Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utforske biomolekylær interaksjon mellom molekylær chaperone Hsp90 og dets klientprotein Kinase Cdc37 ved hjelp av field-effect biosensing teknologi

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Field-effect biosensing (FEB) er en etikettfri teknikk for å oppdage biomolekylære interaksjoner. Den måler den elektriske strømmen gjennom grafenbiosensoren som bindingsmålene immobiliseres til. FEB-teknologien ble brukt til å evaluere biomolekylære interaksjoner mellom Hsp90 og Cdc37, og det ble påvist et sterkt samspill mellom de to proteinene.

Abstract

Biomolekylære interaksjoner spiller allsidige roller i en rekke cellulære prosesser ved å regulere og koordinere funksjonelt relevante biologiske hendelser. Biomolekyler som proteiner, karbohydrater, vitaminer, fettsyrer, nukleinsyrer og enzymer er grunnleggende byggesteiner i levende vesener; de samles i komplekse nettverk i biosystemer for å synkronisere et utall livshendelser. Proteiner bruker vanligvis komplekse interaktivitetsnettverk for å utføre sine funksjoner; Derfor er det obligatorisk å evaluere slike interaksjoner for å avdekke deres betydning i celler på både cellulære og organismenivåer. Mot dette målet introduserer vi en raskt fremvoksende teknologi, felteffekt biosensing (FEB), for å bestemme spesifikke biomolekylære interaksjoner. FEB er en stasjonær, etikettfri og pålitelig biomolekylær deteksjonsteknikk for å bestemme spesifikke interaksjoner og bruker elektroniske biosensorer av høy kvalitet. FEB-teknologien kan overvåke interaksjoner i nanomolarområdet på grunn av de biokompatible nanomaterialene som brukes på biosensoroverflaten. Som et konseptbevis ble proteinproteininteraksjonen (PPI) mellom varmesjokkprotein 90 (Hsp90) og celledelingssyklus 37 (Cdc37) belyst. Hsp90 er en ATP-avhengig molekylær anstand som spiller en viktig rolle i folding, stabilitet, modning og kvalitetskontroll av mange proteiner, og dermed regulerer flere vitale cellulære funksjoner. Cdc37 regnes som en protein kinase-spesifikk molekylær anstand, som det spesifikt anerkjenner og rekrutterer protein kinases til Hsp90 for å regulere deres nedstrøms signaltransduksjonsveier. Som sådan regnes Cdc37 som en med-anstand av Hsp90. Chaperone-kinase-banen (Hsp90/Cdc37-komplekset) er hyperaktivert i flere maligniteter som fremmer cellulær vekst; Derfor er det et potensielt mål for kreftbehandling. Den nåværende studien viser effektiviteten til FEB-teknologi ved hjelp av Hsp90 / Cdc37-modellsystemet. FEB oppdaget en sterk PPI mellom de to proteinene (KD-verdier på 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM i tre uavhengige eksperimenter). Oppsummert er FEB en etikettfri og kostnadseffektiv PPI-deteksjonsplattform, som tilbyr raske og nøyaktige målinger.

Introduction

Biomolekylære interaksjoner:
Proteiner er essensielle deler av organismer og deltar i mange molekylære veier som cellemetabolisme, cellestruktur, cellesignalering, immunresponser, celleadhesjon og mer. Mens noen proteiner utfører sin funksjon (er) uavhengig, samhandler de fleste proteiner med andre proteiner ved hjelp av et bindende grensesnitt for å koordinere riktig biologisk aktivitet1.

Biomolekylære interaksjoner kan hovedsakelig klassifiseres basert på de distinkte strukturelle og funksjonelle egenskapene til proteiner involvert2, for eksempel basert på proteinoverflatene, den komplekse stabiliteten eller utholdenheten til interaksjoner3. Identifisering av essensielle proteiner og deres roller i biomolekylære interaksjoner er avgjørende for å forstå biokjemiske mekanismer på molekylærnivå4. For tiden er det forskjellige tilnærminger for å oppdage disse interaksjonene5: in vitro6, i silico7, i levende celler8, ex vivo9 og in vivo10 med hver har sine egne styrker og svakheter.

In vivo-analysene utføres ved hjelp av hele dyret som et eksperimentelt verktøy11, oghan eks vivo-analyser utføres på vevsekstrakter eller hele organer (f.eks. hjerte, hjerne, lever) i et kontrollert eksternt miljø ved å gi minimale endringer i naturlige forhold. Den vanligste anvendelsen av in vivo- og ex vivo-studier er å evaluere farmakokinetikk, farmakodynamikk og toksisitetseffekter av potensielle farmakologiske midler før menneskelige studier ved å sikre deres generelle sikkerhet og effekt12.

Biomolekylære interaksjoner kan også påvises i levende celler. Imaging levende celler tillater oss å observere dynamiske interaksjoner som de utfører reaksjonene av en bestemt biokjemisk vei13. Videre kan deteksjonsteknikker, for eksempel bioluminescens eller fluorescensresonansenergioverføring, gi informasjon om hvor og når disse interaksjonene skjer i celle14. Selv om deteksjon i levende celler gir viktige detaljer, er disse deteksjonsmetodene avhengige av optikk og etiketter, noe som kanskje ikke gjenspeiler den opprinnelige biologien; de er også mindre kontrollerte enn in vitro-metoder og krever spesialisert kompetanse for å utføre15.

I silico beregningsmetoder brukes primært til storskala screening av målmolekyler før in vitro-forsøkene. Beregningsmessige prediksjonsmetoder, databaserte databaser, molekylær dokking, kvantitative strukturaktivitetsrelasjoner og andre molekylære dynamikksimuleringsmetoder er blant de veletablerte i silicoverktøy 16. Sammenlignet med arbeidskrevende eksperimentelle teknikker, kan in silico-verktøyene enkelt gjøre spådommer med høy følsomhet, men med redusert nøyaktighet i prediktiv ytelse17.

In vitro-analyser utføres med mikroorganismer eller biologiske molekyler utenfor deres standard biologiske kontekst. Skildring av biomolekylære interaksjoner gjennom in vitro-metoder er avgjørende for å forstå proteinfunksjoner og biologien bak det komplekse nettverket av cellefunksjon. Den foretrukne analysemetodikken velges i henhold til proteinets iboende egenskaper, kinetiske verdier og modusen og intensiteten av interaksjoner 18,19.

Hsp90/Cdc37-interaksjonen:
Chaperone-kinase-banen, som forbinder Hsp90 og Cdc37, er et lovende terapeutisk mål i tumorbiologi20. Hsp90 spiller en sentral rolle i cellesykluskontroll, proteinmontering, celleoverlevelse og signalveier. Proteiner som er avhengige av Hsp90 for deres funksjoner, leveres til Hsp90 for kompleksitet gjennom en medprest, for eksempel Cdc37. Hsp90/Cdc37-komplekset styrer foldingen av de fleste proteinkinaser og fungerer som et knutepunkt for en rekke intracellulære signalnettverk21. Det er et lovende anti-tumor mål på grunn av sin forhøyede uttrykk i ulike maligniteter, inkludert akutt myeloblastisk leukemi, multippel myeloma, og hepatocellulært karsinom22,23.

Vanlige in vitro biomolekylære interaksjonsdeteksjonsteknikker
Co-immunoprecipitation (co-IP) er en teknikk som er avhengig av antigen-antistoff spesifisitet for å identifisere biologisk relevante interaksjoner24. Den største ulempen ved denne metoden er dens manglende evne til å oppdage interaksjoner med lav affinitet og kinetiske verdier24. Biofysiske metoder som isotermisk titreringskalorimetri (ITC), overflateplasmonresonans (SPR), biolayer interferometri (BLI) og FEB-teknologi foretrekkes for å bestemme kinetiske verdier.

