Summary
Field-effect biosensing (FEB) är en etikettfri teknik för att detektera biomolekylära interaktioner. Den mäter den elektriska strömmen genom grafenbiosensorn till vilken bindningsmålen är immobiliserade. FEB-tekniken användes för att utvärdera biomolekylära interaktioner mellan Hsp90 och Cdc37 och en stark interaktion mellan de två proteinerna detekterades.
Abstract
Biomolekylära interaktioner spelar mångsidiga roller i många cellulära processer genom att reglera och samordna funktionellt relevanta biologiska händelser. Biomolekyler som proteiner, kolhydrater, vitaminer, fettsyror, nukleinsyror och enzymer är grundläggande byggstenar i levande varelser; de samlas i komplexa nätverk i biosystem för att synkronisera en myriad av livshändelser. Proteiner använder vanligtvis komplexa interaktomnätverk för att utföra sina funktioner; därför är det obligatoriskt att utvärdera sådana interaktioner för att avslöja deras betydelse i celler på både cellulär och organismnivå. Mot detta mål introducerar vi en snabbt framväxande teknik, field-effect biosensing (FEB), för att bestämma specifika biomolekylära interaktioner. FEB är en bänkskiva, etikettfri och pålitlig biomolekylär detektionsteknik för att bestämma specifika interaktioner och använder högkvalitativa elektroniska baserade biosensorer. FEB-tekniken kan övervaka interaktioner i nanomolärt område på grund av de biokompatibla nanomaterial som används på dess biosensoryta. Som ett bevis på konceptet belyses protein-proteininteraktionen (PPI) mellan värmechockprotein 90 (Hsp90) och celldelningscykel 37 (Cdc37). Hsp90 är en ATP-beroende molekylär chaperon som spelar en viktig roll i vikning, stabilitet, mognad och kvalitetskontroll av många proteiner och därigenom reglerar flera vitala cellulära funktioner. Cdc37 betraktas som en proteinkinasspecifik molekylär chaperon, eftersom den specifikt känner igen och rekryterar proteinkinaser till Hsp90 för att reglera deras nedströms signaltransduktionsvägar. Som sådan anses Cdc37 vara en co-chaperone av Hsp90. Chaperon-kinasvägen (Hsp90 / Cdc37-komplexet) är hyperaktiverad vid flera maligniteter som främjar cellulär tillväxt; därför är det ett potentiellt mål för cancerbehandling. Föreliggande studie visar effektiviteten hos FEB-tekniken med hjälp av modellsystemet Hsp90/Cdc37. FEB detekterade en stark PPI mellan de två proteinerna (KD-värden på 0,014 μM, 0,053 μM och 0,072 μM i tre oberoende experiment). Sammanfattningsvis är FEB en etikettfri och kostnadseffektiv PPI-detekteringsplattform, som erbjuder snabba och exakta mätningar.
Introduction
Biomolekylära interaktioner:
Proteiner är väsentliga delar av organismer och deltar i många molekylära vägar som cellmetabolism, cellstruktur, cellsignalering, immunsvar, cellvidhäftning och mer. Medan vissa proteiner utför sin funktion (er) oberoende, interagerar de flesta proteiner med andra proteiner med hjälp av ett bindande gränssnitt för att samordna korrekt biologisk aktivitet1.
Biomolekylära interaktioner kan huvudsakligen klassificeras baserat på de distinkta strukturella och funktionella egenskaperna hos involverade proteiner2, till exempel baserat på proteinytorna, den komplexa stabiliteten eller persistensen av interaktioner3. Att identifiera essentiella proteiner och deras roller i biomolekylära interaktioner är avgörande för att förstå biokemiska mekanismer på molekylär nivå4. För närvarande finns det olika metoder för att upptäcka dessa interaktioner5: in vitro6, in silico7, i levande celler8, ex vivo9 och in vivo10 där var och en har sina egna styrkor och svagheter.
In vivo-analyserna utförs med hela djuret som ett experimentellt verktyg11, ocht he ex vivo-analyser utförs på vävnadsextrakt eller hela organ (t.ex. hjärta, hjärna, lever) i en kontrollerad yttre miljö genom att ge minimala förändringar under naturliga förhållanden. Den vanligaste tillämpningen av in vivo - och ex vivo-studier är att utvärdera farmakokinetiken, farmakodynamiken och toxicitetseffekterna av potentiella farmakologiska agens före försök på människa genom att säkerställa deras övergripande säkerhet och effekt12.
Biomolekylära interaktioner kan också detekteras inom levande celler. Avbildning av levande celler tillåter oss att observera dynamiska interaktioner när de utför reaktionerna hos en viss biokemisk väg13. Dessutom kan detektionstekniker, såsom bioluminescens eller fluorescensresonansenergiöverföring, ge information om var och när dessa interaktioner inträffar i cellen14. Även om detektion i levande celler erbjuder viktiga detaljer, är dessa detektionsmetoder beroende av optik och etiketter, vilket kanske inte återspeglar den ursprungliga biologin; De är också mindre kontrollerade än in vitro-metoder och kräver specialiserad expertis för att utföra15.
Beräkningsmetoderna in silico används främst för storskalig screening av målmolekyler före in vitro-experimenten . Beräkningsprediktionsmetoder, datorbaserade databaser, molekylär dockning, kvantitativa struktur-aktivitetsrelationer och andra molekylära dynamiksimuleringsmetoder är bland de väletablerade i silicoverktyg 16. Jämfört med mödosamma experimentella tekniker kan in silico-verktygen enkelt göra förutsägelser med hög känslighet, men med minskad noggrannhet i prediktiv prestanda17.
In vitro-analyser utförs med mikroorganismer eller biologiska molekyler utanför deras biologiska standardsammanhang. Att skildra biomolekylära interaktioner genom in vitro-metoder är avgörande för att förstå proteinfunktioner och biologin bakom det komplexa nätverket av cellfunktion. Den föredragna analysmetoden väljs utifrån proteinets inneboende egenskaper, kinetiska värden och interaktionsläget och intensiteten18,19.
Hsp90/Cdc37-interaktionen:
Chaperon-kinasvägen, som förbinder Hsp90 och Cdc37, är ett lovande terapeutiskt mål inom tumörbiologi20. Hsp90 spelar en central roll i cellcykelkontroll, proteinmontering, cellöverlevnad och signalvägar. Proteiner som är beroende av Hsp90 för sina funktioner levereras till Hsp90 för komplexering genom en co-chaperon, såsom Cdc37. Hsp90 / Cdc37-komplexet styr vikningen av de flesta proteinkinaser och fungerar som ett nav för en mängd intracellulära signalnätverk21. Det är ett lovande antitumörmål på grund av dess förhöjda uttryck i olika maligniteter, inklusive akut myeloblastisk leukemi, multipelt myelom och hepatocellulärt karcinom22,23.
Vanliga in vitro biomolekylära interaktionsdetekteringstekniker
Co-immunoprecipitation (co-IP) är en teknik som bygger på antigen-antikroppsspecificitet för att identifiera biologiskt relevanta interaktioner24. Den primära nackdelen med denna metod är dess oförmåga att detektera interaktioner med låg affinitet och kinetiska värden24. Biofysiska metoder som isotermisk titreringskalorimetri (ITC), ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och FEB-teknik föredras för att bestämma de kinetiska värdena.
ITC är en biofysisk detektionsmetod baserad på bestämning av bindande energi tillsammans med en fullständig termodynamikanalys för att karakterisera biomolekylära interaktioner25. Den främsta fördelen med ITC är att det inte kräver någon märkning eller fixering av målproteinet. De största svårigheterna som ITC stöter på är den höga koncentrationen av målprotein som krävs för ett experiment och svårigheten att analysera icke-kovalenta komplex på grund av små bindande entalpier26. Både SPR och BLI är etikettfria biofysiska tekniker som bygger på immobiliseringen av målmolekylen på sensorytan, följt av efterföljande injektioner av analyten över det immobiliserade målet27,28. I SPR mäts förändringar i brytningsindexet under biomolekylära interaktioner27; i BLI registreras interferensen i reflekterat ljus i realtid som en förändring i våglängden som en funktion av tid28. Både SPR och BLI delar gemensamma fördelar med att erbjuda hög specificitet, känslighet och detekteringsfunktioner29. I båda metoderna immobiliseras målproteinet på biosensorytor, och därför kan det finnas en viss förlust av målets ursprungliga konformation, vilket gör det svårt att skilja mellan specifika kontra icke-specifika interaktioner30. BLI använder dyra fiberoptiska engångsbiosensorer för att immobilisera målet och är därför en kostsam teknik31. Jämfört med dessa väletablerade biomolekylära detektionsverktyg erbjuder FEB-tekniken en pålitlig och etikettfri plattform genom att använda låga nanomolära koncentrationer för biomolekylär detektion i realtid med kinetisk karakterisering. FEB-tekniken övervinner också de bubblande utmaningarna i ITC och är mer kostnadseffektiv jämfört med SPR eller BLI.
De fälteffekttransistorbaserade biosensorerna (FET) är ett framväxande fält för att detektera biomolekylära interaktioner genom att erbjuda olika biomedicinska tillämpningar. I FET-systemet immobiliseras målen till biosensorchipsen och interaktioner detekteras genom förändringar i konduktans32. Den unika egenskapen som ska beaktas vid utvecklingen av en effektiv elektronisk biosensor är de fysikalisk-kemiska egenskaperna såsom den halvledande naturen och den kemiska stabiliteten hos beläggningsmaterialet som används för att tillverka sensorytan33. Konventionella material som kisel som används för FET har begränsat sensorernas känslighet eftersom det kräver oxidskikt inklämda mellan transistorkanalen och en specifik miljö för korrekt funktion34. Dessutom är kiseltransistorer känsliga för miljöer med högt salt, vilket gör det svårt att mäta biologiska interaktioner i sin naturliga miljö. Den grafenbaserade biosensorn presenteras som ett alternativ eftersom den erbjuder utmärkt kemisk stabilitet och elektriskt fält. Eftersom grafen är ett enda atomlager av kol är det både extremt känsligt som halvledare och kemiskt kompatibelt med biologiska lösningar; båda dessa egenskaper är önskvärda för att generera kompatibla elektroniska biosensorer35. Den anmärkningsvärda ultrahöga belastningspotentialen hos biomolekyler som erbjuds av grafenbelagda biosensorer leder till utvecklingen av grafenbaserade biosensorer FEB-teknik.
Principen för FEB-teknik: FEB är en etikettfri biomolekylär detektionsteknik som mäter den elektriska strömmen genom grafenbiosensorn till vilken bindningsmålen är immobiliserade. Interaktioner mellan det immobiliserade proteinet och analyten resulterar i förändringar i ström som övervakas i realtid, vilket möjliggör noggranna kinetiska mätningar36.
Instrumentering: FEB-systemet består av ett grafenfälteffekttransistor (gFET) sensorchip och en elektronisk läsare som tillämpar en konstant spänning under hela experimentet (figur 1). Analyten appliceras i lösning på målproteinet immobiliserat på biosensorytan. När en interaktion inträffar mäts och registreras en förändring i strömmen i realtid. När analytkoncentrationen ökar kommer fraktionen av bunden analyt också att öka, vilket orsakar högre växlingar i strömmen. Med hjälp av den automatiserade analysprogramvara som medföljer instrumentet (Table of Materials) mäts och registreras I-Response i termer av biosensingenheter (BU)37. I-Response definieras som förändringen i strömmen (I) genom biosensorchipet mätt i realtid vid interaktionen mellan det immobiliserade målet och analyten. Den automatiserade analysprogramvaran FEB kan analysera både I-Response och C-Response på dynamiska interaktionshändelser, där C-Response registrerar förändringarna i kapacitansen (C). Variationerna i både I-Response och C-Response motsvarar direkt fraktionen av bunden analyt och kan analyseras ytterligare för att generera KD-värden . Standardinställningen för den automatiserade analysprogramvaran är I-Response.
Figur 1: Översikt över den experimentella installationen. (A) Grafenbaserat chip och en elektronisk läsare. (B) En översikt över chipkomponenterna. Chipet är fäst vid två elektroder som levererar ström till systemet. Chipets yta är täckt med grafen, som när den aktiveras kan binda målet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Metodik:
Initialt sätts det aktiverade biosensorchipet in i FEB-enheten (figur 1) följt av utförandet av stegen som beskrivs nedan: (1) Kalibrering: Experimentet börjar med systemkalibrering med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH = 7.4) för att skapa baslinjens jämviktsrespons. (2) Förening: Analyten införs i chipet och I-responsen övervakas tills bindande mättnad uppnås. (3) Dissociation: Analyten dissocieras med 1x PBS. (4) Regenerering: Rester av analyten avlägsnas med 1x PBS. (5) Tvätt: Totalt fem tvättar utförs med 1x PBS för noggrant avlägsnande av de bundna och obundna analyterna från chipet.
Analys:
Dataanalys utförs med hjälp av den helautomatiska programvaran som medföljer instrumentet. Den automatiserade analysprogramvaran genererar en Hill-passformsplot med ett KD-värde . Hill fit plot beskriver föreningen av en analyt till målproteinet som en funktion av analytkoncentrationer. Koncentrationen vid vilken ett halvmaxiellt svar uppnås är proportionell mot KD-värdet . Ett lågt KD-värde representerar hög bindningsaffinitet och vice versa.
För att validera data som erhållits från FEB-experimentet extraheras I-svar från varje avläsningspunkt för varje analytkoncentration med hjälp av programvaran för datagranskning / export och kan exporteras till annan statistisk analysprogramvara (se materialtabell) som förklaras nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: De rekombinanta proteiner som användes i denna studie, Hsp90 och Cdc37, erhölls kommersiellt (se materialtabell).
1. Aktivering av chip
OBS: Alla material som ska användas i experimentet listas i materialförteckningen. Filtrera alla beredda lösningar genom ett sterilt 0,2 μm filter.
- Förbered 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodimid (EDC) lösning genom att tillsätta 2 mg EDC till 2,5 ml 1 M2-(N-morfolino) etansulfonsyra (MES) buffert (pH = 6,0) i ett 15 ml rör. Förbered N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) lösningar genom att tillsätta 6 mg sulfo-NHS till 2,5 ml 1 M MES-buffert (pH = 6,0) i ett separat 15 ml rör. Aliquot 50 μL av varje lösning i oberoende rör och lagra vid -20 ° C för framtida användning.
- Blanda lika stora volymer EDC-sandsulfo-NHS-lösning (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) genom pipettering upp och ner (inte virvel).
OBS: Den blandade lösningen av EDC / sulfo-NHS måste användas inom 30 minuter för att upprätthålla effektiv tvärbindning för korrekt chipfunktionalisering. - Placera biosensorchippet (5,7 cm x 2,4 cm; se Materialtabell) som levereras av företaget i en petriskål i glas med ett monterat lock. Alla funktionaliseringssteg som är involverade i chipaktivering föreslås att de görs i petriskålen. Applicera 50 μL 1 M MES-buffert (pH = 6,0) på biosensorchipet, inkubera i 1 min vid rumstemperatur och aspirera sedan bufferten.
