Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Field-effect biosensing (FEB) is een labelvrije techniek voor het detecteren van biomoleculaire interacties. Het meet de elektrische stroom door de grafeen biosensor waaraan de bindende doelen worden geïmmobiliseerd. De FEB-technologie werd gebruikt om biomoleculaire interacties tussen Hsp90 en Cdc37 te evalueren en er werd een sterke interactie tussen de twee eiwitten gedetecteerd.

Abstract

Biomoleculaire interacties spelen een veelzijdige rol in tal van cellulaire processen door functioneel relevante biologische gebeurtenissen te reguleren en te coördineren. Biomoleculen zoals eiwitten, koolhydraten, vitamines, vetzuren, nucleïnezuren en enzymen zijn fundamentele bouwstenen van levende wezens; ze verzamelen zich in complexe netwerken in biosystemen om een groot aantal levensgebeurtenissen te synchroniseren. Eiwitten maken meestal gebruik van complexe interactoomnetwerken om hun functies uit te voeren; daarom is het verplicht om dergelijke interacties te evalueren om hun belang in cellen op zowel cellulair als organismeniveau te ontrafelen. Om dit doel te bereiken, introduceren we een snel opkomende technologie, field-effect biosensing (FEB), om specifieke biomoleculaire interacties te bepalen. FEB is een benchtop, labelvrije en betrouwbare biomoleculaire detectietechniek om specifieke interacties te bepalen en maakt gebruik van hoogwaardige elektronische biosensoren. De FEB-technologie kan interacties in het nanomolaire bereik volgen vanwege de biocompatibele nanomaterialen die op het biosensoroppervlak worden gebruikt. Als proof of concept werd de eiwit-eiwitinteractie (PPI) tussen heat shock protein 90 (Hsp90) en celdelingscyclus 37 (Cdc37) opgehelderd. Hsp90 is een ATP-afhankelijke moleculaire chaperonne die een essentiële rol speelt bij het vouwen, stabiliteit, rijping en kwaliteitscontrole van veel eiwitten, waardoor meerdere vitale cellulaire functies worden gereguleerd. Cdc37 wordt beschouwd als een eiwitkinase-specifieke moleculaire chaperonne, omdat het specifiek eiwitkinasen voor Hsp90 herkent en rekruteert om hun stroomafwaartse signaaltransductieroutes te reguleren. Als zodanig wordt Cdc37 beschouwd als een co-chaperonne van Hsp90. De chaperonnekinaseroute (Hsp90/Cdc37-complex) is hypergeactiveerd bij meerdere maligniteiten die cellulaire groei bevorderen; daarom is het een potentieel doelwit voor kankertherapie. De huidige studie toont de efficiëntie van feb-technologie met behulp van het Hsp90/Cdc37-modelsysteem. FEB detecteerde een sterke PPI tussen de twee eiwitten (KD-waarden van 0,014 μM, 0,053 μM en 0,072 μM in drie onafhankelijke experimenten). Kortom, het VBO is een labelvrij en kosteneffectief PPI-detectieplatform, dat snelle en nauwkeurige metingen biedt.

Introduction

Biomoleculaire interacties:
Eiwitten zijn essentiële onderdelen van organismen en nemen deel aan tal van moleculaire routes zoals celmetabolisme, celstructuur, celsignalering, immuunresponsen, celadhesie en meer. Hoewel sommige eiwitten hun functie(s) onafhankelijk uitvoeren, interageren de meeste eiwitten met andere eiwitten met behulp van een bindende interface om de juiste biologische activiteit te coördineren1.

Biomoleculaire interacties kunnen voornamelijk worden geclassificeerd op basis van de verschillende structurele en functionele kenmerken van betrokken eiwitten2, bijvoorbeeld op basis van de eiwitoppervlakken, de complexe stabiliteit of de persistentie van interacties3. Het identificeren van essentiële eiwitten en hun rol in biomoleculaire interacties is van vitaal belang voor het begrijpen van biochemische mechanismen op moleculair niveau4. Momenteel zijn er verschillende benaderingen om deze interacties5 te detecteren: in vitro6, in silico7, in levende cellen8, ex vivo9 en in vivo10 met elk zijn eigen sterke en zwakke punten.

De in vivo assays worden uitgevoerd met behulp van het hele dier als een experimenteel hulpmiddel11, ende ex vivo assays worden uitgevoerd op weefselextracten of hele organen (bijv. Hart, hersenen, lever) in een gecontroleerde externe omgeving door minimale veranderingen in natuurlijke omstandigheden te bieden. De meest voorkomende toepassing van in vivo en ex vivo studies is het evalueren van de farmacokinetiek, farmacodynamiek en toxiciteitseffecten van potentiële farmacologische agentia vóór proeven bij mensen door hun algehele veiligheid en werkzaamheid te waarborgen12.

Biomoleculaire interacties kunnen ook worden gedetecteerd in levende cellen. Beeldvorming van levende cellen stelt ons in staat om dynamische interacties te observeren terwijl ze de reacties van een bepaalde biochemische route uitvoeren13. Bovendien kunnen detectietechnieken, zoals bioluminescentie of fluorescentieresonantie-energieoverdracht, informatie geven over waar en wanneer deze interacties plaatsvinden in de cel14. Hoewel detectie in levende cellen cruciale details biedt, vertrouwen deze detectiemethoden op optica en labels, die mogelijk niet de inheemse biologie weerspiegelen; ze zijn ook minder gecontroleerd dan in vitro methoden en vereisen gespecialiseerde expertise om15 uit te voeren.

De in silico computationele methoden worden voornamelijk gebruikt voor grootschalige screening van doelmoleculen vóór de in vitro experimenten. Computationele voorspellingsmethoden, computergebaseerde databases, moleculaire docking, kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties en andere moleculaire dynamica-simulatiebenaderingen behoren tot de gevestigde in silico-tools 16. In vergelijking met moeizame experimentele technieken kunnen de in silico-tools gemakkelijk voorspellingen doen met een hoge gevoeligheid, maar met verminderde nauwkeurigheid in voorspellende prestaties17.

In vitro assays worden uitgevoerd met micro-organismen of biologische moleculen buiten hun standaard biologische context. Het weergeven van biomoleculaire interacties door middel van in vitro methoden is van cruciaal belang voor het begrijpen van eiwitfuncties en de biologie achter het complexe netwerk van celfuncties. De voorkeurstestmethodologie wordt gekozen op basis van de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, kinetische waarden en de wijze en intensiteit van interacties18,19.

De interactie Hsp90/Cdc37:
De chaperonne-kinaseroute, die Hsp90 en Cdc37 verbindt, is een veelbelovend therapeutisch doelwit in de tumorbiologie20. Hsp90 speelt een centrale rol in de controle van de celcyclus, eiwitassemblage, celoverleving en signaalroutes. Eiwitten die afhankelijk zijn van Hsp90 voor hun functies worden geleverd aan Hsp90 voor complexatie via een co-chaperonne, zoals Cdc37. Het Hsp90/Cdc37-complex regelt de vouwing van de meeste eiwitkinasen en dient als hub voor een groot aantal intracellulaire signaleringsnetwerken21. Het is een veelbelovend antitumordoel vanwege de verhoogde expressie in verschillende maligniteiten, waaronder acute myeloblastische leukemie, multipel myeloom en hepatocellulair carcinoom22,23.

Veelgebruikte in vitro biomoleculaire interactie detectietechnieken
Co-immunoprecipitatie (co-IP) is een techniek die vertrouwt op antigeen-antilichaamspecificiteit om biologisch relevante interacties te identificeren24. Het belangrijkste nadeel van deze methode is het onvermogen om interacties met lage affiniteit en kinetische waarden te detecteren24. Biofysische methoden zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en FEB-technologie hebben de voorkeur om de kinetische waarden te bepalen.

ITC is een biofysische detectiemethode gebaseerd op de bepaling van bindingsenergie samen met een volledige thermodynamica-analyse om biomoleculaire interacties te karakteriseren25. Het belangrijkste voordeel van ITC is dat het geen etikettering of fixatie van het doeleiwit vereist. De belangrijkste problemen die ITC ondervindt, zijn de hoge concentratie doeleiwit die nodig is voor één experiment en de moeilijkheid om niet-covalente complexen te analyseren als gevolg van kleine bindende enthalpies26. Zowel SPR als BLI zijn labelvrije biofysische technieken die afhankelijk zijn van de immobilisatie van het doelmolecuul op het sensoroppervlak, gevolgd door daaropvolgende injecties van de analyt over het geïmmobiliseerde doel27,28. In SPR worden veranderingen in de brekingsindex tijdens biomoleculaire interacties gemeten27; in BLI wordt de interferentie in gereflecteerd licht in real-time geregistreerd als een verandering in golflengte als functie van tijd28. Zowel SPR als BLI delen gemeenschappelijke voordelen van het aanbieden van hoge specificiteit, gevoeligheid en detectiemogelijkheden29. In beide methoden wordt het doeleiwit geïmmobiliseerd op biosensoroppervlakken en daarom kan er enig verlies zijn van de oorspronkelijke conformatie van het doelwit, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen specifieke versus niet-specifieke interacties30. BLI gebruikt dure wegwerpbare glasvezelbiosensoren om het doelwit te immobiliseren en is daarom een kostbare techniek31. In vergelijking met deze gevestigde biomoleculaire detectietools biedt FEB-technologie een betrouwbaar en labelvrij platform door lage nanomolelarconcentraties te gebruiken voor biomoleculaire detectie in realtime met kinetische karakterisering. De FEB-technologie overwint ook de borrelende uitdagingen in ITC en is kosteneffectiever in vergelijking met SPR of BLI.

De op veldeffecttransistor (FET) gebaseerde biosensoren is een opkomend veld voor het detecteren van biomoleculaire interacties door gevarieerde biomedische toepassingen aan te bieden. In het FET-systeem worden doelen geïmmobiliseerd naar de biosensorchips en interacties worden gedetecteerd door veranderingen in geleiding32. Het unieke kenmerk waarmee rekening moet worden gehouden bij de ontwikkeling van een efficiënte elektronische biosensor zijn de fysisch-chemische eigenschappen zoals de semi-geleidende aard en chemische stabiliteit van het coatingmateriaal dat wordt gebruikt om het sensoroppervlak te fabriceren33. Conventionele materialen zoals silicium die voor FET worden gebruikt, hebben de gevoeligheid van sensoren beperkt omdat het oxidelagen vereist die ingeklemd zitten tussen het transistorkanaal en een specifieke omgeving voor een goede werking34. Bovendien zijn siliciumtransistors gevoelig voor zoutrijke omgevingen, waardoor het moeilijk is om biologische interacties in hun natuurlijke omgeving te meten. De op grafeen gebaseerde biosensor wordt gepresenteerd als een alternatief omdat het een uitstekende chemische stabiliteit en elektrisch veld biedt. Aangezien grafeen een enkele atomaire laag koolstof is, is het zowel extreem gevoelig als een halfgeleider en chemisch compatibel met biologische oplossingen; beide kwaliteiten zijn wenselijk om compatibele elektronische biosensoren te genereren35. Het opmerkelijke ultrahoge laadpotentieel van biomoleculen dat wordt geboden door biosensoren met grafeencoating, leidt tot de ontwikkeling van op grafeen gebaseerde biosensoren FEB-technologie.

Principe van FEB-technologie: FEB is een labelvrije biomoleculaire detectietechniek die de elektrische stroom meet door de grafeenbiosensor waaraan de bindingsdoelen worden geïmmobiliseerd. Interacties tussen het geïmmobiliseerde eiwit en de analyt resulteren in veranderingen in de stroom die in realtime worden gemonitord, waardoor nauwkeurige kinetische metingenmogelijk zijn 36.

Instrumentatie: Het FEB-systeem bestaat uit een grafeenveldeffecttransistor (gFET) sensorchip en een elektronische lezer die gedurende het hele experiment een constante spanning toepast (figuur 1). De analyt wordt in oplossing aangebracht op het doeleiwit dat op het biosensoroppervlak is geïmmobiliseerd. Wanneer een interactie optreedt, wordt een verandering in de stroom gemeten en in realtime geregistreerd. Naarmate de analytconcentratie toeneemt, zal ook de fractie van gebonden analyt toenemen, waardoor hogere wisselingen in de stroom ontstaan. Met behulp van de geautomatiseerde analysesoftware die bij het instrument wordt geleverd (Tabel van materialen), wordt I-Respons gemeten en geregistreerd in termen van biosensing units (BU)37. I-Respons wordt gedefinieerd als de verandering in de stroom (I) door de biosensorchip gemeten in real-time bij de interactie van het geïmmobiliseerde doelwit met de analyt. De geautomatiseerde analysesoftware van het VBO kan zowel de I-Respons als de C-Respons op dynamische interactiegebeurtenissen analyseren, waarbij de C-Respons de veranderingen in de capaciteit (C) registreert. De variaties in zowel de I-Respons als de C-Respons komen direct overeen met de fractie van gebonden analyt en kunnen verder worden geanalyseerd om KD-waarden te genereren. De standaardvoorkeur van de geautomatiseerde analysesoftware is I-Response.

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van de experimentele opstelling. (A) Op grafeen gebaseerde chip en een elektronische lezer. (B) Een overzicht van de chipcomponenten. De chip is bevestigd aan twee elektroden die stroom leveren aan het systeem. Het oppervlak van de chip is bedekt met grafeen, dat bij activering het doelwit kan binden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Methodologie:
In eerste instantie wordt de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat ingebracht (figuur 1), gevolgd door de uitvoering van de onderstaande stappen: (1) Kalibratie: Het experiment begint met systeemkalibratie met behulp van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; pH = 7,4) om de basislijn equilibratierespons te creëren. (2) Associatie: De analyt wordt in de chip geïntroduceerd en de I-respons wordt gemonitord totdat de bindingsverzadiging is bereikt. (3) Dissociatie: De analyt wordt gedissocieerd met behulp van 1x PBS. (4) Regeneratie: Restanten van de analyt worden verwijderd met behulp van 1x PBS. (5) Wassen: In totaal worden vijf wasbeurten uitgevoerd met behulp van 1x PBS voor het grondig verwijderen van de gebonden en ongebonden analyten uit de chip.

Analyse:
Data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van de volledig geautomatiseerde software die bij het instrument wordt geleverd. De geautomatiseerde analysesoftware genereert een Hill fit plot met eenKD-waarde . De Hill fit plot beschrijft de associatie van een analyt met het doeleiwit als functie van analytconcentraties. De concentratie waarbij een half-maximale respons wordt bereikt, is evenredig met de KD-waarde . Een lageKD-waarde vertegenwoordigt een hoge bindingsaffiniteit en vice versa.

Om de gegevens verkregen uit het VBO-experiment te valideren, worden I-responsen geëxtraheerd uit elk uitleespunt voor elke analytconcentratie met behulp van de data review/export software en kunnen ze worden geëxporteerd naar andere statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen) zoals hieronder uitgelegd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De recombinante eiwitten die in deze studie werden gebruikt, Hsp90 en Cdc37, werden commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).

1. Chip activering

OPMERKING: Alle materialen die in het experiment moeten worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen. Filtreer alle bereide oplossingen door een steriel filter van 0,2 μm.

  1. Bereid 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC) oplossing door 2 mg EDC toe te voegen aan 2,5 ml 1 M 2-(N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) buffer (pH = 6,0) in een buis van 15 ml. Bereid N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)-oplossingen door 6 mg sulfo-NHS toe te voegen aan 2,5 ml MES-buffer van 1 M (pH = 6,0) in een afzonderlijke buis van 15 ml. Vul 50 μL van elke oplossing in onafhankelijke buizen en bewaar bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
  2. Meng gelijke volumes EDC-zandsulfosfo-NHS-oplossing (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) door op en neer te pipetteren (geen vortex gebruiken).
    OPMERKING: De gemengde oplossing van EDC/sulfo-NHS moet binnen 30 minuten worden gebruikt om effectieve cross-linking te behouden voor een goede chipfunctionalisatie.
  3. Plaats de door het bedrijf geleverde biosensorchip (5,7 cm x 2,4 cm; zie Materialentabel) in een glazen petrischaaltje met deksel. Alle functionalisatiestappen die betrokken zijn bij chipactivering worden voorgesteld om in de petrischaal te worden uitgevoerd. Breng 50 μL van 1 M MES-buffer (pH = 6,0) aan op de biosensorchip, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en zuig vervolgens de buffer op.
  4. Breng onmiddellijk 50 μL EDC/sulfo-NHS-oplossing aan op de sensorchip. Dek de petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig EDC/sulfo-NHS-oplossing uit de chip.
  5. Spoel de chip eenmaal af met 50 μL van 1 M MES-buffer (pH = 6,0); de MES-buffer opzuigen.

2. Doel eiwit immobilisatie

  1. Spoel de chip 2x af met 50 μL van 1x PBS (pH = 7,4). Zuig de PBS uit de chip en voeg het doelmolecuul Hsp90 (50 μL; 500 nM) toe.
    OPMERKING: Buffermismatch kan het hele experiment verpesten; daarom is het belangrijk om vóór het experiment ervoor te zorgen dat het doelmolecuul zich in dezelfde buffer bevindt als die welke wordt gebruikt voor kalibratie (bijv. 1x PBS (pH = 7,4)). Voer indien nodig een bufferuitwisseling uit door nachtelijke dialyse vóór het experiment. In dit experiment werd nachtelijke dialyse uitgevoerd voor beide recombinante eiwitten, Hsp90 en Cdc37, tegen 1x PBS (pH = 7,4; zie Tabel met materialen) met een goede bufferuitwisseling bij 4 °C. De concentratie van het doelmateriaal (Hsp90 in dit geval) kan variëren afhankelijk van verschillende experimentele protocollen en de aard van doelmaterialen (eiwit/peptide/liganden).
  2. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de oplossing met het doelmolecuul op en spoel 3x met 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Zuig de 1x PBS (pH = 7,4) oplossing uit de chip.
  3. Voeg 50 μL Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol in 1x PBS (pH = 7,4)) oplossing toe aan de chip. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de Quench 1-oplossing uit de chip.
  4. Voeg 50 μL Quench 2 (1 M ethanolamine (pH = 8,5)) oplossing toe aan de chip. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig Quench 2-oplossing uit de chip en spoel de chip 5x met 50 μL 1x PBS, waarbij de laatste PBS-druppel op de sensor achterblijft.

3. Voorbereiding van analytmonsters

  1. Bereid analytverdunningsreeksen voor Cdc37 voor in het gewenste concentratiebereik. Voor het eerste experiment werden de volgende concentraties gebruikt: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM en 5.000 nM. Voor het tweede experiment werd een andere set concentraties gebruikt, variërend van 0,4 nM tot 200 nM.
  2. Ontwerp het experiment om ten minste acht verschillende analytconcentraties op te nemen om een betrouwbare KD-waarde te verkrijgen. bereid de verschillende verdunningen van het analyte-eiwit in dezelfde buffer als die welke wordt gebruikt voor kalibratie en doeleiwit; hier is het 1x PBS (pH = 7,4).

4. Laden van de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat

OPMERKING: Het FEB-apparaat bestaat uit een lezer met LED-lichtindicaties en een cartridge om de biosensorchip in te brengen.

  1. Na doeleiwitimmobilisatie plaatst u de geactiveerde chip in de cartridge van het apparaat, die via USB op een computer is aangesloten. Na het inbrengen van de chip wordt een groen LED-lampje op de lezer weergegeven dat aangeeft dat het FEB-apparaat klaar is voor het experiment. Installeer de geautomatiseerde software (zie Materiaaltabel) die door het bedrijf wordt geleverd op de computer waarop het FEB-apparaat is aangesloten, om het experiment stap voor stap te volgen zoals hieronder beschreven.

5. Voer het experiment uit

  1. Druk op de module Experiment uitvoeren op de geautomatiseerde software en kies 10 punten met regeneratie of een ander gewenst protocol. Vul de volgende gegevens in: naam van de operator, naam van het experiment, datum (bijv. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); regeneratiebuffer (bijv. PBS-buffer); geïmmobiliseerd doel (bijv. Hsp90); analyt in oplossing (bijv. Cdc37). Zie aanvullende figuur S1 voor nadere bijzonderheden.
  2. Druk op de knop Experiment starten die in de software wordt weergegeven en volg de instructies die door de geautomatiseerde software worden weergegeven zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De software is volledig geautomatiseerd, gebruiksvriendelijk en begeleidt de gebruiker stap voor stap tijdens het experiment. Er verschijnt een pop-upvenster op het scherm met instructies om verder te gaan bij elke stap van het experiment. De software geeft instructies voor elke repetitieve stap achtereenvolgens van kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en wassen (5x) voor elke analytconcentratie gedurende het experiment.
  3. Voer instrumentkalibratie uit. Zuig hiervoor de resterende PBS-oplossing uit de chip en breng 50 μL kalibratiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de kalibratiestap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer dat is bepaald voor de kalibratiestap (5 min) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.
  4. Voer vervolgens een analytassociatie uit. Om dit te doen, zuigt u de kalibratiebuffer uit de chip en past u 50 μL van de laagste analytconcentratie (25 nM Cdc37) toe. Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de koppelingsstap is voltooid. De software toont het eindpunt voor de koppelingsstap (5 min) met een waarschuwingsalarm om door te gaan.
  5. Voer een analytdissociatie uit. Om dit te doen, zuigt u de analytoplossing uit de chip en brengt u 50 μL van de dissociatiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de duur van de dissociatiestap (5 min) is voltooid. De software toont het eindpunt voor de dissociatiestap (5 min) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.
  6. Voer vervolgens chipregeneratie uit. Zuig de dissociatieoplossing van de chip aan en breng 50 μL regeneratiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 30 s totdat de duur van de regeneratiestap (30 s) is voltooid. De software toont het eindpunt voor de regeneratiestap (30 s) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.
  7. Was ten slotte de chip. Zuig de regeneratieoplossing uit de chip en breng 50 μL wasbuffer (1x PBS; pH = 7,4) aan op de chip. Zuig de oplossing uit de chip en herhaal dit 5x. Laat de laatste druppel wasbuffer op de chip zitten en druk op de knop Doorgaan en wacht 30 s totdat de duur van de wasstap is voltooid in het softwaredisplay.
    OPMERKING: De software geeft het eindpunt voor de wasstap (30 s) weer met een waarschuwingsalarm om door te gaan met de volgende cyclus van het experiment.
  8. Herhaal de stappen voor elke gebruikte analytconcentratie; de vijf stappen van kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en wassen (5x) vormen één cyclus. Voor het hier getoonde experiment voerden we 10 cycli uit voor 10 analytconcentraties (variërend van 25 nM tot 5.000 nM of 0,4 nM tot 200 nM; Figuur 2).

