिखर पर है ( अनुपूरक आकृति S3 देखें), और तब किए गए सभी परिवर्तनों को सहेजने के लिए सहेजें बटन दबाएँ.
    7. डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर की होम स्क्रीन पर, डेटा विश्लेषण दबाएँ. डेटा का विश्लेषण/प्लॉट का चयन करें, निर्यात करने के लिए चरणों का चयन करें ( अनुपूरक चित्र S4 देखें). डेटा निर्यात करने से पहले निर्यात सूची में अंशांकन चरण (जैसे, चरण 1, चरण 6, और इसी तरह) को घटाने के बाद प्रत्येक संबद्धता चरण (जैसे, चरण 2, चरण 7, और इसी तरह) जोड़ें।
    8. इस डेटा को निर्यात करें दबाएँ. सॉफ़्टवेयर एक स्प्रेडशीट फ़ाइल उत्पन्न करता है जिसमें प्रत्येक ट्रांजिस्टर से प्रत्येक विश्लेषक एकाग्रता डेटा बिंदु के लिए आई-रिस्पांस होता है (यदि सभी ट्रांजिस्टर काम कर रहे हैं, तो हमारे पास प्रत्येक एकाग्रता बिंदु के लिए तीन अलग-अलग आई-प्रतिक्रिया मान होंगे)। सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर में डेटा का और विश्लेषण करने के लिए इस स्प्रेडशीट फ़ाइल का उपयोग करें.
  4. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें. तीन Y मानों के साथ एक XY तालिका बनाएँ; बनाएँ दबाएँ. इस तालिका (X, Y मान) के लिए डेटा चरण 6.3.8 में बनाई गई स्प्रेडशीट फ़ाइल से प्रतिलिपि बनाई गई है। एक्स-अक्ष विश्लेषक एकाग्रता (उपयोग की गई एकाग्रता के आधार पर) से मेल खाता है, और तीन वाई मान कंपनी द्वारा आपूर्ति किए गए डेटा समीक्षा / निर्यात सॉफ़्टवेयर से प्राप्त आई-प्रतिक्रियाओं के अनुरूप हैं।
  5. इस डेटा का विश्लेषण करें दबाएँ. XY विश्लेषण > Nonlinear प्रतिगमन (वक्र फ़िट) > बाइंडिंग संतृप्ति > एक साइट > कुल चुनें। सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से डेटा का विश्लेषण करेगा, KD मान उत्पन्न करेगा, और डेटा बिंदुओं का ग्राफ बनाएगा।

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Representative Results

प्रयोग 1 से परिणाम:
लक्ष्य प्रोटीन Hsp90 (500 nM) को ऊपर वर्णित लक्ष्य स्थिरीकरण प्रोटोकॉल के बाद चिप में स्थिर कर दिया गया था। पहले प्रयोग के लिए, विश्लेषक प्रोटीन की 10 सांद्रता, Cdc37, 25 nM से 5,000 nM तक, साहित्य में उपलब्ध डेटा के आधार पर तैयार की गई थी ( तालिका 1 देखें)।

प्रयोग के चरणों को वास्तविक समय में आई-रिस्पांस (चित्रा 3 ए) में होने वाले परिवर्तनों का पालन करके मॉनिटर किया जा सकता है। कोई कल्पना कर सकता है कि प्रोटोकॉल में शामिल प्रत्येक चरण पूरे प्रयोग के दौरान आई-रिस्पांस को कैसे प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, आई- रिस्पांस अंशांकन के दौरान शून्य के करीब है, और एसोसिएशन चरण में, आई-रिस्पांस धीरे-धीरे विश्लेषक (Cdc37) सांद्रता में वृद्धि के साथ बढ़ता है। इस प्रयोग (चित्रा 3ए) के आंकड़ों को देखते हुए, आई-रिस्पांस में अचानक वृद्धि कम विश्लेषक सांद्रता (25 एनएम पर 50 बीयू) में देखी गई थी। कम विश्लेषक एकाग्रता पर एक कम आई-रिस्पांस की उम्मीद की गई थी जो बढ़ती सांद्रता के साथ धीरे-धीरे बढ़ जाएगी। इस अचानक वृद्धि ने सुझाव दिया कि कम विश्लेषक एकाग्रता बिंदुओं सहित एक प्रयोग को डिजाइन किया जाना चाहिए।

ऊपर चर्चा किए गए प्रोटोकॉल चरणों के बाद, डेटा का विश्लेषण प्रदान किए गए स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में किया गया था, जिसने स्वचालित रूप से एक गणना किए गए केडी मान (चित्रा 3 बी) के साथ एक हिल फिट प्लॉट उत्पन्न किया था। पहले प्रयोग के लिए स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से गणना की गई केडी मान 350,000 ± 76,000 μM था। अधिकांश सामान्य जैविक इंटरैक्शन ने कम μM में या यहां तक कि nM रेंज में एक KD मान दिखाया; इस प्रकार, पहले प्रयोग के लिए उत्पन्न केडी मान बहुत अधिक है।

मनाया उच्च केडी मूल्य के लिए कई स्पष्टीकरण हो सकते हैं: अध्ययन किए गए दो विशिष्ट प्रोटीन (Hsp90 / Cdc37) के बीच कम आत्मीयता बाध्यकारी हो सकती है, जिसका अर्थ है कि आणविक इंटरैक्शन के लिए एक उच्च लिगैंड एकाग्रता की आवश्यकता होती है; प्रयोग गैर-आदर्श, आउट-ऑफ-रेंज विश्लेषक सांद्रता के साथ डिज़ाइन किया गया हो सकता है; उच्च मूल्य विश्लेषण सॉफ्टवेयर के फिटिंग मॉड्यूल में उपयोग किए जाने वाले अंतर्निहित मापदंडों के कारण हो सकता है। स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर डेटा बिंदुओं को फिट करने के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग करता है, लेकिन कुछ इंटरैक्शन इस मॉडल में अच्छी तरह से फिट नहीं हो सकते हैं, इस प्रकार गलत डेटा देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च केडी मान होते हैं।