ITC er en biofysisk deteksjonsmetode basert på bestemmelse av bindende energi sammen med en komplett termodynamikkanalyse for å karakterisere biomolekylære interaksjoner25. Den viktigste fordelen med ITC er at det ikke krever merking eller fiksering av målproteinet. De viktigste vanskelighetene som ITC møter er den høye konsentrasjonen av målprotein som kreves for ett eksperiment og vanskeligheten med å analysere ikke-kovalente komplekser på grunn av små bindende entalpier26. Både SPR og BLI er etikettfrie biofysiske teknikker som er avhengige av immobilisering av målmolekylet på sensoroverflaten, etterfulgt av påfølgende injeksjoner av analytten over det immobiliserte målet27,28. I SPR måles endringer i brytningsindeksen under biomolekylære interaksjoner27; I BLI registreres interferensen i reflektert lys i sanntid som en endring i bølgelengden som en funksjon av tid28. Både SPR og BLI deler felles fordeler ved å tilby høy spesifisitet, følsomhet og deteksjonsevne29. I begge metoder er målproteinet immobilisert på biosensoroverflater, og derfor kan det være noe tap av målets opprinnelige konformasjon, noe som gjør det vanskelig å diskriminere mellom spesifikke kontra ikke-spesifikke interaksjoner30. BLI bruker dyre engangs fiberoptiske biosensorer for å immobilisere målet, og er derfor en kostbar teknikk31. Sammenlignet med disse veletablerte biomolekylære deteksjonsverktøyene, tilbyr FEB-teknologi en pålitelig og etikettfri plattform ved å bruke lave nanomolarkonsentrasjoner for biomolekylær deteksjon i sanntid med kinetisk karakterisering. FEB-teknologien overvinner også de boblende utfordringene i ITC og er mer kostnadseffektiv sammenlignet med SPR eller BLI.

Den felteffekttransistor (FET) basert biosensorer er et fremvoksende felt for å oppdage biomolekylære interaksjoner ved å tilby varierte biomedisinske applikasjoner. I FET-systemet blir mål immobilisert til biosensorbrikkene og interaksjoner oppdages ved endringer i ledning32. Den unike egenskapen som skal vurderes i utviklingen av en effektiv elektronisk biosensor er de fysisk-kjemiske egenskapene som den halvledende naturen og kjemisk stabilitet av beleggmaterialet som brukes til å fremstille sensoroverflaten33. Konvensjonelle materialer som silisium som brukes til FET har begrenset følsomheten til sensorer fordi det krever oksidlag smurt mellom transistorkanalen og et spesifikt miljø for riktig funksjon34. Videre er silisiumtransistorer følsomme for høye saltmiljøer, noe som gjør det vanskelig å måle biologiske interaksjoner i sitt naturlige miljø. Den grafenbaserte biosensoren presenteres som et alternativ, da den tilbyr utmerket kjemisk stabilitet og elektrisk felt. Siden grafen er et enkelt atomlag av karbon, er det både ekstremt følsomt som en halvleder og kjemisk kompatibel med biologiske løsninger; begge disse egenskapene er ønskelige å generere kompatible elektroniske biosensorer35. Det bemerkelsesverdige ultrahøye lastepotensialet til biomolekyler som tilbys av grafenbelagte biosensorer fører til utvikling av grafenbaserte biosensorer FEB-teknologi.

Prinsipp for FEB-teknologi: FEB er en etikettfri biomolekylær deteksjonsteknikk som måler den elektriske strømmen gjennom grafenbiosensoren som bindingsmålene immobiliseres til. Interaksjoner mellom det immobiliserte proteinet og analytten resulterer i endringer i strøm som overvåkes i sanntid, noe som muliggjør nøyaktige kinetiske målinger36.

Instrumentering: FEB-systemet består av en grafenfelteffekttransistorsensor (gFET) og en elektronisk leser som bruker konstant spenning gjennom hele eksperimentet (figur 1). Analytten påføres i løsning på målproteinet immobilisert på biosensoroverflaten. Når en interaksjon oppstår, måles og registreres en endring i strømmen i sanntid. Etter hvert som analyttkonsentrasjonen øker, vil brøkdelen av bundet analytt også øke, noe som forårsaker høyere vekslinger i strømmen. Ved hjelp av den automatiserte analyseprogramvaren som følger med instrumentet (Materialfortegnelse), måles og registreres I-Response når det gjelder biosensing-enheter (BU)37. I-Response er definert som endringen i den nåværende (I) gjennom biosensorbrikken målt i sanntid etter samspillet mellom det immobiliserte målet med analytten. Feb automatisert analyse programvare kan analysere både I-Response og C-Response til dynamiske interaksjon hendelser, der C-Response registrerer endringene i kapasitans (C). Variasjonene i både I-Response og C-Response samsvarer direkte med brøkdelen av bundet analytt og kan analyseres ytterligere for å generere KD-verdier . Standardinnstillingen for den automatiserte analyseprogramvaren er I-Response.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over det eksperimentelle oppsettet. (A) Grafenbasert brikke og en elektronisk leser. (B) En oversikt over brikkekomponentene. Brikken er festet til to elektroder som leverer strøm til systemet. Overflaten på brikken er dekket med grafen, som når den aktiveres kan binde målet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Metodikk:
I utgangspunktet settes den aktiverte biosensorbrikken inn i FEB-enheten (figur 1) etterfulgt av utførelsen av trinnene som er beskrevet nedenfor: (1) Kalibrering: Eksperimentet starter med systemkalibrering ved hjelp av 1x fosfatbufret saltvann (PBS; pH = 7,4) for å skape baseline likevektsrespons. (2) Forening: Analytten innføres i brikken, og I-Response overvåkes til bindingsmetningen er nådd. (3) Dissosiasjon: Analytten er dissosiert ved hjelp av 1x PBS. (4) Regenerering: Rester av analytten fjernes ved hjelp av 1x PBS. (5) Vasking: Totalt fem vasker utføres ved hjelp av 1x PBS for grundig fjerning av de bundne og ubundne analyttene fra brikken.

Analyse:
Dataanalyse utføres ved hjelp av den helautomatiske programvaren som følger med instrumentet. Den automatiserte analyseprogramvaren genererer en Hill fit-tomt med en KD-verdi . Hill fit plott beskriver foreningen av en analytt til målproteinet som en funksjon av analyttkonsentrasjoner. Konsentrasjonen der en halvmaksimal respons oppnås er proporsjonal med KD-verdien . En lav KD-verdi representerer høy bindingsaffinitet og omvendt.

For å validere dataene som er hentet fra FEB-eksperimentet, blir I-Responses hentet fra hvert avlesningspunkt for hver analyttkonsentrasjon ved hjelp av datagjennomgangs-/eksportprogramvaren og kan eksporteres til annen statistisk analyseprogramvare (se Tabell over materialer) som forklart nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: De rekombinante proteinene som ble brukt i denne studien, Hsp90 og Cdc37, ble kommersielt oppnådd (se Materialfortegnelser).

1. Chip aktivering

MERK: Alle materialer som skal brukes i eksperimentet er oppført i materialtabellen. Filtrer alle forberedte løsninger gjennom et sterilt 0,2 μm filter.