6. Analyse

  1. Druk op de knop Analyse boven aan de geautomatiseerde analysesoftware aan het einde van het experiment. Er verschijnt een weergavevenster met alle experimentele punten. Controleer in het venster of de analytconcentraties die voor het voorgeschreven protocol worden gebruikt, correct zijn.
  2. Druk op de knop Analyse uitvoeren om deKD-waarde automatisch te genereren. De software genereert een Hill fit plot door de analytconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige I-Responsen waaruit de dissociatieconstante bij evenwicht, KD-waarde , wordt berekend.
  3. Exporteer de onbewerkte gegevens voor analyse in andere statistische analysesoftware met behulp van de gegevensbeoordelings- / exportsoftware zoals hieronder beschreven.
    1. Kopieer het R1R-bestand dat automatisch aan het einde van het experiment is gemaakt (bijvoorbeeld Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) naar een nieuwe map op het bureaublad. Open de door het bedrijf geleverde software voor gegevensbeoordeling/-export (zie aanvullende figuur S2A).
    2. Klik op Gegevensverwerking > R1R-bestanden verwerken > OK op het startscherm van de software voor gegevensbeoordeling / -export.
    3. Selecteer de map met R1R-bestanden die in stap 6.3.1 op het bureaublad zijn gemaakt. en druk op de knop OK . Hiermee wordt een kopie van de oorspronkelijke R1R-gegevens gemaakt om de gegevens te bekijken en te bewerken zonder het oorspronkelijke bestand te overschrijven.
    4. Druk op het pictogram voor gegevensverwerking dat te zien is op het startscherm van de software voor gegevensbeoordeling/-export. Druk op Load Processed R1R Files > OK. Selecteer dezelfde map die is gemaakt in stap 6.3.1 met verwerkte R1R-bestanden. Druk op OK. Bij deze stap is de map met de experimentbestanden klaar om te worden gecontroleerd.
    5. Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer Kalibratie > bewerkte R1R-bestanden kalibreren > OK (zie Aanvullende figuur S2B). Deze stap kalibreert alle gegevenspunten volgens de eerste kalibratiestap om een basislijn te maken.
    6. Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer R1R-bestanden controleren en bewerken > OK. Controleer de gegevenspunten, verwijder punten of voeg stappen toe met de knop Verwijderen/Stap toevoegen . Zorg ervoor dat alle stappen zich op de juiste plaats bevinden, bijvoorbeeld de kalibratiestap bevindt zich op de basislijn, de koppelingsstap bevindt zich op de piek (zie Aanvullende afbeelding S3) en druk vervolgens op de knop Opslaan om alle aangebrachte wijzigingen op te slaan.
    7. Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer Gegevens analyseren/plotten, kies de stappen die u wilt exporteren (zie Aanvullende afbeelding S4). Voeg elke koppelingsstap (bijvoorbeeld stap 2, stap 7, enzovoort) toe nadat u de kalibratiestap (bijvoorbeeld stap 1, stap 6, enzovoort) hebt afgetrokken van de exportlijst voordat u de gegevens exporteert.
    8. Druk op Deze gegevens exporteren. De software genereert een spreadsheetbestand met de I-respons voor elk analytconcentratiegegevenspunt van elke transistor (als alle transistors werken, hebben we drie verschillende I-responswaarden voor elk concentratiepunt). Gebruik dit spreadsheetbestand om de gegevens in de statistische software verder te analyseren.
  4. Open de statistische analysesoftware. Maak een XY-tabel met drie Y-waarden; druk op Maken. De gegevens voor deze tabel (X-, Y-waarden) worden gekopieerd uit het spreadsheetbestand dat is gemaakt in stap 6.3.8. De x-as komt overeen met de analytconcentratie (afhankelijk van de gebruikte concentratie) en de drie Y-waarden komen overeen met de I-responsen, verkregen uit de door het bedrijf geleverde Data Review/Export-software .
  5. Druk op Deze gegevens analyseren. Kies XY-analyses > niet-lineaire regressie (curve fit) > bindingsverzadiging > één site > totaal. De software analyseert automatisch de gegevens, genereert de KD-waarde en maakt een grafiek van de gegevenspunten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten van experiment 1:
Het doeleiwit Hsp90 (500 nM) werd geïmmobiliseerd naar de chip volgens het doelimmobilisatieprotocol zoals hierboven beschreven. Voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nM tot 5.000 nM, bereid op basis van de beschikbare gegevens in de literatuur (zie tabel 1).

De stappen van het experiment kunnen in realtime worden gevolgd door de veranderingen in de I-respons te volgen (figuur 3A). Men kan visualiseren hoe elke stap in het protocol de I-Respons gedurende het hele experiment beïnvloedt. De I-respons is bijvoorbeeld bijna nul tijdens de kalibratie en in de associatiestap neemt de I-respons geleidelijk toe met toenemende analytconcentraties (Cdc37). Kijkend naar de gegevens van dit experiment (figuur 3A), werd een plotselinge toename van de I-respons waargenomen in lage analytconcentraties (50 BU bij 25 nM). Bij een lage analytconcentratie werd een lage I-respons verwacht die geleidelijk zal toenemen met toenemende concentraties. Deze plotselinge toename suggereerde dat een experiment met lagere analytconcentratiepunten moest worden ontworpen.

Volgens de hierboven besproken protocolstappen werden de gegevens geanalyseerd in de meegeleverde geautomatiseerde analysesoftware, die automatisch een Hill fit-plot genereerde met een berekende KD-waarde (figuur 3B). De KD-waarde berekend uit de geautomatiseerde analysesoftware voor het eerste experiment was 350.000 ± 76.000 μM. De meeste van de gemeenschappelijke biologische interacties vertoonden een KD-waarde in het lage μM- of zelfs in het nM-bereik; deKD-waarde die voor het eerste experiment wordt gegenereerd, is dus erg hoog.

Er kunnen verschillende verklaringen zijn voor de waargenomen hoge KD-waarde : er kan een lage affiniteitsbinding zijn tussen de twee onderzochte specifieke eiwitten (Hsp90/Cdc37), wat betekent dat een hoge ligandconcentratie vereist is voor de moleculaire interacties; het experiment kan zijn ontworpen met niet-ideale analytconcentraties buiten bereik; de hoge waarde kan te wijten zijn aan de ingebouwde parameters die worden gebruikt in de montagemodule van de analysesoftware. De geautomatiseerde analysesoftware maakt gebruik van een dosis-respons analysemodule om de gegevenspunten te passen, maar sommige interacties passen mogelijk niet goed in dit model, waardoor valse gegevens worden verkregen, wat resulteert in hoge KD-waarden .

Om een nauwkeurige KD-waarde te verkrijgen met een verzadigde Hill-plot, is standaardisatie van het experiment met vallen en opstaan vereist, die zowel lagere als hogere analytconcentratiepunten omvat, om de laagste KD-waarde met een laag foutenpercentage te verkrijgen.

Rekening houdend met al deze factoren werden de gegevens van analysesoftware geëxporteerd naar aanvullende statistische analysesoftware. De I-respons voor elk associatiepunt is geëxtraheerd met behulp van de geautomatiseerde software voor gegevensbeoordeling/-export en wordt samengevat in tabel 2 door de stappen te volgen die hierboven in de analysestap (stap 6) zijn besproken.

De statistische analysesoftwareresultaten (figuur 3C) toonden een relatief lage KD-waarde met een hoge standaarddeviatie (0,011 ± 0,494 μM) en een lage R2-waarde van 0,78. De significante variatie die werd waargenomen in de KD-waarde en de lage R2-waarde suggereerde dat de voor dit experiment gekozen concentratiepunten niet optimaal zijn. Daarnaast viel ook op dat sommige grafiekpunten niet goed pasten bij de plottrendlijn (figuur 3C); dit versterkte de noodzaak om een tweede experiment te ontwerpen door verschillende analytconcentratiepunten op te nemen.

De ingebouwde parameters die door de twee analysesoftware worden gebruikt, zijn volledig verschillend en worden weerspiegeld in het proces voor het genererenvan K D-waarden . De verschillen in de KD-waarden verkregen uit de twee analysesoftware (350.000 ± 76.000 μM versus 0,011 ± 0,494 μM) kunnen worden toegeschreven aan het feit dat verschillende analysemodules werden gebruikt voor de berekening. De analyse die wordt uitgevoerd in de statistische analysesoftware past mogelijk beter bij deze interactie, waardoor een lagere KD-waarde ontstaat.

Als de resultaten van beide analyses echter worden gecombineerd (350.000 ± 76.000 μM en 0,011 ± 0,494 μM), kan worden geconcludeerd dat het eerste experiment niet optimaal was en dat extra concentratiepunten nodig zouden zijn.

Om dit punt te valideren, werd het niet-gecorreleerde grafiekpunt, 3.000 nM, uitgesloten (zie aanvullende figuur S5). De resultaten van de analyse toonden een KD-waarde van 0,006 ± 0,081 μM met een R2-waarde van 0,98. Deze resultaten gaven aan dat het volgende experiment zou moeten worden ontworpen gericht op meer relevante concentraties. Daarom werd een tweede experiment uitgevoerd om Hsp90/Cdc37 PPI te evalueren met behulp van verschillende testpunten met concentraties onder en boven de voorspelde KD.

Resultaten van experiment 2:
Het doeleiwit, Hsp90 (500 nM) werd geïmmobiliseerd naar de chip met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven. In totaal werden 10 concentraties van de analyt (Cdc37) als volgt bereid: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM en 200 nM. Het tweede experiment is ontworpen door verschillende analytconcentratiepunten op te nemen, door rekening te houden met alle inzichten die zijn opgedaan uit het vorige experiment zoals hierboven vermeld.

Tijdens het experiment werd elke stap in realtime gemonitord (figuur 4A). Hier begint de real-time I-Response-grafiek (afgeleid van de lage concentraties van de analyt-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) aanvankelijk vanaf nul en neemt geleidelijk toe bij de toename van analytconcentraties in elke cyclus van het experiment in vergelijking met de plotselinge toename van I-Response waargenomen in het eerste experiment.

Volgens het hierboven genoemde protocol werden de gegevens geanalyseerd met behulp van de geautomatiseerde analysesoftware (figuur 4B). De KD-waarde berekend uit de geautomatiseerde analysesoftware voor dit experiment was 0,0673 ± 0,0002 μM, wat een sterke interactie tussen doeleiwit Hsp90 en analyt Cdc37 suggereerde. De standaarddeviatie van 0,0002 μM was veel kleiner dan die verkregen in het eerste experiment, wat vertrouwen geeft dat de nieuwe gegevens veel betrouwbaarder zijn.

Om dit resultaat te valideren, hebben we de gegevenspunten (tabel 3) geëxporteerd naar een andere statistische analysesoftware zoals eerder uitgelegd; de resultaten van de analyse zijn samengevat in figuur 4C.

Met behulp van de statistische analysesoftware bleek dat de KD-waarde voor Hsp90/Cdc37 PPI 0,014 ± 0,005 μM is (figuur 4C). De lage waarden van KD en standaarddeviatie wijzen op een sterke interactie tussen de twee eiwitten, Hsp90 en Cdc37. Bovendien geeft de R2-waarde van 0,99 aan dat de analyse perfect past bij de experimentele grafiekpunten. Beide analysesoftware toonde consistentie in de resultaten, met lage KD-waarden van respectievelijk ongeveer 0,0673 ± 0,0002 μM en 0,014 ± 0,005 μM.

Om de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van het experiment te bevestigen, werd hetzelfde experiment uitgevoerd in twee replicaties met Hsp90 (500 nM) als doeleiwit en Cdc37 als analyt met dezelfde concentraties variërend van 0,4 nm tot 200 nm als gebruikt in het tweede experiment. Tijdens het experiment werd elke stap in real-time gemonitord (aanvullende figuur S6A en aanvullende figuur S7A). De KD-waarde berekend met de geautomatiseerde analysesoftware is weergegeven in aanvullende figuur S6B en aanvullende figuur S7B (respectievelijk 0,053 ± 0,002 μM en 0,0719 ± 0,0007 μM). Zoals eerder vermeld, werden de gegevenspunten geëxporteerd (aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2) naar een andere statistische analysesoftware, en de resultaten worden weergegeven in aanvullende figuur S6C en aanvullende figuur S7C (aanvullende figuur S6C: KD is 0,003 ± 0,009 μM en R2 is 0,99; Aanvullende figuur S7C: KD is 0,004 ± 0,009 μM en R2 is 0,99). De resultaten van de twee replicaties van zowel de analysesoftware bevestigden goed als bevestigden de nauwkeurigheid, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimentele gegevens van Hsp90 / Cdc37 FEB.

Er werd ook een controlestudie uitgevoerd waarin de biomoleculaire interactie tussen Hsp90 en een controle-eiwit, Bovine serum albumine (BSA), werd opgehelderd. De controlestudie met BSA als analyt werd uitgevoerd met behulp van een identieke experimentele opstelling en analytconcentraties die in het tweede experiment werden gebruikt. Een totaal van 10 concentraties van het controle-eiwit, BSA, variërend van 0,4 nM tot 200 nM werden bereid in 1x PBS (pH = 7,4) en elke stap van het experiment werd in realtime gemonitord.

Net als bij het experiment met Hsp90 en Cdc37 begint de real-time I-Response grafiek in eerste instantie vanaf 0; in de controlestudie nam de I-respons echter niet geleidelijk toe na de toename van de analytconcentraties (aanvullende figuur S8A). De gegevens werden ook geanalyseerd met behulp van de geautomatiseerde analysesoftware (aanvullende figuur S8B) en de software was niet in staat om de KD-waarde te berekenen uit de gegevenspunten van dit experiment. Uit de software gegenereerde Hill Plot blijkt dat er geen interactie is tussen Hsp90 en de BSA-analyt van de besturing. Om dit resultaat te valideren, hebben we de gegevenspunten (aanvullende tabel S3) geëxporteerd naar een andere statistische analysesoftware zoals eerder uitgelegd. Met behulp van de statistische analysesoftware werd vastgesteld dat de KD-waarde voor Hsp90/BSA PPI negatief is (aanvullende figuur S8C; KD is -0,009 ± -0,0003 μM), wat opnieuw aangeeft dat er geen interactie is tussen de twee eiwitten, Hsp90 en BSA. Bovendien geeft de R2-waarde (0,82) aan dat de analyse niet paste bij de experimentele grafiekpunten. Beide analysesoftware toonde consistentie in de resultaten dat Hsp90 en BSA niet op elkaar inwerken.

Bij het vergelijken van Hsp90/Cdc37 FEB experimentele gegevens met andere experimentele gegevens die beschikbaar zijn in de literatuur, bleek dat de KD-waarden verkregen in deze studie (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM, en KD = 0,072 ± 0,001 μM) in twee ordes van grootte lager waren dan eerder gepubliceerde gegevens (KD = 1,46 μM38 of 6 μM39 ). Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van volledige menselijke Hsp90- en Cdc37-constructies in de huidige experimenten. Eerdere studies werden uitgevoerd op gist Hsp90-constructen die slechts gedeeltelijk eiwit38 of C. elegans homologe eiwitten39 bevatten (tabel 1). Om de resultaten verkregen in het FEB-systeem te valideren, werden ITC-experimenten uitgevoerd.

Evaluatie van Hsp90/Cdc37 PPI met behulp van het ITC-systeem:
ITC wordt beschouwd als de gouden standaard om biomoleculaire interacties te onderzoeken. Verder voerden we ITC uit om de thermodynamische kinetiek van de Hsp90/Cdc37 PPI te bepalen, en als validatie voor het FEB-experiment. De Hsp90 en Cdc37 worden onderworpen aan dialyse tegen PBS (pH = 7,0) vóór ITC. Ongeveer 0,25 μM-oplossing van het doeleiwit (Hsp90) en 2,5 μM-oplossing van analyteiwit (Cdc37) werden bereid in PBS voor de calorimetrische titraties. Een totaal volume van 80 μL Cdc37-oplossing met opeenvolgende tussenpozen werd getitreerd van de roterende spuit naar de cel met 150 μL Hsp90-oplossing bij 298,15 K. Elke injectie vond plaats gedurende een duur van 4 s en het tijdsinterval tussen opeenvolgende injecties was 150 s. In totaal werden 19 injecties van elk 2 μL gemaakt met een roersnelheid van respectievelijk 500 tpm en een referentievermogen van 41,9 μW. De warmtevariatie als gevolg van Hsp90/Cdc37-interactie werd gemonitord en de uiteindelijke gegevens verkregen aan het einde van de Cdc37-analytinjecties werden aangebracht met behulp van ITC-analysesoftware die door het bedrijf werd geleverd. De warmtevariaties samen met de thermodynamische parameters zoals molaire enthalpieverandering (ΔH), entropieverandering (ΔS), het aantal bindingsplaatsen (n) en de evenwichtsdissociatieconstante (KD) tussen Hsp90/Cdc37 PPI werden geschat. De Gibbs vrije energieverandering (ΔG) werd ook berekend uit de vergelijking ΔG = ΔH - TΔS na het verkrijgen van thermische parameters uit het ITC-thermogram.

De ITC-plot onthult de hoeveelheid warmte die wordt verbruikt of vrijgemaakt tijdens de biologische interacties om de aard van interacties en intermoleculaire krachten die de PPI 40 beheersen op tehelderen. Cdc37 (2,5 μM) werd getitreerd in Hsp90 (0,25 μM) en de overeenkomstige curven zijn weergegeven in figuur 5A,B. Het verkregen ITC-plot bleek exotherm te zijn en werd ingepast in een enkel bindingsplaatsmodel met een bindingsstoichiometrie (n) van één bindingsenergie, ΔG = -45,9 kJ/mol en KD-waarde = 0,009 μM. De lichte inconsistentie waargenomen in de vorm van een endotherme verschuiving aan het begin van het ITC-thermogram (figuur 5A) suggereert de vorming van bellen tijdens het titreren van het analyte-eiwit naar de meetcel41,42. Onder de Hsp90/Cdc37 PPI, ITC-experimenten uitgevoerd bij lagere en hogere concentraties, vertoonde de 10-voudige overmaat van Cdc37 (Hsp90-concentratie = 0,25 μM en Cdc37-concentratie = 2,5 μM) acceptabele bindingsparameters door een verzadigingscurve te bereiken. De KD-waarde verkregen uit ITC (KD = 0,009 μM) correleerde goed met de KD-waarde berekend met behulp van FEB-technologie (KD = 0,014 μM, 0,053 μM en 0,072 μM), wat de gevoeligheid en nauwkeurigheid van het VBO bij het detecteren van Hsp90/Cdc37 PPI sterk ondersteunt.

Figure 2
Figuur 2: Samenvatting van het protocol. (A) Samenvatting van de stappen voor het activeringsproces van de chip. (B) Grafische weergave van de vijf herhalende stappen in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Gegevensbestanden gegenereerd uit experiment 1. (A) Experimentgegevens worden in realtime bewaakt. De y-as komt overeen met de I-Respons in biosensoreenheden (BU), en de x-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. Dit cijfer komt overeen met de gegevens van het eerste experiment. (B) Hill Fit plot gegenereerd uit de geautomatiseerde analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons, de x-as komt overeen met concentraties van analyt (Cdc37) in nM. Voor dit experiment is de KD-waarde 350.000 ± 76.000 μM. (C) Associatieplot gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons aan het einde van de associatiefase, de x-as komt overeen met de verschillende analyt, Cdc37, concentraties. Dit plot is gegenereerd met behulp van de gegevenspunten in tabel 2. Samenvatting van de analyseresultaten is opgenomen in de grafiek; voor dit experiment is de KD-waarde 0,011 ± 0,494 μM en de R2-waarde 0,78. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Gegevensbestanden gegenereerd uit experiment 2. (A) Experimentgegevens worden in realtime bewaakt. De y-as komt overeen met de I-Respons in biosensoreenheden (BU), en de x-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. Dit cijfer komt overeen met de gegevens van het tweede experiment. (B) Hill Fit plot gegenereerd uit de geautomatiseerde analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons, de x-as komt overeen met de concentratie van analyt (Cdc37) in nM. Voor dit experiment is de KD-waarde 0,0673 ± 0,0002 μM (C) Associatieplot gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons aan het einde van de associatiefase, de x-as komt overeen met de verschillende analyt Cdc37 concentraties. Dit plot is gegenereerd met behulp van de gegevenspunten in tabel 3. Samenvatting van de analyseresultaten is opgenomen in de grafiek; voor dit experiment is de KD-waarde 0,014 ± 0,005 μM en de R2-waarde 0,99. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: ITC-thermogram van Hsp90- en Cdc37-interactie. (A) Het bovenpaneel vertegenwoordigt de overeenkomstige warmte-evoluerende curven die worden verkregen als gevolg van opeenvolgende injecties van Cdc37 (2,5 μM) in Hsp90 (0,25 μM) bij 298,15 K. Het differentieel vermogen (DP) vertegenwoordigt differentieel vermogen als functie van de tijd. (B) De geïntegreerde gegevenspunten in het onderste paneel geven de overeenkomstige genormaliseerde warmte versus de molaire verhouding van Hsp90/Cdc37 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Uitgevoerde assays VBO-analyse KD Prisma analyse KD Oorsprong construeren Aminozuren Verwijzingen
ITC 1,46 μM en 1,32 μM NA Gist Hsp90 N-terminal domein van Hsp90 36
Humane Cdc37
SPR 6 μM NA C. elegans Volledige lengte 37
VBO - Eerste herkansing 0,014 μM 0,067 μM Menselijke Hsp90 Volledige lengte Uitgevoerd in dit onderzoek
Humane Cdc37
VBO - Tweede herhaling 0,053 μM 0,003 μM Menselijke Hsp90 Volledige lengte Uitgevoerd in dit onderzoek
Humane Cdc37
VBO - Derde herhaling 0,072 μM 0,004 μM Menselijke Hsp90 Volledige lengte Uitgevoerd in dit onderzoek
Humane Cdc37
ITC 0,009 μM NA Menselijke Hsp90 Volledige lengte Uitgevoerd in dit onderzoek
Humane Cdc37
VBO- Controlestudie Geen gegevens (er waren onvoldoende gegevens om de KD te berekenen) -0,009 μM (KD-waarde met negatieve waarden geeft aan dat er geen interactie is) Menselijke Hsp90 Volledige lengte Uitgevoerd in dit onderzoek
BSA

Tabel 1: Hsp90/Cdc37 PPI evaluatie met behulp van verschillende methoden gerapporteerd in deze studie en de literatuur.

Analytconcentraties (nM) I-Respons transistor 1 I-Response transistor 2 I-Response transistor 3 Gemiddeld
Reactie van I
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tabel 2: Samenvatting van de I-Respons waarden gegenereerd uit drie verschillende transistors van elke chip op elk concentratiepunt van het eerste experiment.

Analytconcentraties (nM) I-Respons transistor 1 I-Response transistor 2 I-Response transistor 3 Gemiddelde I-respons
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tabel 3: Samenvatting van de I-Response waarden gegenereerd uit drie verschillende transistors van elke chip op elk concentratiepunt van het tweede experiment.