एक संतृप्त हिल प्लॉट के साथ एक सटीक केडी मान प्राप्त करने के लिए, परीक्षण और त्रुटि द्वारा प्रयोग के मानकीकरण की आवश्यकता होती है जिसमें कम और उच्च विश्लेषक सांद्रता बिंदु दोनों शामिल होते हैं, कम त्रुटि दर के साथ सबसे कम केडी मान प्राप्त करने के लिए।

इन सभी कारकों को ध्यान में रखते हुए, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से डेटा को अतिरिक्त सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में निर्यात किया गया था। प्रत्येक संबद्धता बिंदु के लिए I-Response स्वचालित डेटा समीक्षा/निर्यात सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके निकाला गया था और विश्लेषण चरण (चरण 6) में ऊपर चर्चा किए गए चरणों का पालन करके तालिका 2 में सारांशित किया गया है।

सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर परिणाम (चित्रा 3C) ने एक उच्च मानक विचलन (0.011 ± 0.494 μM) और 0.78 के कम R2 मान के साथ अपेक्षाकृत कम KD मान दिखाया। केडी मान और कम आर2 मान में देखी गई महत्वपूर्ण भिन्नता ने सुझाव दिया कि इस प्रयोग के लिए चुने गए एकाग्रता बिंदु इष्टतम नहीं हैं। इसके अलावा, यह भी देखा गया कि कुछ ग्राफ बिंदु प्लॉट ट्रेंडलाइन (चित्रा 3 सी) के साथ अच्छी तरह से फिट नहीं थे; इसने विभिन्न विश्लेषक एकाग्रता बिंदुओं को शामिल करके एक दूसरे प्रयोग को डिजाइन करने की आवश्यकता को मजबूत किया।

दो विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा उपयोग किए जाने वाले अंतर्निहित पैरामीटर पूरी तरह से अलग हैं, और यह केडी मूल्यों की उत्पादन प्रक्रिया में परिलक्षित होता है। दो विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (350,000 ± 76,000 μM बनाम 0.011 ± 0.494 μM) से प्राप्त KD मानों में अंतर को इस तथ्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि गणना के लिए विभिन्न विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में किया गया विश्लेषण इस इंटरैक्शन के लिए बेहतर फिट हो सकता है, इस प्रकार कम केडी मान देता है।

फिर भी, यदि दोनों विश्लेषणों के परिणामों को संयुक्त किया जाता है (350,000 ± 76,000 μM और 0.011 ± 0.494 μM), तो यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि पहला प्रयोग इष्टतम नहीं था और अतिरिक्त एकाग्रता बिंदुओं की आवश्यकता होगी।

इस बिंदु को मान्य करने के लिए, असंबद्ध ग्राफ बिंदु, 3,000 nM को बाहर रखा गया था (अनुपूरक चित्र S5 देखें)। विश्लेषण के परिणामों ने 0.98 के R2 मान के साथ 0.006 ± 0.081 μM का KD मान दिखाया। इन परिणामों ने संकेत दिया कि अगले प्रयोग को अधिक प्रासंगिक सांद्रता पर ध्यान केंद्रित करते हुए डिज़ाइन किया जाना चाहिए। इसलिए, Hsp90/ Cdc37 PPI का मूल्यांकन करने के लिए एक दूसरा प्रयोग किया गया था, जिसमें पूर्वानुमानित केडी के नीचे और ऊपर सांद्रता के साथ विभिन्न परीक्षण बिंदुओं का उपयोग किया गया था।

प्रयोग 2 से परिणाम:
लक्ष्य प्रोटीन, Hsp90 (500 nM) को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके चिप में स्थिर कर दिया गया था। विश्लेषक (Cdc37) की कुल 10 सांद्रता निम्नानुसार तैयार की गई थी: 0.4 nM, 0.8 nM, 1.6 nM, 3.2 nM, 6.4 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, और 200 nM। दूसरे प्रयोग को विभिन्न विश्लेषक एकाग्रता बिंदुओं को शामिल करके डिज़ाइन किया गया था, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, पिछले प्रयोग से प्राप्त सभी अंतर्दृष्टि पर विचार करके।

प्रयोग के दौरान, प्रत्येक चरण को वास्तविक समय (चित्रा 4 ए) में मॉनिटर किया गया था। यहां, वास्तविक समय I-प्रतिक्रिया ग्राफ (विश्लेषक-0.4 nM, 0.6 nM, 1.6 nM की कम सांद्रता से व्युत्पन्न) शुरू में शून्य से शुरू होता है और पहले प्रयोग में देखी गई I-Response की अचानक वृद्धि की तुलना में प्रयोग के प्रत्येक चक्र में विश्लेषक सांद्रता में वृद्धि पर धीरे-धीरे बढ़ता है।

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (चित्रा 4 बी) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। इस प्रयोग के लिए स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से गणना की गई केडी मान 0.0673 ± 0.0002 μM था, जिसने लक्ष्य प्रोटीन Hsp90 और विश्लेषक Cdc37 के बीच एक मजबूत बातचीत का सुझाव दिया। 0.0002 μM का मानक विचलन पहले प्रयोग में प्राप्त की तुलना में बहुत छोटा था, जो विश्वास दिलाता है कि नया डेटा बहुत अधिक विश्वसनीय है।

इस परिणाम को मान्य करने के लिए, हमने डेटा बिंदुओं (तालिका 3) को किसी अन्य सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में निर्यात किया, जैसा कि पहले समझाया गया था; विश्लेषण के परिणामों को चित्र 4C में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि Hsp90/Cdc37 PPI के लिए KD मान 0.014 ± 0.005 μM (चित्रा 4C) है। केडी और मानक विचलन के कम मूल्य दो प्रोटीन, Hsp90 और Cdc37 के बीच एक मजबूत बातचीत का संकेत देते हैं। इसके अलावा, 0.99 का आर2 मान इंगित करता है कि विश्लेषण पूरी तरह से प्रयोगात्मक ग्राफ बिंदुओं को फिट करता है। दोनों विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ने परिणामों में निरंतरता दिखाई, जिसमें क्रमशः लगभग 0.0673 ± 0.0002 μM और 0.014 ± 0.005 μM के कम KD मान थे।

प्रयोग की पुनरुत्पादकता और सटीकता की पुष्टि करने के लिए, एक ही प्रयोग एचएसपी 90 (500 एनएम) का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन के रूप में और सीडीसी 37 को विश्लेषक के रूप में 0.4 एनएम से 200 एनएम तक की समान सांद्रता के साथ दो प्रतिकृतियों में किया गया था जैसा कि दूसरे प्रयोग में उपयोग किया गया था। प्रयोग के दौरान, प्रत्येक चरण को वास्तविक समय (पूरक चित्रा S6A और अनुपूरक चित्रा S7A) में मॉनिटर किया गया था। स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से परिकलित KD मान को अनुपूरक चित्र S6B और अनुपूरक आकृति S7B (0.053 ± 0.002 μM और 0.0719 ± क्रमशः 0.0007 μM) में दर्शाया गया है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, डेटा बिंदुओं को किसी अन्य सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को निर्यात किया गया था (अनुपूरक तालिका S1 और अनुपूरक तालिका S2) और परिणाम अनुपूरक चित्र S6C और अनुपूरक चित्र S7C (अनुपूरक चित्र S6C: KD 0.003 ± 0.009 μM है और R2 0.99 है; अनुपूरक चित्र S7C: KD 0.004 ± 0.009 μM है और R2 0.99 है)। दोनों विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से दो प्रतिकृतियों के परिणामों ने अच्छी तरह से पुष्टि की और Hsp90 / Cdc37 FEB प्रयोगात्मक डेटा की सटीकता, पुनरावृत्ति और पुनरुत्पादन की पुष्टि की।

एक नियंत्रण अध्ययन भी किया गया था जिसमें एचएसपी 90 और एक नियंत्रण प्रोटीन, बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के बीच बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को स्पष्ट किया गया था। एक विश्लेषक के रूप में बीएसए का उपयोग करके नियंत्रण अध्ययन दूसरे प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले एक समान प्रयोगात्मक सेटअप और विश्लेषक सांद्रता का उपयोग करके किया गया था। नियंत्रण प्रोटीन, बीएसए की कुल 10 सांद्रता, 0.4 एनएम से 200 एनएम तक 1x पीबीएस (पीएच = 7.4) में तैयार की गई थी और प्रयोग के प्रत्येक चरण की वास्तविक समय में निगरानी की गई थी।

Hsp90 और Cdc37 के साथ प्रयोग के समान, वास्तविक समय I-Response ग्राफ शुरू में 0 से शुरू होता है; हालांकि, नियंत्रण अध्ययन में, विश्लेषक सांद्रता (पूरक चित्रा S8A) की वृद्धि पर I-Response में धीरे-धीरे वृद्धि नहीं हुई। डेटा का विश्लेषण स्वचालित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (पूरक चित्रा S8B) का उपयोग करके भी किया गया था, और सॉफ़्टवेयर इस प्रयोग के डेटा बिंदुओं से KD मान की गणना करने में असमर्थ था। यह सॉफ्टवेयर से उत्पन्न हिल प्लॉट से स्पष्ट है, कि Hsp90 और नियंत्रण BSA विश्लेषक के बीच कोई बातचीत नहीं है। इस परिणाम को मान्य करने के लिए, हमने डेटा बिंदुओं (पूरक तालिका S3) को किसी अन्य सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में निर्यात किया जैसा कि पहले समझाया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि Hsp90/BSA PPI के लिए KD मान नकारात्मक है (अनुपूरक चित्रा S8C; KD -0.009 ± -0.0003 μM) है, जो फिर से इंगित करता है कि दो प्रोटीन, Hsp90 और BSA के बीच कोई बातचीत नहीं है। इसके अलावा, R2 मान (0.82) इंगित करता है कि विश्लेषण प्रयोगात्मक ग्राफ बिंदुओं को फिट नहीं करता है। दोनों विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ने परिणामों में स्थिरता दिखाई कि Hsp90 और BSA बातचीत नहीं करते हैं।

साहित्य में उपलब्ध अन्य प्रयोगात्मक डेटा के साथ Hsp90 / Cdc37 FEB प्रयोगात्मक डेटा की तुलना करते समय, यह पाया गया कि इस अध्ययन में प्राप्त KD मान (KD = 0.014 ± 0.005 μM, KD = 0.053 ± 0.002 μM, और KD = 0.072 ± 0.001 μM) पहले प्रकाशित डेटा (K D = 1.46 μM) से कम परिमाण के दो क्रमों में थे (KD = 1.46 μM38) ). इन मतभेदों को वर्तमान प्रयोगों में पूर्ण लंबाई वाले मानव Hsp90 और Cdc37 निर्माणों के उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। पिछले अध्ययन खमीर Hsp90 निर्माणों पर किए गए थे जिसमें केवल आंशिक प्रोटीन38 या C. elegans होमोलॉग प्रोटीन39 (तालिका 1) शामिल थे। FEB प्रणाली में प्राप्त परिणामों को मान्य करने के लिए, ITC प्रयोग किए गए थे।

आईटीसी प्रणाली का उपयोग करके Hsp90/Cdc37 PPI का मूल्यांकन करना:
आईटीसी को बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन की जांच करने के लिए सोने का मानक माना जाता है। हमने आगे Hsp90 / Cdc37 PPI के थर्मोडायनामिक कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए ITC का प्रदर्शन किया, और FEB प्रयोग के लिए सत्यापन के रूप में। Hsp90 और Cdc37 को आईटीसी से पहले पीबीएस (पीएच = 7.0) के खिलाफ डायलिसिस के अधीन किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन (Hsp90) के बारे में 0.25 μM समाधान और विश्लेषक प्रोटीन (Cdc37) के 2.5 μM समाधान कैलोरीमेट्रिक अनुमापन के लिए PBS में तैयार किए गए थे। लगातार अंतराल पर Cdc37 समाधान के 80 μL की कुल मात्रा घूर्णन सिरिंज से सेल में 298.15 K पर Hsp90 समाधान के 150 μL युक्त करने के लिए titrated था। प्रत्येक इंजेक्शन 4 एस की अवधि में हुआ, और लगातार इंजेक्शन के बीच का समय अंतराल 150 सेकंड था। प्रत्येक 2 μL के कुल 19 इंजेक्शन क्रमशः 500 rpm की सरगर्मी गति और 41.9 μW की संदर्भ शक्ति के साथ बनाए गए थे। Hsp90 / Cdc37 इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप गर्मी भिन्नता की निगरानी की गई थी, और Cdc37 विश्लेषक इंजेक्शन के अंत में प्राप्त अंतिम डेटा को कंपनी द्वारा आपूर्ति किए गए आईटीसी विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके फिट किया गया था। थर्मोडायनामिक मापदंडों जैसे कि दाढ़ एन्थैल्पी परिवर्तन (ΠH), एन्ट्रॉपी परिवर्तन (ΠS), बाध्यकारी साइटों की संख्या (n), और Hsp90/Cdc37 PPI के बीच संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (KD) के साथ ऊष्मा भिन्नताओं का अनुमान लगाया गया था। गिब्स मुक्त ऊर्जा परिवर्तन (ΠG) की गणना भी ITC थर्मोग्राम से थर्मल पैरामीटर प्राप्त करने के बाद समीकरण से की गई थी।

आईटीसी प्लॉट पीपीआई40 को नियंत्रित करने वाले इंटरैक्शन और इंटरमॉलिक्युलर बलों की प्रकृति को स्पष्ट करने के लिए जैविक इंटरैक्शन के दौरान उपयोग की जाने वाली या मुक्त गर्मी की मात्रा का खुलासा करता है। Cdc37 (2.5 μM) को Hsp90 (0.25 μM) में titrated किया गया था, और इसी वक्र को चित्र 5A, B में दर्शाया गया है। प्राप्त आईटीसी प्लॉट को एक्सोथर्मिक पाया गया था और इसे एक एकल बाइंडिंग साइट मॉडल में फिट किया गया था, जिसमें एक की बाध्यकारी स्टोइकोइमेट्री (एन) प्रदर्शित की गई थी, बाध्यकारी ऊर्जा, ΠG = -45.9 kJ / mol, और KD मान = 0.009 μM। आईटीसी थर्मोग्राम (चित्रा 5ए) की शुरुआत में एक एंडोथर्मिक शिफ्ट के रूप में देखी गई मामूली असंगतता माप सेल41,42 के लिए विश्लेषक प्रोटीन को टिटरेट करते समय बुलबुले के गठन का सुझाव देती है। Hsp90 / Cdc37 PPI के बीच, कम और उच्च सांद्रता पर किए गए ITC प्रयोगों में, Cdc37 की 10 गुना अधिकता (Hsp90 एकाग्रता = 0.25 μM और Cdc37 एकाग्रता = 2.5 μM) ने संतृप्ति वक्र प्राप्त करके स्वीकार्य बाध्यकारी मापदंडों का प्रदर्शन किया। ITC (KD = 0.009 μM) से प्राप्त KD मान FEB प्रौद्योगिकी (KD = 0.014 μM, 0.053 μM, और 0.072 μM) का उपयोग करके गणना किए गए KD मान के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है, जो Hsp90/Cdc37 PPI का पता लगाने में FEB की संवेदनशीलता और सटीकता का दृढ़ता से समर्थन करता है।

Figure 2
चित्र 2: प्रोटोकॉल सारांश. (A) चिप सक्रियण प्रक्रिया के लिए चरणों का सारांश. (बी) प्रोटोकॉल में पांच दोहराए जाने वाले चरणों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रयोग 1. (A) से उत्पन्न डेटा फ़ाइलें वास्तविक समय में मॉनिटर किए गए प्रयोग डेटा. y-अक्ष बायोसेंसर इकाइयों (BU) में I-Response से मेल खाती है, और x-अक्ष प्रयोग में विश्लेषक के विभिन्न समय बिंदुओं और सांद्रता से मेल खाती है। यह आंकड़ा पहले प्रयोग के डेटा से मेल खाता है। (बी) स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर से उत्पन्न हिल फिट प्लॉट। y-अक्ष I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष nM में विश्लेषक (Cdc37) की सांद्रता से मेल खाती है। इस प्रयोग के लिए, KD मान 350,000 ± 76,000 μM है। (C) सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न एसोसिएशन प्लॉट। y-अक्ष एसोसिएशन चरण के अंत में I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष विभिन्न विश्लेषक, Cdc37, सांद्रता से मेल खाती है। यह प्लॉट तालिका 2 में दिए गए डेटा बिंदुओं का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। विश्लेषण परिणामों का सारांश ग्राफ में प्रदान किया गया है; इस प्रयोग के लिए, KD मान 0.011 ± 0.494 μM है और R2 मान 0.78 है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रयोग 2 से उत्पन्न डेटा फ़ाइलें. (A) प्रयोग डेटा वास्तविक समय में मॉनिटर किया जाता है। y-अक्ष बायोसेंसर इकाइयों (BU) में I-Response से मेल खाती है, और x-अक्ष प्रयोग में विश्लेषक के विभिन्न समय बिंदुओं और सांद्रता से मेल खाती है। यह आंकड़ा दूसरे प्रयोग के डेटा से मेल खाता है। (बी) स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर से उत्पन्न हिल फिट प्लॉट। y-अक्ष I-Response से मेल खाता है, x-अक्ष nM में विश्लेषक (Cdc37) की एकाग्रता से मेल खाता है। इस प्रयोग के लिए, KD मान 0.0673 ± 0.0002 μM (C) एसोसिएशन प्लॉट सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न है। y-अक्ष एसोसिएशन चरण के अंत में I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष विभिन्न विश्लेषक Cdc37 सांद्रता से मेल खाती है। यह प्लॉट तालिका 3 में दिए गए डेटा बिंदुओं का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। विश्लेषण परिणामों का सारांश ग्राफ में प्रदान किया गया है; इस प्रयोग के लिए, KD मान 0.014 ± 0.005 μM है और R2 मान 0.99 है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र5: Hsp90 और Cdc37 इंटरैक्शन का ITC थर्मोग्राम। (A) शीर्ष पैनल 298.15 K पर Hsp90 (0.25 μM) में Cdc37 (2.5 μM) के लगातार इंजेक्शन के कारण प्राप्त इसी गर्मी विकसित वक्रों का प्रतिनिधित्व करता है। विभेदक शक्ति (DP) समय के एक कार्य के रूप में विभेदक शक्ति का प्रतिनिधित्व करती है। (B) नीचे के पैनल में एकीकृत डेटा बिंदु Hsp90/Cdc37 के दाढ़ अनुपात बनाम संबंधित सामान्यीकृत ऊष्मा को नामित करते हैं। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Assays प्रदर्शन किया FEB विश्लेषण KD प्रिज्म विश्लेषण KD मूल बनाएँ अमीनो एसिड संदर्भ
आईटीसी 1.46 μM, और 1.32 μM ना खमीर Hsp90 Hsp90 का N-टर्मिनल डोमेन 36
मानव Cdc37
SPR 6 μM ना C. elegans पूर्ण लंबाई 37
FEB - पहले repetion 0.014 μM 0.067 μM मानव Hsp90 पूर्ण लंबाई इस अध्ययन में किया गया प्रदर्शन
मानव Cdc37
FEB - दूसरी पुनरावृत्ति 0.053 μM 0.003 μM मानव Hsp90 पूर्ण लंबाई इस अध्ययन में किया गया प्रदर्शन
मानव Cdc37
FEB - तीसरी पुनरावृत्ति 0.072 μM 0.004 μM मानव Hsp90 पूर्ण लंबाई इस अध्ययन में किया गया प्रदर्शन
मानव Cdc37
आईटीसी 0.009 μM ना मानव Hsp90 पूर्ण लंबाई इस अध्ययन में किया गया प्रदर्शन
मानव Cdc37
FEB- नियंत्रण अध्ययन कोई डेटा नहीं (केडी की गणना करने के लिए अपर्याप्त डेटा था) -0.009 μM (नकारात्मक मानों के साथ KD मान इंगित करता है कि कोई इंटरैक्शन नहीं है) मानव Hsp90 पूर्ण लंबाई इस अध्ययन में किया गया प्रदर्शन
BSA

तालिका 1: Hsp90 / Cdc37 पीपीआई मूल्यांकन इस अध्ययन और साहित्य में रिपोर्ट किए गए विभिन्न तरीकों का उपयोग करके।

विश्लेषक सांद्रता (nM) I-Response ट्रांजिस्टर 1 I-Response Transistor 2 I-Response Transistor 3 औसत
I-Response
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

तालिका 2: पहले प्रयोग के प्रत्येक एकाग्रता बिंदु पर प्रत्येक चिप के तीन अलग-अलग ट्रांजिस्टर से उत्पन्न आई-रिस्पांस मूल्यों का सारांश।

विश्लेषक सांद्रता (nM) I-Response ट्रांजिस्टर 1 I-Response Transistor 2 I-Response Transistor 3 औसत I-प्रतिक्रिया
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

तालिका 3: दूसरे प्रयोग के प्रत्येक एकाग्रता बिंदु पर प्रत्येक चिप के तीन अलग-अलग ट्रांजिस्टर से उत्पन्न आई-रिस्पांस मूल्यों का सारांश।

अनुपूरक चित्रा S1: प्रयोग की शुरुआत से पहले स्वचालित सॉफ़्टवेयर की मुख्य स्क्रीन का स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S2: डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए स्वचालित सॉफ़्टवेयर की मुख्य स्क्रीन का स्क्रीनशॉट। (ए) डेटा प्रोसेसिंग विकल्पों को दिखाने वाले डेटा समीक्षा / निर्यात सॉफ़्टवेयर का मुख्य स्क्रीन प्रदर्शन। (बी) डेटा समीक्षा / निर्यात सॉफ्टवेयर का मुख्य स्क्रीन प्रदर्शन जो डेटा विश्लेषण विकल्प दिखाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S3: समीक्षा /निर्यात सॉफ़्टवेयर से प्राप्त समीक्षा डेटा अंक। इस चरण में, प्रयोग की समीक्षा करें और डेटा बिंदु जोड़ें या हटाएँ। सुनिश्चित करें कि एसोसिएशन बिंदु (2, 7, 12, 17, 22, और इसी तरह) हमेशा पिक पर है। उदाहरण के लिए, बाईं ओर से पहला पिक डेटा पॉइंट नंबर 2 है, और फिर डेटा पॉइंट नंबर 10 (लेकिन यह संख्या 7 होना चाहिए)। इसे हल करने के लिए बस अंक 3, 4, और 5 को हटा दें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक आकृति S4: उदाहरण के लिए डेटा सूची निर्यात करें. इस चरण में, चुना गया है कि निर्यात किए जाने वाले प्रयोग बिंदु क्या हैं। एक एसोसिएशन बिंदु (2, 7, 12, 17, 22, और इसी तरह) चुनें और पिछले अंशांकन चरणों (1, 6, 11, 16, 21, और इतने पर) को घटाएं। निर्यात सूची में सभी बिंदु जोड़ें और प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए I-Response के साथ एक स्प्रेडशीट प्राप्त करने के लिए इस डेटा को निर्यात करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S5: सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न एसोसिएशन प्लॉट। y-अक्ष एसोसिएशन चरण के अंत में I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष विभिन्न विश्लेषक Cdc37 सांद्रता से मेल खाती है। यह प्लॉट पहले प्रयोग से डेटा बिंदुओं का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था और 3,000 एनएम एकाग्रता डेटा बिंदु को बाहर रखा गया था। विश्लेषण परिणामों का सारांश ग्राफ में प्रदान किया गया है; इस प्रयोग के लिए, KD मान 0.006 ± 0.081 μM है और R2 मान 0.98 है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S6: प्रयोग 2 से उत्पन्न डेटा फ़ाइलें 1 प्रतिकृति। (ए) वास्तविक समय में निगरानी किए गए प्रयोग डेटा। y-अक्ष बायोसेंसर इकाइयों (BU) में I-Response से मेल खाती है, और x-अक्ष प्रयोग में विश्लेषक के विभिन्न समय बिंदुओं और सांद्रता से मेल खाती है। यह आंकड़ा दूसरे प्रयोग में किए गए दूसरे पुनरावृत्ति से डेटा से मेल खाता है जहां एचएसपी 90 को चिप (500 एनएम) पर स्थिर किया गया था और सीडीसी 37 विश्लेषक की 10 सांद्रता तैयार की गई थी (0.4-200 एनएम)। वास्तविक समय I-प्रतिक्रिया ग्राफ शुरू में 0 से शुरू होता है और प्रयोग के प्रत्येक चक्र में विश्लेषक सांद्रता की वृद्धि पर धीरे-धीरे बढ़ता है, यह सुझाव देता है कि प्रयोग सफल है। (बी) स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर से उत्पन्न हिल फिट प्लॉट। y-अक्ष I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष nM में विश्लेषक (Cdc37) की सांद्रता से मेल खाती है। स्वचालित विश्लेषण के परिणामों ने अपेक्षाकृत कम KD मान और 0.0531 ± 0.0002 μM के कम मानक विचलन को दिखाया, जो Hsp90 और Cdc37 के बीच एक मजबूत बातचीत का सुझाव देता है। (C) सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न एसोसिएशन प्लॉट। y-अक्ष एसोसिएशन चरण के अंत में I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष विभिन्न विश्लेषक Cdc37 सांद्रता से मेल खाती है। यह प्लॉट तालिका S1 में दिए गए डेटा बिंदुओं का उपयोग करके जनरेट किया गया था। विश्लेषण परिणामों का सारांश ग्राफ में प्रदान किया गया है; इस प्रयोग के लिए, KD मान 0.003 ± 0.009 μM है और R2 मान 0.99 है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S7: प्रयोग 2 से उत्पन्न डेटा फ़ाइलें 1 को दोहराएँ। (ए) वास्तविक समय में निगरानी किए गए प्रयोग डेटा। y-अक्ष बायोसेंसर इकाइयों (BU) में I-Response से मेल खाती है, और x-अक्ष प्रयोग में विश्लेषक के विभिन्न समय बिंदुओं और सांद्रता से मेल खाती है। यह आंकड़ा दूसरे प्रयोग में तीसरे पुनरावृत्ति से डेटा से मेल खाता है जहां एचएसपी 90 को चिप (500 एनएम) पर स्थिर किया गया था और सीडीसी 37 विश्लेषक की 10 सांद्रता तैयार की गई थी (0.4-200 एनएम)। (बी) स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर से उत्पन्न हिल फिट प्लॉट। y-अक्ष I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष nM में विश्लेषक (Cdc37) की सांद्रता से मेल खाती है। स्वचालित विश्लेषण के परिणामों ने अपेक्षाकृत कम KD मान और 0.0719 ± 0.0007 μM का कम मानक विचलन दिखाया, जो Hsp90 और Cdc37 के बीच एक मजबूत बातचीत का सुझाव देता है। y-अक्ष संबद्धता चरण के अंत में I-Response से मेल खाती है. एक्स-अक्ष विभिन्न विश्लेषक Cdc37 सांद्रता से मेल खाती है। यह प्लॉट तालिका S2 में दिए गए डेटा बिंदुओं का उपयोग करके जनरेट किया गया था। विश्लेषण परिणामों का सारांश ग्राफ में प्रदान किया गया है; इस प्रयोग के लिए, KD मान 0.004 ± 0.009 μM है और R2 मान 0.99 है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा S8: नियंत्रण प्रयोग से उत्पन्न डेटा फ़ाइलें. (ए) वास्तविक समय में निगरानी किए गए प्रयोग डेटा। y-अक्ष बायोसेंसर इकाइयों (BU) में I-Response से मेल खाती है, और x-अक्ष प्रयोग में विश्लेषक के विभिन्न समय बिंदुओं और सांद्रता से मेल खाती है। यह आंकड़ा नियंत्रण प्रयोग से डेटा से मेल खाता है जहां Hsp90 चिप (500 nM) पर स्थिर किया गया था और BSA (नियंत्रण प्रोटीन) विश्लेषक की 10 सांद्रता (0.4-200 nM) तैयार की गई थी। वास्तविक समय I-Response ग्राफ 10-15 BU के आसपास कम I-Response से शुरू होता है और प्रयोग के प्रत्येक चक्र में विश्लेषक सांद्रता में वृद्धि पर वृद्धि नहीं करता है, यह सुझाव देता है कि Hsp90 और BSA के बीच कोई बातचीत नहीं है। (बी) स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर से उत्पन्न हिल फिट प्लॉट। y-अक्ष I-Response से मेल खाता है; x-अक्ष nM में विश्लेषक (BSA) की सांद्रता से मेल खाती है। स्वचालित विश्लेषण के परिणामों से पता चला है कि KD मान की गणना करने के लिए अपर्याप्त डेटा है जो सुझाव देता है कि Hsp90 और BSA के बीच कोई इंटरैक्शन नहीं है। (C) सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न एसोसिएशन प्लॉट। y-अक्ष एसोसिएशन चरण के अंत में I-Response से मेल खाती है, x-अक्ष विभिन्न विश्लेषक BSA सांद्रता से मेल खाती है। यह प्लॉट तालिका S4 में दिए गए डेटा बिंदुओं का उपयोग करके जनरेट किया गया था। विश्लेषण परिणामों का सारांश ग्राफ में प्रदान किया गया है; इस प्रयोग के लिए, KD मान -0.009 ± -0.0003 μM है और R2 मान 0.82 है। शून्य के करीब एक ऋणात्मक KD मान इंगित करता है कि Hsp90 और BSA के बीच कोई इंटरैक्शन नहीं है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका S1: प्रत्येक एकाग्रता बिंदु पर उत्पन्न आई-रिस्पांस मूल्यों का सारांश और प्रत्येक चिप के ट्रांजिस्टर (प्रत्येक चिप के लिए तीन अलग-अलग ट्रांजिस्टर) से पढ़ा जाता है। यह तालिका दूसरे प्रयोग के लिए किए गए दूसरे पुनरावृत्ति से निकाले गए डेटा से मेल खाती है जहां Hsp90 को चिप (500 nM) पर स्थिर किया गया था और Cdc37 विश्लेषक की 10 सांद्रता तैयार की गई थी (0.4-200 nM)। इस तालिका के डेटा बिंदुओं का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण के लिए किया गया था। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका S2: प्रत्येक एकाग्रता बिंदु पर उत्पन्न आई-रिस्पांस मूल्यों का सारांश और प्रत्येक चिप के ट्रांजिस्टर (प्रत्येक चिप के लिए तीन अलग-अलग ट्रांजिस्टर) से पढ़ा जाता है। यह तालिका दूसरे प्रयोग के लिए किए गए तीसरे पुनरावृत्ति से निकाले गए डेटा से मेल खाती है जहां Hsp90 को चिप (500 nM) पर स्थिर किया गया था और Cdc37 विश्लेषक की 10 सांद्रता तैयार की गई थी (0.4-200 nM)। इस तालिका के डेटा बिंदुओं का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण के लिए किया गया था। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका S3: प्रत्येक एकाग्रता बिंदु पर उत्पन्न आई-रिस्पांस मूल्यों का सारांश और प्रत्येक चिप के ट्रांजिस्टर (प्रत्येक चिप के लिए तीन अलग-अलग ट्रांजिस्टर) से पढ़ा जाता है। यह तालिका नियंत्रण प्रयोग से डेटा से मेल खाती है जहां Hsp90 को चिप (500 nM) पर स्थिर किया गया था और BSA विश्लेषक की 10 सांद्रता तैयार की गई थी (0.4-200 nM)। इस तालिका के डेटा बिंदुओं का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण के लिए किया गया था। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, एचएसपी 90 और सीडीसी 37 के बीच बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन को निर्धारित करने के लिए फेब तकनीक (एक वास्तविक समय गतिज लक्षण वर्णन दृष्टिकोण) का उपयोग करने की व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया था। प्रारंभिक अन्वेषक प्रयोग (पहला प्रयोग) ने सुझाव दिया कि उचित विश्लेषक सांद्रता का चयन करना प्रयोग का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और प्रयोग को केडी मूल्य के ऊपर और नीचे एकाग्रता बिंदुओं को शामिल करके डिज़ाइन किया जाना चाहिए, जो साहित्य में उपलब्ध डेटा के आधार पर भविष्यवाणी की गई थी।

फिर भी, यदि बातचीत के बारे में कोई प्रारंभिक जानकारी नहीं है, तो हम दोनों कम (0.08 एनएम, 0.16 एनएम, 0.4 एनएम, 2 एनएम) और उच्चतर (1,000 एनएम, 2,500 एनएम, 5,000 एनएम) श्रेणियों में एकाग्रता बिंदुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल करके एक प्रारंभिक प्रयोग डिजाइन करने का सुझाव देते हैं। प्रारंभिक प्रयोग के डी मान का एक मोटा अनुमान प्रदान करता है और एकसटीक के डी मान प्राप्त करने के लिए सही एकाग्रता श्रेणियों का उपयोग करके बाद के प्रयोगों की योजना बनाने में सक्षम बनाता है। FEB सिस्टम एक संपादन प्रोटोकॉल फ़ंक्शन प्रदान करता है जिसमें कोई भी प्रयोग के लिए एकाग्रता बिंदुओं की संख्या चुनने के लिए स्वतंत्र है।

हमारे अनुभव से, FEB प्रोटोकॉल में शामिल सबसे महत्वपूर्ण कदम निम्नानुसार हैं। लक्ष्य प्रोटीन और विश्लेषक बफर अंशांकन बफर के रूप में ही होना चाहिए। यहां तक कि एक छोटा सा बफर बेमेल आई-रिस्पांस में उतार-चढ़ाव का कारण बन सकता है और अविश्वसनीय परिणाम दे सकता है। इस प्रकार, हम उचित बफर एक्सचेंज द्वारा रातभर डायलिसिस करने का सुझाव देते हैं। बायोसेंसर चिप पर सावधानीपूर्वक पिपेटिंग जबकि एस्पिरेटिंग या समाधान लागू करना पूरे प्रयोग के दौरान महत्वपूर्ण है। लापरवाह pipetting टूटी ट्रांजिस्टर या मैं प्रतिक्रिया में उतार-चढ़ाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं; पिपेटिंग करते समय, चिप की संवेदनशील सतह को छूने के लिए सुनिश्चित न करें। चिप सक्रियण प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले ईडीसी / सल्फो-एनएचएस समाधान को प्रत्येक उपयोग से पहले ताजा मिलाया जाना चाहिए। एक पुराने मिश्रण का उपयोग करने के परिणामस्वरूप एक गैर-कार्यात्मक चिप हो सकती है। प्रयोग के सभी चक्रों में शामिल सभी पांच दोहराए जाने वाले चरणों (अंशांकन, संघ, पृथक्करण, पुनर्जनन और धोने) के लिए एक ही बफर का उपयोग करना सुनिश्चित करें।

जब क्षेत्र में अच्छी तरह से स्थापित बायोमोलेक्यूलर डिटेक्शन सिस्टम के साथ फेब की तुलना की जाती है, जैसे कि बीएलआई या एसपीआर, हमने पाया कि सभी तीन तरीके समान लाभ साझा करते हैं 43,44,45 जो हैं: वे लेबल-मुक्त सिस्टम हैं, जिन्हें इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए किसी भी महंगे फ्लोरोसेंट रंजक की आवश्यकता नहीं होती है; वे छोटे nM श्रेणियों में भी इंटरैक्शन का पता लगा सकते हैं; चिप्स SPR और FEB दोनों में पुन: प्रयोज्य हैं और उन्हें 10 प्रयोगों तक कुशलतासे पुनर्जीवित और पुन: उपयोग किया जा सकता है, और सभी तीन विधियां वास्तविक समय में गतिज डेटा प्रदान करती हैं, और प्रयोग का समय कम है।

एसपीआर का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रयोग से अधिक व्यापक डेटा प्रदान करता है ताकि कोई केडी, केऑन, केऑफ, स्टोइकोइमेट्री और थर्मोडायनामिक पैरामीटर44 की गणना कर सके। बीएलआई का प्रमुख लाभ एक प्रयोग में कई सांद्रता का परीक्षण करने की क्षमता है। गतिज माप विभिन्न सेंसरों का उपयोग करके आठ सांद्रता तक के लिए एक साथ किया जा सकता है। हालांकि, बीएलआई सेंसर पुन: प्रयोज्य नहीं हैं, इस प्रकार प्रयोग की लागत को बेहद अधिकबनाते हैं।

FEB का मुख्य लाभ इसका स्वचालित, उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ़्टवेयर है जो पूरे प्रयोग के दौरान उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है, और इसका ओपन-हैंड पिपेटिंग प्लेटफ़ॉर्म जो उपयोगकर्ता को प्रत्येक चरण में स्थिर लक्ष्य में विश्लेषक जोड़ने की अनुमति देता है। एक साधारण सॉफ़्टवेयर के साथ संयुक्त यह ओपन-पिपेटिंग दृष्टिकोण FEB को सीखना आसान बनाता है और इसके लिए बहुत कम या यहां तक कि कोई प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, यह आवश्यक है कि उपयोगकर्ता के पास हैंड पिपेटिंग की बुनियादी महारत है, और स्वचालित तरल हैंडलिंग की कमी का मतलब है कि चरण समय की पुनरुत्पादकता पूरी तरह से उपयोगकर्ता पर निर्भर करती है। एकीकृत तरल हैंडलिंग की इसी कमी का मतलब है कि चिप्स और उपकरण एसपीआर या बीएलआई की तुलना में लागत प्रभावी हैं। FEB भी biosensor चिप तैयारी35 में शामिल परिभाषित निर्माण प्रक्रिया के कारण biomolecular बातचीत का पता लगाने में उच्च reproducibility और विश्वसनीयता प्रदर्शित करता है।

अच्छी तरह से स्थापित और मानक आईटीसी डिटेक्शन विधि की तुलना में, FEB पूरे प्रयोग के लिए नैनोमोलर सांद्रता में केवल 50 μL विश्लेषक मात्रा का उपयोग करता है, जिससे प्रोटीन के न्यूक्लिएशन या एकत्रीकरण की संभावना कम हो जाती है। आईटीसी के साथ सबसे बड़ी समस्याओं में से एक हवा के बुलबुले से बचने के लिए लोड होने से पहले प्रोटीन को डीगैस करना है। आईटीसी प्रयोग के दौरान, लगातार सरगर्मी और तीव्र शुद्धिकरण के कारण माप सेल के अंदर बुलबुले विकसित करने का मौका होता है, जो नमूना समाधान को प्रतिकूल रूप से छींटे मार सकता है या नमूना हानि का कारण बन सकताहै। FEB प्रौद्योगिकी मजबूत लक्ष्य स्थिरीकरण रसायन विज्ञान की पेशकश करके, एकत्रीकरण और bubbling को कम करने, स्थिरता बढ़ाने, और आईटीसी द्वारा सामना की जाने वाली एकाग्रता-निर्भर समस्याओं में सुधार करके आईटीसी की इन चुनौतियों को दूर करती है।

FEB उपकरणों का एक संभावित दोष बफर संरचना और एकाग्रता परिवर्तनों के लिए उनकी संवेदनशीलता है, जो बेसलाइन में एक बहाव का कारण बन सकता है जिसे परिणामों की फिटिंग और विश्लेषण के दौरान ठीक किया जाना चाहिए। बायोसेंसर चिप पीएच और नमक के प्रति भी संवेदनशील है, इसलिए विश्लेषक के अंशांकन और माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले बफर पूरे प्रयोग के दौरान समान होने चाहिए। संरक्षक (जैसे, सोडियम एज़ाइड) और हाइड्रोफोबिक अणुओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले रसायन सेंसर को नुकसान पहुंचा सकते हैं और यहां तक कि गैर-विशिष्ट बंधन में वृद्धि का कारण भी बन सकते हैं। इन कमियों को माप चरणों में बफर स्थिरता पर ध्यान देने के साथ कम किया जा सकता है, विश्लेषक स्टॉक से हस्तक्षेप करने वाले यौगिकों के डायलिसिस, और सतह के उचित passivation (उदाहरण के लिए, डिटर्जेंट, प्रोटीन ब्लॉकर्स, या विभिन्न पीईजी अणुओं का उपयोग)।

संक्षेप में, हमने सफलतापूर्वक FEB तकनीक का उपयोग करके Hsp90 / Cdc37 के बीच मजबूत PPI का प्रदर्शन किया और ITC का उपयोग करके उनकी बातचीत को मान्य किया, PPI का पता लगाने के लिए एक अभिनव वैकल्पिक विधि के रूप में FEB का समर्थन करने के लिए प्रोत्साहित डेटा प्रदान किया। FEB प्रौद्योगिकी दवा की खोज, फार्मास्यूटिकल्स, छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, और प्रोटीन के biomolecular विश्लेषण, एंटीबॉडी विकास, दवा सत्यापन, और विवो प्रभावकारिता में आसानी से इन विट्रो जैविक गतिविधि में अनुवाद करके हमारी उंगलियों पर लीड अनुकूलन के विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है। पीपीआई, प्रोटीन, और डीएनए या आरएनए इंटरैक्शन की खोज में फेब प्रौद्योगिकी और इसके विशाल अनुप्रयोगों के फायदों को ध्यान में रखते हुए, साथ ही प्रोटीन और छोटे अणु (जैसे, दवा) इंटरैक्शन, हम प्रस्ताव करते हैं कि यह पीपीआई डिटेक्शन टूलबॉक्स में एक अद्वितीय, आशाजनक तकनीक है। हमारे उदाहरण में, FEB तकनीक Hsp90 / Cdc37 PPI उम्मीदवार विरोधी की बाध्यकारी प्रभावकारिता का आसानी से आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करती है, जो तब आगे इन विट्रो के लिए होनहार उम्मीदवारों का चयन करने में सहायता करती है और विभिन्न बीमारियों से संबंधित विवो मूल्यांकन में सहायता करती है जिसमें यह पीपीआई महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों, वित्तीय या अन्यथा के किसी भी संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को द्विराष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (BSF) से S.K.S. और N.Q. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

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References

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Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

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