- Applicera 50 μL EDC/sulfo-NHS-lösning omedelbart på sensorchipet. Täck petriskålen och inkubera i 15 min vid rumstemperatur. Aspirera EDC / sulfo-NHS-lösning från chipet.
- Skölj chipet en gång med 50 μL 1 M MES-buffert (pH = 6,0); aspirera MES-bufferten.
2. Målproteinimmobilering
- Skölj chipet 2x med 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirera PBS från chipet och tillsätt målmolekylen, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
OBS: Buffertmatchning kan förstöra hela experimentet; Före experimentet är det därför viktigt att se till att målmolekylen ligger i samma buffert som den som används för kalibrering (t.ex. 1x PBS (pH = 7,4)). Om det behövs, utför ett buffertutbyte genom dialys över natten före experimentet. I detta experiment utfördes dialys över natten för både rekombinanta proteiner, Hsp90 och Cdc37, mot 1x PBS (pH = 7,4; se materialtabell) med korrekt buffertutbyte vid 4 °C. Koncentrationen av målmaterialet (Hsp90 i detta fall) kan variera beroende på olika experimentella protokoll och typen av målmaterial (protein/peptid/ligander). - Täck över petriskålen i glas och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Aspirera lösningen som innehåller målmolekylen och skölj 3x med 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirera 1x PBS (pH = 7,4) lösningen från chipet.
- Tillsätt 50 μL släck 1 (3,9 mM amino-PEG5-alkohol i 1x PBS (pH = 7,4)) lösning till chipet. Aspirera Quench 1-lösningen från chipet.
- Tillsätt 50 μL släck 2 (1 M etanolamin (pH = 8,5)) lösning till chipet. Täck över petriskålen i glas och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Aspirera släck 2-lösningen från chipet och skölj chipet 5x med 50 μL 1x PBS och lämna den sista PBS-droppen på sensorn.
3. Förbereda analytprover
- Förbered analytutspädningsserier för Cdc37 i önskat koncentrationsområde. För det första experimentet användes följande koncentrationer: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1 000 nM, 2 000 nM, 3 000 nM och 5 000 nM. För det andra experimentet användes en annan uppsättning koncentrationer från 0,4 nM till 200 nM.
- Designa experimentet så att det inkluderar minst åtta olika analytkoncentrationer för att erhålla ett tillförlitligt KD-värde . Bereda de olika utspädningarna av analytproteinet i samma buffert som den som används för kalibrering och målprotein. här är det 1x PBS (pH = 7,4).
4. Laddning av det aktiverade biosensorchipet i FEB-enheten
OBS: FEB-enheten består av en läsare med LED-ljusindikanderingar och en patron för att sätta in biosensorchipet.
- Efter immobilisering av målprotein, sätt in det aktiverade chipet i patronen på enheten, som är ansluten via USB till en dator. Efter chipinsättningen visas en grön LED-lampa på läsaren som indikerar att FEB-enheten är redo för experimentet. Installera den automatiserade programvaran (se Materialtabell) som tillhandahålls av företaget på datorn, som FEB-enheten är ansluten till, för att övervaka experimentet steg för steg enligt beskrivningen nedan.
5. Kör experimentet
- Tryck på modulen Kör experiment på den automatiserade programvaran och välj 10 punkter med regenerering eller något annat önskat protokoll. Fyll i följande uppgifter: operatörens namn, experimentets namn, datum (t.ex. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); Regenereringsbuffert (t.ex. PBS-buffert). immobiliserat mål (t.ex. Hsp90); analyt i lösning (t.ex. Cdc37). Se kompletterande figur S1 för mer information.
- Tryck på knappen Starta experimentet som visas på programvaran och följ instruktionerna som visas av den automatiserade programvaran enligt beskrivningen nedan.
OBS: Programvaran är helt automatiserad, användarvänlig och guidar användaren genom hela experimentet steg för steg. Ett popup-fönster visas på skärmen med instruktioner för att gå vidare vid varje steg i experimentet. Programvaran kommer att ge instruktioner för varje repetitivt steg i följd från kalibrering, analytförening, dissociation, regenerering och tvätt (5x) för varje analytkoncentration under hela experimentet. - Utför instrumentkalibrering. För att göra det, aspirera den återstående PBS-lösningen från chipet och applicera 50 μL kalibreringsbuffert (1x PBS; pH = 7,4). Tryck på Fortsätt-knappen och vänta i 5 minuter tills kalibreringssteget är klart. Programvaran visar slutpunkten som bestämts för kalibreringssteget (5 min) med ett varningslarm för uppföljning.
- Utför sedan en analytförening. För att göra det, aspirera kalibreringsbufferten från chipet och applicera 50 μL av den lägsta analytkoncentrationen (25 nM Cdc37). Tryck på Fortsätt-knappen och vänta i 5 minuter tills associationssteget är klart. Programvaran visar slutpunkten för associeringssteget (5 min) med ett varningslarm för att fortsätta.
- Utför en analytdissociation. För att göra det, aspirera analytlösningen från chipet och applicera 50 μL av dissociationsbufferten (1x PBS; pH = 7,4). Tryck på Fortsätt-knappen och vänta i 5 minuter tills dissociationsstegets varaktighet (5 min) är klar. Programvaran visar slutpunkten för dissociationssteget (5 min) med ett varningslarm för uppföljning.
- Utför sedan chipregenerering. Aspirera dissociationslösningen från chipet och applicera 50 μL regenereringsbuffert (1x PBS; pH = 7,4). Tryck på Fortsätt-knappen och vänta i 30 s tills regenereringsstegets varaktighet (30 s) är klar. Programvaran visar slutpunkten för regenereringssteget (30 s) med ett varningslarm för uppföljning.
- Tvätta slutligen chipet. Aspirera regenereringslösningen från chipet och applicera 50 μL tvättbuffert (1x PBS; pH = 7,4) på chipet. Aspirera lösningen från chipet och upprepa denna 5x. Lämna den sista droppen tvättbuffert på chipet och tryck på Fortsätt-knappen och vänta i 30 s tills tvättstegets varaktighet är klar i programvarudisplayen.
OBS: Programvaran visar slutpunkten för tvättsteget (30 s) med ett varningslarm för att fortsätta med nästa cykel av experimentet. - Upprepa stegen för varje analytkoncentration som används; de fem stegen för kalibrering, analytassociation, dissociation, regenerering och tvätt (5x) utgör en cykel. För experimentet som visas här utförde vi 10 cykler för 10 analytkoncentrationer (från 25 nM till 5000 nM eller 0,4 nM till 200 nM; Figur 2).
6. Bedömning
- Tryck på knappen Analys som visas högst upp i den automatiserade analysprogramvaran i slutet av experimentet. Ett visningsfönster som innehåller alla experimentella punkter visas. I fönstret, se till att analytkoncentrationerna som används för det föreskrivna protokollet är korrekta.
- Tryck på knappen Kör analys för att generera KD-värdet automatiskt. Programvaran genererar en Hill fit plot genom att plotta analytkoncentrationerna mot motsvarande I-svar från vilka dissociationskonstanten vid jämvikt, KD-värde , beräknas.
- Exportera rådata för analys i annan statistisk analysprogramvara med hjälp av programvaran för datagranskning/export enligt beskrivningen nedan.
- Kopiera R1R-filen som skapades automatiskt i slutet av experimentet (t.ex. Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) till en ny mapp på skrivbordet. Öppna programvaran datagranskning/export som tillhandahålls av företaget (se kompletterande figur S2A).
- Klicka på Databehandling > Process R1R-filer > OK på startskärmen för datagransknings- / exportprogramvaran.
- Välj den mapp som innehåller R1R-filer som skapades på skrivbordet i steg 6.3.1. och tryck på OK . Detta skapar en kopia av de ursprungliga R1R-data för att granska och redigera data utan att åsidosätta originalfilen.
- Tryck på databehandlingsikonen som visas på startskärmen för programvaran för datagranskning /export. Tryck på Ladda bearbetade R1R-filer > OK. Välj samma mapp som skapades i steg 6.3.1 som innehåller bearbetade R1R-filer. Tryck på OK. I det här steget är mappen som innehåller experimentfilerna redo att granskas.
- Tryck på Dataanalys på startskärmen för programvara för datagranskning/export. Välj Kalibrering > Kalibrera redigerade R1R-filer > OK (se Kompletterande figur S2B). Det här steget kalibrerar alla datapunkter enligt det första kalibreringssteget för att skapa en baslinje.
- Tryck på Dataanalys på startskärmen för programvara för datagranskning/export. Välj Granska och redigera R1R-filer > OK. Granska datapunkterna, ta bort punkter eller lägg till steg med hjälp av knappen Ta bort/lägg till steg . Se till att alla steg är på rätt plats, t.ex. att kalibreringssteget ligger på baslinjen, att associeringssteget är högst (se kompletterande figur S3) och tryck sedan på knappen Spara för att spara alla ändringar som gjorts.
- Tryck på Dataanalys på startskärmen för programvara för datagranskning/export. Välj Analysera/rita data, välj de steg som ska exporteras (se Kompletterande figur S4). Lägg till varje associationssteg (t.ex. steg 2, steg 7 och så vidare) efter att ha subtraherat kalibreringssteget (t.ex. steg 1, steg 6 och så vidare) i exportlistan innan du exporterar data.
- Tryck på Exportera dessa data. Programvaran genererar en kalkylarkfil som innehåller I-Response för varje analytkoncentrationsdatapunkt från varje transistor (om alla transistorer fungerar kommer vi att ha tre olika I-svarsvärden för varje koncentrationspunkt). Använd den här kalkylarkfilen för att ytterligare analysera data i statistikprogramvaran.
- Öppna programvaran för statistisk analys. Skapa en XY-tabell med tre Y-värden; tryck på Skapa. Data för den här tabellen (X- och Y-värden) kopieras från kalkylbladsfilen som skapades i steg 6.3.8. X-axeln motsvarar analytkoncentrationen (beroende på vilken koncentration som används), och de tre Y-värdena motsvarar I-svaren, erhållna från programvaran Data Review/Export som tillhandahålls av företaget.
- Tryck på Analysera dessa data. Välj XY-analyser > icke-linjär regression (curve fit) > bindande mättnad > en plats > totalt. Programvaran analyserar automatiskt data, genererar KD-värdet och skapar ett diagram över datapunkterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat från experiment 1:
Målproteinet Hsp90 (500 nM) immobiliserades till chipet enligt målimmobiliseringsprotokollet som beskrivits ovan. För det första experimentet framställdes 10 koncentrationer av analytproteinet, Cdc37, från 25 nM till 5 000 nM, baserat på tillgängliga data i litteraturen (se tabell 1).
Experimentets steg kan övervakas i realtid genom att följa de förändringar som sker i I-Response (figur 3A). Man kan visualisera hur varje steg som ingår i protokollet påverkar I-Response under hela experimentet. Till exempel är I-responsen nära noll under kalibreringen, och i associeringssteget ökar I-responsen gradvis med ökande analytkoncentrationer (Cdc37). Om man tittade på data från detta experiment (figur 3A) observerades en plötslig ökning av I-responsen i låga analytkoncentrationer (50 BU vid 25 nM). Ett lågt I-svar förväntades vid låg analytkoncentration som kommer att öka gradvis med ökande koncentrationer. Denna plötsliga ökning föreslog att ett experiment inklusive lägre analytkoncentrationspunkter skulle utformas.
Efter de protokollsteg som diskuterats ovan analyserades data i den medföljande automatiserade analysprogramvaran, som automatiskt genererade ett Hill fit-diagram med ett beräknat K D-värde (figur 3B). KD-värdet beräknat från den automatiserade analysprogramvaran för det första experimentet var 350 000 ± 76 000 μM. De flesta av de vanliga biologiska interaktionerna visade ett KD-värde i det låga μM eller till och med i nM-intervallet; Således är KD-värdet som genereras för det första experimentet mycket högt.
Det kan finnas flera förklaringar till det observerade höga KD-värdet : det kan finnas bindning med låg affinitet mellan de två studerade proteinerna (Hsp90/Cdc37), vilket innebär att en hög ligandkoncentration krävs för de molekylära interaktionerna; Experimentet kan ha utformats med icke-idealiska, out-of-range analytkoncentrationer. det höga värdet kan bero på de inbyggda parametrarna som används i anpassningsmodulen i analysprogramvaran. Den automatiserade analysprogramvaran använder en dos-responsanalysmodul för att passa datapunkterna, men vissa interaktioner kanske inte passar bra i den här modellen, vilket ger falska data, vilket resulterar i höga KD-värden .
För att erhålla ett exakt KD-värde med en mättad Hill-plot krävs standardisering av experimentet genom försök och fel som inkluderar både lägre och högre analytkoncentrationspunkter för att förvärva det lägsta KD-värdet med en låg felfrekvens.
Med tanke på alla dessa faktorer exporterades data från analysprogramvara till ytterligare statistisk analysprogramvara. I-Response för varje associationspunkt extraherades med hjälp av den automatiska programvaran för datagranskning/export och sammanfattas i tabell 2 genom att följa stegen som beskrivs ovan i analyssteget (steg 6).
Resultaten från programvaran för statistisk analys (figur 3C) visade ett relativt lågt KD-värde med en hög standardavvikelse (0,011 ± 0,494 μM) och ett lågtR2-värde på 0,78. Den signifikanta variationen som observerades i KD-värdet och det lågaR2-värdet tydde på att de koncentrationspunkter som valts för detta experiment inte är optimala. Dessutom märktes det också att vissa grafpunkter inte passade bra med plottrendlinjen (figur 3C); Detta stärkte behovet av att utforma ett andra experiment genom att inkludera olika analytkoncentrationspunkter.
De inbyggda parametrarna som används av de två analysprogrammen är helt olika, och det återspeglas i K D-värdegenereringsprocessen. Skillnaderna i KD-värdena erhållna från de två analysprogrammen (350 000 ± 76 000 μM jämfört med 0,011 ± 0,494 μM) kan hänföras till det faktum att olika analysmoduler användes för beräkning. Analysen som utförs i den statistiska analysprogramvaran kan passa bättre för denna interaktion, vilket ger ett lägre KD-värde.
Men om resultaten från båda analyserna kombineras (350 000 ± 76 000 μM och 0,011 ± 0,494 μM) kan man dra slutsatsen att det första experimentet inte var optimalt och att ytterligare koncentrationspunkter skulle krävas.
För att validera denna punkt uteslöts den okorrelerade grafpunkten, 3 000 nM (se kompletterande figur S5). Resultaten av analysen visade ett KD-värde på 0,006 ± 0,081 μM med ettR2-värde på 0,98. Dessa resultat indikerade att nästa experiment bör utformas med fokus på mer relevanta koncentrationer. Därför utfördes ett andra experiment för att utvärdera Hsp90 / Cdc37 PPI med hjälp av olika testpunkter med koncentrationer under och över den förutsagda KD.
Resultat från experiment 2:
Målproteinet, Hsp90 (500 nM) immobiliserades till chipet med hjälp av protokollet som beskrivits ovan. Totalt 10 koncentrationer av analyten (Cdc37) framställdes enligt följande: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM och 200 nM. Det andra experimentet utformades genom att inkludera olika analytkoncentrationspunkter genom att överväga alla insikter från det tidigare experimentet som nämnts ovan.
Under experimentet övervakades varje steg i realtid (figur 4A). Här börjar I-Response-grafen i realtid (härledd från de låga koncentrationerna av analyt-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) initialt från noll och ökar gradvis vid ökningen av analytkoncentrationer vid varje cykel av experimentet jämfört med den plötsliga ökningen av I-Response som observerades i det första experimentet.
Enligt protokollet som nämns ovan analyserades data med hjälp av den automatiserade analysprogramvaran (figur 4B). KD-värdet beräknat från den automatiserade analysprogramvaran för detta experiment var 0,0673 ± 0,0002 μM, vilket föreslog en stark interaktion mellan målproteinet Hsp90 och analyten Cdc37. Standardavvikelsen på 0,0002 μM var mycket mindre än den som erhölls i det första experimentet, vilket ger förtroende för att de nya uppgifterna är mycket mer tillförlitliga.
För att validera detta resultat exporterade vi datapunkterna (tabell 3) till en annan statistisk analysprogramvara som förklarats tidigare; Resultaten från analysen sammanfattas i figur 4C.
Med hjälp av den statistiska analysprogramvaran konstaterades att KD-värdet för Hsp90 / Cdc37 PPI är 0,014 ± 0,005 μM (figur 4C). De låga värdena för KD och standardavvikelse indikerar en stark interaktion mellan de två proteinerna, Hsp90 och Cdc37. Dessutom indikerarR2-värdet på 0, 99 att analysen perfekt passar de experimentella grafpunkterna. Båda analysprogrammen visade konsekvens i resultaten, med låga KD-värden på cirka 0,0673 ± 0,0002 μM respektive 0,014 ± 0,005 μM.
För att bekräfta experimentets reproducerbarhet och noggrannhet utfördes samma experiment i två replikat med användning av Hsp90 (500 nM) som målprotein och Cdc37 som analyt med samma koncentrationer som sträcker sig från 0,4 nm till 200 nm som används i det andra experimentet. Under experimentet övervakades varje steg i realtid (tilläggsfigur S6A och tilläggsfigur S7A). KD-värdet beräknat från programvaran för automatiserad analys visas i tilläggsfigur S6B och tilläggsfigur S7B (0,053 ± 0,002 μM respektive 0,0719 ± 0,0007 μM). Som tidigare nämnts exporterades datapunkterna (tilläggstabell S1 och tilläggstabell S2) till ett annat statistiskt analysprogram, och resultaten visas i tilläggsfigur S6C och tilläggsfigur S7C (tilläggsfigur S6C: KD är 0,003 ± 0,009 μM och R2 är 0,99; Tilläggsfigur S7C: KD är 0,004 ± 0,009 μM ochR2 är 0,99). Resultaten av de två replikaten från både analysprogramvaran bekräftade väl och bekräftade noggrannheten, repeterbarheten och reproducerbarheten hos Hsp90 / Cdc37 FEB experimentella data.
En kontrollstudie utfördes också där den biomolekylära interaktionen mellan Hsp90 och ett kontrollprotein, Bovine serum albumin (BSA) belystes. Kontrollstudien med BSA som analyt gjordes med hjälp av en identisk experimentell inställning och analytkoncentrationer som användes i det andra experimentet. Totalt 10 koncentrationer av kontrollproteinet, BSA, från 0,4 nM till 200 nM framställdes i 1x PBS (pH = 7,4) och varje steg i experimentet övervakades i realtid.
I likhet med experimentet med Hsp90 och Cdc37 börjar I-Response-grafen i realtid initialt från 0; I kontrollstudien ökade dock inte I-responsen gradvis vid ökningen av analytkoncentrationerna (tilläggsfigur S8A). Data analyserades också med hjälp av den automatiserade analysprogramvaran (kompletterande figur S8B), och programvaran kunde inte beräkna KD-värdet från datapunkterna i detta experiment. Det framgår, från Hill Plot genererat från programvaran, att det inte finns någon interaktion mellan Hsp90 och kontroll-BSA-analyten. För att validera detta resultat exporterade vi datapunkterna (kompletterande tabell S3) till en annan statistisk analysprogramvara som förklarats tidigare. Med hjälp av den statistiska analysprogramvaran konstaterades att KD-värdet för Hsp90 / BSA PPI är negativt (kompletterande figur S8C; KD är -0,009 ± -0,0003 μM), vilket återigen indikerar att det inte finns någon interaktion mellan de två proteinerna, Hsp90 och BSA. Dessutom indikerarR2-värdet (0,82) att analysen inte passade de experimentella grafpunkterna. Båda analysprogrammen visade konsekvens i resultaten att Hsp90 och BSA inte interagerar.
Vid jämförelse av Hsp90/Cdc37 FEB experimentella data med andra experimentella data som finns tillgängliga i litteraturen fann man att KD-värdena erhållna i denna studie (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM och KD = 0,072 ± 0,001 μM) var i två storleksordningar lägre än tidigare publicerade data (KD = 1,46 μM38 eller 6 μM39 ). Dessa skillnader kan hänföras till användningen av humana Hsp90- och Cdc37-konstruktioner i full längd i de aktuella experimenten. Tidigare studier utfördes på jäst Hsp90-konstruktioner som endast innehöll partiellt protein38 eller C. elegans homologproteiner39 (tabell 1). För att validera de resultat som erhållits i FEB-systemet utfördes ITC-experiment.
Utvärdering av Hsp90/Cdc37 PPI med hjälp av ITC-systemet:
ITC anses vara guldstandarden för att undersöka biomolekylära interaktioner. Vi utförde vidare ITC för att bestämma den termodynamiska kinetiken hos Hsp90 / Cdc37 PPI och som validering för FEB-experimentet. Hsp90 och Cdc37 utsätts för dialys mot PBS (pH = 7,0) före ITC. Cirka 0,25 μM lösning av målproteinet (Hsp90) och 2,5 μM lösning av analytprotein (Cdc37) framställdes i PBS för de kalorimetriska titreringarna. En total volym på 80 μL Cdc37-lösning med på varandra följande intervall titrerades från den roterande sprutan till cellen innehållande 150 μL Hsp90-lösning vid 298,15 K. Varje injektion inträffade under en 4 s varaktighet och tidsintervallet mellan på varandra följande injektioner var 150 s. Totalt 19 injektioner på 2 μL vardera gjordes med en omrörningshastighet på 500 rpm respektive en referenseffekt på 41,9 μW. Värmevariationen till följd av Hsp90/Cdc37-interaktionen övervakades och de slutliga data som erhölls i slutet av Cdc37-analytinjektionerna monterades med hjälp av ITC-analysprogramvara som levererades av företaget. Värmevariationerna tillsammans med de termodynamiska parametrarna såsom molär entalpiförändring (ΔH), entropiförändring (ΔS), antalet bindningsställen (n) och jämviktsdissociationskonstanten (KD) mellan Hsp90 / Cdc37 PPI uppskattades. Gibbs fria energiförändring (ΔG) beräknades också från ekvationen ΔG = ΔH - TΔS efter erhållande av termiska parametrar från ITC-termogrammet.
ITC-diagrammet avslöjar mängden värme som förbrukas eller frigörs under de biologiska interaktionerna för att belysa arten av interaktioner och intermolekylära krafter som styr PPI40. Cdc37 (2,5 μM) titrerades till Hsp90 (0,25 μM), och motsvarande kurvor visas i figur 5A,B. Den erhållna ITC-plottningen befanns vara exoterm och monterades i en enda bindningsplatsmodell som uppvisade en bindande stökiometri (n) av en, bindande energi, ΔG = -45,9 kJ / mol och KD-värde = 0,009 μM. Den lilla inkonsekvens som observerats i form av ett endotermt skifte i början av ITC-termogrammet (figur 5A) föreslår bildandet av bubblor medan analytproteinet titreras till mätcellen41,42. Bland Hsp90 / Cdc37 PPI, ITC-experiment utförda vid lägre och högre koncentrationer, uppvisade det 10-faldiga överskottet av Cdc37 (Hsp90-koncentration = 0,25 μM och Cdc37-koncentration = 2,5 μM) acceptabla bindningsparametrar genom att uppnå en mättnadskurva. KD-värdet erhållet från ITC (KD = 0,009 μM) korrelerade väl med KD-värdet beräknat med FEB-teknik (KD = 0,014 μM, 0,053 μM och 0,072 μM), vilket starkt stöder FEB: s känslighet och noggrannhet vid detektering av Hsp90 / Cdc37 PPI.
Bild 2: Protokollsammanfattning. (A) Sammanfattning av stegen för chipaktiveringsprocessen. (B) Grafisk återgivning av de fem upprepande stegen i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Datafiler som genereras från experiment 1. (A) Experimentdata som övervakas i realtid. Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheter (BU), och x-axeln motsvarar de olika tidpunkterna och koncentrationerna av analyten i experimentet. Denna siffra motsvarar data från det första experimentet. (B) Hill Fit-plot som genereras från den automatiserade analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response, x-axeln motsvarar koncentrationer av analyt (Cdc37) i nM. För detta experiment är KD-värdet 350 000 ± 76 000 μM. (C) Associationsdiagram genererat med hjälp av den statistiska analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response i slutet av associeringsfasen, x-axeln motsvarar de olika analyten, Cdc37, koncentrationerna. Det här diagrammet genererades med hjälp av de datapunkter som anges i tabell 2. Sammanfattning av analysresultaten finns i diagrammet. för detta experiment är KD-värdet 0,011 ± 0,494 μM ochR2-värdet är 0,78. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Datafiler som genereras från experiment 2. (A) Experimentdata som övervakas i realtid. Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheter (BU), och x-axeln motsvarar de olika tidpunkterna och koncentrationerna av analyten i experimentet. Denna siffra motsvarar data från det andra experimentet. (B) Hill Fit-plot som genereras från den automatiserade analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response, x-axeln motsvarar koncentrationen av analyt (Cdc37) i nM. För detta experiment är KD-värdet 0,0673 ± 0,0002 μM (C) Associationsdiagram genererat med hjälp av den statistiska analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response i slutet av associeringsfasen, x-axeln motsvarar de olika analyten Cdc37-koncentrationerna. Det här diagrammet genererades med hjälp av de datapunkter som anges i tabell 3. Sammanfattning av analysresultaten finns i diagrammet. för detta experiment är KD-värdet 0,014 ± 0,005 μM ochR2-värdet är 0,99. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: ITC-termogram för Hsp90- och Cdc37-interaktion. (A) Den övre panelen representerar motsvarande värmeutveckelskurvor erhållna på grund av på varandra följande injektioner av Cdc37 (2,5 μM) i Hsp90 (0,25 μM) vid 298,15 K. Differentialeffekten (DP) representerar differentialkraft som en funktion av tiden. (B) De integrerade datapunkterna i den nedre panelen anger motsvarande normaliserade värme kontra molförhållandet för Hsp90 / Cdc37. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Utförda analyser | FEB analys KD | Prismaanalys KD | Konstruera ursprung | Aminosyror | Referenser |
| ITC | 1,46 μM och 1,32 μM | NA | Jäst Hsp90 | N-terminaldomän för Hsp90 | 36 |
| Mänsklig Cdc37 | |||||
| SPR | 6 μM | NA | C. elegans | Full längd | 37 |
| FEB - Första repetionen | 0,014 μM | 0,067 μM | Mänsklig Hsp90 | Full längd | Utförd i denna studie |
| Mänsklig Cdc37 | |||||
| FEB - Andra upprepningen | 0,053 μM | 0,003 μM | Mänsklig Hsp90 | Full längd | Utförd i denna studie |
| Mänsklig Cdc37 | |||||
| FEB - Tredje repetitionen | 0,072 μM | 0,004 μM | Mänsklig Hsp90 | Full längd | Utförd i denna studie |
| Mänsklig Cdc37 | |||||
| ITC | 0,009 μM | NA | Mänsklig Hsp90 | Full längd | Utförd i denna studie |
| Mänsklig Cdc37 | |||||
| FEB- Kontrollstudie | Inga data (Det fanns otillräckliga data för att beräkna KD) | -0,009 μM (KD-värde med negativa värden indikerar att det inte finns någon interaktion) | Mänsklig Hsp90 | Full längd | Utförd i denna studie |
| BSA |
Tabell 1: Hsp90 / Cdc37 PPI-utvärdering med olika metoder som rapporterats i denna studie och litteraturen.
| Analytkoncentrationer (nM) | I-Response transistor 1 | I-Response transistor 2 | I-Response transistor 3 | Genomsnitt |
| I-svar | ||||
| 25.00 | 53.540 | 49.406 | 50.590 | 51.178 |
| 50.00 | 71.427 | 65.943 | 67.568 | 68.313 |
| 100.00 | 85.305 | 79.226 | 81.074 | 81.868 |
| 200.00 | 106.652 | 99.320 | 101.502 | 102.491 |
| 400.00 | 122.572 | 114.837 | 117.128 | 118.179 |
| 800.00 | 144.293 | 136.374 | 138.872 | 139.846 |
| 1000.00 | 135.165 | 128.657 | 130.425 | 131.416 |
| 2000.00 | 164.487 | 159.401 | 161.697 | 161.862 |
| 3000.00 | 109.997 | 106.705 | 107.205 | 107.969 |
| 5000.00 | 282.637 | 274.207 | 276.247 | 278.422 |
Tabell 2: Sammanfattning av de I-responsvärden som genereras från tre olika transistorer för varje chip vid varje koncentrationspunkt i det första experimentet.
| Analytkoncentrationer (nM) | I-Response transistor 1 | I-Response transistor 2 | I-Response transistor 3 | Genomsnittligt I-svar |
| 0.40 | 13.097 | 14.721 | 11.714 | 13.177 |
| 0.80 | 10.183 | 8.861 | 13.240 | 10.762 |
| 1.60 | 24.826 | 20.377 | 25.240 | 23.481 |
| 3.20 | 40.746 | 41.047 | 40.783 | 40.858 |
| 6.40 | 54.938 | 54.224 | 54.913 | 54.691 |
| 12.80 | 83.057 | 81.452 | 82.596 | 82.369 |
| 25.60 | 110.440 | 109.152 | 110.343 | 109.978 |
| 51.20 | 141.161 | 140.363 | 141.125 | 140.883 |
| 102.40 | 164.215 | 162.679 | 164.572 | 163.822 |
| 200.00 | 196.373 | 197.007 | 198.495 | 197.292 |
Tabell 3: Sammanfattning av de I-responsvärden som genereras från tre olika transistorer för varje chip vid varje koncentrationspunkt i det andra experimentet.
Kompletterande figur S1: Skärmdump av huvudskärmen för automatiserad programvara före experimentets början. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Skärmdump av huvudskärmen för automatiserad programvara för databehandling och analys. (A) Huvudskärmsvisning av programvara för granskning/export av data som visar alternativ för databehandling. (B) Huvudskärmen för programvara för granskning/export av data som visar alternativ för dataanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Granskningsdatapunkterna som erhållits från gransknings-/exportprogramvara. I det här steget granskar du experimentet och lägger till eller tar bort datapunkter. Se till att kopplingspunkten (2, 7, 12, 17, 22 och så vidare) alltid är vid valet. Till exempel är det första valet från vänster datapunkt nummer 2 och sedan datapunkt nummer 10 (men det ska vara nummer 7). För att lösa detta tar du bara bort punkterna 3, 4 och 5. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur S4: Exportera datalista till exempel. I det här steget väljer du vilka experimentpunkter som ska exporteras. Välj en kopplingspunkt (2, 7, 12, 17, 22 och så vidare) och subtrahera de tidigare kalibreringsstegen (1, 6, 11, 16, 21 och så vidare). Lägg till alla punkter i exportlistan och exportera dessa data för att få ett kalkylblad med I-Response för varje datapunkt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S5: Associationsdiagram genererat med hjälp av programvaran för statistisk analys. Y-axeln motsvarar I-Response i slutet av associeringsfasen, x-axeln motsvarar de olika analyten Cdc37-koncentrationerna. Det här diagrammet genererades med hjälp av datapunkterna från det första experimentet och exkluderade koncentrationsdatapunkten på 3 000 nM. Sammanfattning av analysresultaten finns i diagrammet. för detta experiment är KD-värdet 0,006 ± 0,081 μM ochR2-värdet är 0,98. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S6: Datafiler som genereras från experiment 2 replikera 1. (A) Försöksdata som övervakas i realtid. Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheter (BU), och x-axeln motsvarar de olika tidpunkterna och koncentrationerna av analyten i experimentet. Denna siffra motsvarar data från den andra repetitionen som utfördes i det andra experimentet där Hsp90 immobiliserades på chipet (500 nM) och 10 koncentrationer av Cdc37-analyt framställdes (0,4-200 nM). I-Response-grafen i realtid börjar initialt från 0 och ökar gradvis vid ökningen av analytkoncentrationer vid varje cykel av experimentet, vilket tyder på att experimentet är framgångsrikt. (B) Hill Fit-plot som genereras från den automatiserade analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response, x-axeln motsvarar koncentrationer av analyt (Cdc37) i nM. Resultaten från den automatiserade analysen visade ett relativt lågt KD-värde och låg standardavvikelse på 0,0531 ± 0,0002 μM, vilket tyder på en stark interaktion mellan Hsp90 och Cdc37. (C) Associationsdiagrammet genererat med hjälp av den statistiska analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response i slutet av associeringsfasen, x-axeln motsvarar de olika analyten Cdc37-koncentrationerna. Det här diagrammet genererades med hjälp av de datapunkter som anges i tabell S1. Sammanfattning av analysresultaten finns i diagrammet. för detta experiment är KD-värdet 0,003 ± 0,009 μM ochR2-värdet är 0,99. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S7: Datafiler som genereras från experiment 2 replikera 1. (A) Försöksdata som övervakas i realtid. Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheter (BU), och x-axeln motsvarar de olika tidpunkterna och koncentrationerna av analyten i experimentet. Denna siffra motsvarar data från den tredje upprepningen i det andra experimentet där Hsp90 immobiliserades på chipet (500 nM) och 10 koncentrationer av Cdc37-analyt framställdes (0,4-200 nM). (B) Hill Fit-plot som genereras från den automatiserade analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response, x-axeln motsvarar koncentrationer av analyt (Cdc37) i nM. Resultaten från den automatiserade analysen visade ett relativt lågt KD-värde och en låg standardavvikelse på 0,0719 ± 0,0007 μM, vilket tyder på en stark interaktion mellan Hsp90 och Cdc37. (C) Associationsdiagram genererat med hjälp av den statistiska analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response i slutet av associeringsfasen. X-axeln motsvarar de olika analyten Cdc37-koncentrationerna. Det här diagrammet genererades med hjälp av de datapunkter som anges i tabell S2. Sammanfattning av analysresultaten finns i diagrammet. för detta experiment är KD-värdet 0,004 ± 0,009 μM ochR2-värdet är 0,99. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S8: Datafiler som genereras från kontrollexperimentet. (A) Försöksdata som övervakas i realtid. Y-axeln motsvarar I-responsen i biosensorenheter (BU), och x-axeln motsvarar de olika tidpunkterna och koncentrationerna av analyten i experimentet. Denna siffra motsvarar data från kontrollexperimentet där Hsp90 immobiliserades på chipet (500 nM) och 10 koncentrationer av BSA (kontrollprotein) analyt framställdes (0,4-200 nM). I-Response-grafen i realtid börjar från lågt I-svar runt 10-15 BU och ökar inte vid en ökning av analytkoncentrationerna vid varje cykel av experimentet, vilket tyder på att det inte finns någon interaktion mellan Hsp90 och BSA. (B) Hill Fit-plot som genereras från den automatiserade analysprogramvaran. Y-axeln motsvarar I-Response; x-axeln motsvarar koncentrationer av analyt (BSA) i nM. Resultaten från den automatiserade analysen visade att det inte finns tillräckliga data för att beräkna KD-värdet som tyder på att det inte finns någon interaktion mellan Hsp90 och BSA. (C) Associationsdiagram som genereras med hjälp av programvaran för statistisk analys. Y-axeln motsvarar I-Response i slutet av associeringsfasen, x-axeln motsvarar de olika analyt-BSA-koncentrationerna. Det här diagrammet genererades med hjälp av de datapunkter som anges i tabell S4. Sammanfattning av analysresultaten finns i diagrammet. för detta experiment är KD-värdet -0,009 ± -0,0003 μM ochR2-värdet är 0,82. Ett negativt KD-värde nära noll indikerar att det inte finns någon interaktion mellan Hsp90 och BSA. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Sammanfattning av de I-Response-värden som genereras vid varje koncentrationspunkt och läses från varje chips transistorer (tre olika transistorer för varje chip). Denna tabell motsvarar de data som extraherats från den andra repetitionen som utfördes för det andra experimentet där Hsp90 immobiliserades på chipet (500 nM) och 10 koncentrationer av Cdc37-analyt framställdes (0,4-200 nM). Datapunkterna från denna tabell användes för analys i programvaran för statistisk analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell S2: Sammanfattning av de I-Response-värden som genereras vid varje koncentrationspunkt och läses från varje chips transistorer (tre olika transistorer för varje chip). Denna tabell motsvarar de data som extraherats från den tredje repetitionen som utfördes för det andra experimentet där Hsp90 immobiliserades på chipet (500 nM) och 10 koncentrationer av Cdc37-analyt framställdes (0,4-200 nM). Datapunkterna från denna tabell användes för analys i programvaran för statistisk analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell S3: Sammanfattning av de I-Response-värden som genereras vid varje koncentrationspunkt och läses från varje chips transistor (tre olika transistorer för varje chip). Denna tabell motsvarar data från kontrollexperimentet där Hsp90 immobiliserades på chipet (500 nM) och 10 koncentrationer av BSA-analyt framställdes (0,4-200 nM). Datapunkterna från denna tabell användes för analys i programvaran för statistisk analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie utvärderades möjligheten att använda FEB-tekniken (en kinetisk karakteriseringsmetod i realtid) för att bestämma den biomolekylära interaktionen mellan Hsp90 och Cdc37. Det första undersökande experimentet (första experimentet) föreslog att valet av rätt analytkoncentrationer är en kritisk del av experimentet och att experimentet bör utformas genom att inkludera koncentrationspunkter över och under KD-värdet , vilket förutspåddes baserat på de data som finns tillgängliga i litteraturen.
Ändå, om det inte finns någon preliminär information om interaktionen, föreslår vi att man utformar ett preliminärt experiment genom att inkludera ett brett spektrum av koncentrationspunkter i både lägre (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) och högre (1 000 nM, 2 500 nM, 5 000 nM) intervall. Det preliminära experimentet ger en grov uppskattning av KD-värdet och gör det möjligt att planera de efterföljande experimenten med rätt koncentrationsintervall för att erhålla ett exakt KD-värde . FEB-systemet erbjuder en redigeringsprotokollfunktion där man fritt kan välja antalet koncentrationspunkter för experimentet.
Från vår erfarenhet är de mest kritiska stegen som är involverade i FEB-protokollet följande. Målproteinet och analytbufferten bör vara desamma som kalibreringsbufferten. Även en liten buffertmatchning kan orsaka fluktuationer i I-Response och ge opålitliga resultat. Således föreslår vi att du utför dialys över natten genom korrekt buffertutbyte. Noggrann pipettering på biosensorchipet medan du aspirerar eller applicerar en lösning är avgörande under hela experimentet. Slarvig pipettering kan leda till trasiga transistorer eller fluktuationer i I-Response; När du pipetterar, se till att inte vidröra chipets känsliga yta. EDC/sulfo-NHS-lösningen som används i chipaktiveringsprocessen bör blandas färskt före varje användning. Användning av en gammal blandning kan resultera i ett icke-funktionaliserat chip. Se till att använda samma buffert för alla de fem repetitiva stegen (kalibrering, association, dissociation, regenerering och tvätt) som är involverade i experimentets alla cykler.
När vi jämförde FEB med väletablerade biomolekylära detektionssystem i fältet, såsom BLI eller SPR, fann vi att alla tre metoderna delar liknande fördelar 43,44,45 som är: de är etikettfria system, som inte kräver några dyra fluorescerande färgämnen för att upptäcka interaktionerna; de kan upptäcka interaktioner även i små nM-intervall; chipsen är återanvändbara i både SPR och FEB och de kan regenereras och återanvändas effektivt för upp till 10 experiment, och alla tre metoderna ger kinetiska data i realtid och experimenttiden är kort.
Den största fördelen med SPR är att det ger mer omfattande data från experimentet så att man kan beräkna KD, Kpå, Kav, stökiometri och termodynamiska parametrar44. Den största fördelen med BLI är dess förmåga att testa flera koncentrationer i ett experiment. De kinetiska mätningarna kan göras samtidigt för upp till åtta koncentrationer med hjälp av olika sensorer. BLI-sensorerna är dock inte återanvändbara, vilket gör kostnaden för experimentet extremt hög43.
Den största fördelen med FEB är dess automatiserade, användarvänliga programvara som guidar användaren genom hela experimentet och dess pipetteringsplattform med öppen hand som gör det möjligt för användaren att lägga till analyten till det immobiliserade målet vid varje steg. Denna öppna pipetteringsmetod i kombination med en enkel programvara gör FEB lätt att lära sig och kräver liten eller till och med ingen träning. Det kräver dock att användaren har en grundläggande behärskning av handpipettering, och bristen på automatiserad vätskehantering innebär att reproducerbarheten av stegtiming beror helt på användaren. Samma brist på integrerad vätskehantering innebär att flisen och instrumenten är kostnadseffektiva jämfört med SPR eller BLI. FEB uppvisar också hög reproducerbarhet och tillförlitlighet vid detektering av biomolekylära interaktioner på grund av den definierade tillverkningsprocessen som är involverad i biosensorchipberedning35.
Jämfört med den väletablerade och standard ITC-detektionsmetoden använder FEB endast 50 μL analytvolym vid nanomolära koncentrationer för hela experimentet, vilket minskar risken för kärnbildning eller aggregering av proteiner. Ett av de största problemen med ITC är att avgasa proteinerna innan de laddas för att undvika luftbubblor. Under ITC-experimentet finns det en chans att utveckla bubblor inuti mätcellen på grund av kontinuerlig omrörning och intensiv rensning, vilket kan stänka provlösningen negativt eller orsaka provförlust42. FEB-tekniken övervinner dessa utmaningar med ITC genom att erbjuda robust målimmobiliseringskemi, minska aggregering och bubbling, öka stabiliteten och förbättra koncentrationsberoende problem som ITC står inför.
En potentiell nackdel med FEB-enheter är deras mottaglighet för buffertsammansättning och koncentrationsförändringar, vilket kan orsaka en drift i baslinjen som bör korrigeras under montering och analys av resultaten. Biosensorchipet är också känsligt för pH och salt, så buffertar som används vid kalibrering och mätning av analyten måste vara desamma under hela experimentet. Kemikalier som används som konserveringsmedel (t.ex. natriumazid) och hydrofoba molekyler kan skada sensorn och kan till och med orsaka en ökning av icke-specifik bindning. Dessa nackdelar kan mildras med uppmärksamhet på buffertkonsistens under hela mätstegen, dialys av interfererande föreningar från analytbeståndet och lämplig passivering av ytan (t.ex. användning av tvättmedel, proteinblockerare eller olika PEG-molekyler).
Sammanfattningsvis visade vi framgångsrikt stark PPI mellan Hsp90 / Cdc37 genom att använda FEB-tekniken och validerade deras interaktion med ITC, vilket gav uppmuntrande data för att stödja FEB som en innovativ alternativ metod för PPI-detektering. FEB-tekniken erbjuder ett brett spektrum av applikationer inom olika områden av läkemedelsupptäckt, läkemedel, biomolekylär analys av små molekyler, peptider och proteiner, antikroppsutveckling, läkemedelsvalidering och blyoptimering till hands genom att enkelt översätta in vitro-biologisk aktivitet till in vivo-effekt . Med tanke på fördelarna med FEB-tekniken och dess enorma tillämpningar för att utforska PPI-, protein- och DNA- eller RNA-interaktioner, liksom protein- och småmolekylinteraktioner (t.ex. läkemedel), föreslår vi att det är en unik, lovande teknik i PPI-detektionsverktygslådan. I vårt fall erbjuder FEB-tekniken ett värdefullt verktyg för att enkelt bedöma den bindande effekten av Hsp90 / Cdc37 PPI-kandidatantagonister, vilket sedan hjälper till att välja lovande kandidater för ytterligare in vitro - och in vivo-utvärderingar avseende olika sjukdomar där denna PPI är kritisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter, ekonomiska eller på annat sätt.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag från Binational Science Foundation (BSF) till S.K.S. och N.Q.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated analysis software | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis. |
| COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
biosensor chip |
| Data review software | Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points. |
| Dialysis bag | CelluSep, Membrane filtration products | T2-10-15 CAS number: NA |
T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m) |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) | Cardea (Nanomed) | EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8 |
White powder |
| ITC (Isothermal titration calorimetry) system | Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) | NA CAS number: NA |
|
| MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer | Merck | M3671-50G CAS number: 4432-31-9 |
White powder |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips | Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Graphene-based chip |
| PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 | Bio-Lab | 001623237500 CAS number: 7758-11-4 |
Liquid transparent solution |
| Pipete | Thermo Scientific | 11855231 CAS number: NA |
Finnpipette F3 5-50 µL, yellow |
| Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-002-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-003-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Recombinant protein Cdc37 | Abcam | ab256157 CAS number: NA |
|
| Recombinant protein Hsp90 beta | Abcam | ab80033 CAS number: NA |
|
| Spreadsheet | Excel, Microsoft office | NA CAS number: NA |
|
| Statistical software | GraphPad, Prism | NA CAS number: NA |
Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used |
| Sulfo-NHS | Cardea (Nanomed) | NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7 |
White powder |
| Tips | Alex red | LC 1093-800-000 CAS number: NA |
Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs |
References
- Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
- Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
- Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
- Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
- Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
- Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
- Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
- Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
- Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
- Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
- Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
- Ideker, T., Sharan, R.
- Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
- Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
- Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R.
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
- Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T.
- Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
- Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
- Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
- Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
- Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
- Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
- Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
- Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
- Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
- Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
- Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
- Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
- Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
- Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E.
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
- Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).