Aanvullende figuur S1: Screenshot van het hoofdscherm van geautomatiseerde software vóór het begin van het experiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Screenshot van het hoofdscherm van geautomatiseerde software voor gegevensverwerking en -analyse. (A) Hoofdschermweergave van software voor gegevensbeoordeling / -export met opties voor gegevensverwerking. (B) De hoofdschermweergave van software voor gegevensbeoordeling/-export met opties voor gegevensanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: De beoordelingsgegevenspunten verkregen uit beoordelings-/exportsoftware. Bekijk in deze stap het experiment en voeg gegevenspunten toe of verwijder deze. Zorg ervoor dat het associatiepunt (2, 7, 12, 17, 22, enzovoort) altijd bij de keuze staat. De eerste keuze van links is bijvoorbeeld gegevenspunt nummer 2 en vervolgens gegevenspunt nummer 10 (maar het moet nummer 7 zijn). Om dit op te lossen, verwijdert u de punten 3, 4 en 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Gegevenslijst exporteren bijvoorbeeld. Kies in deze stap welke experimentpunten moeten worden geëxporteerd. Kies een koppelingspunt (2, 7, 12, 17, 22, enzovoort) en trek de vorige kalibratiestappen (1, 6, 11, 16, 21, enzovoort) af. Voeg alle punten toe aan de exportlijst en exporteer deze gegevens om een spreadsheet met de I-Respons voor elk gegevenspunt te krijgen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S5: Associatieplot gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons aan het einde van de associatiefase, de x-as komt overeen met de verschillende analyt Cdc37 concentraties. Deze plot werd gegenereerd met behulp van de gegevenspunten uit het eerste experiment en sloot het 3.000 nM-concentratiegegevenspunt uit. Samenvatting van de analyseresultaten is opgenomen in de grafiek; voor dit experiment is de KD-waarde 0,006 ± 0,081 μM en de R2-waarde 0,98. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S6: Gegevensbestanden gegenereerd uit experiment 2 repliceren 1. (A) Experimentele gegevens die in realtime worden gemonitord. De y-as komt overeen met de I-Respons in biosensoreenheden (BU), en de x-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. Dit cijfer komt overeen met de gegevens van de tweede herhaling uitgevoerd in het tweede experiment waarbij Hsp90 werd geïmmobiliseerd op de chip (500 nM) en 10 concentraties Cdc37-analyt werden bereid (0,4-200 nM). De real-time I-Response-grafiek begint aanvankelijk vanaf 0 en neemt geleidelijk toe bij de toename van de analytconcentraties bij elke cyclus van het experiment, wat suggereert dat het experiment succesvol is. (B) Hill Fit plot gegenereerd uit de geautomatiseerde analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons, de x-as komt overeen met concentraties van analyt (Cdc37) in nM. De resultaten van de geautomatiseerde analyse toonden een relatief lage KD-waarde en een lage standaarddeviatie van 0,0531 ± 0,0002 μM, wat wijst op een sterke interactie tussen Hsp90 en Cdc37. (C) De associatieplot gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons aan het einde van de associatiefase, de x-as komt overeen met de verschillende analyt Cdc37 concentraties. Dit plot is gegenereerd met behulp van de gegevenspunten in tabel S1. Samenvatting van de analyseresultaten is opgenomen in de grafiek; voor dit experiment is de KD-waarde 0,003 ± 0,009 μM en de R2-waarde 0,99. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S7: Gegevensbestanden gegenereerd uit experiment 2 repliceren 1. (A) Experimentele gegevens die in realtime worden gemonitord. De y-as komt overeen met de I-Respons in biosensoreenheden (BU), en de x-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. Dit cijfer komt overeen met de gegevens van de derde herhaling in het tweede experiment waarbij Hsp90 werd geïmmobiliseerd op de chip (500 nM) en 10 concentraties Cdc37-analyt werden bereid (0,4-200 nM). (B) Hill Fit plot gegenereerd uit de geautomatiseerde analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons, de x-as komt overeen met concentraties van analyt (Cdc37) in nM. De resultaten van de geautomatiseerde analyse toonden een relatief lage KD-waarde en een lage standaarddeviatie van 0,0719 ± 0,0007 μM, wat wijst op een sterke interactie tussen Hsp90 en Cdc37. (C) Associatieplot gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons aan het einde van de associatiefase. De x-as komt overeen met de verschillende analyt Cdc37 concentraties. Dit plot is gegenereerd met behulp van de gegevenspunten in tabel S2. Samenvatting van de analyseresultaten is opgenomen in de grafiek; voor dit experiment is de KD-waarde 0,004 ± 0,009 μM en de R2-waarde 0,99. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S8: Gegevensbestanden gegenereerd uit het besturingsexperiment. (A) Experimentele gegevens die in realtime worden gemonitord. De y-as komt overeen met de I-Respons in biosensoreenheden (BU), en de x-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. Dit cijfer komt overeen met de gegevens van het controle-experiment waarbij Hsp90 werd geïmmobiliseerd op de chip (500 nM) en 10 concentraties BSA (controle-eiwit) analyt werden bereid (0,4-200 nM). De real-time I-Response grafiek begint met een lage I-Respons rond 10-15 BU en neemt niet toe bij een toename van de analytconcentraties bij elke cyclus van het experiment, wat suggereert dat er geen interactie is tussen de Hsp90 en BSA. (B) Hill Fit plot gegenereerd uit de geautomatiseerde analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons; de x-as komt overeen met de concentraties van analyt (BSA) in nM. De resultaten van de geautomatiseerde analyse toonden aan dat er onvoldoende gegevens zijn om de KD-waarde te berekenen, wat suggereert dat er geen interactie is tussen Hsp90 en BSA. (C) Associatieplot gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De y-as komt overeen met I-Respons aan het einde van de associatiefase, de x-as komt overeen met de verschillende BSA-concentraties van analyt. Dit plot is gegenereerd met behulp van de gegevenspunten in tabel S4. Samenvatting van de analyseresultaten is opgenomen in de grafiek; voor dit experiment is de KD-waarde -0,009 ± -0,0003 μM en de R2-waarde 0,82. Een negatieve KD-waarde dicht bij nul geeft aan dat er geen interactie is tussen Hsp90 en BSA. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Samenvatting van de I-Response waarden gegenereerd op elk concentratiepunt en afgelezen van de transistors van elke chip (drie verschillende transistors voor elke chip). Deze tabel komt overeen met de gegevens uit de tweede herhaling uitgevoerd voor het tweede experiment waarbij Hsp90 werd geïmmobiliseerd op de chip (500 nM) en 10 concentraties Cdc37-analyt werden bereid (0,4-200 nM). De datapunten uit deze tabel zijn gebruikt voor analyse in de statistische analysesoftware. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Samenvatting van de I-Response waarden gegenereerd op elk concentratiepunt en afgelezen van de transistors van elke chip (drie verschillende transistors voor elke chip). Deze tabel komt overeen met de gegevens uit de derde herhaling uitgevoerd voor het tweede experiment waarbij Hsp90 werd geïmmobiliseerd op de chip (500 nM) en 10 concentraties Cdc37-analyt werden bereid (0,4-200 nM). De datapunten uit deze tabel zijn gebruikt voor analyse in de statistische analysesoftware. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S3: Samenvatting van de I-Response waarden gegenereerd op elk concentratiepunt en afgelezen van de transistor van elke chip (drie verschillende transistors voor elke chip). Deze tabel komt overeen met de gegevens van het controle-experiment waarbij Hsp90 werd geïmmobiliseerd op de chip (500 nM) en 10 concentraties BSA-analyt werden bereid (0,4-200 nM). De datapunten uit deze tabel zijn gebruikt voor analyse in de statistische analysesoftware. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie werd de haalbaarheid van het gebruik van de FEB-technologie (een real-time kinetische karakteriseringsbenadering) geëvalueerd om de biomoleculaire interactie tussen Hsp90 en Cdc37 te bepalen. Het eerste verkennende experiment (eerste experiment) suggereerde dat het kiezen van de juiste analytconcentraties een cruciaal onderdeel van het experiment is en dat het experiment moet worden ontworpen door concentratiepunten boven en onder de KD-waarde op te nemen, die werden voorspeld op basis van de gegevens die beschikbaar zijn in de literatuur.

Niettemin, als er geen voorlopige informatie is over de interactie, raden we aan een voorlopig experiment te ontwerpen door een breed scala aan concentratiepunten op te nemen in zowel lagere (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) als hogere (1.000 nM, 2.500 nM, 5.000 nM) bereiken. Het voorlopige experiment geeft een ruwe schatting van de KD-waarde en maakt het mogelijk de volgende experimenten te plannen met behulp van de juiste concentratiebereiken om een nauwkeurige KD-waarde te verkrijgen. Het FEB-systeem biedt een bewerkingsprotocolfunctie waarbij men vrij is om het aantal concentratiepunten voor het experiment te kiezen.

Uit onze ervaring zijn de meest kritische stappen in het VBO-protocol als volgt. De doeleiwit- en analytbuffer moet hetzelfde zijn als de kalibratiebuffer. Zelfs een kleine buffermismatch kan fluctuaties in de I-Respons veroorzaken en onbetrouwbare resultaten geven. Daarom raden we aan om dialyse 's nachts uit te voeren door een goede bufferuitwisseling. Zorgvuldig pipetteren op de biosensorchip tijdens het aanzuigen of toepassen van een oplossing is van cruciaal belang tijdens het hele experiment. Onzorgvuldig pipetteren kan leiden tot gebroken transistors of fluctuaties in de I-Respons; zorg er tijdens het pipetteren voor dat u het gevoelige oppervlak van de chip niet raakt. De EDC/sulfo-NHS-oplossing die wordt gebruikt in het chipactiveringsproces moet voor elk gebruik vers worden gemengd. Het gebruik van een oud mengsel kan resulteren in een niet-gefunctionaliseerde chip. Zorg ervoor dat u dezelfde buffer gebruikt voor alle vijf repetitieve stappen (kalibratie, associatie, dissociatie, regeneratie en wassen) die betrokken zijn bij alle cycli van het experiment.

Bij het vergelijken van het VBO met gevestigde biomoleculaire detectiesystemen in het veld, zoals BLI of SPR, ontdekten we dat alle drie de methoden vergelijkbare voordelen delen 43,44,45 die zijn: het zijn labelvrije systemen, die geen dure fluorescerende kleurstoffen nodig hebben om de interacties te detecteren; ze kunnen interacties detecteren, zelfs in kleine nM-bereiken; de chips zijn herbruikbaar in zowel SPR als FEB en ze kunnen efficiënt worden geregenereerd en hergebruikt voor maximaal 10 experimenten, en alle drie de methoden leveren kinetische gegevens in realtime, en de experimenttijd is kort.

Het belangrijkste voordeel van SPR is dat het uitgebreidere gegevens uit het experiment biedt, zodat men KD, Kon, Koff, stoichiometrie en thermodynamische parameters kan berekenen44. Het grote voordeel van BLI is de mogelijkheid om meerdere concentraties in één experiment te testen. De kinetische metingen kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd voor maximaal acht concentraties door gebruik te maken van verschillende sensoren. De BLI-sensoren zijn echter niet herbruikbaar, waardoor de kosten van het experiment extreem hoogzijn 43.

Het belangrijkste voordeel van het VBO is de geautomatiseerde, gebruiksvriendelijke software die de gebruiker tijdens het experiment begeleidt, en het pipetteerplatform met open hand waarmee de gebruiker de analyt bij elke stap aan het geïmmobiliseerde doelwit kan toevoegen. Deze open pipetteerbenadering in combinatie met een eenvoudige software maakt het VBO gemakkelijk te leren en vereist weinig of zelfs geen training. Het vereist echter wel dat de gebruiker een basisbeheersing van handpipetters heeft, en het gebrek aan geautomatiseerde vloeistofverwerking betekent dat de reproduceerbaarheid van staptiming volledig afhankelijk is van de gebruiker. Ditzelfde gebrek aan geïntegreerde vloeistofbehandeling betekent dat de chips en instrumenten kosteneffectief zijn in vergelijking met SPR of BLI. Het VBO vertoont ook een hoge reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid bij het detecteren van biomoleculaire interacties als gevolg van het gedefinieerde fabricageproces dat betrokken is bij de bereiding van biosensorchips35.

Vergeleken met de gevestigde en standaard ITC-detectiemethode, gebruikt FEB slechts 50 μL analytvolume bij nanomolaire concentraties voor het hele experiment, waardoor de kans op nucleatie of aggregatie van eiwitten afneemt. Een van de grootste problemen met ITC is het ontgassen van de eiwitten voordat ze worden geladen om luchtbellen te voorkomen. Tijdens het ITC-experiment is er een kans op het ontwikkelen van bellen in de meetcel als gevolg van continu roeren en intense zuivering, die de monsteroplossing nadelig kunnen spetteren of monsterverlies kunnen veroorzaken42. De FEB-technologie overwint deze uitdagingen van ITC door robuuste doelimmobilisatiechemie aan te bieden, aggregatie en borrelen te verminderen, de stabiliteit te vergroten en concentratieafhankelijke problemen waarmee ITC wordt geconfronteerd te verbeteren.

Een mogelijk nadeel van VBO-hulpmiddelen is hun gevoeligheid voor buffersamenstelling en concentratieveranderingen, die een afwijking in de uitgangswaarde kunnen veroorzaken die moet worden gecorrigeerd tijdens de aanpassing en analyse van de resultaten. De biosensorchip is ook gevoelig voor pH en zout, dus buffers die worden gebruikt tijdens de kalibratie en meting van de analyt moeten gedurende het hele experiment hetzelfde zijn. Chemicaliën die worden gebruikt als conserveermiddelen (bijv. Natriumazide) en hydrofobe moleculen kunnen de sensor beschadigen en kunnen zelfs een toename van niet-specifieke binding veroorzaken. Deze nadelen kunnen worden verzacht met aandacht voor bufferconsistentie tijdens de meetstappen, dialyse van storende verbindingen uit de analytenvoorraad en passende passivering van het oppervlak (bijv. Gebruik van detergentia, eiwitblokkers of verschillende PEG-moleculen).

Samenvattend hebben we met succes sterke PPI aangetoond tussen Hsp90 /Cdc37 door gebruik te maken van de FEB-technologie en hun interactie gevalideerd met behulp van ITC, wat bemoedigende gegevens oplevert om FEB te ondersteunen als een innovatieve alternatieve methode voor PPI-detectie. De FEB-technologie biedt een breed scala aan toepassingen op verschillende gebieden van geneesmiddelenontdekking, farmaceutica, biomoleculaire analyse van kleine moleculen, peptiden en eiwitten, antilichaamontwikkeling, medicijnvalidatie en leadoptimalisatie binnen handbereik door in vitro biologische activiteit gemakkelijk te vertalen in in vivo werkzaamheid. Gezien de voordelen van FEB-technologie en de immense toepassingen ervan bij het verkennen van PPI-, eiwit- en DNA- of RNA-interacties, evenals interacties tussen eiwitten en kleine moleculen (bijv. Geneesmiddelen), stellen we voor dat het een unieke, veelbelovende technologie is in de PPI-detectietoolbox. In ons geval biedt FEB-technologie een waardevol hulpmiddel om de bindende werkzaamheid van Hsp90 / Cdc37 PPI-kandidaatantagonisten gemakkelijk te beoordelen, wat vervolgens helpt bij het selecteren van veelbelovende kandidaten voor verdere in vitro en in vivo evaluaties met betrekking tot verschillende ziekten waarbij deze PPI van cruciaal belang is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Binational Science Foundation (BSF) aan S.K.S. en N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

Biochemie Celdelingscyclus 37 Cdc37 Heat shock protein 90 Hsp90 Protein kinase Graphene biosensor Field-effect biosensing Cancer Biomolecular interactions
Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter