Summary
场效应生物传感（FEB）是一种用于检测生物分子相互作用的无标记技术。它测量通过石墨烯生物传感器的电流，结合目标被固定到该传感器。FEB技术用于评估Hsp90和Cdc37之间的生物分子相互作用，并检测到两种蛋白质之间的强相互作用。
Abstract
生物分子相互作用通过调节和协调功能相关的生物事件，在众多细胞过程中发挥多种作用。蛋白质，碳水化合物，维生素，脂肪酸，核酸和酶等生物分子是生物的基本组成部分;它们组装成生物系统中的复杂网络，以同步无数的生活事件。蛋白质通常利用复杂的相互作用组网络来执行其功能;因此，必须评估这种相互作用，以揭示它们在细胞和生物体水平上在细胞中的重要性。为了实现这一目标，我们引入了一种快速新兴的技术，场效应生物传感（FEB），以确定特定的生物分子相互作用。FEB是一种台式，无标记且可靠的生物分子检测技术，用于确定特定的相互作用，并使用高质量的电子生物传感器。FEB技术可以监测纳米摩尔范围内的相互作用，因为其生物传感器表面使用了生物相容性纳米材料。作为概念验证，阐明了热休克蛋白90（Hsp90）和细胞分裂周期37（Cdc37）之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）。Hsp90是一种ATP依赖性分子伴侣，在许多蛋白质的折叠，稳定性，成熟和质量控制中起着至关重要的作用，从而调节多种重要的细胞功能。Cdc37被认为是一种蛋白激酶特异性分子伴侣，因为它特异性识别并招募蛋白激酶到Hsp90以调节其下游信号转导途径。因此，Cdc37被认为是Hsp90的共同伴侣。伴侣激酶途径（Hsp90 / Cdc37复合物）在促进细胞生长的多种恶性肿瘤中被过度激活;因此，它是癌症治疗的潜在靶点。本研究证明了使用Hsp90/Cdc37模型系统的FEB技术的有效性。FEB检测到两种蛋白质之间的PPI很强（在三个独立实验中KD 值为0.014μM，0.053μM和0.072μM）。总之，FEB是一个无标签且具有成本效益的PPI检测平台，可提供快速准确的测量。
Introduction
生物分子相互作用：
蛋白质是生物体的重要组成部分，参与许多分子途径，如细胞代谢，细胞结构，细胞信号传导，免疫反应，细胞粘附等。虽然一些蛋白质独立执行其功能，但大多数蛋白质使用结合界面与其他蛋白质相互作用以协调适当的生物活性1。
生物分子相互作用可以主要根据所涉及的蛋白质2的独特结构和功能特征进行分类，例如，基于蛋白质表面的复合物稳定性或相互作用的持久性3。鉴定必需蛋白质及其在生物分子相互作用中的作用对于在分子水平4上理解生化机制至关重要。目前，有各种方法来检测这些相互作用5：体外6， 计算机7，活细胞8，离体9和 体内10，每种方法都有自己的优点和缺点。
使用整个动物作为实验工具11进行体内测定，并且通过在自然条件下提供最小的改变，在受控的外部环境中对组织提取物或整个器官（例如，心脏，大脑，肝脏）进行离体测定。体内和离体研究最常见的应用是通过确保其整体安全性和有效性，在人体试验之前评估潜在药理学药物的药代动力学，药效学和毒性作用12。
生物分子相互作用也可以在活细胞内检测到。成像活细胞使我们能够观察动态相互作用，因为它们执行特定生化途径13的反应。此外，检测技术，例如生物发光或荧光共振能量转移，可以提供关于这些相互作用在细胞14内何时何地发生的信息。虽然活细胞中的检测提供了关键的细节，但这些检测方法依赖于光学和标记，这可能不反映本地生物学;它们也比 体外 方法控制得更少，并且需要专业知识来执行15。
计算机计算方法主要用于在体外实验之前对目标分子进行大规模筛选。计算预测方法，基于计算机的数据库，分子对接，定量构效关系和其他分子动力学模拟方法是计算机工具16中公认的方法。与费力的实验技术相比，计算机计算机工具可以轻松做出高灵敏度的预测，但预测性能的准确性会降低17.
体外 测定是使用其标准生物背景之外的微生物或生物分子进行的。通过 体外 方法描绘生物分子相互作用对于理解蛋白质功能和复杂细胞功能网络背后的生物学至关重要。优选的测定方法根据蛋白质的内在性质，动力学值以及相互作用的模式和强度18，19选择。
Hsp90/Cdc37 相互作用：
连接Hsp90和Cdc37的伴侣激酶途径是肿瘤生物学20中一个有前途的治疗靶点。Hsp90在细胞周期控制，蛋白质组装，细胞存活和信号通路中起着核心作用。依赖Hsp90进行功能的蛋白质通过共同伴侣（如Cdc37）递送到Hsp90进行复合。Hsp90 / Cdc37复合物控制大多数蛋白激酶的折叠，并作为众多细胞内信号网络的枢纽21。它是一种有前途的抗肿瘤靶点，因为它在各种恶性肿瘤（包括急性成骨髓细胞白血病，多发性骨髓瘤和肝细胞癌22，23）中的表达升高。
常用 的体外 生物分子相互作用检测技术
共免疫沉淀（co-IP）是一种依靠抗原- 抗体特异性来鉴定生物学相关相互作用的技术24。该方法的主要缺点是它无法检测低亲和力相互作用和动力学值24。等温滴定量热法 （ITC）、表面等离子体共振 （SPR）、生物层干涉测量 （BLI） 和 FEB 技术等生物物理方法优先用于确定动力学值。
ITC是一种基于结合能测定以及完整的热力学分析的生物物理检测方法，用于表征生物分子相互作用25。ITC的主要优点是它不需要对靶蛋白进行任何标记或固定。ITC遇到的主要困难是一个实验所需的高浓度靶蛋白以及由于小结合焓26而难以分析非共价复合物。SPR和BLI都是无标记的生物物理技术，依赖于目标分子在传感器表面上的固定化，然后在固定的靶标27，28上随后注入分析物。在SPR中，测量生物分子相互作用期间折射率的变化27;在BLI中，反射光中的干涉被实时记录为波长的变化，作为时间28的函数。SPR 和 BLI 在提供高特异性、灵敏度和检测能力方面具有共同的优势29.在这两种方法中，靶蛋白固定在生物传感器表面上，因此，靶标的天然构象可能存在一些损失，这使得难以区分特异性与非特异性相互作用30。BLI使用昂贵的一次性光纤生物传感器来固定目标，因此是一种昂贵的技术31。与这些成熟的生物分子检测工具相比，FEB技术通过使用低纳摩尔浓度进行生物分子实时检测和动力学表征，提供了一个可靠且无标记的平台。FEB技术还克服了ITC面临的冒泡挑战，与SPR或BLI相比更具成本效益。
基于场效应晶体管（FET）的生物传感器是通过提供各种生物医学应用来检测生物分子相互作用的新兴领域。在FET系统中，目标被固定在生物传感器芯片上，并且通过电导32的变化来检测相互作用。在开发高效电子生物传感器时要考虑的独特特征是物理化学性质，例如用于制造传感器表面33的涂层材料的半导体性质和化学稳定性。传统的材料，如用于FET的硅已经限制了传感器的灵敏度，因为它需要夹在晶体管通道和特定环境之间的氧化物层34。此外，硅晶体管对高盐环境敏感，因此很难测量其自然环境中的生物相互作用。基于石墨烯的生物传感器作为替代品提供，因为它具有出色的化学稳定性和电场。由于石墨烯是碳的单原子层，因此它作为半导体非常敏感，并且与生物溶液具有化学相容性;这两种质量都是期望生成兼容的电子生物传感器35。石墨烯包覆生物传感器提供的生物分子的超高负载潜力导致基于石墨烯的生物传感器FEB技术的发展。
FEB技术原理：FEB是一种无标记的生物分子检测技术，可测量通过石墨烯生物传感器的电流，结合目标被固定到石墨烯生物传感器。固定化蛋白质与分析物之间的相互作用导致实时监测的电流变化，从而实现准确的动力学测量36。
仪器仪表：FEB系统包括一个石墨烯场效应晶体管（gFET）传感器芯片和一个在整个实验中施加恒定电压的电子阅读器（图1）。将分析物在溶液中施加到固定在生物传感器表面上的靶蛋白上。当相互作用发生时，实时测量和记录电流的变化。随着分析物浓度的增加，结合分析物的比例也会增加，导致电流中的更高交替。使用仪器随附的自动分析软件（材料表），以生物传感单元（BU）37测量和记录I-Response。I-Response被定义为在固定目标与分析物相互作用时实时测量的通过生物传感器芯片的电流（I）的变化。FEB自动分析软件可以分析I响应和C响应动态相互作用事件，其中C响应记录电容（C）的变化。I-Response和C-Response的变化直接对应于结合分析物的分数，并且可以进一步分析以产生KD 值。自动分析软件的默认首选项为 I-响应。
图1：实验设置概述，（A）基于石墨烯的芯片和电子阅读器。（B）芯片组件概述。芯片连接到两个电极上，为系统提供电流。芯片的表面覆盖着石墨烯，石墨烯在被激活时可以结合目标。请点击此处查看此图的大图。
方法论：
最初，将激活的生物传感器芯片插入FEB器件（图1），然后执行下面概述的步骤：（1）校准：实验开始于使用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH = 7.4）进行系统校准，以产生基线平衡响应。（2）关联：将分析物引入芯片中，并监测I-Response，直到达到结合饱和。（3）解离：使用1x PBS解离分析物。（4）再生：使用1x PBS除去分析物的残留物。（5）洗涤：使用1x PBS进行总共五次洗涤，以彻底去除芯片中的结合和未结合的分析物。
分析：
使用仪器随附的全自动软件进行数据分析。自动分析软件生成具有 KD 值的希尔拟合图。希尔拟合图描述了分析物与目标蛋白的关联作为分析物浓度的函数。达到半极大响应的浓度与 KD 值成正比。低 KD 值表示高绑定亲和力，反之亦然。
为了验证从FEB实验获得的数据，使用数据审查/导出软件从每个分析物浓度的每个读数点提取I-Responses，并可以导出到其他统计分析软件（参见 材料表），如下所述。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：本研究中使用的重组蛋白Hsp90和Cdc37是商业获得的（见 材料表）。
1. 芯片激活
注：实验中使用的所有材料都列在 材料表中。通过无菌的0.2μm过滤器过滤所有准备好的溶液。
- 通过在15 mL管中加入2mg EDC到2.5mL 1 M 2-（N-吗啉基）乙烷磺酸（MES）缓冲液（pH = 6.0）中，制备1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）溶液。通过在单独的15 mL管中加入6mg磺基NHS到2.5mL的1M MES缓冲液（pH = 6.0）中来制备N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基NHS）溶液。
- 通过上下移液（不涡旋）混合等体积的EDC砂磺-NHS溶液（50μLEDC + 50μL磺基NHS）。
注意：EDC /磺基-NHS的混合溶液必须在30分钟内使用，以保持有效的交联，以实现适当的芯片功能化。 - 将公司提供的生物传感器芯片（5.7 cm x 2.4 cm;见 材料表）放在装有盖子的玻璃培养皿中。建议芯片激活中涉及的所有功能化步骤都在培养皿内完成。将50μL1M MES缓冲液（pH = 6.0）施加到生物传感器芯片上，在室温下孵育1分钟，然后吸出缓冲液。
- 立即将50μLEDC / sulfo-NHS溶液涂在传感器芯片上。盖上培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸出EDC / sulfo-NHS溶液。
- 用50μL1M MES缓冲液（pH = 6.0）冲洗芯片一次;吸出MES缓冲液。
2. 靶向蛋白固定化
- 用 50 μL 1x PBS （pH = 7.4） 冲洗芯片 2 倍。从芯片中抽出PBS并加入目标分子Hsp90（50μL; 500nM）。
注意：缓冲区不匹配可能会破坏整个实验;因此，在实验之前，重要的是要确保目标分子与用于校准的缓冲液位于相同的缓冲液中（例如，1x PBS（pH = 7.4））。如果需要，在实验前通过过夜透析进行缓冲液交换。在该实验中，对重组蛋白Hsp90和Cdc37进行过夜透析，反对1x PBS（pH = 7.4;参见 材料表），在4°C下进行适当的缓冲液交换。 目标物质（在本例中为Hsp90）的浓度可以根据不同的实验方案和目标物质（蛋白质/肽/配体）的性质而变化。 - 盖上玻璃培养皿，在室温下孵育30分钟。吸出含有目标分子的溶液，并用50μL1x PBS（pH = 7.4）冲洗3次。从芯片中抽出1x PBS（pH = 7.4）溶液。
- 向芯片中加入50μL淬灭1（3.9mM氨基PEG5醇在1x PBS（pH = 7.4）中）溶液。盖上玻璃培养皿并在室温下孵育15分钟。从芯片中吸取淬火1溶液。
- 向芯片中加入50μL淬灭2（1M乙醇胺（pH = 8.5））溶液。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育15分钟。从芯片中吸取淬灭2溶液，并使用50μL的1x PBS冲洗芯片5x，将最后一个PBS液滴留在传感器上。
3. 制备分析物样品
- 在所需浓度范围内制备Cdc37的分析物稀释系列。对于第一个实验，使用以下浓度：25 nM，50 nM，100 nM，200 nM，400 nM，800 nM，1，000 nM，2，000 nM，3，000 nM和5，000 nM。对于第二个实验，使用了一组从0.4 nM到200 nM的不同浓度。
- 将实验设计为包括至少八种不同的分析物浓度，以获得可靠的KD 值。在与用于校准和靶蛋白的缓冲液相同的缓冲液中制备分析物蛋白的不同稀释度;这里是1x PBS（pH = 7.4）。
4. 将激活的生物传感器芯片装入 FEB 器件
注：FEB 器件由一个带 LED 指示灯的读卡器和一个用于插入生物传感器芯片的墨盒组成。
- 靶蛋白固定后，将活化的芯片插入设备的墨盒中，该盒 通过 USB连接到计算机。芯片插入后，读卡器上将显示绿色LED灯，表示FEB设备已准备好进行实验。在 FEB 设备所连接的计算机上安装公司提供的自动化软件（参见 材料表），以便按如下所述逐步监控实验。
5. 运行实验
- 按自动软件上的 “运行实验 ”模块，然后选择 10个点，使用再生 或任何其他所需的协议。填写以下详细信息：操作员姓名、实验名称、日期（例如，Yana、Hsp90 + Cdc37、2021 年 3 月 14 日）;再生缓冲液（例如 PBS 缓冲液）;固定目标（例如，Hsp90）;溶液中的分析物（例如 Cdc37）。有关详细信息 ，请参见补充图 S1 。
- 按软件上显示 的“开始实验 ”按钮，然后按照自动化软件显示的说明进行操作，如下所述。
注意：该软件是完全自动化的，用户友好，并逐步指导用户完成整个实验过程。屏幕上将出现一个弹出窗口，其中包含在实验的每个步骤中进一步进行的说明。该软件将在整个实验过程中为每种分析物浓度提供校准，分析物关联，解离，再生和洗涤（5x）的每个重复步骤的说明。 - 执行仪器校准。为此，从芯片中吸取剩余的PBS溶液，并施加50μL校准缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）。按“ 继续 ”按钮并等待5分钟，直到校准步骤完成。该软件显示为校准步骤（5分钟）确定的终点，并发出警告警报以进行跟进。
- 接下来，执行分析物关联。为此，从芯片中吸出校准缓冲液，并施加50μL最低分析物浓度（Cdc37的25nM）。按“ 继续 ”按钮并等待 5 分钟，直到关联步骤完成。软件显示关联步骤（5分钟）的端点，并发出警告警报以继续。
- 进行分析物解离。为此，从芯片中吸取分析物溶液并施加50μL解离缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）。按“ 继续 ”按钮并等待 5 分钟，直到解离步骤持续时间（5 分钟）完成。该软件显示解离步骤（5分钟）的端点，并发出警告警报以进行跟进。
- 接下来，执行芯片再生。从芯片中抽出解离溶液并施加50μL再生缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）。按“ 继续 ”按钮并等待 30 秒，直到再生步骤持续时间 （30 秒） 结束。该软件显示再生步骤（30秒）的终点，并发出警告警报以进行跟进。
- 最后，清洗芯片。从芯片中吸取再生溶液，并将50μL洗涤缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）施加到芯片上。从芯片中吸出溶液并重复此5倍。将最后一滴洗涤缓冲液留在芯片上，然后按“ 继续 ”按钮，等待30秒，直到软件显示屏中的洗涤步骤持续时间结束。
注意：软件显示清洗步骤（30秒）的终点，并发出警告警报，以继续进行下一个实验周期。 - 对使用的每种分析物浓度重复步骤;校准，分析物关联，解离，再生和洗涤（5x）的五个步骤构成一个循环。对于这里显示的实验，我们对10种分析物浓度（范围从25 nM到5，000 nM或0.4nM到200 nM）进行了10次循环; 图 2）。
6. 分析
- 在实验结束时，按下自动分析软件顶部的“分析”按钮。将出现一个包含所有实验点的显示窗口。在窗口中，确保用于规定方案的分析物浓度是正确的。
- 按 “运行分析 ”按钮可自动生成 KD 值。该软件通过将分析物浓度与相应的I响应绘制在一起来生成希尔拟合图，从中计算平衡处的解离常数KD 值。
- 使用数据查看/导出软件导出原始数据，以便在其他统计分析软件中进行分析，如下所述。
- 将实验结束时自动创建的 R1R 文件（例如，Hsp90 + Cdc37 14.03.2021）复制到桌面上的新文件夹中。打开公司提供 的数据审查/导出 软件（见 补充图S2A）。
- 单击 数据处理>处理R1R文件> 数据审查/导出软件的主屏幕上确定。
- 选择包含步骤 6.3.1 中在桌面上创建的 R1R 文件的文件夹。，然后按 “确定 ”按钮。这将创建原始 R1R 数据的副本，以便在不覆盖原始文件的情况下查看和编辑数据。
- 按数据审查/导出软件主屏幕上看到的数据处理图标。按 “加载已处理的 R1R 文件”>确定”。选择在步骤 6.3.1 中创建的包含已处理 R1R 文件的同一文件夹。按 确定。在此步骤中，包含实验文件的文件夹已准备好进行审阅。
- 在数据审查/导出软件的主屏幕上，按 数据分析。选择 校准>校准已编辑的R1R文件>确定 （参见 补充图S2B）。此步骤根据第一个校准步骤校准所有数据点，以创建基线。
- 在数据审查/导出软件的主屏幕上，按 数据分析。选择“ 查看并编辑 R1R 文件”>确定”。使用“删除/添加步骤”按钮查看数据点、删除点或 添加步骤 。确保所有步骤都位于正确的位置，例如，校准步骤位于基线上，关联步骤处于峰值（请参阅 补充图 S3），然后按“ 保存 ”按钮保存所做的所有更改。
- 在数据审查/导出软件的主屏幕上，按 数据分析。选择“ 分析/绘制数据”，选择要导出的步骤（请参见 补充图 S4）。在导出数据之前，将校准步骤（例如，步骤1，步骤6等）减去到导出列表后，将每个关联步骤（例如，步骤2，步骤7等）添加到导出列表中。
- 按 导出此数据。该软件生成一个电子表格文件，其中包含来自每个晶体管的每个分析物浓度数据点的I-Response（如果所有晶体管都在工作，我们将为每个浓度点提供三个不同的I响应值）。使用此电子表格文件进一步分析统计软件中的数据。
- 打开统计分析软件。创建一个具有三个Y值的XY表;按 创建。此表的数据（X、Y 值）将从步骤 6.3.8 中创建的电子表格文件中复制。x 轴对应于分析物浓度（取决于所使用的浓度），三个 Y 值对应于从公司提供 的数据审查/导出 软件获得的 I 响应。
- 按 分析此数据。选择 XY 分析>非线性回归（曲线拟合）>结合饱和度>一个站点>总计。该软件将自动分析数据，生成KD 值，并创建数据点的图形。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
实验 1 的结果：
如上所述，将目标蛋白Hsp90（500 nM）固定到芯片上。对于第一个实验，根据文献中可用的数据制备了10种浓度的分析物蛋白Cdc37，范围从25 nM到5，000 nM（见 表1）。
通过跟踪I响应中发生的变化，可以实时监测实验的步骤（图3A）。人们可以想象方案中包含的每个步骤如何影响整个实验中的I-Response。例如，在校准期间，I-响应接近于零，并且在关联步骤中，I-响应随着分析物（Cdc37）浓度的增加而逐渐增加。查看该实验的数据（图3A），在低分析物浓度（25nM时为50 BU）中观察到I-响应的突然增加。在低分析物浓度下，预计I-响应较低，随着浓度的增加，I-Response将逐渐增加。这种突然增加表明，应该设计一个包含较低分析物浓度点的实验。
按照上面讨论的协议步骤，在提供的自动分析软件中分析数据，该软件自动生成具有计算KD 值的希尔拟合图（图3B）。从自动分析软件计算出的第一次实验的KD 值为350，000±76，000μM。大多数常见的生物相互作用在低μM甚至nM范围内显示出KD 值;因此，为第一次实验产生的KD 值非常高。
对于观察到的高KD 值，可以有几种解释：所研究的两种特定蛋白质之间可能存在低亲和力结合（Hsp90 / Cdc37），这意味着分子相互作用需要高配体浓度;该实验可能是用非理想，超出范围的分析物浓度设计的;高值可能是由于分析软件的拟合模块中使用的内置参数。自动分析软件使用剂量反应分析模块来拟合数据点，但某些相互作用可能不适合该模型，从而给出错误数据，导致高KD 值。
为了获得饱和希尔图的准确KD 值，需要通过反复试验对实验进行标准化，其中包括较低和较高的分析物浓度点，以低错误率获得最低的KD 值。
考虑到所有这些因素，分析软件的数据被导出到其他统计分析软件。使用自动数据审查/导出软件提取每个关联点的I-Response，并按照上面分析步骤（步骤6）中讨论的步骤在 表2 中进行了总结。
统计分析软件结果（图3C）显示KD 值相对较低，标准偏差高（0.011±0.494μM），R2 值低0.78。在KD 值和低R2 值中观察到的显着变化表明为该实验选择的浓度点不是最优的。此外，还注意到一些图形点与绘图趋势线不太吻合（图3C）;这加强了通过包括不同的分析物浓度点来设计第二个实验的需要。
两种分析软件使用的内置参数完全不同，反映在KD 值生成过程中。从两个分析软件获得的KD 值的差异（350，000±76，000 μM与0.011±0.494 μM）可归因于使用不同的分析模块进行计算。在统计分析软件中执行的分析可能更适合这种相互作用，从而给出较低的KD 值。
然而，如果将两种分析的结果结合起来（350，000±76，000μM和0.011±0.494μM），则可以得出结论，第一次实验不是最佳的，需要额外的浓度点。
为了验证这一点，不相关的图形点，排除了3，000 nM（参见 补充图S5）。分析结果显示，KD 值为0.006±0.081μM，R2 值为0.98。这些结果表明，下一个实验的设计应侧重于更相关的浓度。因此，进行了第二个实验，以评估Hsp90 / Cdc37 PPI，使用浓度低于和高于预测KD的不同测试点。
实验 2 的结果：
目标蛋白Hsp90（500 nM）使用如上所述的协议固定到芯片上。共制备了10种浓度的分析物（Cdc37），如下所示：0.4 nM，0.8 nM，1.6 nM，3.2 nM，6.4 nM，12.5 nM，25 nM，50 nM，100 nM和200 nM。第二个实验是通过包括不同的分析物浓度点来设计的，通过考虑从上述先前实验中获得的所有见解。
在实验过程中，实时监测每个步骤（图4A）。在这里，实时I-Response图（由分析物的低浓度-0.4 nM，0.6 nM，1.6 nM导出）最初从零开始，并且随着实验每个周期分析物浓度的增加而逐渐增加，与第一个实验中观察到的I-Response的突然增加相比。
按照上述协议，使用自动分析软件分析数据（图4B）。从该实验的自动分析软件计算出的KD 值为0.0673±0.0002μM，这表明靶蛋白Hsp90和分析物Cdc37之间存在很强的相互作用。0.0002 μM的标准偏差比第一次实验获得的标准偏差小得多，这使人们确信新数据更加可靠。
为了验证这一结果，我们将数据点（表3）导出到另一个统计分析软件，如前所述;分析结果总结在 图4C中。
使用统计分析软件发现Hsp90 / Cdc37 PPI的KD 值为0.014±0.005μM（图4C）。KD 和标准偏差的低值表明两种蛋白质Hsp90和Cdc37之间存在很强的相互作用。此外，R2 值为 0.99 表示分析完全拟合实验图形点。两种分析软件的结果均一致，KD 值分别为约0.0673±0.0002 μM和0.014±0.005 μM。
为了确认实验的可重复性和准确性，使用Hsp90（500 nM）作为靶蛋白和Cdc37作为分析物在两个重复中进行了相同的实验，其浓度范围从0.4nm到200nm与第二个实验中使用的相同。在实验过程中，对每个步骤进行实时监测（补充图S6A和补充图S7A）。从自动分析软件计算出的KD值在补充图S6B和补充图S7B中描述（分别为0.053±0.002 μM和0.0719±0.0007 μM）。如前所述，数据点被导出（补充表S1和补充表S2）到另一个统计分析软件，结果显示在补充图S6C和补充图S7C中（补充图S6C：KD为0.003±0.009μM，R2为0.99;补充图S7C：KD为0.004±0.009μM，R2为0.99）。两个分析软件的两个重复结果都得到了很好的证实，并证实了Hsp90 / Cdc37 FEB实验数据的准确性，可重复性和再现性。
还进行了对照研究，其中阐明了Hsp90与对照蛋白牛血清白蛋白（BSA）之间的生物分子相互作用。使用BSA作为分析物的对照研究是使用相同的实验设置和第二个实验中使用的分析物浓度完成的。在1x PBS（pH = 7.4）中共制备10种浓度的对照蛋白BSA，范围从0.4 nM到200 nM，并且实时监测实验的每个步骤。
与Hsp90和Cdc37的实验类似，实时I-Response图最初从0开始;然而，在对照研究中，I-反应不会随着分析物浓度的增加而逐渐增加（补充图S8A）。使用自动分析软件（补充图S8B）对数据进行了分析，并且该软件无法从该实验的数据点计算出KD 值。从软件生成的Hill Plot中可以证明，Hsp90与对照BSA分析物之间没有相互作用。为了验证这一结果，我们将数据点（补充表S3）导出到另一个统计分析软件，如前所述。使用统计分析软件发现Hsp90/BSA PPI的KD 值为负（补充图S8C;KD 为-0.009±-0.0003μM），再次表明两种蛋白质Hsp90和BSA之间没有相互作用。此外，R2 值 （0.82） 表示分析不符合实验图形点。两种分析软件都显示出Hsp90和BSA不相互作用的结果的一致性。
当将Hsp90 / Cdc37 FEB实验数据与文献中可用的其他实验数据进行比较时，发现本研究中获得的KD 值（KD = 0.014±0.005μM，KD = 0.053±0.002μM，KD = 0.072±0.001μM）比以前发表的数据（KD = 1.46μM38 或6μM39）低两个数量级。).这些差异可以归因于在当前实验中使用全长人类Hsp90和Cdc37结构。以前的研究是在仅含有部分蛋白质38 或 秀丽隐杆线虫 同源蛋白39 的酵母Hsp90构建体上进行的（表1）。为了验证在FEB系统中获得的结果，进行了ITC实验。
使用 ITC 系统评估 Hsp90/Cdc37 PPI：
ITC被认为是研究生物分子相互作用的黄金标准。我们进一步进行了ITC以确定Hsp90 / Cdc37 PPI的热力学动力学，并作为FEB实验的验证。Hsp90 和 Cdc37 在 ITC 之前接受针对 PBS 的透析（pH = 7.0）。在PBS中制备约0.25μM目标蛋白溶液（Hsp90）和2.5μM分析物蛋白溶液（Cdc37）用于量热滴定。将总体积为80μL的Cdc37溶液连续间隔从旋转注射器滴定到含有150μLHsp90溶液的细胞，浓度为298.15 K。每次注射持续4 s，连续注射之间的时间间隔为150 s。总共19次2μL的进样，分别以500 rpm的搅拌速度和41.9μW的参考功率进行。监测了Hsp90 / Cdc37相互作用引起的热变化，并使用该公司提供的ITC分析软件对Cdc37分析物注射结束时获得的最终数据进行了拟合。估算了Hsp90/Cdc37 PPI之间的热变化以及摩尔焓变化（ΔH）、熵变化（ΔS）、结合位点数（n）和平衡解离常数（KD）等热力学参数。吉布斯自由能变化（ΔG）也是从方程ΔG = ΔH - TΔS从ITC热图中获得热参数后计算得出的。
ITC图揭示了生物相互作用过程中消耗或释放的热量，以阐明控制PPI40的相互作用和分子间力的性质。将Cdc37（2.5 μM）滴定为Hsp90（0.25 μM），相应的曲线如图 5A，B所示。所得ITC图为放热图，拟合到单个结合位点模型中，该模型的结合化学计量（n）为1，结合能ΔG = -45.9 kJ /mol，KD 值= 0.009μM。在ITC温度图开始时以吸热位移的形式观察到的轻微不一致（图5A）表明在将分析物蛋白滴定到测量细胞41，42时形成气泡。在Hsp90/ Cdc37 PPI中，在较低和较高浓度下进行的ITC实验中，Cdc37的10倍过量（Hsp90浓度= 0.25μM和Cdc37浓度= 2.5μM）通过达到饱和曲线表现出可接受的结合参数。从ITC获得的KD 值（KD = 0.009 μM）与使用FEB技术计算的KD 值（KD = 0.014 μM，0.053 μM和0.072 μM）具有良好的相关性，有力地支持了FEB在检测Hsp90 / Cdc37 PPI方面的灵敏度和准确性。
图 2：协议摘要。 （A） 芯片激活过程步骤摘要。（B）协议中五个重复步骤的图形表示。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：从实验生成的数据文件 1. （A） 实时监控的实验数据。y轴对应于生物传感器单元（BU）中的I响应，x轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。此数字对应于第一个实验的数据。（B） 由自动分析软件生成的希尔拟合图。y 轴对应于 I 响应，x 轴对应于 nM 中分析物 （Cdc37） 的浓度。对于该实验，KD 值为350，000±76，000μM.（C）使用统计分析软件生成的关联图。y轴对应于关联阶段结束时的I-Response，x轴对应于不同的分析物Cdc37浓度。该图是使用 表2中提供的数据点生成的。分析结果摘要在图表中提供;对于该实验，KD 值为0.011±0.494μM，R2 值为0.78。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：从实验生成的数据文件 2. （A） 实时监控实验数据。y轴对应于生物传感器单元（BU）中的I响应，x轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。这个数字对应于第二个实验的数据。（B） 由自动分析软件生成的希尔拟合图。y 轴对应于 I 响应，x 轴对应于 nM 中分析物 （Cdc37） 的浓度。对于该实验，KD 值为0.0673±使用统计分析软件生成的0.0002μM（C）关联图。y轴对应于关联阶段结束时的I-Response，x轴对应于不同的分析物Cdc37浓度。该图是使用 表3中提供的数据点生成的。分析结果摘要在图表中提供;对于该实验，KD 值为0.014±0.005μM，R2 值为0.99。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：Hsp90 和 Cdc37 相互作用的 ITC 温度图。 （A） 顶板表示由于在 298.15 K 下将 Cdc37 （2.5 μM） 连续注射到 Hsp90 （0.25 μM） 中获得的相应热量演化曲线。差分功率（DP）表示差分功率作为时间的函数。（B） 底部面板中的集成数据点表示相应的归一化热量与 Hsp90/Cdc37 的摩尔比。 请点击此处查看此图的大图。
| 进行的分析 | 二月分析 KD | 棱镜分析 KD | 构造原点 | 氨基酸 | 引用 |
| 国贸中心 | 1.46 μM 和 1.32 μM | 那 | 酵母 Hsp90 | Hsp90的N端域 | 36 |
| 人类疾病预防控制中心37 | |||||
| 断续器 | 6 微米 | 那 | 秀丽隐杆线虫 | 全长 | 37 |
| 2月 - 第一次重复 | 0.014 微米 | 0.067 微米 | 人类 Hsp90 | 全长 | 在本研究中进行 |
| 人类疾病预防控制中心37 | |||||
| 2月 - 第二次重复 | 0.053 微米 | 0.003 微米 | 人类 Hsp90 | 全长 | 在本研究中进行 |
| 人类疾病预防控制中心37 | |||||
| 2月 - 第三次重复 | 0.072 微米 | 0.004 微米 | 人类 Hsp90 | 全长 | 在本研究中进行 |
| 人类疾病预防控制中心37 | |||||
| 国贸中心 | 0.009 微米 | 那 | 人类 Hsp90 | 全长 | 在本研究中进行 |
| 人类疾病预防控制中心37 | |||||
| 2月 - 对照研究 | 无数据（没有足够的数据来计算 KD） | -0.009 μM（KD值为负值表示没有相互作用） | 人类 Hsp90 | 全长 | 在本研究中进行 |
| 断续器 |
表1：使用本研究和文献中报告的不同方法进行Hsp90 / Cdc37 PPI评估。
| 分析物浓度 （nM） | I 响应晶体管 1 | I 响应晶体管 2 | I 响应晶体管 3 | 平均 |
| I-响应 | ||||
| 25.00 | 53.540 | 49.406 | 50.590 | 51.178 |
| 50.00 | 71.427 | 65.943 | 67.568 | 68.313 |
| 100.00 | 85.305 | 79.226 | 81.074 | 81.868 |
| 200.00 | 106.652 | 99.320 | 101.502 | 102.491 |
| 400.00 | 122.572 | 114.837 | 117.128 | 118.179 |
| 800.00 | 144.293 | 136.374 | 138.872 | 139.846 |
| 1000.00 | 135.165 | 128.657 | 130.425 | 131.416 |
| 2000.00 | 164.487 | 159.401 | 161.697 | 161.862 |
| 3000.00 | 109.997 | 106.705 | 107.205 | 107.969 |
| 5000.00 | 282.637 | 274.207 | 276.247 | 278.422 |
表2：在第一个实验的每个集中点，每个芯片的三个不同晶体管产生的I-Response值摘要。
| 分析物浓度 （nM） | I 响应晶体管 1 | I 响应晶体管 2 | I 响应晶体管 3 | 平均 I 响应 |
| 0.40 | 13.097 | 14.721 | 11.714 | 13.177 |
| 0.80 | 10.183 | 8.861 | 13.240 | 10.762 |
| 1.60 | 24.826 | 20.377 | 25.240 | 23.481 |
| 3.20 | 40.746 | 41.047 | 40.783 | 40.858 |
| 6.40 | 54.938 | 54.224 | 54.913 | 54.691 |
| 12.80 | 83.057 | 81.452 | 82.596 | 82.369 |
| 25.60 | 110.440 | 109.152 | 110.343 | 109.978 |
| 51.20 | 141.161 | 140.363 | 141.125 | 140.883 |
| 102.40 | 164.215 | 162.679 | 164.572 | 163.822 |
| 200.00 | 196.373 | 197.007 | 198.495 | 197.292 |
表3：在第二次实验的每个集中点，每个芯片的三个不同晶体管产生的I-Response值摘要。
补充图S1：实验开始前自动化软件主屏幕的截图。请点击此处下载此文件。
补充图S2：用于数据处理和分析的自动化软件主屏幕的屏幕截图。（A） 数据审查/导出软件的主屏幕显示，显示数据处理选项。 （二） 数据审核/导出软件的主屏幕显示，显示数据分析选项。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：从审查/导出软件获得的评论数据点。 在此步骤中，查看实验并添加或删除数据点。确保关联点（2、7、12、17、22 等）始终处于选取位置。例如，从左侧开始的第一个选取是数据点编号 2，然后是数据点编号 10（但应该是编号 7）。要解决此问题，只需删除点 3、4 和 5。 请点击此处下载此文件。
补充图 S4：例如导出数据列表。 在此步骤中，选择要导出的实验点。选择关联点（2、7、12、17、22 等）并减去之前的校准步骤（1、6、11、16、21 等）。将所有点添加到导出列表并导出此数据，以获取包含每个数据点的 I-Response 的电子表格。 请点击此处下载此文件。
补充图S5：使用统计分析软件生成的关联图。 y轴对应于关联阶段结束时的I-Response，x轴对应于不同的分析物Cdc37浓度。该图是使用第一个实验的数据点生成的，并排除了3，000 nM浓度数据点。分析结果摘要在图表中提供;对于该实验，KD 值为0.006±0.081μM，R2 值为0.98。 请点击此处下载此文件。
补充图S6：从实验2生成的数据文件复制1。（一）实时监测实验数据。y轴对应于生物传感器单元（BU）中的I响应，x轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。该数字对应于在第二次实验中进行的第二次重复的数据，其中Hsp90固定在芯片上（500 nM）并制备了10浓度的Cdc37分析物（0.4-200 nM）。实时 I-Response 图最初从 0 开始，并在实验的每个周期中随着分析物浓度的增加而逐渐增加，这表明实验是成功的。（B） 由自动分析软件生成的希尔拟合图。y 轴对应于 I 响应，x 轴对应于 nM 中分析物 （Cdc37） 的浓度。自动分析结果显示，KD值相对较低，标准差较低，为0.0531±0.0002 μM，表明Hsp90与Cdc37之间存在很强的相互作用。y轴对应于关联阶段结束时的I-Response，x轴对应于不同的分析物Cdc37浓度。该图是使用表S1中提供的数据点生成的。分析结果摘要在图表中提供;对于该实验，KD值为0.003±0.009μM，R2值为0.99。请点击此处下载此文件。
补充图S7：从实验2生成的数据文件复制1。（一）实时监测实验数据。y轴对应于生物传感器单元（BU）中的I响应，x轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。该数字对应于第二次实验中第三次重复的数据，其中Hsp90固定在芯片上（500 nM）并制备了10浓度的Cdc37分析物（0.4-200 nM）。（B） 由自动分析软件生成的希尔拟合图。y 轴对应于 I 响应，x 轴对应于 nM 中分析物 （Cdc37） 的浓度。自动分析的结果显示KD值相对较低，标准差为0.0719±0.0007μM，表明Hsp90和Cdc37之间存在很强的相互作用。y 轴对应于关联阶段结束时的 I 响应。x轴对应于不同的分析物Cdc37浓度。该图是使用表S2中提供的数据点生成的。分析结果摘要在图表中提供;对于该实验，KD值为0.004±0.009μM，R2值为0.99。请点击此处下载此文件。
补充图S8：对照实验生成的数据文件。 （一）实时监测实验数据。y轴对应于生物传感器单元（BU）中的I响应，x轴对应于实验中分析物的不同时间点和浓度。该数字对应于对照实验的数据，其中Hsp90固定在芯片上（500 nM）并制备了10浓度的BSA（对照蛋白）分析物（0.4-200 nM）。实时I-Response图从10-15 BU左右的低I-Response开始，并且不会随着实验每个周期分析物浓度的增加而增加，这表明Hsp90和BSA之间没有相互作用。（B） 由自动分析软件生成的希尔拟合图。y 轴对应于 I 响应;x轴对应于nM中的分析物（BSA）浓度。自动分析的结果表明，没有足够的数据来计算KD 值，这表明Hsp90和BSA之间没有相互作用。（三）使用统计分析软件生成的关联图。y轴对应于关联阶段结束时的I-Response，x轴对应于不同的分析物BSA浓度。该图是使用 表 S4 中提供的数据点生成的。分析结果摘要在图表中提供;对于该实验，KD 值为-0.009±-0.0003μM，R2 值为0.82。接近零的负 KD 值表示 Hsp90 和 BSA 之间没有相互作用。 请点击此处下载此文件。
补充表 S1： 在每个集中点生成的I-Response值的摘要，并从每个芯片的晶体管（每个芯片三个不同的晶体管）读取。该表对应于从第二次重复实验中提取的数据，其中Hsp90固定在芯片上（500 nM）并制备了10浓度的Cdc37分析物（0.4-200 nM）。该表中的数据点用于统计分析软件中的分析。 请按此下载此表格。
补充表 S2： 在每个集中点生成的I-Response值的摘要，并从每个芯片的晶体管（每个芯片三个不同的晶体管）读取。该表对应于从第二次实验的第三次重复中提取的数据，其中Hsp90固定在芯片上（500 nM）并制备了10浓度的Cdc37分析物（0.4-200 nM）。该表中的数据点用于统计分析软件中的分析。 请按此下载此表格。
补充表 S3： 在每个集中点生成并从每个芯片的晶体管（每个芯片三个不同的晶体管）读取的I-Response值的摘要。该表对应于对照实验的数据，其中Hsp90固定在芯片上（500 nM）并制备了10浓度的BSA分析物（0.4-200 nM）。该表中的数据点用于统计分析软件中的分析。 请按此下载此表格。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究评估了使用FEB技术（一种实时动力学表征方法）的可行性，以确定Hsp90和Cdc37之间的生物分子相互作用。最初的探索性实验（第一个实验）表明，选择适当的分析物浓度是实验的关键部分，并且实验的设计应包括高于和低于KD 值的浓度点，这些浓度点是根据文献中可用的数据预测的。
然而，如果没有关于相互作用的初步信息，我们建议设计一个初步实验，在较低的（0.08 nM，0.16 nM，0.4 nM，2 nM）和更高的（1，000 nM，2，500 nM，5，000 nM）范围内包括广泛的浓度点。初步实验提供了KD 值的粗略估计，并能够使用正确的浓度范围计划后续实验，以获得准确的KD 值。FEB系统提供编辑协议功能，用户可以自由选择实验的浓度点数。
根据我们的经验，FEB协议涉及的最关键步骤如下。目标蛋白和分析物缓冲液应与校准缓冲液相同。即使是很小的缓冲区不匹配也可能导致I-Response的波动，并给出不可靠的结果。因此，我们建议通过适当的缓冲液交换进行隔夜透析。在整个实验过程中，在抽吸或应用溶液时小心地移液生物传感器芯片至关重要。粗心移液可能导致晶体管破裂或I响应波动;移液时，请确保不要接触芯片的敏感表面。芯片活化过程中使用的EDC/磺基-NHS溶液应在每次使用前新鲜混合。使用旧的混合物可能会导致芯片无法正常工作。确保对实验的所有周期中涉及的所有五个重复步骤（校准，关联，解离，再生和洗涤）使用相同的缓冲液。
当将FEB与现场成熟的生物分子检测系统（如BLI或SPR）进行比较时，我们发现所有三种方法都具有相似的优势43，44，45，它们是：它们是无标记的系统，不需要任何昂贵的荧光染料来检测相互作用;即使在小的nM范围内，它们也可以检测相互作用;这些芯片在SPR和FEB中都可以重复使用，并且可以有效地再生和重复使用多达10个实验，并且所有三种方法都实时提供动力学数据，并且实验时间很短。
SPR的主要优点是它提供了来自实验的更广泛数据，因此可以计算KD，Kon，Koff，化学计量和热力学参数44。BLI的主要优点是它能够在一次实验中测试多种浓度。通过使用不同的传感器，可以同时对多达八种浓度进行动力学测量。然而，BLI传感器是不可重复使用的，因此使得实验成本极高43。
FEB的主要优点是其自动化，用户友好的软件，可在整个实验过程中指导用户，以及其开放式移液平台，允许用户在每个步骤中将分析物添加到固定的靶标中。这种开放式移液方法与简单的软件相结合，使FEB易于学习，几乎不需要培训。然而，它确实要求用户对手动移液有基本的掌握，并且缺乏自动化的液体处理意味着步骤计时的再现性完全取决于用户。同样缺乏集成的液体处理意味着与SPR或BLI相比，芯片和仪器具有成本效益。FEB在检测生物分子相互作用方面也表现出高再现性和可靠性，这是由于生物传感器芯片制备中涉及的明确制造工艺35。
与成熟的标准ITC检测方法相比，FEB在整个实验中仅使用纳摩尔浓度的50μL分析物体积，从而降低了蛋白质成核或聚集的机会。ITC最大的问题之一是在上样前对蛋白质进行脱气，以避免气泡。在ITC实验期间，由于连续搅拌和强烈吹扫，测量池内有可能产生气泡，这可能会不利地溅出样品溶液或导致样品损失42。FEB技术通过提供强大的靶标固定化化学，减少聚集和冒泡，提高稳定性以及改善ITC面临的浓度依赖性问题，克服了ITC的这些挑战。
FEB器件的一个潜在缺点是它们对缓冲液成分和浓度变化的敏感性，这可能导致基线漂移，应在结果的拟合和分析过程中进行校正。生物传感器芯片对pH值和盐也敏感，因此在整个实验过程中，校准和分析物测量期间使用的缓冲液必须相同。用作防腐剂（例如叠氮化钠）和疏水分子的化学物质会损坏传感器，甚至可能导致非特异性结合的增加。通过注意整个测量步骤中的缓冲液一致性，透析分析物储备中的干扰化合物以及适当的表面钝化（例如，使用洗涤剂，蛋白质阻滞剂或不同的PEG分子），可以减轻这些缺点。
总之，我们通过使用 FEB 技术成功地证明了 Hsp90/Cdc37 之间的强 PPI，并使用 ITC 验证了它们的相互作用，提供了令人鼓舞的数据来支持 FEB 作为 PPI 检测的创新替代方法。FEB技术在药物发现，制药，小分子，肽和蛋白质的生物分子分析，抗体开发，药物验证和铅优化等不同领域提供了广泛的应用，通过将 体外 生物活性转化为 体内 功效，触手可及。考虑到FEB技术的优势及其在探索PPI，蛋白质和DNA或RNA相互作用以及蛋白质和小分子（例如药物）相互作用方面的巨大应用，我们提出它是PPI检测工具箱中一种独特而有前途的技术。在我们的实例中，FEB技术提供了一种有价值的工具，可以方便地评估Hsp90 / Cdc37 PPI候选拮抗剂的结合疗效，然后有助于选择有前途的候选药物，以进行与该PPI至关重要的各种疾病的进一步 体外 和 体内 评估。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有利益冲突，财务或其他方面。
Acknowledgments
这项研究得到了两国科学基金会（BSF）对S.K.S.和N.Q.的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated analysis software | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis. |
| COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
biosensor chip |
| Data review software | Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points. |
| Dialysis bag | CelluSep, Membrane filtration products | T2-10-15 CAS number: NA |
T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m) |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) | Cardea (Nanomed) | EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8 |
White powder |
| ITC (Isothermal titration calorimetry) system | Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) | NA CAS number: NA |
|
| MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer | Merck | M3671-50G CAS number: 4432-31-9 |
White powder |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips | Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Graphene-based chip |
| PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 | Bio-Lab | 001623237500 CAS number: 7758-11-4 |
Liquid transparent solution |
| Pipete | Thermo Scientific | 11855231 CAS number: NA |
Finnpipette F3 5-50 µL, yellow |
| Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-002-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-003-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Recombinant protein Cdc37 | Abcam | ab256157 CAS number: NA |
|
| Recombinant protein Hsp90 beta | Abcam | ab80033 CAS number: NA |
|
| Spreadsheet | Excel, Microsoft office | NA CAS number: NA |
|
| Statistical software | GraphPad, Prism | NA CAS number: NA |
Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used |
| Sulfo-NHS | Cardea (Nanomed) | NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7 |
White powder |
| Tips | Alex red | LC 1093-800-000 CAS number: NA |
Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs |
References
- Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
- Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
- Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
- Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
- Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
- Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
- Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
- Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
- Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
- Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
- Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
- Ideker, T., Sharan, R.
- Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
- Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
- Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R.
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
- Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T.
- Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
- Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
- Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
- Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
- Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
- Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
- Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
- Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
- Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
- Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
- Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
- Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
- Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
- Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E.
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
- Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).