  1. Forbered 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) karbodiimid (EDC) oppløsning ved å tilsette 2 mg EDC til 2,5 ml 1 M 2-(N-morpholino) etan sulfonsyre (MES) buffer (pH = 6,0) i et 15 ml rør. Forbered N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) løsninger ved å tilsette 6 mg sulfo-NHS til 2,5 ml 1 M MES-buffer (pH = 6,0) i et separat 15 ml rør. Aliquot 50 μL av hver løsning i uavhengige rør og lagre ved -20 °C for fremtidig bruk.
  2. Bland like store mengder EDC sandsulffo-NHS-oppløsning (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) ved å pipettere opp og ned (ikke virvel).
    MERK: Den blandede oppløsningen til EDC/sulfo-NHS må brukes innen 30 minutter for å opprettholde effektiv krysskobling for riktig brikkefunksjonalisering.
  3. Plasser biosensorbrikken (5,7 cm x 2,4 cm; se Materialbord) som leveres av selskapet i en Petri-glassfat med montert lokk. Alle funksjonaliseringstrinnene som er involvert i chipaktivering, foreslås å gjøres i Petri-parabolen. Påfør 50 μL 1 M MES-buffer (pH = 6,0) på biosensorbrikken, inkuber i 1 min ved romtemperatur, og aspirer deretter bufferen.
  4. Påfør 50 μL EDC/sulfo-NHS-oppløsning umiddelbart på sensorbrikken. Dekk Petri-retten og inkuber i 15 min ved romtemperatur. Aspirate EDC/sulfo-NHS-oppløsning fra brikken.
  5. Skyll brikken én gang med 50 μL 1 M MES-buffer (pH = 6,0); aspirer MES-bufferen.

2. Målprotein immobilisering

  1. Skyll brikken 2x med 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirer PBS fra brikken og legg til målmolekylet, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
    MERK: Bufferkonflikt kan ødelegge hele eksperimentet. Før eksperimentet er det derfor viktig å sørge for at målmolekylet er i samme buffer som det som brukes til kalibrering (f.eks. 1x PBS (pH = 7,4)). Utfør om nødvendig en bufferutveksling ved dialyse over natten før eksperimentet. I dette eksperimentet ble det utført dialyse over natten for både rekombinante proteiner, Hsp90 og Cdc37, mot 1x PBS (pH = 7,4; se Materialtabell) med riktig bufferutveksling ved 4 °C. Konsentrasjonen av målmaterialet (Hsp90 i dette tilfellet) kan variere i henhold til forskjellige eksperimentelle protokoller og arten av målmaterialer (protein / peptid / ligander).
  2. Dekk glass petriskålen og inkuber i 30 min ved romtemperatur. Aspirer oppløsningen som inneholder målmolekylet og skyll 3x med 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirer 1x PBS (pH = 7,4) oppløsning fra brikken.
  3. Tilsett 50 μL slukking 1 (3,9 mM amino-PEG5-alkohol i 1x PBS (pH = 7,4)) oppløsning til brikken. Dekk glasset Petri-tallerkenen og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Aspirer Quench 1-løsningen fra brikken.
  4. Tilsett 50 μL quench 2 (1 M etanolamin (pH = 8,5)) oppløsning til brikken. Dekk glass petriskålen og inkuber i 15 min ved romtemperatur. Aspirate Quench 2-oppløsning fra brikken og skyll brikken 5x ved hjelp av 50 μL 1x PBS, og la den siste PBS-dråpen ligge på sensoren.

3. Forbereder analyttprøver

  1. Forbered analyttfortynningsserie for Cdc37 i ønsket konsentrasjonsområde. For det første eksperimentet ble følgende konsentrasjoner brukt: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM og 5000 nM. For det andre eksperimentet ble et annet sett med konsentrasjoner fra 0,4 nM til 200 nM brukt.
  2. Design eksperimentet for å inkludere minst åtte forskjellige analyttkonsentrasjoner for å oppnå en pålitelig KD-verdi . Forbered de forskjellige fortynningene av analyttproteinet i samme buffer som det som brukes til kalibrering og målprotein; her er det 1x PBS (pH = 7,4).

4. Lasting av den aktiverte biosensorbrikken i FEB-enheten

MERK: FEB-enheten består av en leser med LED-lysindikasjoner og en patron for å sette inn biosensorbrikken.

  1. Etter målprotein immobilisering, sett den aktiverte brikken inn i patronen på enheten, som er koblet via USB til en datamaskin. Etter innsetting av brikken vises et grønt LED-lys på leseren som indikerer at FEB-enheten er klar for eksperimentet. Installer den automatiserte programvaren (se Materialfortegnelse) som leveres av selskapet på datamaskinen, som FEB-enheten er koblet til, for å overvåke eksperimentet trinn for trinn som beskrevet nedenfor.

5. Kjør eksperimentet

  1. Trykk på Run Experiment-modulen på den automatiserte programvaren og velg 10 poeng med regenerering eller en hvilken som helst annen ønsket protokoll. Fyll ut følgende detaljer: operatørnavn, eksperimentnavn, dato (f.eks. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); regenereringsbuffer (f.eks. PBS-buffer); immobilisert mål (f.eks. analytt i oppløsning (f.eks. Se supplerende figur S1 for mer informasjon.
  2. Trykk på Start eksperimentknappen som vises på programvaren, og følg instruksjonene som vises av den automatiserte programvaren som beskrevet nedenfor.
    MERK: Programvaren er helautomatisk, brukervennlig og veileder brukeren gjennom hele eksperimentet trinn for trinn. Et popup-vindu vises på skjermen med instruksjoner for å fortsette videre på hvert trinn i eksperimentet. Programvaren vil gi instruksjoner for hvert repeterende trinn fortløpende fra kalibrering, analyttforening, dissosiasjon, regenerering og vask (5x) for hver analyttkonsentrasjon gjennom hele eksperimentet.
  3. Utfør instrumentkalibrering. For å gjøre dette, aspirer den gjenværende PBS-løsningen fra brikken og påfør 50 μL kalibreringsbuffer (1x PBS; pH = 7,4). Trykk på Fortsett-knappen og vent i 5 minutter til kalibreringstrinnet er ferdig. Programvaren viser endepunktet som er bestemt for kalibreringstrinnet (5 min) med en advarselsalarm for oppfølging.
  4. Deretter utfører du en analyttforening. For å gjøre dette, aspirer kalibreringsbufferen fra brikken og påfør 50 μL av den laveste analyttkonsentrasjonen (25 nM cdc37). Trykk på Fortsett-knappen og vent i 5 minutter til tilknytningstrinnet er ferdig. Programvaren viser endepunktet for tilknytningstrinnet (5 min) med en advarselsalarm for å fortsette.
  5. Utfør en analytt dissosiasjon. For å gjøre det, aspirer analyttoppløsningen fra brikken og påfør 50 μL av dissosiasjonsbufferen (1x PBS; pH = 7,4). Trykk på Fortsett-knappen og vent i 5 minutter til dissosiasjonstrinnets varighet (5 min) er fullført. Programvaren viser endepunktet for dissosiasjon trinn (5 min) med en advarsel alarm til oppfølging.
  6. Deretter utfører du brikkeregenerering. Aspirer dissosiasjonsløsningen fra brikken og påfør 50 μL regenereringsbuffer (1x PBS; pH = 7,4). Trykk på Fortsett-knappen og vent i 30 s til regenereringstrinnets varighet (30 s) er fullført. Programvaren viser endepunktet for regenerering trinn (30 s) med en advarsel alarm å følge opp.
  7. Til slutt vasker du brikken. Aspirer regenereringsløsningen fra brikken og påfør 50 μL vaskebuffer (1x PBS; pH = 7,4) på brikken. Aspirer løsningen fra brikken og gjenta denne 5xen. La den siste dråpen av vaskebufferen stå på brikken og trykk på Fortsett-knappen og vent i 30 s til vasketrinnets varighet er ferdig i programvaredisplayet.
    MERK: Programvaren viser endepunktet for vasketrinnet (30 s) med en advarselsalarm for å fortsette med neste syklus av eksperimentet.
  8. Gjenta trinnene for hver analyttkonsentrasjon som brukes; De fem trinnene for kalibrering, analytttilknytning, dissosiasjon, regenerering og vask (5x) utgjør en syklus. For eksperimentet som vises her, utførte vi 10 sykluser for 10 analyttkonsentrasjoner (alt fra 25 nM til 5000 nM eller 0,4 nM til 200 nM; Figur 2).

6. Analyse

  1. Trykk på Analyse-knappen sett øverst i den automatiserte analyseprogramvaren på slutten av eksperimentet. Et visningsvindu som inneholder alle eksperimentelle punkter, vises. I vinduet, sørg for at analyttkonsentrasjonene som brukes til den foreskrevne protokollen er riktige.
  2. Trykk på Kjør analyse-knappen for å generere KD-verdien automatisk. Programvaren genererer en Hill fit plott ved å plotte analyttkonsentrasjonene mot de tilsvarende I-Responses hvorfra dissosiasjonskonstanten ved likevekt, KD-verdi , beregnes.
  3. Eksporter rådataene for analyse i annen statistisk analyseprogramvare ved hjelp av datagjennomgangs-/eksportprogramvaren som beskrevet nedenfor.
    1. Kopier R1R-filen som ble opprettet automatisk på slutten av eksperimentet (f.eks. Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) til en ny mappe på skrivebordet. Åpne programvaren For datagjennomgang/eksport levert av selskapet (se Tilleggsfigur S2A).
    2. Klikk på Databehandling > Behandle R1R-filer > OK på startskjermen til datagjennomgangs- / eksportprogramvaren.
    3. Velg mappen som inneholder R1R-filer som ble opprettet på skrivebordet i trinn 6.3.1. og trykk på OK-knappen . Dette oppretter en kopi av de opprinnelige R1R-dataene for å se gjennom og redigere dataene uten å overstyre den opprinnelige filen.
    4. Trykk på databehandlingsikonet som vises på startskjermen til datagjennomgangs- / eksportprogramvaren. Trykk Last inn behandlede R1R-filer > OK. Velg den samme mappen som ble opprettet i trinn 6.3.1 som inneholder behandlede R1R-filer. Trykk OK. På dette trinnet er mappen som inneholder eksperimentfilene, klar til å gjennomgås.
    5. Trykk på Dataanalyse på startskjermen for datagjennomgangs-/eksportprogramvare. Velg Kalibrering > Kalibrer redigerte R1R-filer > OK (se Tilleggsfigur S2B). Dette trinnet kalibrerer alle datapunktene i henhold til det første kalibreringstrinnet for å opprette en grunnlinje.
    6. Trykk på Dataanalyse på startskjermen for datagjennomgangs-/eksportprogramvare. Velg Se gjennom og rediger R1R-filer > OK. Se gjennom datapunktene, slett punkter eller legg til trinn ved hjelp av Slett/legg til trinn-knappen . Kontroller at alle trinnene er på riktig sted, for eksempel at kalibreringstrinnet er på grunnlinjen, tilknytningstrinnet er på topp (se Tilleggsfigur S3), og trykk deretter på Lagre-knappen for å lagre alle endringene som er gjort.
    7. Trykk på Dataanalyse på startskjermen for datagjennomgangs-/eksportprogramvare. Velg Analyser/tegn inn data, velg trinnene som skal eksporteres (se Tilleggsfigur S4). Legg til hvert tilknytningstrinn (for eksempel trinn 2, trinn 7 og så videre) etter at du har trukket fra kalibreringstrinnet (for eksempel trinn 1, trinn 6 og så videre) i eksportlisten før du eksporterer dataene.
    8. Trykk Eksporter disse dataene. Programvaren genererer en regnearkfil som inneholder I-Response for hvert analyttkonsentrasjonsdatapunkt fra hver transistor (hvis alle transistorer fungerer, vil vi ha tre forskjellige I-responsverdier for hvert konsentrasjonspunkt). Bruk denne regnearkfilen til å analysere dataene ytterligere i den statistiske programvaren.
  4. Åpne programvaren for statistisk analyse. Opprett en XY-tabell med tre Y-verdier. trykk på Opprett. Dataene for denne tabellen (X-, Y-verdier) kopieres fra regnearkfilen som ble opprettet i trinn 6.3.8. X-aksen tilsvarer analyttkonsentrasjon (avhengig av konsentrasjonen som brukes), og de tre Y-verdiene tilsvarer I-Responses, hentet fra Data Review / Export-programvaren levert av selskapet.
  5. Trykk Analyser disse dataene. Velg XY-analyser > ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) > bindingsmetning > ett område > totalt. Programvaren vil automatisk analysere dataene, generere KD-verdien og lage en graf over datapunktene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultater fra eksperiment 1:
Målproteinet Hsp90 (500 nM) ble immobilisert til brikken etter mål-immobiliseringsprotokollen som beskrevet ovenfor. For det første eksperimentet ble 10 konsentrasjoner av analyttproteinet, Cdc37, fra 25 nM til 5000 nM, utarbeidet basert på dataene som er tilgjengelige i litteraturen (se tabell 1).

Trinnene i eksperimentet kan overvåkes i sanntid ved å følge endringene som skjer i I-Response (figur 3A). Man kan visualisere hvordan hvert trinn som er inkludert i protokollen påvirker I-Response gjennom hele eksperimentet. For eksempel er I- Response nær null under kalibrering, og i tilknytningstrinnet øker I-Response gradvis med økende analyttkonsentrasjoner (Cdc37). Ved å se på dataene fra dette eksperimentet (figur 3A) ble det observert en plutselig økning i I-Response i lave analytkonsentrasjoner (50 BU ved 25 nM). En lav I-Response var forventet ved lav analyttkonsentrasjon som vil øke gradvis med økende konsentrasjoner. Denne plutselige økningen antydet at et eksperiment inkludert lavere analyttkonsentrasjonspunkter skulle utformes.

Etter protokolltrinnene som er beskrevet ovenfor, ble dataene analysert i den medfølgende automatiserte analyseprogramvaren, som automatisk genererte et Hill fit-plott med en beregnet KD-verdi (figur 3B). KD-verdien beregnet fra den automatiserte analyseprogramvaren for det første eksperimentet var 350 000 ± 76 000 μM. De fleste av de vanlige biologiske interaksjonene viste en KD-verdi i det lave μM eller til og med i nM-området; Dermed er KD-verdien som genereres for det første eksperimentet svært høy.

Det kan være flere forklaringer på den observerte høye KD-verdien : det kan være lav affinitetsbinding mellom de to spesifikke proteinene som studeres (Hsp90 / Cdc37), noe som betyr at en høy ligandkonsentrasjon er nødvendig for molekylære interaksjoner; eksperimentet kan ha blitt designet med ikke-ideelle, utenfor rekkevidde analyttkonsentrasjoner; den høye verdien kan skyldes de innebygde parametrene som brukes i tilpasningsmodulen til analyseprogramvaren. Den automatiserte analyseprogramvaren bruker en doseresponsanalysemodul for å passe til datapunktene, men noen interaksjoner passer kanskje ikke godt inn i denne modellen, og gir dermed falske data, noe som resulterer i høye KD-verdier .

For å oppnå en nøyaktig KD-verdi med en mettet Hill-tomt, kreves standardisering av eksperimentet ved prøving og feiling som inkluderer både lavere og høyere analyttkonsentrasjonspunkter, for å oppnå den laveste KD-verdien med lav feilfrekvens.

Tatt i betraktning alle disse faktorene ble dataene fra analyseprogramvare eksportert til ytterligere statistisk analyseprogramvare. I-Response for hvert tilknytningspunkt ble trukket ut ved hjelp av den automatiserte programvaren for datagjennomgang/-eksport, og er oppsummert i tabell 2 ved å følge trinnene ovenfor i analysetrinnet (trinn 6).

De statistiske analyseprogramvareresultatene (figur 3C) viste en relativt lav KD-verdi med et høyt standardavvik (0,011 ± 0,494 μM) og en lav R2-verdi på 0,78. Den signifikante variasjonen observert i KD-verdien og lav R2-verdi antydet at konsentrasjonspunktene som er valgt for dette eksperimentet, ikke er optimale. I tillegg ble det også lagt merke til at noen grafpunkter ikke passet godt med plottets trendlinje (figur 3C); Dette styrket behovet for å designe et nytt eksperiment ved å inkludere forskjellige analyttkonsentrasjonspunkter.

De innebygde parametrene som brukes av de to analyseprogramvarene er helt forskjellige, og det gjenspeiles i KD-verdigenereringsprosessen . Forskjellene i KD-verdiene hentet fra de to analyseprogramvarene (350 000 ± 76 000 μM vs. 0,011 ± 0,494 μM) kan tilskrives det faktum at forskjellige analysemoduler ble brukt til beregning. Analysen som utføres i den statistiske analyseprogramvaren kan være bedre egnet for denne interaksjonen, og dermed gi en lavere KD-verdi .

Likevel, hvis resultatene fra begge analysene kombineres (350.000 ± 76.000 μM og 0.011 ± 0.494 μM), kan det konkluderes med at det første eksperimentet ikke var optimalt og at det ville være behov for ytterligere konsentrasjonspunkter.

For å validere dette punktet ble det usammenhengende grafpunktet, 3000 nM, utelukket (se Tilleggsfigur S5). Resultatene av analysen viste en KD-verdi på 0,006 ± 0,081 μM med en R2-verdi på 0,98. Disse resultatene indikerte at neste eksperiment skulle utformes med fokus på mer relevante konsentrasjoner. Derfor ble det utført et nytt eksperiment for å evaluere Hsp90/Cdc37 PPI ved hjelp av forskjellige testpunkter med konsentrasjoner under og over den anslåtte KD.

Resultater fra eksperiment 2:
Målproteinet Hsp90 (500 nM) ble immobilisert til brikken ved hjelp av protokollen som beskrevet ovenfor. Totalt 10 konsentrasjoner av analytten (Cdc37) ble utarbeidet som følger: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM og 200 nM. Det andre eksperimentet ble designet ved å inkludere forskjellige analyttkonsentrasjonspunkter, ved å vurdere all innsikt fra det forrige eksperimentet som nevnt ovenfor.

Under eksperimentet ble hvert trinn overvåket i sanntid (figur 4A). Her starter sanntids I-Response-grafen (avledet fra de lave konsentrasjonene av analytt-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) i utgangspunktet fra null og øker gradvis ved økningen av analyttkonsentrasjoner ved hver syklus av eksperimentet sammenlignet med den plutselige økningen av I-Response observert i det første eksperimentet.

Etter protokollen nevnt ovenfor ble dataene analysert ved hjelp av den automatiserte analyseprogramvaren (figur 4B). KD-verdien beregnet fra den automatiserte analyseprogramvaren for dette eksperimentet var 0,0673 ± 0,0002 μM, noe som antydet en sterk interaksjon mellom målproteinet Hsp90 og analytt Cdc37. Standardavviket på 0,0002 μM var mye mindre enn det som ble oppnådd i det første eksperimentet, noe som gir tillit til at de nye dataene er mye mer pålitelige.

For å validere dette resultatet eksporterte vi datapunktene (tabell 3) til en annen statistisk analyseprogramvare som forklart tidligere; resultatene fra analysen er oppsummert i figur 4C.

Ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren ble det funnet at KD-verdien for Hsp90 /Cdc37 PPI er 0,014 ± 0,005 μM (figur 4C). De lave verdiene av KD og standardavvik indikerer en sterk interaksjon mellom de to proteinene, Hsp90 og Cdc37. Videre indikerer R2-verdien på 0,99 at analysen passer perfekt til de eksperimentelle grafpunktene. Begge analyseprogramvarene viste konsistens i resultatene, med lave KD-verdier på henholdsvis ca. 0,0673 ± 0,0002 μM og 0,014 ± 0,005 μM.

For å bekrefte eksperimentets reproduserbarhet og nøyaktighet ble det samme eksperimentet utført i to replikeringer ved hjelp av Hsp90 (500 nM) som målprotein og Cdc37 som analytt med de samme konsentrasjonene fra 0,4 nm til 200 nm som brukt i det andre eksperimentet. Under eksperimentet ble hvert trinn overvåket i sanntid (Tilleggsfigur S6A og tilleggsfigur S7A). KD-verdien beregnet fra den automatiserte analyseprogramvaren er avbildet i tilleggsfigur S6B og tilleggsfigur S7B (henholdsvis 0,053 ± 0,002 μM og 0,0719 ± 0,0007 μM). Som nevnt tidligere ble datapunktene eksportert (Supplementary Table S1 og Supplementary Table S2) til en annen statistisk analyseprogramvare, og resultatene er vist i Supplementary Figure S6C and Supplementary Figure S7C (Supplementary Figure S6C: KD is 0.003 ± 0.009 μM og R2 er 0,99; Supplerende figur S7C: KD er 0,004 ± 0,009 μM og R2 er 0,99). Resultatene av de to replikerer fra både analyseprogramvaren bekreftet godt og bekreftet nøyaktigheten, repeterbarheten og reproduserbarheten til Hsp90 / Cdc37 FEB eksperimentelle data.

Det ble også utført en kontrollstudie der det biomolekylære samspillet mellom Hsp90 og et kontrollprotein, Bovine serumalbumin (BSA) ble belyst. Kontrollstudien som brukte BSA som analytt ble gjort ved hjelp av et identisk eksperimentelt oppsett og analyttkonsentrasjoner som ble brukt i det andre eksperimentet. Totalt 10 konsentrasjoner av kontrollproteinet, BSA, fra 0,4 nM til 200 nM ble tilberedt i 1x PBS (pH = 7,4) og hvert trinn i eksperimentet ble overvåket i sanntid.

I likhet med eksperimentet med Hsp90 og Cdc37, starter sanntids I-Response-grafen i utgangspunktet fra 0; I kontrollstudien økte imidlertid ikke I-Response gradvis etter økningen av analyttkonsentrasjoner (Supplerende figur S8A). Dataene ble også analysert ved hjelp av den automatiserte analyseprogramvaren (Supplementary Figure S8B), og programvaren kunne ikke beregne KD-verdien fra datapunktene i dette eksperimentet. Det fremgår, fra Hill Plot generert fra programvaren, at det ikke er noe samspill mellom Hsp90 og kontrollen BSA analytt. For å validere dette resultatet eksporterte vi datapunktene (Supplementary Table S3) til en annen statistisk analyseprogramvare som forklart tidligere. Ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren ble det funnet at KD-verdien for Hsp90 / BSA PPI er negativ (Supplerende figur S8C; KD er -0,009 ± -0,0003 μM), noe som igjen indikerer at det ikke er noen interaksjon mellom de to proteinene, Hsp90 og BSA. Videre indikerer R2-verdien (0,82) at analysen ikke passet til de eksperimentelle grafpunktene. Begge analyseprogramvarene viste konsistens i resultatene at Hsp90 og BSA ikke samhandler.

Ved sammenligning av Hsp90/Cdc37 FEB eksperimentelle data med andre eksperimentelle data som er tilgjengelige i litteraturen, ble det funnet at KD-verdiene oppnådd i denne studien (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM, og KD = 0,072 ± 0,001 μM) var i to størrelsesordener lavere enn tidligere publiserte data (KD = 1,46 μM38 eller 6 μM39 ). Disse forskjellene kan tilskrives bruk av menneske Hsp90- og Cdc37-konstruksjoner i full lengde i de nåværende eksperimentene. Tidligere studier ble utført på gjær Hsp90 konstruksjoner som bare inneholdt delvis protein38 eller C. elegans homolog proteiner39 (Tabell 1). For å validere resultatene oppnådd i FEB-systemet ble ITC-eksperimenter utført.

Evaluering av Hsp90/Cdc37 PPI ved hjelp av ITC-systemet:
ITC regnes som gullstandarden for å undersøke biomolekylære interaksjoner. Vi utførte videre ITC for å bestemme de termodynamiske kinetikkene til Hsp90/Cdc37 PPI, og som validering for FEB-eksperimentet. Hsp90 og Cdc37 blir utsatt for dialyse mot PBS (pH = 7.0) før ITC. Omtrent 0,25 μM løsning av målproteinet (Hsp90) og 2,5 μM oppløsning av analyttprotein (Cdc37) ble tilberedt i PBS for de kalorimetriske titrasjonene. Et totalt volum på 80 μL Cdc37-oppløsning ved påfølgende intervaller ble titrert fra den roterende sprøyten til cellen som inneholder 150 μL Hsp90-oppløsning ved 298,15 K. Hver injeksjon forekom over 4 s varighet, og tidsintervallet mellom påfølgende injeksjoner var 150 s. Totalt 19 injeksjoner på 2 μL hver ble laget med en rørehastighet på henholdsvis 500 rpm og en referansekraft på 41,9 μW. Varmevariasjonen som følge av Hsp90/Cdc37-interaksjon ble overvåket, og de endelige dataene som ble innhentet på slutten av Cdc37-analyttinjeksjonene ble montert ved hjelp av ITC-analyseprogramvare levert av selskapet. Varmevariasjonene sammen med de termodynamiske parametrene som molar entalpiendring (ΔH), entropiendring (ΔS), antall bindingssteder (n) og likevektsdissosiasjonskonstanten (KD) mellom Hsp90/Cdc37 PPI ble estimert. Gibbs frie energiendring (ΔG) ble også beregnet ut fra ligningen ΔG = ΔH - TΔS etter å ha fått termiske parametere fra ITC-termgrammet.

ITC-plottet avslører mengden varme som brukes opp eller frigjøres under de biologiske interaksjonene for å belyse arten av interaksjoner og intermolekylære krefter som styrer PPI40. Cdc37 (2,5 μM) ble titrert inn i Hsp90 (0,25 μM), og de tilsvarende kurvene er avbildet i figur 5A,B. ITC-plottet som ble oppnådd ble funnet å være eksotermisk og ble montert i en enkelt bindingsstedsmodell som viste en bindende stoichiometri (n) av en, bindende energi, ΔG = -45,9 kJ/mol, og KD-verdi = 0,009 μM. Den lille inkonsekvensen observert i form av et endotermisk skifte i begynnelsen av ITC-termgrammet (figur 5A) antyder dannelsen av bobler mens du titrerer analyttproteinet til målecellen41,42. Blant Hsp90/Cdc37 PPI-eksperimentene som utføres ved lavere og høyere konsentrasjoner, viste 10 ganger overskudd av Cdc37 (Hsp90-konsentrasjon = 0,25 μM og Cdc37 konsentrasjon = 2,5 μM) akseptable bindingsparametere ved å oppnå en metningskurve. KD-verdien hentet fra ITC (KD = 0,009 μM) korrelerte godt med KD-verdien beregnet ved hjelp av FEB-teknologi (KD = 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM), som sterkt støtter FEB's følsomhet og nøyaktighet i å oppdage Hsp90/Cdc37 PPI.

Figure 2
Figur 2: Protokollsammendrag. (A) Sammendrag av trinnene for brikkeaktiveringsprosessen. (B) Grafisk fremstilling av de fem gjentatte trinnene i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Datafiler generert fra eksperiment 1. (A) Eksperimenter data overvåket i sanntid. Y-aksen tilsvarer I-Response i biosensorenheter (BU), og x-aksen tilsvarer de forskjellige tidspunktene og konsentrasjonene til analytten i eksperimentet. Dette tallet tilsvarer dataene fra det første eksperimentet. (B) Hill Fit-plott generert fra den automatiserte analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response, x-aksen tilsvarer konsentrasjoner av analytt (Cdc37) i nM. For dette eksperimentet er KD-verdien 350 000 ± 76 000 μM. (C) Association-plottet som genereres ved hjelp av programvaren for statistisk analyse. Y-aksen tilsvarer I-Response på slutten av tilknytningsfasen, x-aksen tilsvarer de forskjellige analyttene, Cdc37, konsentrasjonene. Dette plottet ble generert ved hjelp av datapunktene i tabell 2. Oppsummering av analyseresultatene er gitt i grafen; For dette eksperimentet er KD-verdien 0,011 ± 0,494 μM og R2-verdien 0,78. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Datafiler generert fra eksperiment 2. (A) Eksperimenter data som overvåkes i sanntid. Y-aksen tilsvarer I-Response i biosensorenheter (BU), og x-aksen tilsvarer de forskjellige tidspunktene og konsentrasjonene til analytten i eksperimentet. Denne figuren tilsvarer dataene fra det andre eksperimentet. (B) Hill Fit-plott generert fra den automatiserte analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response, x-aksen tilsvarer konsentrasjonen av analytt (Cdc37) i nM. For dette eksperimentet er KD-verdien 0,0673 ± 0,0002 μM (C) Association-plottet som genereres ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response på slutten av tilknytningsfasen, x-aksen tilsvarer de forskjellige analytt Cdc37-konsentrasjonene. Dette plottet ble generert ved hjelp av datapunktene i tabell 3. Oppsummering av analyseresultatene er gitt i grafen; For dette eksperimentet er KD-verdien 0,014 ± 0,005 μM og R2-verdien 0,99. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: ITC-termgram med Hsp90- og Cdc37-interaksjon. (A) Topppanelet representerer de tilsvarende varmeutviklingskurvene oppnådd på grunn av påfølgende injeksjoner av Cdc37 (2,5 μM) i Hsp90 (0,25 μM) ved 298,15 K. Differensialkraften (DP) representerer differensialkraft som en funksjon av tid. (B) De integrerte datapunktene i bunnpanelet angir tilsvarende normalisert varme kontra molarforholdet til Hsp90/Cdc37. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Utførte analyser FEB analyse KD Prisme analyse KD Bygg opprinnelse Aminosyrer Referanser
ITC 1,46 μM og 1,32 μM NA Gjær Hsp90 N-terminaldomene for Hsp90 36
Menneskelig Cdc37
SPR 6 μM NA C. elegans Full lengde 37
FEB - Første repetisjon 0,014 μM 0,067 μM Menneskelig Hsp90 Full lengde Utført i denne studien
Menneskelig Cdc37
FEB - Andre repetisjon 0,053 μM 0,003 μM Menneskelig Hsp90 Full lengde Utført i denne studien
Menneskelig Cdc37
FEB - Tredje repetisjon 0,072 μM 0,004 μM Menneskelig Hsp90 Full lengde Utført i denne studien
Menneskelig Cdc37
ITC 0,009 μM NA Menneskelig Hsp90 Full lengde Utført i denne studien
Menneskelig Cdc37
FEB- Kontroll studie Ingen data (det var ikke nok data til å beregne KD) -0,009 μM (KD-verdi med negative verdier angir at det ikke er noen interaksjon) Menneskelig Hsp90 Full lengde Utført i denne studien
BSA

Tabell 1: Hsp90/Cdc37 PPI-evaluering ved hjelp av ulike metoder rapportert i denne studien og litteraturen.

Analyttkonsentrasjoner (nM) I-Response-transistor 1 I-Response-transistor 2 I-Response-transistor 3 Gjennomsnitt
I-Svar
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tabell 2: Sammendrag av I-Response-verdiene generert fra tre forskjellige transistorer av hver brikke ved hvert konsentrasjonspunkt i det første eksperimentet.

Analyttkonsentrasjoner (nM) I-Response-transistor 1 I-Response-transistor 2 I-Response-transistor 3 Gjennomsnittlig I-Svar
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tabell 3: Sammendrag av I-Response-verdiene generert fra tre forskjellige transistorer av hver brikke ved hvert konsentrasjonspunkt i det andre eksperimentet.

Supplerende figur S1: Skjermbilde av hovedskjermen til automatisert programvare før begynnelsen av eksperimentet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Skjermbilde av hovedskjermen til automatisert programvare for databehandling og analyse. (A) Hovedskjermvisning av datagjennomgang / eksportprogramvare som viser databehandlingsalternativer. (B) Hovedskjermvisningen av datagjennomgang / eksportprogramvare som viser dataanalysealternativer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Gjennomgangsdatapunktene hentet fra gjennomgangs-/eksportprogramvare. I dette trinnet går du gjennom eksperimentet og legger til eller sletter datapunkter. Kontroller at tilknytningspunktet (2, 7, 12, 17, 22 og så videre) alltid er ved valget. Det første valget fra venstre er for eksempel datapunkt nummer 2, og deretter datapunkt nummer 10 (men det må være nummer 7). Hvis du vil løse dette, sletter du bare punkt 3, 4 og 5. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: Eksporter dataliste for eksempel. I dette trinnet velger du hvilket eksperiment som skal eksporteres. Velg et tilknytningspunkt (2, 7, 12, 17, 22 og så videre) og trekk fra de forrige kalibreringstrinnene (1, 6, 11, 16, 21 og så videre). Legg til alle punktene i eksportlisten, og eksporter disse dataene for å få et regneark med I-Svaret for hvert datapunkt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S5: Tilknytningsplott generert ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response på slutten av tilknytningsfasen, x-aksen tilsvarer de forskjellige analytt Cdc37-konsentrasjonene. Denne plottet ble generert ved hjelp av datapunktene fra det første eksperimentet og utelukket datapunktet med 3000 nM-konsentrasjon. Oppsummering av analyseresultatene er gitt i grafen; For dette eksperimentet er KD-verdien 0,006 ± 0,081 μM og R2-verdien 0,98. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S6: Datafiler generert fra eksperiment 2 replikerer 1. (A) Eksperimenter data som overvåkes i sanntid. Y-aksen tilsvarer I-Response i biosensorenheter (BU), og x-aksen tilsvarer de forskjellige tidspunktene og konsentrasjonene til analytten i eksperimentet. Denne figuren tilsvarer dataene fra den andre repetisjonen som ble utført i det andre eksperimentet der Hsp90 ble immobilisert på brikken (500 nM) og 10 konsentrasjoner av Cdc37 analytt ble utarbeidet (0,4-200 nM). Sanntids I-Response grafen starter i utgangspunktet fra 0 og øker gradvis ved økningen av analyttkonsentrasjoner ved hver syklus av eksperimentet, noe som tyder på at eksperimentet er vellykket. (B) Hill Fit-plott generert fra den automatiserte analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response, x-aksen tilsvarer konsentrasjoner av analytt (Cdc37) i nM. Resultatene fra den automatiserte analysen viste en relativt lav KD-verdi og et lavt standardavvik på 0,0531 ± 0,0002 μM, noe som tyder på en sterk interaksjon mellom Hsp90 og Cdc37. (C) Tilknytningsplottet generert ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response på slutten av tilknytningsfasen, x-aksen tilsvarer de forskjellige analytt Cdc37-konsentrasjonene. Dette plottet ble generert ved hjelp av datapunktene i tabell S1. Oppsummering av analyseresultatene er gitt i grafen; For dette eksperimentet er KD-verdien 0,003 ± 0,009 μM og R2-verdien 0,99. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S7: Datafiler generert fra eksperiment 2 replikerer 1. (A) Eksperimenter data som overvåkes i sanntid. Y-aksen tilsvarer I-Response i biosensorenheter (BU), og x-aksen tilsvarer de forskjellige tidspunktene og konsentrasjonene til analytten i eksperimentet. Denne figuren tilsvarer dataene fra den tredje repetisjonen i det andre eksperimentet der Hsp90 ble immobilisert på brikken (500 nM) og 10 konsentrasjoner av Cdc37 analytt ble utarbeidet (0,4-200 nM). (B) Hill Fit-plott generert fra den automatiserte analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response, x-aksen tilsvarer konsentrasjoner av analytt (Cdc37) i nM. Resultatene fra den automatiserte analysen viste en relativt lav KD-verdi og et lavt standardavvik på 0,0719 ± 0,0007 μM, noe som tyder på en sterk interaksjon mellom Hsp90 og Cdc37. (C) Association plot generert ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response på slutten av tilknytningsfasen. X-aksen tilsvarer de forskjellige analytt Cdc37-konsentrasjonene. Dette plottet ble generert ved hjelp av datapunktene i tabell S2. Oppsummering av analyseresultatene er gitt i grafen; For dette eksperimentet er KD-verdien 0,004 ± 0,009 μM og R2-verdien 0,99. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S8: Datafiler generert fra kontrolleksperimentet. (A) Eksperimenter data som overvåkes i sanntid. Y-aksen tilsvarer I-Response i biosensorenheter (BU), og x-aksen tilsvarer de forskjellige tidspunktene og konsentrasjonene til analytten i eksperimentet. Denne figuren tilsvarer dataene fra kontrolleksperimentet der Hsp90 ble immobilisert på brikken (500 nM) og 10 konsentrasjoner av BSA (kontrollprotein) analytt ble tilberedt (0,4-200 nM). Sanntids I-Response grafen starter fra lav I-Response rundt 10-15 BU og øker ikke ved en økning i analyttkonsentrasjonene ved hver syklus av eksperimentet, noe som tyder på at det ikke er noen interaksjon mellom Hsp90 og BSA. (B) Hill Fit-plott generert fra den automatiserte analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response. x-aksen tilsvarer konsentrasjoner av analytt (BSA) i nM. Resultatene fra den automatiserte analysen viste at det ikke er nok data til å beregne KD-verdien som tyder på at det ikke er noen interaksjon mellom Hsp90 og BSA. (C) Tilknytningsplott generert ved hjelp av den statistiske analyseprogramvaren. Y-aksen tilsvarer I-Response på slutten av tilknytningsfasen, x-aksen tilsvarer de forskjellige analytt BSA-konsentrasjonene. Denne plottet ble generert ved hjelp av datapunktene i tabell S4. Oppsummering av analyseresultatene er gitt i grafen; For dette eksperimentet er KD-verdien -0,009 ± -0,0003 μM, og R2-verdien er 0,82. En negativ KD-verdi nær null angir at det ikke er noen interaksjon mellom Hsp90 og BSA. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S1: Sammendrag av I-Response-verdiene generert ved hvert konsentrasjonspunkt og lest fra hver brikkes transistorer (tre forskjellige transistorer for hver brikke). Denne tabellen tilsvarer dataene som ble hentet fra den andre repetisjonen som ble utført for det andre eksperimentet der Hsp90 ble immobilisert på brikken (500 nM) og 10 konsentrasjoner av Cdc37 analytt ble utarbeidet (0,4-200 nM). Datapunktene fra denne tabellen ble brukt til analyse i den statistiske analyseprogramvaren. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S2: Sammendrag av I-Response-verdiene generert ved hvert konsentrasjonspunkt og lest fra hver brikkes transistorer (tre forskjellige transistorer for hver brikke). Denne tabellen tilsvarer dataene som ble hentet fra den tredje repetisjonen som ble utført for det andre eksperimentet der Hsp90 ble immobilisert på brikken (500 nM) og 10 konsentrasjoner av Cdc37 analytt ble utarbeidet (0,4-200 nM). Datapunktene fra denne tabellen ble brukt til analyse i den statistiske analyseprogramvaren. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S3: Sammendrag av I-Response-verdiene generert ved hvert konsentrasjonspunkt og lest fra hver brikkes transistor (tre forskjellige transistorer for hver brikke). Denne tabellen tilsvarer dataene fra kontrolleksperimentet der Hsp90 ble immobilisert på brikken (500 nM) og 10 konsentrasjoner av BSA analytt ble utarbeidet (0,4-200 nM). Datapunktene fra denne tabellen ble brukt til analyse i den statistiske analyseprogramvaren. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien ble muligheten for å bruke FEB-teknologien (en kinetisk karakteriseringstilnærming i sanntid) evaluert for å bestemme den biomolekylære interaksjonen mellom Hsp90 og Cdc37. Det første utforskende eksperimentet (første eksperiment) antydet at valg av riktige analyttkonsentrasjoner er en kritisk del av eksperimentet, og at eksperimentet bør utformes ved å inkludere konsentrasjonspunkter over og under KD-verdien , som ble spådd basert på dataene som er tilgjengelige i litteraturen.

Likevel, hvis det ikke er foreløpig informasjon om interaksjonen, foreslår vi å designe et foreløpig eksperiment ved å inkludere et bredt spekter av konsentrasjonspunkter i både lavere (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) og høyere (1000 nM, 2500 nM, 5000 nM) områder. Det foreløpige eksperimentet gir et grovt estimat av KD-verdien og gjør det mulig å planlegge de påfølgende forsøkene ved hjelp av de riktige konsentrasjonsområdene for å oppnå en nøyaktig KD-verdi . FEB-systemet tilbyr en redigeringsprotokollfunksjon der man står fritt til å velge antall konsentrasjonspunkter for eksperimentet.

Fra vår erfaring er de mest kritiske trinnene som er involvert i FEB-protokollen som følger. Målproteinet og analyttbufferen skal være den samme som kalibreringsbufferen. Selv en liten bufferkonflikt kan føre til svingninger i I-Response og gi upålitelige resultater. Dermed foreslår vi å utføre dialyse over natten ved riktig bufferutveksling. Forsiktig pipettering på biosensorbrikken mens du aspirerer eller bruker en løsning er avgjørende gjennom hele eksperimentet. Uforsiktig pipettering kan føre til ødelagte transistorer eller svingninger i I-Response; under pipettering, må du passe på å ikke berøre den følsomme overflaten på brikken. EDC/sulfo-NHS-løsningen som brukes i sponaktiveringsprosessen, bør blandes friskt før hver bruk. Bruk av en gammel blanding kan resultere i en ikke-funksjonalisert brikke. Sørg for å bruke den samme bufferen for alle de fem repeterende trinnene (kalibrering, tilknytning, dissosiasjon, regenerering og vask) som er involvert i alle syklusene i eksperimentet.

Når vi sammenlignet FEB med veletablerte biomolekylære deteksjonssystemer i feltet, for eksempel BLI eller SPR, fant vi ut at alle tre metodene har lignende fordeler 43,44,45 som er: de er etikettfrie systemer, som ikke krever noen dyre fluorescerende fargestoffer for å oppdage interaksjonene; de kan oppdage interaksjoner selv i små nM-områder; sjetongene kan brukes på nytt i både SPR og FEB, og de kan regenereres og gjenbrukes effektivt for opptil 10 eksperimenter, og alle tre metodene gir kinetiske data i sanntid, og eksperimenttiden er kort.

Den største fordelen med SPR er at den gir mer omfattende data fra eksperimentet slik at man kan beregne KD, Kpå, Kav, stoichiometri og termodynamiske parametere44. Den største fordelen med BLI er dens evne til å teste flere konsentrasjoner i ett eksperiment. Kinetiske målinger kan gjøres samtidig for opptil åtte konsentrasjoner ved hjelp av forskjellige sensorer. BLI-sensorene er imidlertid ikke gjenbrukbare, noe som gjør kostnadene for eksperimentet ekstremt høye43.

Den største fordelen med FEB er den automatiserte, brukervennlige programvaren som veileder brukeren gjennom hele eksperimentet, og den åpne pipetteringsplattformen som lar brukeren legge til analytten til det immobiliserte målet på hvert trinn. Denne åpen pipetteringsmetoden kombinert med en enkel programvare gjør FEB enkel å lære og krever liten eller til og med ingen opplæring. Det krever imidlertid at brukeren har en grunnleggende mestring av håndpipettering, og mangelen på automatisert væskehåndtering betyr at reproduserbarheten av trinntid avhenger helt av brukeren. Den samme mangelen på integrert væskehåndtering betyr at sjetongene og instrumentene er kostnadseffektive sammenlignet med SPR eller BLI. FEB har også høy reproduserbarhet og pålitelighet i å oppdage biomolekylære interaksjoner på grunn av den definerte fabrikasjonsprosessen som er involvert i biosensorbrikkeforberedelse35.

Sammenlignet med den veletablerte og standard ITC-deteksjonsmetoden, bruker FEB bare 50 μL analyttvolum ved nanomolarkonsentrasjoner for hele eksperimentet, noe som reduserer sjansen for kjernedannelse eller aggregering av proteiner. Et av de største problemene med ITC er å avgasse proteinene før lasting for å unngå luftbobler. Under ITC-eksperimentet er det en sjanse for å utvikle bobler inne i målecellen på grunn av kontinuerlig omrøring og intens rensing, noe som kan erstatte prøveløsningen negativt eller forårsake prøvetap42. FEB-teknologien overvinner disse utfordringene ved ITC ved å tilby robust mål-immobiliseringskjemi, redusere aggregering og boble, øke stabiliteten og forbedre konsentrasjonsavhengige problemer som ITC står overfor.

En potensiell ulempe ved FEB-enheter er deres følsomhet for buffersammensetning og konsentrasjonsendringer, noe som kan føre til en drift i grunnlinjen som bør korrigeres under montering og analyse av resultatene. Biosensorbrikken er også følsom for pH og salt, så buffere som brukes under kalibrering og måling av analytten må være de samme gjennom hele eksperimentet. Kjemikalier som brukes som konserveringsmidler (f.eks. natriumazid) og hydrofobe molekyler kan skade sensoren og kan til og med føre til en økning i ikke-spesifikk binding. Disse ulempene kan reduseres med hensyn til bufferkonsistens gjennom måletrinnene, dialyse av forstyrrende forbindelser fra analyttbestanden og passende passivisering av overflaten (f.eks. bruk av vaskemidler, proteinblokkere eller forskjellige PEG-molekyler).

Oppsummert demonstrerte vi vellykket sterk PPI mellom Hsp90 /Cdc37 ved å bruke FEB-teknologien og validerte deres interaksjon ved hjelp av ITC, og ga oppmuntrende data til å støtte FEB som en innovativ alternativ metode for PPI-deteksjon. FEB-teknologien tilbyr et bredt spekter av applikasjoner innen ulike områder av legemiddeloppdagelse, legemidler, biomolekylær analyse av små molekyler, peptider og proteiner, antistoffutvikling, legemiddelvalidering og blyoptimalisering lett tilgjengelig ved å oversette in vitro biologisk aktivitet lett til in vivo-effekt . Tatt i betraktning fordelene med FEB-teknologi og dens enorme anvendelser i å utforske PPI-, protein- og DNA- eller RNA-interaksjoner, samt protein- og lite molekyl (f.eks. legemiddel) interaksjoner, foreslår vi at det er en unik, lovende teknologi i PPI-deteksjonsverktøykassen. I vårt tilfelle tilbyr FEB-teknologi et verdifullt verktøy for å enkelt vurdere den bindende effekten av Hsp90 / Cdc37 PPI-kandidatantagonister, som deretter hjelper til med å velge lovende kandidater for ytterligere in vitro - og in vivo-evalueringer knyttet til ulike sykdommer der denne PPI er kritisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, økonomiske eller på annen måte.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Binational Science Foundation (BSF) til S.K.S. og N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

Biokjemi Utgave 181 Celledelingssyklus 37 Cdc37 Varmesjokkprotein 90 Hsp90 Protein kinase Grafen biosensor Felteffekt biosensing Kreft Biomolekylære interaksjoner
Utforske biomolekylær interaksjon mellom molekylær chaperone Hsp90 og dets klientprotein Kinase Cdc37 ved hjelp av field-effect biosensing teknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter