Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Udforskning af biomolekylær interaktion mellem den molekylære chaperon Hsp90 og dens klientproteinkinase Cdc37 ved hjælp af felteffektbiosensingteknologi

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Field-effect biosensing (FEB) er en etiketfri teknik til påvisning af biomolekylære interaktioner. Den måler den elektriske strøm gennem grafenbiosensoren, som bindingsmålene er immobiliseret til. FEB-teknologien blev brugt til at evaluere biomolekylære interaktioner mellem Hsp90 og Cdc37, og der blev påvist en stærk interaktion mellem de to proteiner.

Abstract

Biomolekylære interaktioner spiller alsidige roller i adskillige cellulære processer ved at regulere og koordinere funktionelt relevante biologiske begivenheder. Biomolekyler såsom proteiner, kulhydrater, vitaminer, fedtsyrer, nukleinsyrer og enzymer er grundlæggende byggesten i levende væsener; de samles i komplekse netværk i biosystemer for at synkronisere et utal af livsbegivenheder. Proteiner bruger typisk komplekse interaktomnetværk til at udføre deres funktioner; derfor er det obligatorisk at evaluere sådanne interaktioner for at opklare deres betydning i celler på både cellulært og organismeniveau. Mod dette mål introducerer vi en hurtigt voksende teknologi, field-effect biosensing (FEB), til at bestemme specifikke biomolekylære interaktioner. FEB er en stationær, etiketfri og pålidelig biomolekylær detektionsteknik til bestemmelse af specifikke interaktioner og bruger elektronisk baserede biosensorer af høj kvalitet. FEB-teknologien kan overvåge interaktioner i det nanomolære område på grund af de biokompatible nanomaterialer, der anvendes på dens biosensoroverflade. Som et bevis på konceptet blev protein-protein-interaktionen (PPI) mellem varmechokprotein 90 (Hsp90) og celledelingscyklus 37 (Cdc37) belyst. Hsp90 er en ATP-afhængig molekylær chaperon, der spiller en væsentlig rolle i foldning, stabilitet, modning og kvalitetskontrol af mange proteiner og derved regulerer flere vitale cellulære funktioner. Cdc37 betragtes som en proteinkinase-specifik molekylær chaperon, da den specifikt genkender og rekrutterer proteinkinaser til Hsp90 for at regulere deres nedstrøms signaltransduktionsveje. Som sådan betragtes Cdc37 som en co-chaperone af Hsp90. Chaperon-kinasevejen (Hsp90 / Cdc37-komplekset) er hyperaktiveret i flere maligniteter, der fremmer cellulær vækst; derfor er det et potentielt mål for kræftbehandling. Denne undersøgelse viser effektiviteten af FEB-teknologien ved hjælp af Hsp90 / Cdc37-modelsystemet. FEB påviste en stærk PPI mellem de to proteiner (KD-værdier på 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM i tre uafhængige eksperimenter). Sammenfattende er FEB en etiketfri og omkostningseffektiv PPI-detektionsplatform, der tilbyder hurtige og nøjagtige målinger.

Introduction

Biomolekylære interaktioner:
Proteiner er væsentlige dele af organismer og deltager i adskillige molekylære veje såsom cellemetabolisme, cellestruktur, cellesignalering, immunresponser, celleadhæsion og meget mere. Mens nogle proteiner udfører deres funktion(er) uafhængigt, interagerer de fleste proteiner med andre proteiner ved hjælp af en bindende grænseflade til at koordinere korrekt biologisk aktivitet1.

Biomolekylære interaktioner kan hovedsageligt klassificeres ud fra de forskellige strukturelle og funktionelle egenskaber ved involverede proteiner2, for eksempel baseret på proteinoverfladerne, den komplekse stabilitet eller persistensen af interaktioner3. Identifikation af essentielle proteiner og deres roller i biomolekylære interaktioner er afgørende for at forstå biokemiske mekanismer på molekylært niveau4. I øjeblikket er der forskellige tilgange til at detektere disse interaktioner5: in vitro6, in silico7, i levende celler8, ex vivo9 og in vivo10, hvor hver har sine egne styrker og svagheder.

In vivo-assays udføres ved hjælp af hele dyret som et eksperimentelt værktøj11, ogt ex vivo-assays udføres på vævsekstrakter eller hele organer (f.eks. Hjerte, hjerne, lever) i et kontrolleret eksternt miljø ved at give minimale ændringer i naturlige forhold. Den mest almindelige anvendelse af in vivo- og ex vivo-undersøgelser er at evaluere farmakokinetikken, farmakodynamikken og toksicitetsvirkningerne af potentielle farmakologiske agenser før humane forsøg ved at sikre deres samlede sikkerhed og virkning12.

Biomolekylære interaktioner kan også påvises i levende celler. Billeddannelse af levende celler giver os mulighed for at observere dynamiske interaktioner, når de udfører reaktionerne fra en bestemt biokemisk vej13. Desuden kan detektionsteknikker, såsom bioluminescens eller fluorescensresonansenergioverførsel, give information om, hvor og hvornår disse interaktioner forekommer i cellen14. Selvom detektion i levende celler tilbyder vigtige detaljer, er disse detektionsmetoder afhængige af optik og etiketter, som muligvis ikke afspejler den oprindelige biologi; de er også mindre kontrollerede end in vitro-metoder og kræver specialiseret ekspertise for at udføre15.

In silico-beregningsmetoderne anvendes primært til storstilet screening af målmolekyler før in vitro-forsøgene . Beregningsmæssige forudsigelsesmetoder, computerbaserede databaser, molekylær docking, kvantitative struktur-aktivitetsforhold og andre molekylære dynamiksimuleringsmetoder er blandt de veletablerede i silico-værktøjer 16. Sammenlignet med besværlige eksperimentelle teknikker kan in silico-værktøjerne let lave forudsigelser med høj følsomhed, men med reduceret nøjagtighed i prædiktiv ydeevne17.

In vitro-assays udføres med mikroorganismer eller biologiske molekyler uden for deres standard biologiske kontekst. At skildre biomolekylære interaktioner gennem in vitro-metoder er afgørende for at forstå proteinfunktioner og biologien bag det komplekse netværk af cellefunktion. Den foretrukne analysemetode vælges i henhold til proteinets iboende egenskaber, kinetiske værdier og interaktionsmåden og intensiteten18,19.

Hsp90/Cdc37-interaktionen:
Chaperon-kinase-vejen, der forbinder Hsp90 og Cdc37, er et lovende terapeutisk mål i tumorbiologi20. Hsp90 spiller en central rolle i cellecykluskontrol, proteinsamling, celleoverlevelse og signalveje. Proteiner, der er afhængige af Hsp90 for deres funktioner, leveres til Hsp90 til kompleksnering gennem en co-chaperon, såsom Cdc37. Hsp90/Cdc37-komplekset styrer foldningen af de fleste proteinkinaser og fungerer som et knudepunkt for en lang række intracellulære signalnetværk21. Det er et lovende antitumormål på grund af dets forhøjede ekspression i forskellige maligniteter, herunder akut myeloblastisk leukæmi, multipelt myelom og hepatocellulært carcinom22,23.

Almindeligt anvendt in vitro biomolekylære interaktionsdetekteringsteknikker
Co-immunoprecipitation (co-IP) er en teknik, der er afhængig af antigen-antistofs specificitet for at identificere biologisk relevante interaktioner24. Den primære ulempe ved denne metode er dens manglende evne til at detektere interaktioner med lav affinitet og kinetiske værdier24. Biofysiske metoder såsom isotermisk titreringskalorimetri (ITC), overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og FEB-teknologi foretrækkes til at bestemme de kinetiske værdier.

ITC er en biofysisk detektionsmetode baseret på bestemmelse af bindingsenergi sammen med en komplet termodynamikanalyse til karakterisering af biomolekylære interaktioner25. Den primære fordel ved ITC er, at det ikke kræver nogen mærkning eller fiksering af målproteinet. De største vanskeligheder, som ITC støder på, er den høje koncentration af målprotein, der kræves til et eksperiment, og vanskeligheden ved at analysere ikke-kovalente komplekser på grund af små bindende entalpier26. Både SPR og BLI er etiketfrie biofysiske teknikker, der er afhængige af immobilisering af målmolekylet på sensoroverfladen efterfulgt af efterfølgende injektioner af analytten over det immobiliserede mål27,28. I SPR måles ændringer i brydningsindekset under biomolekylære interaktioner27; i BLI registreres interferensen i reflekteret lys i realtid som en ændring i bølgelængden som en funktion af tid28. Både SPR og BLI deler fælles fordele ved at tilbyde høj specificitet, følsomhed og detektionsfunktioner29. I begge metoder immobiliseres målproteinet på biosensoroverflader, og der kan derfor være et vist tab af målets oprindelige konformation, hvilket gør det vanskeligt at skelne mellem specifikke vs. ikke-specifikke interaktioner30. BLI bruger dyre engangsfiberoptiske biosensorer til at immobilisere målet, og er derfor en dyr teknik31. Sammenlignet med disse veletablerede biomolekylære detektionsværktøjer tilbyder FEB-teknologien en pålidelig og etiketfri platform ved at bruge lave nanomolære koncentrationer til biomolekylær detektion i realtid med kinetisk karakterisering. FEB-teknologien overvinder også de boblende udfordringer, som ITC står over for, og er mere omkostningseffektiv sammenlignet med SPR eller BLI.

De felteffekttransistorbaserede biosensorer (FET) er et voksende felt til påvisning af biomolekylære interaktioner ved at tilbyde forskellige biomedicinske applikationer. I FET-systemet immobiliseres målene til biosensorchipsene, og interaktioner detekteres ved ændringer i konduktans32. Det unikke træk, der skal tages i betragtning ved udviklingen af en effektiv elektronisk biosensor, er de fysisk-kemiske egenskaber såsom den halvledende karakter og kemiske stabilitet af det belægningsmateriale, der anvendes til fremstilling af sensoroverfladen33. Konventionelle materialer som silicium, der anvendes til FET, har begrænset sensorernes følsomhed, fordi det kræver oxidlag klemt inde mellem transistorkanalen og et specifikt miljø for korrekt funktion34. Desuden er siliciumtransistorer følsomme over for miljøer med højt saltindhold, hvilket gør det svært at måle biologiske interaktioner i deres naturlige miljø. Den grafenbaserede biosensor præsenteres som et alternativ, da den tilbyder fremragende kemisk stabilitet og elektrisk felt. Da grafen er et enkelt atomlag af kulstof, er det både ekstremt følsomt som en halvleder og kemisk kompatibelt med biologiske opløsninger; begge disse kvaliteter er ønskelige for at generere kompatible elektroniske biosensorer35. Det bemærkelsesværdige ultrahøje belastningspotentiale i biomolekyler, der tilbydes af grafenbelagte biosensorer, fører til udviklingen af grafenbaserede biosensorer FEB-teknologi.

Princippet om FEB-teknologi: FEB er en etiketfri biomolekylær detektionsteknik, der måler den elektriske strøm gennem grafenbiosensoren, som bindingsmålene immobiliseres til. Interaktioner mellem det immobiliserede protein og analytten resulterer i ændringer i strømmen, der overvåges i realtid, hvilket muliggør nøjagtige kinetiske målinger36.

Instrumentering: FEB-systemet består af en grafenfelteffekttransistor (gFET) sensorchip og en elektronisk læser, der anvender en konstant spænding gennem hele eksperimentet (figur 1). Analytten påføres i opløsning på målproteinet immobiliseret på biosensoroverfladen. Når en interaktion opstår, måles og registreres en ændring i strømmen i realtid. Efterhånden som analytkoncentrationen stiger, vil fraktionen af bundet analyt også stige, hvilket forårsager højere vekslinger i strømmen. Ved hjælp af den automatiserede analysesoftware, der følger med instrumentet (Table of Materials), måles og registreres I-Response i form af biosensingenheder (BU)37. I-Response defineres som ændringen i strømmen (I) gennem biosensorchippen målt i realtid ved interaktionen mellem det immobiliserede mål og analytten. DEN FEB automatiserede analysesoftware kan analysere både I-Response og C-Response til dynamiske interaktionshændelser, hvor C-Response registrerer ændringerne i kapacitansen (C). Variationerne i både I-Response og C-Response svarer direkte til brøkdelen af bundet analyt og kan analyseres yderligere for at generere KD-værdier . Den automatiserede analysesoftwares standardpræference er I-Response.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over forsøgsopstillingen. (A) Grafenbaseret chip og elektronisk læser. (B) En oversigt over chipkomponenterne. Chippen er fastgjort til to elektroder, der leverer strøm til systemet. Overfladen af chippen er dækket af grafen, som, når den aktiveres, kan binde målet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Metodik:
Indledningsvis indsættes den aktiverede biosensorchip i FEB-enheden (figur 1) efterfulgt af udførelsen af nedenstående trin: (1) Kalibrering: Eksperimentet starter med systemkalibrering ved anvendelse af 1x fosfatbufret saltvand (PBS; pH = 7,4) for at skabe baseline-ligevægtsresponsen. (2) Tilknytning: Analytten indføres i chippen, og I-Response overvåges, indtil bindingsmætningen er nået. (3) Dissociation: Analytten dissocieres ved hjælp af 1x PBS. (4) Regenerering: Rester af analytten fjernes ved hjælp af 1x PBS. (5) Vask: I alt fem vaske udføres ved hjælp af 1x PBS til grundig fjernelse af de bundne og ubundne analytter fra chippen.

Analyse:
Dataanalyse udføres ved hjælp af den fuldautomatiske software, der følger med instrumentet. Den automatiserede analysesoftware genererer et Hill fit-plot med en KD-værdi . Hill fit-plottet beskriver en analyts tilknytning til målproteinet som en funktion af analytkoncentrationer. Koncentrationen, ved hvilken der opnås et halvt maksimalt respons, er proportional med KD-værdien . En lav KD-værdi repræsenterer høj bindingsaffinitet og omvendt.

For at validere de data, der er opnået fra FEB-eksperimentet, ekstraheres I-Responses fra hvert udlæsningspunkt for hver analytkoncentration ved hjælp af datagennemgangs-/eksportsoftwaren og kan eksporteres til anden statistisk analysesoftware (se materialetabellen) som forklaret nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: De rekombinante proteiner, der blev anvendt i denne undersøgelse, Hsp90 og Cdc37, blev kommercielt opnået (se tabel over materialer).

1. Chip aktivering

BEMÆRK: Alle materialer, der skal bruges i eksperimentet, er angivet i materialetabellen. Filtrer alle tilberedte opløsninger gennem et sterilt 0,2 μm filter.

  1. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidopløsning (EDC) fremstilles ved tilsætning af 2 mg EDC til 2,5 ml 1 M2-(N-morpholino) ethansulfonsyrebuffer (MES) buffer (pH = 6,0) i et 15 ml rør. N-hydroxysulfosuccinimidopløsninger (sulfo-NHS) fremstilles ved tilsætning af 6 mg sulfo-NHS til 2,5 ml 1 M MES-buffer (pH = 6,0) i et separat 15 ml rør.
  2. Bland lige store mængder EDC-sandsulfo-NHS-opløsning (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) ved pipettering op og ned (ikke hvirvel).
    BEMÆRK: Den blandede opløsning af EDC / sulfo-NHS skal anvendes inden for 30 minutter for at opretholde effektiv tværbinding for korrekt chipfunktionalisering.
  3. Anbring biosensorchippen (5,7 cm x 2,4 cm; se Materialetabel), der leveres af virksomheden, i en petriskål i glas med monteret låg. Alle funktionaliseringstrin, der er involveret i chipaktivering, foreslås udført i petriskålen. Påfør 50 μL 1 M MES-buffer (pH = 6,0) på biosensorchippen, inkuber i 1 minut ved stuetemperatur, og aspirer derefter bufferen.
  4. Påfør straks 50 μL EDC/sulfo-NHS-opløsning på sensorchippen. Dæk petriskålen til og inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
  5. Skyl chippen en gang med 50 μL 1 M MES-buffer (pH = 6,0); aspirer MES-bufferen.

2. Mål protein immobilisering

  1. Skyl chippen 2x med 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirer PBS fra chippen og tilsæt målmolekylet, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
    BEMÆRK: Buffer uoverensstemmelse kan ødelægge hele eksperimentet; Derfor er det vigtigt inden forsøget at sikre, at målmolekylet er i samme buffer som det, der anvendes til kalibrering (f.eks. 1x PBS (pH = 7,4)). Udfør om nødvendigt en bufferudveksling ved dialyse natten over før eksperimentet. I dette eksperiment blev dialyse natten over udført for begge rekombinante proteiner, Hsp90 og Cdc37, mod 1x PBS (pH = 7,4; se tabel over materialer) med korrekt bufferudveksling ved 4 °C. Koncentrationen af målmaterialet (Hsp90 i dette tilfælde) kan variere afhængigt af forskellige eksperimentelle protokoller og arten af målmaterialer (protein/peptid/ligander).
  2. Dæk glassets petriskålen og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Aspirer opløsningen indeholdende målmolekylet og skyl 3x med 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirer 1x PBS (pH = 7,4) opløsningen fra chippen.
  3. Tilsæt 50 μL Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alkohol i 1x PBS (pH = 7,4)) opløsning til chippen. Aspirer Quench 1-opløsningen fra chippen.
  4. Der tilsættes 50 μL Quench 2 (1 M ethanolamin (pH = 8,5)) opløsning til chippen. Dæk glasset petriskålen og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Aspirat Quench 2-opløsning fra chippen, og skyl chippen 5x ved hjælp af 50 μL 1x PBS, hvilket efterlader den sidste PBS-dråbe på sensoren.

3. Forberedelse af analytprøver

  1. Analytfortyndingsserier til Cdc37 fremstilles i det ønskede koncentrationsområde. Til det første eksperiment blev følgende koncentrationer anvendt: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM og 5.000 nM. Til det andet eksperiment blev der anvendt et andet sæt koncentrationer fra 0,4 nM til 200 nM.
  2. Forsøgsforsøget skal indeholde mindst otte forskellige analytkoncentrationer for at opnå en pålidelig KD-værdi . De forskellige fortyndinger af analytproteinet forberedes i samme buffer som den, der anvendes til kalibrering og målprotein. her er det 1x PBS (pH = 7,4).

4. Ilægning af den aktiverede biosensorchip i FEB-enheden

BEMÆRK: FEB-enheden består af en læser med LED-lysindikationer og en patron til at indsætte biosensorchippen.

  1. Efter målproteinimmobilisering skal du indsætte den aktiverede chip i enhedens patron, som er tilsluttet via USB til en computer. Efter chipindsættelsen vises et grønt LED-lys på læseren, der angiver, at FEB-enheden er klar til eksperimentet. Installer den automatiserede software (se tabel over materialer), der leveres af virksomheden på computeren, som FEB-enheden er tilsluttet, for at overvåge eksperimentet trin for trin som beskrevet nedenfor.

5. Kør eksperimentet

  1. Tryk på modulet Kør eksperiment på den automatiserede software, og vælg 10 punkter med regenerering eller en anden ønsket protokol. Udfyld følgende oplysninger: operatørnavn, eksperimentnavn, dato (f.eks. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); regenereringsbuffer (f.eks. PBS-buffer) immobiliseret mål (f.eks. Hsp90); analyt i opløsning (f.eks. Cdc37). Se supplerende figur S1 for yderligere oplysninger.
  2. Tryk på knappen Start eksperimentet , der vises på softwaren, og følg instruktionerne fra den automatiserede software som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Softwaren er fuldt automatiseret, brugervenlig og guider brugeren gennem hele eksperimentet trin for trin. Et pop op-vindue vises på skærmen med instruktioner til at gå videre på hvert trin i eksperimentet. Softwaren vil give instruktioner for hvert gentagende trin i træk fra kalibrering, analytforening, dissociation, regenerering og vask (5x) for hver analytkoncentration under hele eksperimentet.
  3. Udfør kalibrering af instrumenter. For at gøre dette skal du aspirere den resterende PBS-opløsning fra chippen og anvende 50 μL kalibreringsbuffer (1x PBS; pH = 7,4). Tryk på knappen Fortsæt , og vent i 5 minutter, indtil kalibreringstrinnet er afsluttet. Softwaren viser det slutpunkt, der er bestemt for kalibreringstrinnet (5 min.) med en advarselsalarm til opfølgning.
  4. Udfør derefter en analytforening. For at gøre dette skal kalibreringsbufferen aspireres fra chippen og påføres 50 μL af den laveste analytkoncentration (25 nM Cdc37). Tryk på knappen Fortsæt , og vent i 5 minutter, indtil tilknytningstrinnet er afsluttet. Softwaren viser slutpunktet for tilknytningstrinnet (5 min), mens en advarselsalarm fortsætter.
  5. Udfør en analyt dissociation. For at gøre dette skal analytopløsningen aspireres fra chippen og påføre 50 μL af dissociationsbufferen (1x PBS; pH = 7,4). Tryk på knappen Fortsæt , og vent i 5 minutter, indtil varigheden af dissociationstrinnet (5 min) er afsluttet. Softwaren viser slutpunktet for dissociationstrinnet (5 min) med en advarselsalarm til opfølgning.
  6. Udfør derefter chipregenerering. Aspirer dissociationsopløsningen fra chippen, og påfør 50 μL regenereringsbuffer (1x PBS; pH = 7,4). Tryk på knappen Fortsæt , og vent i 30 s, indtil varigheden af regenereringstrinnet (30 s) er afsluttet. Softwaren viser slutpunktet for regenereringstrinnet (30 s) med en advarselsalarm til opfølgning.
  7. Til sidst skal du vaske chippen. Aspirer regenereringsopløsningen fra chippen, og påfør 50 μL vaskebuffer (1x PBS; pH = 7,4) på chippen. Aspirer opløsningen fra chippen og gentag denne 5x. Lad den sidste dråbe vaskebuffer være på chippen, og tryk på knappen Fortsæt , og vent i 30 s, indtil vasketrinnets varighed er afsluttet i softwaredisplayet.
    BEMÆRK: Softwaren viser slutpunktet for vasketrinnet (30 s) med en advarselsalarm for at fortsætte med den næste cyklus i eksperimentet.
  8. Gentag trinnene for hver anvendt analytkoncentration; de fem trin kalibrering, analytforening, dissociation, regenerering og vask (5x) udgør én cyklus. Til eksperimentet vist her udførte vi 10 cyklusser for 10 analytkoncentrationer (fra 25 nM til 5.000 nM eller 0,4 nM til 200 nM; Figur 2).

6. Bedømmelse

  1. Tryk på knappen Analyse , der ses øverst i den automatiserede analysesoftware i slutningen af eksperimentet. Et displayvindue, der indeholder alle de eksperimentelle punkter, vises. I vinduet skal det sikres, at de analytkoncentrationer, der anvendes til den foreskrevne protokol, er korrekte.
  2. Tryk på knappen Kør analyse for automatisk at generere KD-værdien . Softwaren genererer et Hill fit-plot ved at plotte analytkoncentrationerne mod de tilsvarende I-Responses, hvorfra dissociationskonstanten ved ligevægt, KD-værdien , beregnes.
  3. Eksportér de rå data til analyse i anden statistisk analysesoftware ved hjælp af datagennemgangs-/eksportsoftwaren som beskrevet nedenfor.
    1. Kopier R1R-filen, der oprettes automatisk i slutningen af eksperimentet (f.eks. Hsp90 + Cdc37 14.03.2021), til en ny mappe på skrivebordet. Åbn den datagennemgangs-/eksportsoftware, der leveres af virksomheden (se supplerende figur S2A).
    2. Klik på Databehandling > Behandle R1R-filer > OK på startskærmen for datagennemgangs- / eksportsoftwaren.
    3. Vælg den mappe, der indeholder R1R-filer, der er oprettet på skrivebordet i trin 6.3.1. , og tryk på knappen OK . Dette opretter en kopi af de originale R1R-data for at gennemse og redigere dataene uden at tilsidesætte den oprindelige fil.
    4. Tryk på ikonet for databehandling, der ses på startskærmen i datagennemgangs-/eksportsoftwaren. Tryk på Indlæs behandlede R1R-filer > OK. Vælg den samme mappe, der blev oprettet i trin 6.3.1, og som indeholder behandlede R1R-filer. Tryk på OK. På dette trin er mappen, der indeholder eksperimentfilerne, klar til at blive gennemgået.
    5. Tryk på Dataanalyse på startskærmen for software til datagennemgang/-eksport. Vælg Kalibrering > Kalibrer redigeret R1R-filer > OK (se Supplerende figur S2B). Dette trin kalibrerer alle datapunkter i henhold til det første kalibreringstrin for at oprette en basislinje.
    6. Tryk på Dataanalyse på startskærmen for software til datagennemgang/-eksport. Vælg Gennemse og rediger R1R-filer > OK. Gennemse datapunkterne, slet punkter, eller tilføj trin ved hjælp af knappen Slet/tilføj trin . Sørg for, at alle trin er på det rigtige sted, f.eks. kalibreringstrinnet er på basislinjen, tilknytningstrinnet er på toppen (se supplerende figur S3), og tryk derefter på knappen Gem for at gemme alle de foretagne ændringer.
    7. Tryk på Dataanalyse på startskærmen for software til datagennemgang/-eksport. Vælg Analysér/afbild data, vælg de trin, der skal eksporteres (se supplerende figur S4). Tilføj hvert tilknytningstrin (f.eks. trin 2, trin 7 osv.), når du har trukket kalibreringstrinnet (f.eks. trin 1, trin 6 osv.) fra eksportlisten, før du eksporterer dataene.
    8. Tryk på Eksportér disse data. Softwaren genererer en regnearksfil, der indeholder I-Response for hvert analytkoncentrationsdatapunkt fra hver transistor (hvis alle transistorer fungerer, har vi tre forskellige I-responsværdier for hvert koncentrationspunkt). Brug denne regnearksfil til yderligere at analysere dataene i den statistiske software.
  4. Åbn den statistiske analysesoftware. Opret en XY-tabel med tre Y-værdier; tryk på Opret. Dataene for denne tabel (X, Y-værdier) kopieres fra regnearksfilen, der blev oprettet i trin 6.3.8. X-aksen svarer til analytkoncentrationen (afhængigt af den anvendte koncentration), og de tre Y-værdier svarer til I-Responses, der er opnået fra Data Review/Export-softwaren , der leveres af virksomheden.
  5. Tryk på Analysér disse data. Vælg XY-analyser > ikke-lineær regression (Curve Fit) > bindingsmætning > ét sted > total. Softwaren analyserer automatisk dataene, genererer KD-værdien og opretter en graf over datapunkterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultater fra forsøg 1:
Målproteinet Hsp90 (500 nM) blev immobiliseret til chippen efter målimmobiliseringsprotokollen som beskrevet ovenfor. Til det første forsøg blev der fremstillet 10 koncentrationer af analytproteinet, Cdc37, fra 25 nM til 5.000 nM, baseret på de data, der var tilgængelige i litteraturen (se tabel 1).

Trinene i eksperimentet kan overvåges i realtid ved at følge de ændringer, der forekommer i I-responsen (figur 3A). Man kan visualisere, hvordan hvert trin, der er inkluderet i protokollen, påvirker I-Response gennem hele eksperimentet. For eksempel er I-Response tæt på nul under kalibrering, og i associationstrinnet øges I-Response gradvist med stigende analytkoncentrationer (Cdc37). Ser man på dataene fra dette eksperiment (figur 3A), blev der observeret en pludselig stigning i I-responsen i lave analytkoncentrationer (50 BU ved 25 nM). Der var forventet et lavt I-response ved lav analytkoncentration, som vil stige gradvist med stigende koncentrationer. Denne pludselige stigning antydede, at et eksperiment med lavere analytkoncentrationspunkter skulle udformes.

Efter de protokoltrin, der er diskuteret ovenfor, blev dataene analyseret i den medfølgende automatiserede analysesoftware, som automatisk genererede et Hill fit-plot med en beregnet K D-værdi (figur 3B). KD-værdien beregnet ud fra den automatiserede analysesoftware til det første eksperiment var 350.000 ± 76.000 μM. De fleste af de almindelige biologiske interaktioner viste en KD-værdi i den lave μM eller endda i nM-området; således er KD-værdien, der genereres til det første eksperiment, meget høj.

Der kan være flere forklaringer på den observerede høje KD-værdi : Der kan være lav affinitetsbinding mellem de to undersøgte specifikke proteiner (Hsp90/Cdc37), hvilket betyder, at der kræves en høj ligandkoncentration for de molekylære interaktioner; forsøget kunne være designet med ikke-ideelle, out-of-range analytkoncentrationer; den høje værdi kan skyldes de indbyggede parametre, der anvendes i analysesoftwarens tilpasningsmodul. Den automatiserede analysesoftware bruger et dosis-respons-analysemodul til at passe til datapunkterne, men nogle interaktioner passer muligvis ikke godt ind i denne model, hvilket giver falske data, hvilket resulterer i høje KD-værdier .

For at opnå en nøjagtig KD-værdi med et mættet Hill-plot kræves standardisering af eksperimentet ved forsøg og fejl, som omfatter både lavere og højere analytkoncentrationspunkter for at opnå den laveste KD-værdi med en lav fejlrate.

I betragtning af alle disse faktorer blev dataene fra analysesoftware eksporteret til yderligere statistisk analysesoftware. I-Response for hvert tilknytningspunkt blev ekstraheret ved hjælp af den automatiserede datagennemgangs-/eksportsoftware og opsummeres i tabel 2 ved at følge de trin, der er beskrevet ovenfor i analysetrinnet (trin 6).

Resultaterne af den statistiske analysesoftware (figur 3C) viste en relativt lav KD-værdi med en høj standardafvigelse (0,011 ± 0,494 μM) og en lavR2-værdi på 0,78. Den signifikante variation, der blev observeret i KD-værdien og den laveR2-værdi , antydede, at de koncentrationspunkter, der blev valgt til dette forsøg, ikke er optimale. Derudover blev det også bemærket, at nogle grafpunkter ikke passede godt til plottrendlinjen (figur 3C); Dette styrkede behovet for at designe et andet eksperiment ved at inkludere forskellige analytkoncentrationspunkter.

De indbyggede parametre, der anvendes af de to analysesoftware, er helt forskellige, og det afspejles i K D-værdigenereringsprocessen. Forskellene i KD-værdierne opnået fra de to analysesoftware (350.000 ± 76.000 μM vs. 0.011 ± 0.494 μM) kan tilskrives det faktum, at forskellige analysemoduler blev brugt til beregning. Analysen udført i den statistiske analysesoftware kan være en bedre pasform til denne interaktion, hvilket giver en lavere KD-værdi.

Hvis resultaterne fra begge analyser kombineres (350.000 ± 76.000 μM og 0,011 ± 0,494 μM), kan det dog konkluderes, at det første forsøg ikke var optimalt, og at der ville være behov for yderligere koncentrationspunkter.

For at validere dette punkt blev det ukorrelerede grafpunkt, 3.000 nM, udelukket (se supplerende figur S5). Resultaterne af analysen viste en KD-værdi på 0,006 ± 0,081 μM med enR2-værdi på 0,98. Disse resultater viste, at det næste forsøg skulle udformes med fokus på mere relevante koncentrationer. Derfor blev der udført et andet eksperiment for at evaluere Hsp90 / Cdc37 PPI ved hjælp af forskellige testpunkter med koncentrationer under og over den forudsagte KD.

Resultater fra forsøg 2:
Målproteinet, Hsp90 (500 nM) blev immobiliseret til chippen ved hjælp af protokollen som beskrevet ovenfor. I alt 10 koncentrationer af analytten (Cdc37) blev fremstillet som følger: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM og 200 nM. Det andet eksperiment blev designet ved at inkludere forskellige analytkoncentrationspunkter ved at overveje alle de indsigter, der blev opnået fra det foregående eksperiment som nævnt ovenfor.

Under eksperimentet blev hvert trin overvåget i realtid (figur 4A). Her starter I-Response-grafen i realtid (afledt af de lave koncentrationer af analytten-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) oprindeligt fra nul og stiger gradvist ved stigningen i analytkoncentrationerne ved hver cyklus af eksperimentet sammenlignet med den pludselige stigning i I-Response, der blev observeret i det første eksperiment.

Efter ovennævnte protokol blev dataene analyseret ved hjælp af den automatiserede analysesoftware (figur 4B). KD-værdien beregnet ud fra den automatiserede analysesoftware til dette eksperiment var 0,0673 ± 0,0002 μM, hvilket antydede en stærk interaktion mellem målprotein Hsp90 og analyt Cdc37. Standardafvigelsen på 0,0002 μM var meget mindre end den, der blev opnået i det første eksperiment, hvilket giver tillid til, at de nye data er meget mere pålidelige.

For at validere dette resultat eksporterede vi datapunkterne (tabel 3) til en anden statistisk analysesoftware som forklaret tidligere; resultaterne fra analysen er opsummeret i figur 4C.

Ved hjælp af den statistiske analysesoftware blev det konstateret, at KD-værdien for Hsp90 / Cdc37 PPI er 0,014 ± 0,005 μM (figur 4C). De lave værdier af KD og standardafvigelsen indikerer en stærk interaktion mellem de to proteiner, Hsp90 og Cdc37. Desuden indikererR2-værdien på 0,99, at analysen passer perfekt til de eksperimentelle grafpunkter. Begge analyseprogrammer viste konsistens i resultaterne med lave KD-værdier på henholdsvis ca. 0,0673 ± 0,0002 μM og 0,014 ± 0,005 μM.

For at bekræfte eksperimentets reproducerbarhed og nøjagtighed blev det samme eksperiment udført i to replikater ved anvendelse af Hsp90 (500 nM) som målprotein og Cdc37 som analyt med de samme koncentrationer fra 0,4 nm til 200 nm som anvendt i det andet eksperiment. Under forsøget blev hvert trin overvåget i realtid (supplerende figur S6A og supplerende figur S7A). KD-værdien beregnet ud fra den automatiserede analysesoftware er afbildet i supplerende figur S6B og supplerende figur S7B (henholdsvis 0,053 ± 0,002 μM og 0,0719 ± 0,0007 μM). Som tidligere nævnt blev datapunkterne eksporteret (supplerende tabel S1 og supplerende tabel S2) til en anden statistisk analysesoftware, og resultaterne er vist i supplerende figur S6C og supplerende figur S7C (supplerende figur S6C: KD er 0,003 ± 0,009 μM og R2 er 0,99; Supplerende figur S7C: KD er 0,004 ± 0,009 μM ogR2 er 0,99). Resultaterne af de to replikater fra begge analysesoftwaren bekræftede godt og bekræftede nøjagtigheden, repeterbarheden og reproducerbarheden af Hsp90 / Cdc37 FEB eksperimentelle data.

Der blev også udført et kontrolstudie, hvor den biomolekylære interaktion mellem Hsp90 og et kontrolprotein, Bovine serumalbumin (BSA), blev belyst. Kontrolundersøgelsen ved hjælp af BSA som analyt blev udført ved hjælp af en identisk eksperimentel opsætning og analytkoncentrationer, der blev anvendt i det andet eksperiment. I alt 10 koncentrationer af kontrolproteinet, BSA, fra 0,4 nM til 200 nM blev fremstillet i 1x PBS (pH = 7,4), og hvert trin i eksperimentet blev overvåget i realtid.

I lighed med eksperimentet med Hsp90 og Cdc37 starter I-Response-grafen i realtid oprindeligt fra 0; I kontrolundersøgelsen steg I-Responset imidlertid ikke gradvist ved stigningen i analytkoncentrationerne (supplerende figur S8A). Dataene blev også analyseret ved hjælp af den automatiserede analysesoftware (supplerende figur S8B), og softwaren var ikke i stand til at beregne KD-værdien ud fra datapunkterne i dette eksperiment. Det fremgår af Hill Plot genereret fra softwaren, at der ikke er nogen interaktion mellem Hsp90 og kontrol-BSA-analytten. For at validere dette resultat eksporterede vi datapunkterne (supplerende tabel S3) til en anden statistisk analysesoftware som forklaret tidligere. Ved hjælp af den statistiske analysesoftware blev det konstateret, at KD-værdien for Hsp90/BSA PPI er negativ (supplerende figur S8C; KD er -0,009 ± -0,0003 μM), hvilket igen indikerer, at der ikke er nogen interaktion mellem de to proteiner, Hsp90 og BSA. Desuden indikererR2-værdien (0,82), at analysen ikke passede til de eksperimentelle grafpunkter. Begge analysesoftware viste konsistens i resultaterne, at Hsp90 og BSA ikke interagerer.

Ved sammenligning af Hsp90/Cdc37 FEB eksperimentelle data med andre eksperimentelle data, der er tilgængelige i litteraturen, blev det konstateret, at KD-værdierne opnået i denne undersøgelse (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM og KD = 0,072 ± 0,001 μM) var i to størrelsesordener lavere end tidligere offentliggjorte data (KD = 1,46 μM38 eller 6 μM39 ). Disse forskelle kan tilskrives brugen af humane Hsp90- og Cdc37-konstruktioner i fuld længde i de nuværende eksperimenter. Tidligere undersøgelser blev udført på gær Hsp90-konstruktioner, der kun indeholdt partielt protein38 eller C. elegans homologproteiner 39 (tabel 1). For at validere resultaterne opnået i FEB-systemet blev ITC-eksperimenter udført.

Evaluering af Hsp90/Cdc37 PPI ved hjælp af ITC-systemet:
ITC betragtes som guldstandarden til at undersøge biomolekylære interaktioner. Vi udførte yderligere ITC for at bestemme den termodynamiske kinetik af Hsp90 / Cdc37 PPI og som validering for FEB-eksperimentet. Hsp90 og Cdc37 udsættes for dialyse mod PBS (pH = 7,0) før ITC. Ca. 0,25 μM opløsning af målproteinet (Hsp90) og 2,5 μM opløsning af analytprotein (Cdc37) blev fremstillet i PBS til de kalorimetriske titreringer. Et samlet volumen på 80 μL Cdc37-opløsning med på hinanden følgende intervaller blev titreret fra den roterende sprøjte til cellen indeholdende 150 μL Hsp90-opløsning ved 298,15 K. Hver injektion fandt sted over en varighed på 4 s, og tidsintervallet mellem på hinanden følgende injektioner var 150 s. I alt 19 injektioner på hver 2 μL blev foretaget med en omrøringshastighed på henholdsvis 500 o / min og en referenceeffekt på 41,9 μW. Varmevariationen som følge af Hsp90/Cdc37-interaktionen blev overvåget, og de endelige data, der blev opnået ved afslutningen af Cdc37-analytinjektionerne, blev monteret ved hjælp af ITC-analysesoftware leveret af virksomheden. Varmevariationerne sammen med de termodynamiske parametre såsom molær entalpiændring (ΔH), entropiændring (ΔS), antallet af bindingssteder (n) og ligevægtsdessociationskonstanten (KD) mellem Hsp90 / Cdc37 PPI blev estimeret. Gibbs-fri energiændring (ΔG) blev også beregnet ud fra ligningen ΔG = ΔH - TΔS efter opnåelse af termiske parametre fra ITC-termogrammet.

ITC-plottet afslører mængden af varme, der bruges eller frigøres under de biologiske interaktioner for at belyse arten af interaktioner og intermolekylære kræfter, der styrer PPI40. Cdc37 (2,5 μM) blev titreret i Hsp90 (0,25 μM), og de tilsvarende kurver er afbildet i figur 5A,B. Det opnåede ITC-plot viste sig at være eksotermt og blev monteret i en enkelt bindingsstedsmodel, der udviste en bindende støkiometri (n) på en, bindende energi, ΔG = -45,9 kJ / mol og KD-værdi = 0,009 μM. Den lille inkonsekvens, der observeres i form af et endotermt skift i begyndelsen af ITC-termogrammet (figur 5A), antyder dannelsen af bobler, mens analytproteinet titreres til målecellen41,42. Blandt Hsp90/Cdc37 PPI, ITC-eksperimenter udført ved lavere og højere koncentrationer, udviste det 10 gange store overskud af Cdc37 (Hsp90-koncentration = 0,25 μM og Cdc37-koncentration = 2,5 μM) acceptable bindingsparametre ved at opnå en mætningskurve. KD-værdien opnået fra ITC (KD = 0,009 μM) korrelerede godt med KD-værdien beregnet ved hjælp af FEB-teknologi (KD = 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM), hvilket stærkt understøtter FEB's følsomhed og nøjagtighed ved påvisning af Hsp90 / Cdc37 PPI.

Figure 2
Figur 2: Protokoloversigt. (A) Oversigt over trinnene til chipaktiveringsprocessen. (B) Grafisk gengivelse af de fem gentagne trin i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Datafiler genereret fra eksperiment 1. (A) Eksperimentdata overvåget i realtid. Y-aksen svarer til I-Response i biosensorenheder (BU), og x-aksen svarer til de forskellige tidspunkter og koncentrationer af analytten i forsøget. Dette tal svarer til dataene fra det første eksperiment. (B) Hill Fit-plot genereret fra den automatiserede analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response, x-aksen svarer til koncentrationer af analyt (Cdc37) i nM. For dette eksperiment er KD-værdien 350.000 ± 76.000 μM. (C) Association plot genereret ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response i slutningen af associationsfasen, x-aksen svarer til de forskellige analyt-, Cdc37-koncentrationer. Dette plot blev genereret ved hjælp af datapunkterne i tabel 2. Resumé af analyseresultaterne findes i grafen; for dette eksperiment er KD-værdien 0,011 ± 0,494 μM, ogR2-værdien er 0,78. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Datafiler genereret fra eksperiment 2. (A) Eksperimentdata overvåget i realtid. Y-aksen svarer til I-Response i biosensorenheder (BU), og x-aksen svarer til de forskellige tidspunkter og koncentrationer af analytten i forsøget. Dette tal svarer til dataene fra det andet eksperiment. (B) Hill Fit-plot genereret fra den automatiserede analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response, x-aksen svarer til koncentrationen af analyt (Cdc37) i nM. For dette eksperiment er KD-værdien 0,0673 ± 0,0002 μM (C) Association-plot genereret ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response i slutningen af associationsfasen, x-aksen svarer til de forskellige analyt Cdc37-koncentrationer. Dette plot blev genereret ved hjælp af datapunkterne i tabel 3. Resumé af analyseresultaterne findes i grafen; for dette eksperiment er KD-værdien 0,014 ± 0,005 μM, ogR2-værdien er 0,99. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: ITC-termogram af Hsp90- og Cdc37-interaktion. (A) Toppanelet repræsenterer de tilsvarende varmeudviklende kurver opnået på grund af på hinanden følgende injektioner af Cdc37 (2,5 μM) i Hsp90 (0,25 μM) ved 298,15 K. Den differentielle effekt (DP) repræsenterer differentiel effekt som en funktion af tiden. (B) De integrerede datapunkter i bundpanelet angiver den tilsvarende normaliserede varme i forhold til det molære forhold mellem Hsp90 /Cdc37. Klik her for at se en større version af denne figur.

Assays udført FEB analyse KD Prisme analyse KD Konstruer oprindelse Aminosyrer Referencer
ITC 1,46 μM og 1,32 μM NA Gær Hsp90 N-terminal domæne af Hsp90 36
Menneskelig Cdc37
SPR 6 μM NA C. elegans Fuld længde 37
FEB - Første repetion 0,014 μM 0,067 μM Menneskelig Hsp90 Fuld længde Udført i denne undersøgelse
Menneskelig Cdc37
FEB - Anden gentagelse 0,053 μM 0,003 μM Menneskelig Hsp90 Fuld længde Udført i denne undersøgelse
Menneskelig Cdc37
FEB - Tredje gentagelse 0,072 μM 0,004 μM Menneskelig Hsp90 Fuld længde Udført i denne undersøgelse
Menneskelig Cdc37
ITC 0,009 μM NA Menneskelig Hsp90 Fuld længde Udført i denne undersøgelse
Menneskelig Cdc37
FEB- Kontrolundersøgelse Ingen data (Der var utilstrækkelige data til at beregne KD) -0,009 μM (KD-værdi med negative værdier indikerer, at der ikke er nogen interaktion) Menneskelig Hsp90 Fuld længde Udført i denne undersøgelse
BSA

Tabel 1: Hsp90/Cdc37 PPI-evaluering ved hjælp af forskellige metoder rapporteret i denne undersøgelse og litteraturen.

Analytkoncentrationer (nM) I-Respons transistor 1 I-Respons transistor 2 I-Respons transistor 3 Gennemsnitlig
Jeg-svar
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tabel 2: Resumé af I-Response-værdierne genereret fra tre forskellige transistorer af hver chip ved hvert koncentrationspunkt i det første eksperiment.

Analytkoncentrationer (nM) I-Respons transistor 1 I-Respons transistor 2 I-Respons transistor 3 Gennemsnitlig i-respons
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tabel 3: Resumé af I-Response-værdierne genereret fra tre forskellige transistorer af hver chip ved hvert koncentrationspunkt i det andet eksperiment.

Supplerende figur S1: Skærmbillede af hovedskærmen for automatiseret software før eksperimentets begyndelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Skærmbillede af hovedskærmen i automatiseret software til databehandling og analyse. (A) Hovedskærmvisning af datagennemgangs-/eksportsoftware, der viser databehandlingsmuligheder. (B) Hovedskærmen viser datagennemgangs-/eksportsoftware, der viser dataanalysemuligheder. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Gennemgangsdatapunkterne fra gennemgangs-/eksportsoftware. I dette trin skal du gennemse eksperimentet og tilføje eller slette datapunkter. Sørg for, at tilknytningspunktet (2, 7, 12, 17, 22 osv.) altid er ved valget. For eksempel er det første valg fra venstre datapunkt nummer 2 og derefter datapunkt nummer 10 (men det skal være nummer 7). For at løse dette skal du blot slette punkt 3, 4 og 5. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Eksportér f.eks. dataliste. I dette trin skal du vælge, hvilke eksperimentpunkter der skal eksporteres. Vælg et tilknytningspunkt (2, 7, 12, 17, 22 osv.), Og træk de foregående kalibreringstrin fra (1, 6, 11, 16, 21 osv.). Føj alle punkterne til eksportlisten, og eksporter disse data for at få et regneark med I-Response for hvert datapunkt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S5: Foreningsplot genereret ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response i slutningen af associationsfasen, x-aksen svarer til de forskellige analyt Cdc37-koncentrationer. Dette plot blev genereret ved hjælp af datapunkterne fra det første eksperiment og udelukkede 3.000 nM koncentrationsdatapunktet. Resumé af analyseresultaterne findes i grafen; for dette eksperiment er KD-værdien 0,006 ± 0,081 μM, ogR2-værdien er 0,98. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S6: Datafiler genereret fra eksperiment 2 replikere 1. (A) Eksperimentdata, der overvåges i realtid. Y-aksen svarer til I-Response i biosensorenheder (BU), og x-aksen svarer til de forskellige tidspunkter og koncentrationer af analytten i forsøget. Dette tal svarer til dataene fra den anden gentagelse udført i det andet eksperiment, hvor Hsp90 blev immobiliseret på chippen (500 nM), og 10 koncentrationer af Cdc37-analyt blev fremstillet (0,4-200 nM). I-Response-grafen i realtid starter oprindeligt fra 0 og stiger gradvist ved stigningen i analytkoncentrationerne ved hver cyklus af eksperimentet, hvilket tyder på, at eksperimentet er vellykket. (B) Hill Fit-plot genereret fra den automatiserede analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response, x-aksen svarer til koncentrationer af analyt (Cdc37) i nM. Resultaterne fra den automatiserede analyse viste en relativt lav KD-værdi og lav standardafvigelse på 0,0531 ± 0,0002 μM, hvilket tyder på en stærk interaktion mellem Hsp90 og Cdc37. (C) Foreningsplottet genereret ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response i slutningen af associationsfasen, x-aksen svarer til de forskellige analyt Cdc37-koncentrationer. Dette plot blev genereret ved hjælp af datapunkterne i tabel S1. Resumé af analyseresultaterne findes i grafen; for dette eksperiment er KD-værdien 0,003 ± 0,009 μM ogR2-værdien er 0,99. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S7: Datafiler genereret fra eksperiment 2 replikerer 1. (A) Eksperimentdata, der overvåges i realtid. Y-aksen svarer til I-Response i biosensorenheder (BU), og x-aksen svarer til de forskellige tidspunkter og koncentrationer af analytten i forsøget. Dette tal svarer til data fra den tredje gentagelse i det andet eksperiment, hvor Hsp90 blev immobiliseret på chippen (500 nM), og der blev fremstillet 10 koncentrationer af Cdc37-analyt (0,4-200 nM). (B) Hill Fit-plot genereret fra den automatiserede analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response, x-aksen svarer til koncentrationer af analyt (Cdc37) i nM. Resultaterne fra den automatiserede analyse viste en relativt lav KD-værdi og en lav standardafvigelse på 0,0719 ± 0,0007 μM, hvilket tyder på en stærk interaktion mellem Hsp90 og Cdc37. (C) Association plot genereret ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response i slutningen af associationsfasen. X-aksen svarer til de forskellige cdc37-koncentrationer i analytten. Dette plot blev genereret ved hjælp af datapunkterne i tabel S2. Resumé af analyseresultaterne findes i grafen; for dette eksperiment er KD-værdien 0,004 ± 0,009 μM, ogR2-værdien er 0,99. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S8: Datafiler genereret fra kontroleksperimentet. (A) Eksperimentdata, der overvåges i realtid. Y-aksen svarer til I-Response i biosensorenheder (BU), og x-aksen svarer til de forskellige tidspunkter og koncentrationer af analytten i forsøget. Dette tal svarer til data fra kontrolforsøget, hvor Hsp90 blev immobiliseret på chippen (500 nM), og der blev fremstillet 10 koncentrationer af BSA-analyt (kontrolprotein) (0,4-200 nM). I-Response-grafen i realtid starter fra lavt I-response omkring 10-15 BU og øges ikke ved en stigning i analytkoncentrationerne ved hver cyklus af eksperimentet, hvilket tyder på, at der ikke er nogen interaktion mellem Hsp90 og BSA. (B) Hill Fit-plot genereret fra den automatiserede analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response; x-aksen svarer til koncentrationerne af analyt (BSA) i nM. Resultaterne fra den automatiserede analyse viste, at der ikke er tilstrækkelige data til at beregne KD-værdien , hvilket tyder på, at der ikke er nogen interaktion mellem Hsp90 og BSA. (C) Foreningsplot genereret ved hjælp af den statistiske analysesoftware. Y-aksen svarer til I-Response i slutningen af associationsfasen, x-aksen svarer til de forskellige analyt-BSA-koncentrationer. Dette plot blev genereret ved hjælp af datapunkterne i tabel S4. Resumé af analyseresultaterne findes i grafen; for dette eksperiment er KD-værdien -0,009 ± -0,0003 μM ogR2-værdien er 0,82. En negativ KD-værdi tæt på nul indikerer, at der ikke er nogen interaktion mellem Hsp90 og BSA. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Resumé af I-Response-værdierne genereret ved hvert koncentrationspunkt og læst fra hver chips transistorer (tre forskellige transistorer for hver chip). Denne tabel svarer til de data, der blev ekstraheret fra den anden gentagelse udført for det andet eksperiment, hvor Hsp90 blev immobiliseret på chippen (500 nM), og 10 koncentrationer af Cdc37-analyt blev fremstillet (0,4-200 nM). Datapunkterne fra denne tabel blev brugt til analyse i den statistiske analysesoftware. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S2: Resumé af I-Response-værdierne genereret ved hvert koncentrationspunkt og læst fra hver chips transistorer (tre forskellige transistorer for hver chip). Denne tabel svarer til de data, der blev ekstraheret fra den tredje gentagelse udført for det andet eksperiment, hvor Hsp90 blev immobiliseret på chippen (500 nM), og 10 koncentrationer af Cdc37-analyt blev fremstillet (0,4-200 nM). Datapunkterne fra denne tabel blev brugt til analyse i den statistiske analysesoftware. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S3: Resumé af I-Response-værdierne, der genereres ved hvert koncentrationspunkt og læses fra hver chips transistor (tre forskellige transistorer for hver chip). Denne tabel svarer til data fra kontrolforsøget, hvor Hsp90 blev immobiliseret på chippen (500 nM), og der blev fremstillet 10 koncentrationer af BSA-analyt (0,4-200 nM). Datapunkterne fra denne tabel blev brugt til analyse i den statistiske analysesoftware. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse blev muligheden for at anvende FEB-teknologien (en kinetisk karakteriseringsmetode i realtid) evalueret for at bestemme den biomolekylære interaktion mellem Hsp90 og Cdc37. Det indledende sonderende eksperiment (første eksperiment) foreslog, at valg af de korrekte analytkoncentrationer er en kritisk del af eksperimentet, og at eksperimentet skulle designes ved at inkludere koncentrationspunkter over og under KD-værdien , som blev forudsagt ud fra de tilgængelige data i litteraturen.

Ikke desto mindre, hvis der ikke er nogen foreløbige oplysninger om interaktionen, foreslår vi at designe et foreløbigt eksperiment ved at inkludere en bred vifte af koncentrationspunkter i både lavere (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) og højere (1,000 nM, 2,500 nM, 5,000 nM) intervaller. Det indledende eksperiment giver et groft skøn over KD-værdien og gør det muligt at planlægge de efterfølgende eksperimenter ved hjælp af de rigtige koncentrationsområder for at opnå en nøjagtig KD-værdi . FEB-systemet tilbyder en redigeringsprotokolfunktion, hvor man frit kan vælge antallet af koncentrationspunkter for eksperimentet.

Fra vores erfaring er de mest kritiske trin, der er involveret i FEB-protokollen, som følger. Målprotein- og analytbufferen bør være den samme som kalibreringsbufferen. Selv en lille buffermismatch kan forårsage udsving i I-Response og give upålidelige resultater. Således foreslår vi at udføre dialyse natten over ved korrekt bufferudveksling. Omhyggelig pipettering på biosensorchippen under opspiring eller påføring af en opløsning er afgørende under hele eksperimentet. Uforsigtigt pipettering kan føre til ødelagte transistorer eller udsving i I-Response; Under pipettering skal du sørge for ikke at røre ved chippens følsomme overflade. EDC/sulfo-NHS-opløsningen, der anvendes i chipaktiveringsprocessen, skal blandes frisk inden hver brug. Brug af en gammel blanding kan resultere i en ikke-funktionaliseret chip. Sørg for at bruge den samme buffer til alle de fem gentagne trin (kalibrering, association, dissociation, regenerering og vask), der er involveret i alle cyklusser af eksperimentet.

Når vi sammenlignede FEB med veletablerede biomolekylære detektionssystemer på området, såsom BLI eller SPR, fandt vi, at alle tre metoder deler lignende fordele 43,44,45, som er: de er etiketfrie systemer, som ikke kræver dyre fluorescerende farvestoffer for at detektere interaktionerne; de kan registrere interaktioner selv i små nM-intervaller; chipsene kan genbruges i både SPR og FEB, og de kan regenereres og genbruges effektivt til op til 10 eksperimenter, og alle tre metoder giver kinetiske data i realtid, og eksperimenttiden er kort.

Den største fordel ved SPR er, at det giver mere omfattende data fra eksperimentet, så man kan beregne KD, Kon, Koff, støkiometri og termodynamiske parametre44. Den største fordel ved BLI er dens evne til at teste flere koncentrationer i et eksperiment. De kinetiske målinger kan udføres samtidigt i op til otte koncentrationer ved hjælp af forskellige sensorer. BLI-sensorerne kan dog ikke genbruges, hvilket gør omkostningerne ved eksperimentet ekstremt høje43.

Den største fordel ved FEB er dens automatiserede, brugervenlige software, der guider brugeren gennem hele eksperimentet, og dens åbne pipetteringsplatform, der giver brugeren mulighed for at tilføje analytten til det immobiliserede mål ved hvert trin. Denne åbne pipetteringsmetode kombineret med en simpel software gør FEB let at lære og kræver lidt eller endda ingen træning. Det kræver dog, at brugeren har en grundlæggende beherskelse af håndpipettering, og manglen på automatiseret væskehåndtering betyder, at reproducerbarheden af trintiming helt afhænger af brugeren. Den samme mangel på integreret væskehåndtering betyder, at chips og instrumenter er omkostningseffektive sammenlignet med SPR eller BLI. FEB udviser også høj reproducerbarhed og pålidelighed ved påvisning af biomolekylære interaktioner på grund af den definerede fremstillingsproces, der er involveret i biosensorchipforberedelse35.

Sammenlignet med den veletablerede og standard ITC-detektionsmetode anvender FEB kun 50 μL analytvolumen ved nanomolære koncentrationer til hele eksperimentet, hvilket reducerer chancen for nukleation eller aggregering af proteiner. Et af de største problemer med ITC er afgasning af proteinerne inden belastning for at undgå luftbobler. Under ITC-eksperimentet er der en chance for at udvikle bobler inde i målecellen på grund af kontinuerlig omrøring og intens udrensning, hvilket kan sprøjte prøveopløsningen negativt eller forårsage prøvetab42. FEB-teknologien overvinder disse udfordringer ved ITC ved at tilbyde robust målimmobiliseringskemi, reducere aggregering og boble, øge stabiliteten og forbedre koncentrationsafhængige problemer, som ITC står over for.

En potentiel ulempe ved FEB-udstyr er deres modtagelighed for buffersammensætning og koncentrationsændringer, hvilket kan forårsage en afdrift i basislinjen, som bør korrigeres under tilpasningen og analysen af resultaterne. Biosensorchippen er også følsom over for pH og salt, så buffere, der anvendes under kalibrering og måling af analytten, skal være de samme under hele forsøget. Kemikalier, der anvendes som konserveringsmidler (f.eks. natriumazid) og hydrofobe molekyler, kan beskadige sensoren og kan endda forårsage en stigning i ikke-specifik binding. Disse ulemper kan afbødes med opmærksomhed på bufferkonsistens i hele måletrinnene, dialyse af interfererende forbindelser fra analytstammen og passende passivering af overfladen (f.eks. Brug af vaskemidler, proteinblokkere eller forskellige PEG-molekyler).

Sammenfattende demonstrerede vi med succes stærk PPI mellem Hsp90 / Cdc37 ved hjælp af FEB-teknologien og validerede deres interaktion ved hjælp af ITC, hvilket gav opmuntrende data til støtte for FEB som en innovativ alternativ metode til PPI-detektion. FEB-teknologien tilbyder en bred vifte af anvendelser inden for forskellige områder af lægemiddelopdagelse, lægemidler, biomolekylær analyse af små molekyler, peptider og proteiner, antistofudvikling, lægemiddelvalidering og blyoptimering lige ved hånden ved at oversætte in vitro-biologisk aktivitet let til in vivo-effektivitet . I betragtning af fordelene ved FEB-teknologi og dens enorme anvendelser til at udforske PPI-, protein- og DNA- eller RNA-interaktioner samt protein- og småmolekyleinteraktioner (f.eks. Lægemiddel) foreslår vi, at det er en unik, lovende teknologi i PPI-detektionsværktøjskassen. I vores tilfælde er FEB-teknologien et værdifuldt redskab til let at vurdere den bindende virkning af Hsp90/Cdc37 PPI-kandidatantagonister, som derefter hjælper med at udvælge lovende kandidater til yderligere in vitro- og in vivo-evalueringer vedrørende forskellige sygdomme, hvor denne PPI er kritisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, økonomiske eller på anden måde.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Binational Science Foundation (BSF) til S.K.S. og N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

Biokemi Udgave 181 Celledelingscyklus 37 Cdc37 Varmechokprotein 90 Hsp90 Proteinkinase Grafenbiosensor Biosensing med felteffekt Kræft Biomolekylære interaktioner
Udforskning af biomolekylær interaktion mellem den molekylære chaperon Hsp90 og dens klientproteinkinase Cdc37 ved hjælp af felteffektbiosensingteknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter