Summary
전계 효과 바이오 센싱 (FEB)은 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨이없는 기술입니다. 결합 표적이 고정되는 그래핀 바이오센서를 통해 전류를 측정한다. FEB 기술은 Hsp90과 Cdc37 사이의 생체 분자 상호 작용을 평가하는 데 사용되었으며 두 단백질 간의 강력한 상호 작용이 검출되었습니다.
Abstract
생체 분자 상호 작용은 기능적으로 관련된 생물학적 사건을 조절하고 조정함으로써 수많은 세포 과정에서 다양한 역할을합니다. 단백질, 탄수화물, 비타민, 지방산, 핵산 및 효소와 같은 생체 분자는 생명체의 기본 빌딩 블록입니다. 그들은 무수한 삶의 사건을 동기화하기 위해 생물 시스템의 복잡한 네트워크로 모입니다. 단백질은 전형적으로 그들의 기능을 수행하기 위해 복잡한 상호작용 네트워크를 이용한다; 따라서 세포 및 유기체 수준에서 세포에서의 중요성을 밝히기 위해 그러한 상호 작용을 평가하는 것이 필수적입니다. 이 목표를 향해 우리는 특정 생체 분자 상호 작용을 결정하기 위해 빠르게 부상하는 기술인 FEB(Field Effect BioSensing)를 도입합니다. FEB는 벤치탑, 라벨 프리, 신뢰할 수있는 생체 분자 검출 기술로서 특정 상호 작용을 결정하고 고품질의 전자 기반 바이오 센서를 사용합니다. FEB 기술은 바이오 센서 표면에 사용되는 생체 적합성 나노 물질로 인해 나노 몰 범위의 상호 작용을 모니터링 할 수 있습니다. 개념 증명으로서, 열 충격 단백질 90 (Hsp90)과 세포 분열 사이클 37 (Cdc37) 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)이 해명되었다. Hsp90은 ATP 의존성 분자 샤페론으로 많은 단백질의 폴딩, 안정성, 성숙 및 품질 관리에 필수적인 역할을하므로 여러 가지 중요한 세포 기능을 조절합니다. Cdc37은 단백질 키나제 특이적 분자 샤페론으로 간주되며, 이는 단백질 키나아제를 Hsp90으로 특이적으로 인식하고 모집하여 하류 신호 전달 경로를 조절하기 때문입니다. 따라서 Cdc37은 Hsp90의 공동 샤페론으로 간주됩니다. 샤페론-키나제 경로(Hsp90/Cdc37 복합체)는 세포 성장을 촉진하는 다발성 악성종양에서 과다활성화된다; 따라서 암 치료의 잠재적 인 표적입니다. 본 연구는 Hsp90/Cdc37 모델 시스템을 이용한 FEB 기술의 효율성을 입증한다. FEB는 두 단백질 사이에 강한 PPI를 검출하였다(세 번의 독립적인 실험에서 0.014 μM, 0.053 μM 및 0.072 μM의 KD 값 ). 요약하면, FEB는 라벨이 없고 비용 효율적인 PPI 검출 플랫폼으로, 빠르고 정확한 측정을 제공합니다.
Introduction
생체 분자 상호 작용 :
단백질은 유기체의 필수적인 부분이며 세포 대사, 세포 구조, 세포 신호, 면역 반응, 세포 부착 등과 같은 수많은 분자 경로에 참여합니다. 일부 단백질은 독립적으로 기능을 수행하지만, 대부분의 단백질은 적절한 생물학적 활성을 조정하기 위해 결합 인터페이스를 사용하여 다른 단백질과 상호 작용합니다1.
생체분자 상호작용은 주로 관련된 단백질의 뚜렷한 구조적 및 기능적 특성(2)에 기초하여, 예를 들어, 단백질 표면, 복합체 안정성, 또는 상호작용의 지속성(3)에 기초하여 분류될 수 있다. 필수 단백질과 생체 분자 상호 작용에서의 역할을 확인하는 것은 분자 수준 4에서 생화학 적 메커니즘을 이해하는 데필수적입니다. 현재, 이러한 상호작용5를 검출하기 위한 다양한 접근법이 있다: 시험관내 6, 실리코7, 살아있는 세포8, 생체외9, 및 생체내10에서 각각은 그 자신의 강점과 약점을 갖는다.
생체내 분석은 실험 도구(11)로서 전체 동물을 사용하여 수행되고,the ex vivo 분석은 자연 조건의 최소한의 변화를 제공함으로써 조절된 외부 환경에서 조직 추출물 또는 전체 기관(예를 들어, 심장, 뇌, 간)에 대해 수행된다. 생체내 및 생체외 연구의 가장 일반적인 적용은 그들의 전반적인 안전성 및 효능을 보장함으로써 인간 시험 전에 잠재적인 약리학적 제제의 약동학, 약력학 및 독성 효과를 평가하는 것이다12.
생체분자 상호작용은 또한 살아있는 세포 내에서 검출될 수 있다. 살아있는 세포를 이미징하면 특정 생화학 적 경로의 반응을 실행할 때 동적 상호 작용을 관찰 할 수 있습니다13. 더욱이, 생체발광 또는 형광 공명 에너지 전달과 같은 검출 기술은 세포(14) 내에서 이러한 상호작용이 언제 어디서 발생하는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 살아있는 세포에서의 검출은 중요한 세부 사항을 제공하지만, 이러한 검출 방법론은 광학 및 라벨에 의존하며, 이는 네이티브 생물학을 반영하지 않을 수 있습니다. 그들은 또한 시험관 내 방법보다 덜 제어되며15를 수행하기 위해 전문 지식이 필요합니다.
실리코 전산 방법은 주로 시험관내 실험 전에 표적 분자의 대규모 스크리닝에 사용된다. 계산 예측 방법, 컴퓨터 기반 데이터베이스, 분자 도킹, 정량적 구조-활성 관계, 및 기타 분자 역학 시뮬레이션 접근법은 실리코 도구(16)에서 잘 확립된 것 중 하나이다. 힘든 실험 기술과 비교할 때, in silico 도구는 높은 감도로 쉽게 예측을 할 수 있지만 예측 성능의 정확도는 떨어집니다17.
시험관내 분석은 표준 생물학적 맥락 밖의 미생물 또는 생물학적 분자로 수행됩니다. 시험관 내 방법을 통해 생체 분자 상호 작용을 묘사하는 것은 단백질 기능과 세포 기능의 복잡한 네트워크 뒤에있는 생물학을 이해하는 데 중요합니다. 바람직한 분석 방법론은 단백질의 고유 특성, 운동 값, 및 상호작용의 모드 및 강도(18,19)에 따라 선택된다.
Hsp90/Cdc37 상호 작용:
Hsp90과 Cdc37을 연결하는 샤페론-키나제 경로는 종양 생물학(20)에서 유망한 치료 표적이다. Hsp90은 세포 주기 조절, 단백질 조립, 세포 생존 및 신호전달 경로에서 중심적인 역할을 한다. 그들의 기능을 위해 Hsp90에 의존하는 단백질은 Cdc37과 같은 공동 샤페론을 통해 복합체화를 위해 Hsp90으로 전달된다. Hsp90/Cdc37 복합체는 대부분의 단백질 키나제의 폴딩을 제어하고 다수의 세포내 신호전달 네트워크(21)를 위한 허브로서 기능한다. 이는 급성 골수모구성 백혈병, 다발성 골수종 및 간세포암종22,23을 포함하는 다양한 악성종양에서의 그의 상승된 발현으로 인해 유망한 항종양 표적이다.
일반적으로 사용되는 시험관내 생체분자 상호작용 검출 기술
공동면역침전(co-IP)은 생물학적 관련 상호작용(24)을 확인하기 위해 항원-항체 특이성에 의존하는 기술이다. 이 방법의 주요 단점은 낮은 친화도 상호작용 및 동역학적 값24를 검출할 수 없다는 것이다. 등온 적정 열량계 (ITC), 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 생물층 간섭 측정 (BLI) 및 FEB 기술과 같은 생물 물리학 적 방법이 운동 값을 결정하기 위해 바람직하다.
ITC는 생체 분자 상호 작용을 특성화하기위한 완전한 열역학 분석과 함께 결합 에너지의 결정에 기초한 생물 물리학 적 검출 방법입니다25. ITC의 주요 이점은 표적 단백질의 어떠한 표지 또는 고정도 필요로 하지 않는다는 것이다. ITC가 직면하는 주요 어려움은 한 실험에 필요한 고농도의 표적 단백질과 작은 결합 엔탈피26으로 인한 비공유 복합체 분석의 어려움입니다. SPR 및 BLI 둘 모두는 센서 표면 상의 표적 분자의 고정화에 의존하는 라벨이 없는 생물물리학적 기술이며, 이어서 고정화된 표적27,28 위에 분석물의 후속 주사가 뒤따른다. SPR에서, 생체분자 상호작용 동안 굴절률의 변화는 측정된다27; BLI에서, 반사광에서의 간섭은 시간(28)의 함수로서 파장의 변화로서 실시간으로 기록된다. SPR과 BLI는 모두 높은 특이성, 감도 및 검출 기능(29)을 제공하는 공통적인 이점을 공유한다. 두 방법 모두에서, 표적 단백질은 바이오센서 표면 상에 고정화되고, 따라서, 표적의 천연 입체형태가 약간 손실될 수 있고, 이는 특이적 대 비특이적 상호작용(30)을 구별하는 것을 어렵게 만든다. BLI는 고가의 일회용 광섬유 바이오센서를 사용하여 타겟을 고정화하고, 따라서 비용이 많이 드는 기술(31)이다. 이러한 잘 정립 된 생체 분자 검출 도구와 비교할 때, FEB 기술은 운동 특성화를 통해 실시간으로 생체 분자 검출을 위해 낮은 나노 몰 농도를 사용하여 신뢰할 수 있고 라벨이없는 플랫폼을 제공합니다. FEB 기술은 또한 ITC에서 직면 한 버블 링 문제를 극복하고 SPR 또는 BLI에 비해 비용 효율적입니다.
전계 효과 트랜지스터(FET) 기반 바이오센서는 다양한 생물 의학 응용 분야를 제공하여 생체 분자 상호작용을 감지하는 새로운 분야입니다. FET 시스템에서, 표적은 바이오센서 칩에 고정화되고, 상호작용은 전도도(32)의 변화에 의해 검출된다. 효율적인 전자 바이오센서의 개발에서 고려되어야 할 독특한 특징은 센서 표면(33)을 제작하는데 사용되는 코팅 물질의 반전도성 성질 및 화학적 안정성과 같은 물리화학적 특성이다. FET에 사용되는 실리콘과 같은 종래의 재료들은 적절한 기능(34)을 위해 트랜지스터 채널과 특정 환경 사이에 끼워진 산화물 층들을 필요로 하기 때문에 센서의 감도를 제한하였다. 더욱이, 실리콘 트랜지스터는 높은 염수 환경에 민감하기 때문에 자연 환경에서 생물학적 상호작용을 측정하기가 어렵다. 그래핀 기반 바이오 센서는 우수한 화학적 안정성과 전기장을 제공하기 때문에 대안으로 제시됩니다. 그래 핀은 탄소의 단일 원자 층이기 때문에 반도체로서 매우 민감하고 생물학적 용액과 화학적으로 양립 할 수 있습니다. 이들 특성들 모두는 호환가능한 전자 바이오센서들(35)을 생성하는 것이 바람직하다. 그래핀 코팅 바이오센서가 제공하는 생체분자의 놀라운 초고로딩 잠재력은 그래핀 기반 바이오센서 FEB 기술의 개발로 이어진다.
FEB 기술의 원리 : FEB는 결합 표적이 고정되어있는 그래핀 바이오 센서를 통해 전류를 측정하는 라벨이없는 생체 분자 검출 기술입니다. 고정화된 단백질과 분석물 사이의 상호작용은 실시간으로 모니터링되는 전류의 변화를 초래하여, 정확한 동역학적 측정(36)을 가능하게 한다.
계측: FEB 시스템은 그래핀 전계 효과 트랜지스터(gFET) 센서 칩과 실험 전반에 걸쳐 일정한 전압을 적용하는 전자 리더기로 구성됩니다(그림 1). 분석물은 바이오센서 표면에 고정화된 표적 단백질에 용액으로 도포된다. 상호 작용이 발생하면 전류의 변화가 실시간으로 측정되고 기록됩니다. 분석물 농도가 증가함에 따라, 결합된 분석물의 분율 또한 증가하여, 전류에서 더 높은 변화를 야기할 것이다. 계측기(Table of Materials)와 함께 제공된 자동화된 분석 소프트웨어를 사용하여 I-Response가 측정되고 바이오센싱 장치(BU)37로 기록됩니다. I-Response는 고정화된 타겟과 분석물질의 상호작용 시 실시간으로 측정되는 바이오센서 칩을 통한 전류(I)의 변화로 정의된다. FEB 자동 분석 소프트웨어는 C-Response가 정전 용량(C)의 변경을 기록하는 동적 상호 작용 이벤트에 대한 I-응답 및 C-응답을 모두 분석할 수 있습니다. I-응답 및 C-응답 둘 다의 변동은 결합된 분석물의 분율에 직접적으로 대응하며, KD 값을 생성하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 자동화된 분석 소프트웨어의 기본 기본 설정은 I-Response입니다.
그림 1: 실험 설정 개요 . (A) 그래핀 기반 칩 및 전자 리더기. (B) 칩 성분의 개요. 칩은 시스템에 전류를 공급하는 두 개의 전극에 부착됩니다. 칩의 표면은 그래핀으로 덮여 있으며, 활성화되면 표적을 결합 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
방법론:
초기에, 활성화된 바이오센서 칩이 FEB 장치에 삽입되고(도 1) 이어서 아래에 요약된 단계들의 실행이 뒤따른다: (1) 캘리브레이션: 실험은 기준선 평형 반응을 생성하기 위해 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS; pH = 7.4)를 사용하는 시스템 교정으로 시작한다. (2) 연관성 : 분석물이 칩에 도입되고 결합 포화도에 도달 할 때까지 I- 응답이 모니터링됩니다. (3) 해리: 분석물은 1x PBS를 사용하여 해리된다. (4) 재생성: 분석물질의 잔재물은 1x PBS를 사용하여 제거한다. (5) 세척: 칩으로부터 결합 및 비결합 분석물의 철저한 제거를 위해 1x PBS를 사용하여 총 5개의 세척이 수행된다.
분석:
데이터 분석은 계측기와 함께 제공되는 완전 자동화된 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 자동화된 분석소프트웨어는 KD 값을 갖는 힐 핏 플롯을 생성합니다. 힐 핏 플롯은 분석물 농도의 함수로서 표적 단백질에 대한 분석물의 연관성을 기술한다. 반-최대 반응이 달성되는 농도는 KD 값 에 비례한다. 낮은KD 값은 높은 결합 친화도를 나타내고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
FEB 실험에서 얻은 데이터를 검증하기 위해 I-응답은 데이터 검토/내보내기 소프트웨어를 사용하여 각 분석물 농도에 대한 각 판독 지점에서 추출되며 아래에 설명된 대로 다른 통계 분석 소프트웨어( 자료 표 참조)로 내보낼 수 있습니다.
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Protocol
참고: 본 연구에 사용된 재조합 단백질인 Hsp90 및 Cdc37이 상업적으로 수득되었다( 표 참조).
1. 칩 활성화
참고: 실험에 사용되는 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 준비된 모든 용액을 멸균 0.2 μm 필터를 통해 여과하십시오.
- 15 mL 튜브에서 2.5 mL의 1 M 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액(pH = 6.0)에 EDC 2 mg을 첨가하여 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 용액을 제조하였다. 별도의 15 mL 튜브에서 1 M MES 버퍼 (pH = 6.0) 2.5 mL에 설포-NHS 6 mg을 첨가하여 N-하이드록시설포숙신이미드 (sulfo-NHS) 용액을 준비하십시오. 각 용액의 Aliquot 50 μL를 독립 튜브에 넣고 향후 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.
- 동일한 부피의 EDC 모래 설포-NHS 용액 (EDC 50 μL + 50 μL의 sulfo-NHS)을 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오 (볼텍스 방지).
참고: EDC/sulfo-NHS의 혼합 용액은 적절한 칩 기능화를 위해 효과적인 가교를 유지하기 위해 30분 이내에 사용해야 합니다. - 회사에서 공급한 바이오센서 칩(5.7 cm x 2.4 cm; 자료표 참조)을 뚜껑이 달린 유리 페트리 접시에 넣습니다. 칩 활성화와 관련된 모든 기능화 단계는 페트리 접시 내에서 수행하는 것이 좋습니다. 50 μL의 1 M MES 버퍼 (pH = 6.0)를 바이오센서 칩에 적용하고, 실온에서 1분 동안 인큐베이션한 다음, 버퍼를 흡인한다.
- 50μL의 EDC/sulfo-NHS 용액을 센서 칩에 즉시 바릅니다. 페트리 접시를 덮고 실온에서 15분 동안 배양하십시오. 칩에서 EDC/sulfo-NHS 용액을 흡인합니다.
- 칩을 50 μL의 1 M MES 완충액 (pH = 6.0)으로 1회 헹구고; MES 버퍼를 흡인한다.
2. 표적 단백질 고정화
- 칩 2x를 1x PBS의 50 μL로 헹구었다(pH=7.4). 칩으로부터 PBS를 흡인하고, 표적 분자인 Hsp90 (50 μL; 500 nM)을 첨가한다.
참고: 버퍼 불일치는 전체 실험을 망칠 수 있습니다. 따라서, 실험 전에, 표적 분자가 교정에 사용된 것과 동일한 완충액 (예를 들어, 1x PBS (pH = 7.4))에 있는지 확인하는 것이 중요하다. 필요한 경우, 실험 전에 밤새 투석하여 완충액 교환을 수행하십시오. 이 실험에서, 재조합 단백질, Hsp90 및 Cdc37 둘 다에 대해, 4°C에서 적절한 완충액 교환을 갖는 1x PBS (pH = 7.4; 물질의 표 참조)에 대해 밤새 투석을 수행하였다. 표적 물질(이 경우 Hsp90)의 농도는 상이한 실험 프로토콜과 표적 물질(단백질/펩티드/리간드)의 성질에 따라 달라질 수 있다. - 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 표적 분자를 함유하는 용액을 흡인하고, 1x PBS (pH = 7.4)의 50 μL로 3x 헹구었다. 칩으로부터 1x PBS (pH = 7.4) 용액을 흡인한다.
- 칩에 50 μL의 퀀치 1(1x PBS(pH = 7.4) 중의 3.9 mM 아미노-PEG5-알코올) 용액을 첨가한다. 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 칩에서 Quench 1 솔루션을 흡인하십시오.
- 칩에 50 μL의 퀀치2 (1 M 에탄올아민 (pH = 8.5)) 용액을 첨가한다. 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 흡인물 퀀치 2 용액을 칩으로부터 5x 1x PBS의 50 μL를 사용하여 칩 5x를 헹구고, 마지막 PBS 액적을 센서에 남긴다.
3. 분석물 시료 준비
- 원하는 농도 범위에서 Cdc37에 대한 분석물 희석 시리즈를 준비하십시오. 첫 번째 실험을 위해, 다음의 농도가 사용되었다: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1,000 nM, 2,000 nM, 3,000 nM, 및 5,000 nM. 두 번째 실험을 위해, 0.4 nM 내지 200 nM 범위의 상이한 농도 세트가 사용되었다.
- 신뢰할 수있는 KD 값을 얻기 위해 적어도 여덟 개의 상이한 분석물 농도를 포함하도록 실험을 설계한다. 분석물 단백질의 상이한 희석물을 교정에 사용된 것과 동일한 완충액 및 표적 단백질로 제조하는 단계; 여기서 1x PBS (pH = 7.4)입니다.
4. 활성화 된 바이오 센서 칩을 FEB 장치에로드
주: FEB 장치는 LED 조명 표시가 있는 리더기와 바이오센서 칩을 삽입하는 카트리지로 구성됩니다.
- 표적 단백질 고정화 후, 활성화된 칩을 USB를 통해 컴퓨터에 연결된 장치의 카트리지에 삽입하십시오. 칩 삽입 후 FEB 장치가 실험 준비가 되었음을 나타내는 녹색 LED 표시등이 리더에 표시됩니다. FEB 장치가 연결된 컴퓨터에 회사에서 제공하는 자동화 소프트웨어( 자료 표 참조)를 설치하여 아래에 설명된 대로 단계별로 실험을 모니터링합니다.
5. 실험 실행
- 자동화 된 소프트웨어에서 실험 실행 모듈을 누르고 재생성 또는 기타 원하는 프로토콜 로 10 포인트를 선택하십시오. 운영자 이름, 실험 이름, 날짜 (예 : Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021)를 입력하십시오. 재생 완충제 (예를 들어, PBS 완충제); 고정화된 표적 (예를 들어, Hsp90); 용액 중의 분석물 (예를 들어, Cdc37). 자세한 내용은 보충 그림 S1을 참조하십시오.
- 소프트웨어에 표시된 실험 시작 단추를 누르고 아래에 설명된 대로 자동화된 소프트웨어에 표시된 지침을 따릅니다.
참고: 이 소프트웨어는 완전히 자동화되고 사용자 친화적이며 실험 전반에 걸쳐 사용자를 단계별로 안내합니다. 팝업 창이 화면에 나타나고 실험의 각 단계에서 더 진행하라는 지침이 표시됩니다. 이 소프트웨어는 실험 전반에 걸쳐 각 분석물 농도에 대한 교정, 분석물 연관, 해리, 재생 및 세척 (5x)에서 연속적으로 각 반복적 인 단계에 대한 지침을 제공합니다. - 계측기 교정을 수행합니다. 이렇게 하기 위해, 칩으로부터 남아있는 PBS 용액을 흡인하고 50 μL의 교정 완충액(1x PBS; pH = 7.4)을 적용한다. 계속 버튼을 누르고 교정 단계가 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 이 소프트웨어는 교정 단계(5분)에 대해 결정된 끝점을 후속 조치에 대한 경고 경보와 함께 표시합니다.
- 다음으로, 분석물 연관을 수행한다. 이렇게 하려면, 칩으로부터 교정 완충액을 흡인하고 가장 낮은 분석물 농도 (25 nM의 Cdc37)의 50 μL를 적용한다. 계속 단추를 누르고 연결 단계가 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 소프트웨어는 계속 진행하기 위해 경고 경보와 함께 연결 단계 (5 분)의 끝점을 표시합니다.
- 분석물 해리를 수행합니다. 이렇게 하기 위해, 분석물 용액을 칩으로부터 흡인하고 50 μL의 해리 완충액(1x PBS; pH = 7.4)을 적용한다. 계속 버튼을 누르고 해리 단계 지속 시간(5분)이 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 이 소프트웨어는 해리 단계 (5 분)의 끝점을 후속 조치에 대한 경고 경보와 함께 표시합니다.
- 그런 다음 칩 재생성을 수행하십시오. 해리 용액을 칩으로부터 흡인하고 50 μL의 재생 완충액 (1x PBS; pH = 7.4)을 적용한다. 계속 단추를 누르고 재생성 단계 지속 시간(30초)이 완료될 때까지 30초 동안 기다립니다. 이 소프트웨어는 후속 조치에 대한 경고 경보와 함께 재생 단계 (30 초)의 끝점을 표시합니다.
- 마지막으로 칩을 씻으십시오. 칩으로부터 재생 용액을 흡인하고, 50 μL의 세척 완충액(1x PBS; pH = 7.4)을 칩에 적용한다. 칩에서 용액을 흡인하고이 5x를 반복하십시오. 세척 버퍼의 마지막 방울을 칩에 놓고 계속 버튼을 누르고 소프트웨어 디스플레이에서 세척 단계 지속 시간이 완료 될 때까지 30 초 동안 기다리십시오.
참고: 소프트웨어는 세척 단계(30초)의 끝점을 경고와 함께 표시하여 실험의 다음 주기를 진행합니다. - 사용된 각 분석물 농도에 대해 상기 단계를 반복하는 단계; 교정, 분석물 결합, 해리, 재생 및 세척 (5x)의 다섯 단계는 하나의 사이클을 구성합니다. 여기에 나타낸 실험을 위해, 우리는 10개의 분석물 농도 (25 nM 내지 5,000 nM 또는 0.4 nM 내지 200 nM 범위; 그림 2).
6. 분석
- 실험이 끝날 때 자동화된 분석 소프트웨어의 맨 위에 있는 분석 단추를 누릅니다. 모든 실험 포인트가 포함된 표시 창이 나타납니다. 창에서 규정 된 프로토콜에 사용 된 분석물 농도가 올바른지 확인하십시오.
- 분석 실행 단추를눌러 KD 값을 자동으로 생성합니다. 이 소프트웨어는 평형에서의 해리 상수 인 KD 값이 계산되는 해당 I-Response에 대해 분석물 농도를 플로팅하여 Hill fit 플롯을 생성합니다.
- 아래에 설명된 대로 데이터 검토/내보내기 소프트웨어를 사용하여 다른 통계 분석 소프트웨어에서 분석을 위해 원시 데이터를 내보냅니다.
- 실험이 끝날 때 자동으로 생성된 R1R 파일(예: Hsp90 + Cdc37 14.03.2021)을 데스크톱의 새 폴더에 복사합니다. 회사에서 제공하는 데이터 검토/내보내기 소프트웨어를 엽니다( 보충 그림 S2A 참조).
- 데이터 처리 > 처리 R1R 파일을 클릭하> 데이터 검토 / 내보내기 소프트웨어의 홈 화면에서 확인.
- 6.3.1단계에서 바탕 화면에 만든 R1R 파일이 들어 있는 폴더를 선택합니다. 를 누르고 OK 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 원본 R1R 데이터의 복사본이 만들어져 원본 파일을 재정의하지 않고 데이터를 검토하고 편집할 수 있습니다.
- 데이터 검토/내보내기 소프트웨어의 홈 화면에 표시된 데이터 처리 아이콘을 누릅니다. 처리 된 R1R 파일로드를 누르> OK입니다. 처리된 R1R 파일이 포함된 6.3.1단계에서 만든 동일한 폴더를 선택합니다. OK를 누릅니다. 이 단계에서는 실험 파일이 들어 있는 폴더를 검토할 준비가 되었습니다.
- 데이터 검토/내보내기 소프트웨어의 홈 화면에서 데이터 분석을 누릅니다. 교정을 선택> 편집한 R1R 파일을 정상> 보정 합니다( 보충 그림 S2B 참조). 이 단계에서는 첫 번째 보정 단계에 따라 모든 데이터 요소를 보정하여 기준선을 만듭니다.
- 데이터 검토/내보내기 소프트웨어의 홈 화면에서 데이터 분석을 누릅니다. R1R 파일 검토 및 편집을 선택> 확인. 데이터 요소를 검토하거나, 점을 삭제하거나, 단계 삭제/추가 단추를 사용하여 단계를 추가합니다 . 교정 단계가 기준선에 있고 연관 단계가 최고점에 있는지( 보충 그림 S3 참조) 모든 단계가 올바른 위치에 있는지 확인한 다음 저장 버튼을 눌러 모든 변경 사항을 저장합니다.
- 데이터 검토/내보내기 소프트웨어의 홈 화면에서 데이터 분석을 누릅니다. 데이터 분석/플롯을 선택하고 내보낼 단계를 선택합니다( 보충 그림 S4 참조). 데이터를 내보내기 전에 보정 단계(예: 단계 1, 단계 6 등)를 뺀 후 각 연관 단계(예: 단계 2, 단계 7 등)를 내보내기 목록에 추가합니다.
- 이 데이터 내보내기를 누릅니다. 이 소프트웨어는 각 트랜지스터의 각 분석 물 농도 데이터 포인트에 대한 I-Response가 포함 된 스프레드 시트 파일을 생성합니다 (모든 트랜지스터가 작동하는 경우 각 농도 포인트에 대해 세 가지 다른 I 응답 값을 갖습니다). 이 스프레드 시트 파일을 사용하여 통계 소프트웨어의 데이터를 추가로 분석하십시오.
- 통계 분석 소프트웨어를 엽니다. 세 개의 Y 값으로 XY 테이블을 작성하십시오. 만들기를 누릅니다. 이 테이블의 데이터(X, Y 값)는 6.3.8단계에서 만든 스프레드시트 파일에서 복사됩니다. x축은 분석물 농도(사용된 농도에 따라 다름)에 해당하며, 세 개의 Y 값은 회사에서 제공하는 데이터 검토/내보내기 소프트웨어에서 얻은 I-응답에 해당합니다.
- 이 데이터 분석을 누릅니다. 전체 부위 > 결합 포화> 비선형 회귀(곡선 적합)> XY 분석을 선택>니다. 소프트웨어는 자동으로 데이터를 분석하고, KD 값을 생성하고, 데이터 포인트의 그래프를 생성합니다.
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Representative Results
실험 1의 결과:
표적 단백질 Hsp90(500 nM)을 전술한 바와 같이 표적 고정화 프로토콜에 따라 칩에 고정화시켰다. 첫 번째 실험을 위해, 25 nM 내지 5,000 nM 범위의 분석물 단백질, Cdc37의 10 농도를 문헌에서 이용가능한 데이터에 기초하여 제조하였다 ( 표 1 참조).
실험의 단계는 I-Response에서 발생하는 변경 사항을 따라 실시간으로 모니터링할 수 있습니다(그림 3A). 프로토콜에 포함된 각 단계가 실험 전반에 걸쳐 I-Response에 어떻게 영향을 미치는지 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, I-반응은 교정 동안 제로에 가깝고, 연관 단계에서, I-응답은 분석물(Cdc37) 농도가 증가함에 따라 점진적으로 증가한다. 이 실험으로부터의 데이터를 살펴보면(도 3A), 낮은 분석물 농도(25 nM에서 50 BU)에서 I-반응의 급격한 증가가 관찰되었다. 낮은 분석물 농도에서 낮은 I-Response가 예상되었으며, 이는 농도가 증가함에 따라 점진적으로 증가할 것으로 예상되었습니다. 이 갑작스런 증가는 더 낮은 분석물 농도 점을 포함하는 실험이 설계되어야한다는 것을 암시했다.
위에서 논의된 프로토콜 단계에 따라, 데이터는 제공된 자동화된 분석 소프트웨어에서 분석되었고, 이 소프트웨어는 계산된 KD 값을 갖는 힐 핏 플롯을 자동으로 생성하였다(도 3B). 첫 번째 실험을 위한 자동화된 분석 소프트웨어로부터 계산된 KD 값은 350,000 ± 76,000 μM이었다. 대부분의 일반적인 생물학적 상호작용은 낮은 μM 또는 심지어 nM범위에서 KD 값을 나타냈으며; 따라서, 첫 번째 실험에 대해생성된 KD 값은 매우 높다.
관찰된높은 KD 값 에 대한 몇 가지 설명이 있을 수 있다: 연구된 두 특정 단백질 사이에 낮은 친화도 결합이 있을 수 있고(Hsp90/Cdc37), 이는 분자 상호작용을 위해 높은 리간드 농도가 요구된다는 것을 의미한다; 실험은 이상적이지 않고 범위를 벗어난 분석물 농도로 설계되었을 수 있습니다. 높은 값은 분석 소프트웨어의 피팅 모듈에 사용되는 내장 매개 변수 때문일 수 있습니다. 자동화된 분석 소프트웨어는 데이터 포인트에 맞추기 위해 용량 반응 분석 모듈을 사용하지만, 일부 상호작용은 이 모델에 잘 맞지 않을 수 있으며, 따라서 잘못된 데이터를 제공하여높은 KD 값을 초래합니다.
포화 힐 플롯으로 정확한 KD 값을 얻기 위해서는 낮은 오류율로 가장낮은 KD 값을 얻기 위해 더 낮은 분석물 농도 및 더 높은 분석물 농도 포인트를 모두 포함하는 시행 착오에 의한 실험의 표준화가 필요합니다.
이러한 모든 요소를 고려하여 분석 소프트웨어의 데이터를 추가 통계 분석 소프트웨어로 내보냈습니다. 각 연관 지점에 대한 I-응답은 자동화된 데이터 검토/내보내기 소프트웨어를 사용하여 추출되었으며 분석 단계(단계 6)에서 위에서 설명한 단계에 따라 표 2 에 요약됩니다.
통계적 분석 소프트웨어 결과(도 3C)는 높은 표준 편차(0.011 ± 0.494 μM) 및 0.78의 낮은R2 값을 갖는 상대적으로낮은 KD 값을 나타내었다. KD 값 및 낮은R2 값에서 관찰된 유의한 변동은 이 실험을 위해 선택된 농도 포인트가 최적이 아님을 시사하였다. 또한 일부 그래프 포인트가 플롯 추세선과 잘 맞지 않는 것으로 나타났습니다 (그림 3C). 이것은 다른 분석물 농도 점을 포함함으로써 두 번째 실험을 설계할 필요성을 강화시켰다.
두 분석 소프트웨어에서 사용하는 내장 파라미터는 완전히 다르며 KD 값 생성 프로세스에 반영됩니다. 두 분석 소프트웨어(350,000 ± 76,000 μM 대 0.011 ± 0.494 μM)로부터얻어진 KD 값 의 차이는 상이한 분석 모듈이 계산에 사용되었다는 사실에 기인할 수 있다. 통계 분석 소프트웨어에서 수행된 분석은 이러한 상호작용에 더 적합할 수 있고, 따라서 더낮은 KD 값을 부여한다.
그럼에도 불구하고 두 분석의 결과가 결합되면 (350,000 ± 76,000 μM 및 0.011 ± 0.494 μM), 첫 번째 실험이 최적이 아니며 추가 농도 포인트가 필요하다는 결론을 내릴 수 있습니다.
이 점을 검증하기 위해, 상관되지 않은 그래프 점을, 3,000 nM을 배제하였다 ( 보충도 S5 참조). 분석의 결과는 0.006 ± 0.081 μM의 KD 값 과 0.98의R2 값을 나타내었다. 이러한 결과는 다음 실험이보다 관련성이 높은 농도에 초점을 맞추어 설계되어야한다는 것을 나타냅니다. 따라서 두 번째 실험은 예측된 KD 이하 및 위의 농도를 가진 다른 테스트 포인트를 사용하여 Hsp90 / Cdc37 PPI를 평가하기 위해 수행되었습니다.
실험 2의 결과:
표적 단백질인 Hsp90(500 nM)을 전술한 바와 같은 프로토콜을 이용하여 칩에 고정화시켰다. 총 10 농도의 분석물 (Cdc37)을 다음과 같이 제조하였다: 0.4 nM, 0.8 nM, 1.6 nM, 3.2 nM, 6.4 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 및 200 nM. 두 번째 실험은 위에서 언급 한 바와 같이 이전 실험에서 얻은 모든 통찰력을 고려하여 다른 분석 물질 농도 포인트를 포함하여 설계되었습니다.
실험 동안, 각 단계를 실시간으로 모니터링하였다(도 4A). 여기서, 실시간 I-Response 그래프 (분석물-0.4 nM, 0.6 nM, 1.6 nM의 저농도로부터 유도됨)는 초기에 0에서 시작하고, 첫 번째 실험에서 관찰된 I-Response의 급격한 증가와 비교하여 실험의 각 사이클에서 분석물 농도의 증가에 따라 점진적으로 증가한다.
위에서 언급한 프로토콜에 따라, 자동화된 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다(도 4B). 이 실험을 위해 자동화된 분석 소프트웨어로부터 계산된 KD 값은 0.0673 ± 0.0002 μM이었으며, 이는 표적 단백질 Hsp90과 분석물 Cdc37 사이의 강한 상호작용을 시사하였다. 0.0002 μM의 표준 편차는 첫 번째 실험에서 얻은 것보다 훨씬 작았으며, 이는 새로운 데이터가 훨씬 더 신뢰할 수 있다는 확신을 준다.
이 결과를 검증하기 위해 이전에 설명한 대로 데이터 포인트(표 3)를 다른 통계 분석 소프트웨어로 내보냈습니다. 분석으로부터의 결과는 도 4C에 요약되어 있다.
통계 분석 소프트웨어를 사용하여, Hsp90/Cdc37 PPI에대한 KD 값이 0.014 ± 0.005 μM임을 알 수 있었다(도 4C). KD 및 표준 편차의 낮은 값은 두 단백질, Hsp90 및 Cdc37 사이의 강한 상호작용을 나타낸다. 더욱이, 0.99의R2 값은 분석이 실험 그래프 포인트에 완벽하게 적합하다는 것을 나타낸다. 두 분석 소프트웨어 모두 결과에서 일관성을 보였으며, 각각 0.0002 μM ± 0.014 ± 0.005 μM의낮은 KD 값을 보였다.
실험의 재현성과 정확성을 확인하기 위해, 두 번째 실험에서 사용된 것과 동일한 농도에서 Hsp90 (500 nM)을 표적 단백질로, Cdc37을 분석물로 사용하여 두 번의 반복실험에서 동일한 실험을 수행하였다. 실험 동안, 각 단계를 실시간으로 모니터링하였다(보충도 S6A 및 보충도 S7A). 자동화 분석 소프트웨어로부터 계산된 KD 값은 보충도 S6B 및 보충도 S7B에 도시되어 있다(각각 0.053 ± 0.002 μM 및 0.0719 ± 0.0007 μM). 앞서 언급한 바와 같이, 데이터 포인트는 다른 통계 분석 소프트웨어로 내보내졌고(보충 표 S1 및 보충 표 S2), 그 결과는 보충도 S6C 및 보충도 S7C에 도시되어 있다(보충도 S6C: KD는 0.003 ± 0.009 μM이고 R2는 0.99이다; 보충 도 S7C: KD는 0.004± 0.009 μM이고R2는 0.99이다). 분석 소프트웨어 모두에서 두 번의 반복실험 결과는 잘 입증되었으며 Hsp90/Cdc37 FEB 실험 데이터의 정확성, 반복성 및 재현성을 확인했습니다.
Hsp90과 대조군 단백질인 소 혈청 알부민(BSA) 사이의 생체분자 상호작용이 해명된 대조군 연구도 수행되었다. BSA를 분석물로 사용한 대조 연구는 두 번째 실험에서 사용된 동일한 실험 설정과 분석물 농도를 사용하여 수행되었다. 0.4 nM 내지 200 nM 범위의 총 10 농도의 대조군 단백질인 BSA를 1x PBS (pH = 7.4)로 제조하였고, 실험의 각 단계를 실시간으로 모니터링하였다.
Hsp90 및 Cdc37을 사용한 실험과 유사하게, 실시간 I-응답 그래프는 초기에 0부터 시작합니다. 그러나, 대조 연구에서, I-반응은 분석물 농도의 증가에 따라 점진적으로 증가하지 않았다(보충도 S8A). 데이터는 또한 자동화된 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었고(보충도 S8B), 소프트웨어는 이 실험의 데이터 포인트로부터 KD 값을 계산할 수 없었다. 소프트웨어에서 생성 된 Hill Plot에서 Hsp90과 제어 BSA 분석 물질 사이에 상호 작용이 없다는 것이 입증되었습니다. 이 결과를 검증하기 위해 앞에서 설명한 대로 데이터 요소(보충 테이블 S3)를 다른 통계 분석 소프트웨어로 내보냈습니다. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여, Hsp90/BSA PPI에대한 KD 값이 음수임을 알 수 있었다(보충도 S8C; KD는 -0.009± -0.0003 μM)이고, 다시 두 단백질, Hsp90 및 BSA 사이에 상호작용이 없음을 나타낸다. 더욱이, R2 값(0.82)은 분석이 실험 그래프 포인트에 맞지 않았음을 나타낸다. 두 분석 소프트웨어 모두 Hsp90과 BSA가 상호 작용하지 않는 결과에서 일관성을 보여주었습니다.
Hsp90/Cdc37 FEB 실험 데이터를 문헌에서 이용가능한 다른 실험 데이터와 비교하였을 때, 본 연구에서얻어진 KD 값(KD=0.014 ± 0.005 μM, KD=0.053 ± 0.002 μM,및 KD=0.072 ± 0.001 μM)이 이전에 발표된 데이터(KD=1.46 μM38 또는 6 μM39)보다 2배 더 낮은 것으로 나타났다. ). 이러한 차이는 현재 실험에서 전장 인간 Hsp90 및 Cdc37 구축물의 사용에 기인 할 수 있습니다. 이전의 연구는 부분 단백질 38 또는 C. 엘레간 상동체 단백질39만을 함유하는 효모 Hsp90 구축물에 대해 수행되었다(표 1). FEB 시스템에서 얻어진 결과를 검증하기 위해, ITC 실험을 수행하였다.
ITC 시스템을 사용하여 Hsp90/Cdc37 PPI 평가:
ITC는 생체 분자 상호 작용을 조사하기위한 황금 표준으로 간주됩니다. 우리는 Hsp90 / Cdc37 PPI의 열역학적 동역학을 결정하고 FEB 실험에 대한 검증으로 ITC를 추가로 수행했습니다. Hsp90 및 Cdc37은 ITC 전에 PBS (pH = 7.0)에 대해 투석을 실시한다. 표적 단백질(Hsp90)의 약 0.25 μM 용액 및 2.5 μM 분석물 단백질(Cdc37) 용액을 PBS에서 열량 적정을 위해 제조하였다. 연속 간격으로 80 μL의 Cdc37 용액의 총 부피를 회전 주사기로부터 298.15 K에서 150 μL의 Hsp90 용액을 함유하는 세포로 적정하였다. 각 주사는 4 s 지속 시간에 걸쳐 발생했고, 연속 주사 사이의 시간 간격은 150 초였다. 각각 2 μL의 총 19회 주입을 각각 500 rpm의 교반 속도 및 41.9 μW의 기준 전력으로 만들었다. Hsp90 / Cdc37 상호 작용으로 인한 열 변동을 모니터링하고, Cdc37 분석 물질 주입이 끝날 때 얻은 최종 데이터는 회사에서 제공 한 ITC 분석 소프트웨어를 사용하여 장착되었습니다. 몰 엔탈피 변화 (ΔH), 엔트로피 변화 (ΔS), 결합 부위 수 (n) 및 Hsp90 / Cdc37 PPI 사이의 평형 해리 상수 (KD)와 같은 열역학 매개 변수와 함께 열 변동이 추정되었습니다. 깁스 자유 에너지 변화(ΔG)는 또한 ITC 써모그램으로부터 열 파라미터를 획득한 후 ΔG = ΔH - TΔS 방정식으로부터 계산되었다.
ITC 플롯은 PPI40을 지배하는 상호 작용 및 분자간 힘의 본질을 밝히기 위해 생물학적 상호 작용 중에 사용되거나 해방 된 열의 양을 보여줍니다. Cdc37 (2.5 μM)을 Hsp90 (0.25 μM)으로 적정하고, 상응하는 곡선을 도 5A, B에 도시하였다. 수득된 ITC 플롯은 발열성인 것으로 밝혀졌고, 하나의 결합 화학량론(n), 결합 에너지, ΔG = -45.9 kJ/mol,및 KD 값 = 0.009 μM을 나타내는 단일 결합 부위 모델에 끼워넣었다. ITC 서모그램의 시작 부분에서 흡열 이동의 형태로 관찰된 약간의 불일치(도 5A)는 분석 대상 단백질을 측정 세포(41,42)로 적정하면서 기포의 형성을 시사한다. Hsp90/Cdc37 PPI 중에서, ITC 실험은 더 낮고 높은 농도에서 수행되었으며, 10배 초과의 Cdc37(Hsp90 농도 = 0.25 μM 및 Cdc37 농도 = 2.5 μM)은 포화 곡선을 달성함으로써 허용 가능한 결합 파라미터를 나타내었다. ITC (KD = 0.009 μM)로부터 얻은 KD 값은 FEB 기술 (KD = 0.014 μM, 0.053 μM 및 0.072 μM)을 사용하여 계산 된 KD 값과 잘 상관 관계가 있으며, Hsp90 / Cdc37 PPI 검출에 대한 FEB의 감도 및 정확성을 강력하게 지원합니다.
그림 2: 프로토콜 요약. (A) 칩 활성화 공정을 위한 단계의 요약. (B) 프로토콜에서 다섯 가지 반복되는 단계의 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험 1에서 생성된 데이터 파일 . (A) 실시간으로 모니터링되는 실험 데이터. y축은 바이오센서 유닛(BU)의 I-Response에 해당하고, x축은 실험에서 분석물의 상이한 시점 및 농도에 대응한다. 이 그림은 첫 번째 실험의 데이터에 해당합니다. (B) 자동화 된 분석 소프트웨어에서 생성 된 Hill Fit 플롯. y축은 I-응답에 해당하고, x축은 nM의 분석물(Cdc37)의 농도에 해당한다. 이 실험을 위해,KD 값은 350,000 ± 76,000 μM이다. (C) 연관 플롯은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 생성된다. y축은 연관 단계의 끝에서 I-응답에 해당하고, x축은 상이한 분석물인 Cdc37, 농도에 대응한다. 이 플롯은 표 2에 제공된 데이터 포인트를 사용하여 생성되었다. 분석 결과의 요약은 그래프에 제공되고; 이 실험에서 KD 값은 0.011 ± 0.494 μM이고R2 값은 0.78입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 실험 2에서 생성된 데이터 파일 . (A) 실시간으로 모니터링되는 실험 데이터. y축은 바이오센서 유닛(BU)의 I-Response에 해당하고, x축은 실험에서 분석물의 상이한 시점 및 농도에 대응한다. 이 그림은 두 번째 실험의 데이터에 해당합니다. (B) 자동화 된 분석 소프트웨어에서 생성 된 Hill Fit 플롯. y축은 I-응답에 해당하고, x축은 nM에서의 분석물(Cdc37)의 농도에 해당한다. 이 실험을 위해,KD 값은 0.0673 ± 0.0002 μM(C) 연관 플롯을 통계적 분석 소프트웨어를 사용하여 생성된다. y축은 연관 단계의 끝에서 I-응답에 대응하고, x축은 상이한 분석물 Cdc37 농도에 대응한다. 이 플롯은 표 3에 제공된 데이터 포인트를 사용하여 생성되었다. 분석 결과의 요약은 그래프에 제공되고; 이 실험에서 KD 값은 0.014 ± 0.005 μM이고R2 값은 0.99입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Hsp90 및 Cdc37 상호작용의 ITC 서모그램. (A) 상단 패널은 298.15K에서 Hsp90(0.25μM)에 Cdc37(2.5μM)을 연속적으로 주입하여 얻은 상응하는 열 진화 곡선을 나타냅니다. 차동 전력(DP)은 시간의 함수로서 차동 전력을 나타낸다. (B) 하단 패널의 통합 데이터 포인트는 Hsp90/Cdc37의 몰비 대비 해당 정규화된 열을 지정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 분석 수행 | FEB 분석 KD | 프리즘 분석 KD | 원점 구성 | 아미노산 | 참조 |
| 증권 시세 표시기 | 1.46 μM 및 1.32 μM | 북미 | 효모 Hsp90 | Hsp90의 N 말단 도메인 | 36 |
| 인간 Cdc37 | |||||
| 증권 시세 표시기 | 6 μM | 북미 | C. 엘레간 | 전체 길이 | 37 |
| FEB - 첫 번째 반복 | 0.014 μM | 0.067 μM | 인간 Hsp90 | 전체 길이 | 이 연구에서 수행 |
| 인간 Cdc37 | |||||
| FEB - 두 번째 반복 | 0.053 μM | 0.003 μM | 인간 Hsp90 | 전체 길이 | 이 연구에서 수행 |
| 인간 Cdc37 | |||||
| FEB - 세 번째 반복 | 0.072 μM | 0.004 μM | 인간 Hsp90 | 전체 길이 | 이 연구에서 수행 |
| 인간 Cdc37 | |||||
| 증권 시세 표시기 | 0.009 μM | 북미 | 인간 Hsp90 | 전체 길이 | 이 연구에서 수행 |
| 인간 Cdc37 | |||||
| FEB- 제어 연구 | 데이터 없음(KD를 계산할 데이터가 부족함) | -0.009μM(음수 값을 갖는 KD 값은 상호작용이 없음을 나타냄) | 인간 Hsp90 | 전체 길이 | 이 연구에서 수행 |
| 증권 시세 표시기 |
표 1: Hsp90/Cdc37 본 연구 및 문헌에 보고된 상이한 방법을 이용한 PPI 평가.
| 분석물 농도 (nM) | I-응답 트랜지스터 1 | I-응답 트랜지스터 2 | I-응답 트랜지스터 3 | 평균의 |
| I-응답 | ||||
| 25.00 | 53.540 | 49.406 | 50.590 | 51.178 |
| 50.00 | 71.427 | 65.943 | 67.568 | 68.313 |
| 100.00 | 85.305 | 79.226 | 81.074 | 81.868 |
| 200.00 | 106.652 | 99.320 | 101.502 | 102.491 |
| 400.00 | 122.572 | 114.837 | 117.128 | 118.179 |
| 800.00 | 144.293 | 136.374 | 138.872 | 139.846 |
| 1000.00 | 135.165 | 128.657 | 130.425 | 131.416 |
| 2000.00 | 164.487 | 159.401 | 161.697 | 161.862 |
| 3000.00 | 109.997 | 106.705 | 107.205 | 107.969 |
| 5000.00 | 282.637 | 274.207 | 276.247 | 278.422 |
표 2: 첫 번째 실험의 각 농도점에서 각 칩의 세 개의 서로 다른 트랜지스터로부터 생성된 I-Response 값의 요약.
| 분석물 농도 (nM) | I-응답 트랜지스터 1 | I-응답 트랜지스터 2 | I-응답 트랜지스터 3 | 평균 I 응답 |
| 0.40 | 13.097 | 14.721 | 11.714 | 13.177 |
| 0.80 | 10.183 | 8.861 | 13.240 | 10.762 |
| 1.60 | 24.826 | 20.377 | 25.240 | 23.481 |
| 3.20 | 40.746 | 41.047 | 40.783 | 40.858 |
| 6.40 | 54.938 | 54.224 | 54.913 | 54.691 |
| 12.80 | 83.057 | 81.452 | 82.596 | 82.369 |
| 25.60 | 110.440 | 109.152 | 110.343 | 109.978 |
| 51.20 | 141.161 | 140.363 | 141.125 | 140.883 |
| 102.40 | 164.215 | 162.679 | 164.572 | 163.822 |
| 200.00 | 196.373 | 197.007 | 198.495 | 197.292 |
표 3: 두 번째 실험의 각 농도점에서 각 칩의 3개의 서로 다른 트랜지스터로부터 생성된 I-Response 값의 요약.
보충 그림 S1: 실험 시작 전에 자동화된 소프트웨어의 기본 화면의 스크린샷입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2 : 데이터 처리 및 분석을위한 자동화 된 소프트웨어의 기본 화면의 스크린 샷. (A) 데이터 처리 옵션을 보여주는 데이터 검토 / 내보내기 소프트웨어의 메인 화면 표시. (B) 데이터 분석 옵션을 보여주는 데이터 검토 / 내보내기 소프트웨어의 기본 화면 표시. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: 검토/내보내기 소프트웨어에서 얻은 검토 데이터 포인트입니다. 이 단계에서는 실험을 검토하고 데이터 요소를 추가하거나 삭제합니다. 연관 지점(2, 7, 12, 17, 22 등)이 항상 선택 항목에 있는지 확인합니다. 예를 들어 왼쪽에서 첫 번째 선택은 데이터 요소 번호 2이고 데이터 요소 번호 10(숫자 7이어야 함)입니다. 이 문제를 해결하려면 포인트 3, 4 및 5를 삭제하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S4: 예를 들어 데이터 목록 내보내기. 이 단계에서는 내보낼 실험 지점을 선택했습니다. 연관 지점(2, 7, 12, 17, 22 등)을 선택하고 이전 교정 단계(1, 6, 11, 16, 21 등)를 뺍니다. 내보내기 목록에 모든 요소를 추가하고 이 데이터를 내보내 각 데이터 요소에 대한 I-Response가 있는 스프레드시트를 가져옵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S5 : 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 생성 된 연관 그림. y축은 연관 단계의 끝에서 I-응답에 대응하고, x축은 상이한 분석물 Cdc37 농도에 대응한다. 이 플롯은 첫 번째 실험으로부터의 데이터 포인트를 사용하여 생성되었고, 3,000 nM 농도 데이터 포인트를 배제하였다. 분석 결과의 요약은 그래프에 제공되고; 이 실험에서 KD 값은 0.006 ± 0.081 μM이고R2 값은 0.98입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S6: 실험 2에서 생성된 데이터 파일은 1을 복제합니다. (A) 실험 데이터를 실시간으로 모니터링한다. y축은 바이오센서 유닛(BU)의 I-Response에 해당하고, x축은 실험에서 분석물의 상이한 시점 및 농도에 대응한다. 이 수치는 Hsp90이 칩 (500 nM)에 고정되고 10 농도의 Cdc37 분석물이 준비된 두 번째 실험에서 수행 된 두 번째 반복 (0.4-200 nM)의 데이터에 해당합니다. 실시간 I-Response 그래프는 초기에 0부터 시작하여 실험의 각 주기에서 분석물 농도가 증가함에 따라 점진적으로 증가하여 실험이 성공적임을 시사합니다. (B) 자동화 된 분석 소프트웨어에서 생성 된 Hill Fit 플롯. y축은 I-응답에 해당하고, x축은 nM의 분석물(Cdc37)의 농도에 해당한다. 자동화 분석의 결과는 0.0531 내지 0.0002 μM의 비교적낮은 KD 값 과 0.0531의 낮은 표준 편차±를 나타냈으며, 이는 Hsp90과 Cdc37 사이의 강한 상호작용을 시사한다. (C) 통계적 분석 소프트웨어를 사용하여 생성된 연관 플롯. y축은 연관 단계의 끝에서 I-응답에 대응하고, x축은 상이한 분석물 Cdc37 농도에 대응한다. 이 플롯은 표 S1에 제공된 데이터 포인트를 사용하여 생성되었다. 분석 결과의 요약은 그래프에 제공되고; 이 실험에서 KD 값은 0.003 ± 0.009 μM이고R2 값은 0.99입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S7: 실험 2에서 생성된 데이터 파일은 1을 복제합니다. (A) 실험 데이터를 실시간으로 모니터링한다. y축은 바이오센서 유닛(BU)의 I-Response에 해당하고, x축은 실험에서 분석물의 상이한 시점 및 농도에 대응한다. 이 수치는 Hsp90이 칩 (500 nM)에 고정되고 10 농도의 Cdc37 분석물이 준비된 두 번째 실험에서 세 번째 반복으로부터의 데이터에 해당합니다 (0.4-200 nM). (B) 자동화 된 분석 소프트웨어에서 생성 된 Hill Fit 플롯. y축은 I-응답에 해당하고, x축은 nM의 분석물(Cdc37)의 농도에 해당한다. 자동화 분석의 결과는 상대적으로낮은 KD 값 과 0.0719 ± 0.0007 μM의 낮은 표준 편차를 나타냈으며, 이는 Hsp90과 Cdc37 사이의 강한 상호작용을 시사한다. (C) 연관 플롯은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. y축은 연관 단계의 끝에 있는 I-응답에 해당합니다. x축은 상이한 분석물 Cdc37 농도에 대응한다. 이 플롯은 표 S2에 제공된 데이터 포인트를 사용하여 생성되었다. 분석 결과의 요약은 그래프에 제공되고; 이 실험에서 KD 값은 0.004 ± 0.009 μM이고R2 값은 0.99입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S8: 제어 실험에서 생성된 데이터 파일. (A) 실험 데이터를 실시간으로 모니터링한다. y축은 바이오센서 유닛(BU)의 I-Response에 해당하고, x축은 실험에서 분석물의 상이한 시점 및 농도에 대응한다. 이 수치는 Hsp90이 칩 (500 nM)에 고정화되고 10 농도의 BSA (대조군 단백질) 분석물이 준비된 대조 실험으로부터의 데이터에 해당한다 (0.4-200 nM). 실시간 I-응답 그래프는 10-15 BU 주변의 낮은 I-Response에서 시작하며 실험의 각 사이클에서 분석물 농도가 증가하면 증가하지 않으므로 Hsp90과 BSA 간의 상호 작용이 없음을 시사합니다. (B) 자동화 된 분석 소프트웨어에서 생성 된 Hill Fit 플롯. y축은 I-응답에 해당합니다. x축은 nM에서의 분석물(BSA)의 농도에 해당한다. 자동화 된 분석의 결과는 Hsp90과 BSA 사이의 상호 작용이 없음을 시사하는 KD 값을 계산하기에 불충분 한 데이터가 있음을 보여주었습니다. (C) 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 생성된 연관 플롯. y축은 연관 단계의 끝에서 I-응답에 대응하고, x축은 상이한 분석물 BSA 농도에 대응한다. 이 플롯은 표 S4에 제공된 데이터 포인트를 사용하여 생성되었다. 분석 결과의 요약은 그래프에 제공되고; 이 실험에서 KD 값은 -0.009 ± -0.0003 μM이고 R2 값은 0.82입니다. 0에 가까운 음의 KD 값은 Hsp90과 BSA 사이에 상호작용이 없음을 나타낸다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: 각 농도 지점에서 생성된 I-Response 값을 요약하고 각 칩의 트랜지스터(각 칩에 대해 세 개의 서로 다른 트랜지스터)에서 읽습니다. 이 표는 Hsp90이 칩에 고정화되고 (500 nM) 10 농도의 Cdc37 분석물 (0.4-200 nM)을 제조한 두 번째 반복 실험에 대해 수행 된 두 번째 반복으로부터 추출된 데이터에 해당합니다. 이 표의 데이터 포인트는 통계 분석 소프트웨어에서 분석에 사용되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: 각 농도 지점에서 생성된 I-Response 값을 요약하고 각 칩의 트랜지스터(각 칩에 대해 세 개의 서로 다른 트랜지스터)에서 읽습니다. 이 표는 Hsp90이 칩 (500 nM)에 고정되고 10 농도의 Cdc37 분석물이 제조 된 두 번째 실험에 대해 수행 된 세 번째 반복 실험에서 추출 된 데이터에 해당합니다 (0.4-200 nM). 이 표의 데이터 포인트는 통계 분석 소프트웨어에서 분석에 사용되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S3: 각 농도 지점에서 생성된 I-Response 값을 요약하고 각 칩의 트랜지스터(각 칩에 대해 세 개의 서로 다른 트랜지스터)에서 읽습니다. 이 표는 Hsp90이 칩 (500 nM)에 고정되고 10 농도의 BSA 분석물이 준비된 대조 실험으로부터의 데이터에 해당합니다 (0.4-200 nM). 이 표의 데이터 포인트는 통계 분석 소프트웨어에서 분석에 사용되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서, Hsp90과 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용을 결정하기 위해 FEB 기술(실시간 운동 특성화 접근법)을 사용하는 타당성을 평가하였다. 초기 탐구 실험 (첫 번째 실험)은 적절한 분석물 농도를 선택하는 것이 실험의 중요한 부분이며 실험은 KD 값 위와 아래의 농도 점을 포함하여 설계되어야한다고 제안했으며, 이는 문헌에서 사용 가능한 데이터를 기반으로 예측되었습니다.
그럼에도 불구하고, 상호작용에 대한 예비 정보가 없다면, 우리는 더 낮은 (0.08 nM, 0.16 nM, 0.4 nM, 2 nM) 및 더 높은 (1,000 nM, 2,500 nM, 5,000 nM) 범위 모두에서 광범위한 농도 포인트를 포함시킴으로써 예비 실험을 설계하는 것이 제안된다. 예비 실험은 KD 값의 대략적인 추정치를 제공하고, 정확한 KD 값을 얻기 위해 적절한 농도 범위를 사용하여 후속 실험을 계획할 수 있게 한다. FEB 시스템은 실험을위한 집중 점의 수를 자유롭게 선택할 수있는 편집 프로토콜 기능을 제공합니다.
우리의 경험에 비추어 볼 때, FEB 프로토콜과 관련된 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다. 표적 단백질 및 분석물 완충액은 교정 완충액과 동일해야 한다. 작은 버퍼 불일치조차도 I-Response에 변동을 일으키고 신뢰할 수없는 결과를 줄 수 있습니다. 따라서 적절한 버퍼 교환으로 밤새 투석을 수행하는 것이 좋습니다. 용액을 흡인하거나 적용하는 동안 바이오센서 칩에 조심스럽게 피펫팅하는 것은 실험 전반에 걸쳐 매우 중요합니다. 부주의 한 피펫팅은 깨진 트랜지스터 또는 I-응답의 변동으로 이어질 수 있습니다. 피펫팅하는 동안 칩의 민감한 표면을 만지지 않도록하십시오. 칩 활성화 공정에 사용되는 EDC/sulfo-NHS 용액은 매번 사용하기 전에 신선하게 혼합해야 합니다. 오래된 혼합물을 사용하면 비기능화 칩이 발생할 수 있습니다. 실험의 모든 주기에 관련된 다섯 가지 반복 단계(교정, 연관, 해리, 재생 및 세척)에 대해 동일한 버퍼를 사용해야 합니다.
FEB를 BLI 또는 SPR과 같은 분야에서 잘 정립 된 생체 분자 검출 시스템과 비교할 때, 우리는 세 가지 방법 모두 유사한 장점을 공유한다는 것을 발견했습니다43,44,45 : 그들은 상호 작용을 검출하기 위해 값 비싼 형광 염료를 필요로하지 않는 라벨이없는 시스템입니다. 그들은 작은 nM 범위에서도 상호 작용을 감지 할 수 있습니다. 칩은 SPR과 FEB 모두에서 재사용 가능하며 최대 10 번의 실험에 효율적으로 재생되고 재사용 될 수 있으며 세 가지 방법 모두 실시간으로 운동 데이터를 제공하며 실험 시간이 짧습니다.
SPR의 주요 장점은 KD,Kon,Koff, 화학량론, 열역학적 파라미터(44)를 계산할 수 있도록 실험으로부터 보다 광범위한 데이터를 제공한다는 것이다. BLI의 가장 큰 장점은 한 번의 실험에서 여러 농도를 테스트 할 수 있다는 것입니다. 운동 측정은 서로 다른 센서를 사용하여 최대 여덟 개의 농도에 대해 동시에 수행 할 수 있습니다. 그러나 BLI 센서는 재사용 할 수 없으므로 실험 비용이 매우 높습니다43.
FEB의 가장 큰 장점은 실험 전반에 걸쳐 사용자를 안내하는 자동화 된 사용자 친화적 인 소프트웨어와 사용자가 각 단계에서 고정 된 대상에 분석 물질을 추가 할 수있게 해주는 개방형 피펫팅 플랫폼입니다. 간단한 소프트웨어와 함께 결합 된이 개방형 피펫팅 접근 방식은 FEB를 배우기 쉽게 만들고 교육이 거의 또는 전혀 필요하지 않습니다. 그러나 사용자가 핸드 피펫팅에 대한 기본적인 숙달을 필요로하며, 자동화 된 액체 취급이 부족하다는 것은 스텝 타이밍의 재현성이 전적으로 사용자에게 달려 있음을 의미합니다. 이와 같은 통합 액체 취급 부족은 칩과 계측기가 SPR 또는 BLI에 비해 비용 효율적이라는 것을 의미합니다. FEB는 또한 바이오센서 칩 제조(35)에 관여하는 정의된 제조 공정으로 인해 생체분자 상호작용을 검출하는데 있어서 높은 재현성 및 신뢰성을 나타낸다.
잘 확립 된 표준 ITC 검출 방법과 비교할 때, FEB는 전체 실험에 대해 나노몰 농도에서 50 μL의 분석 물질 부피 만 사용하여 단백질의 핵 형성 또는 응집 가능성을 줄입니다. ITC의 가장 큰 문제점 중 하나는 기포를 피하기 위해 로딩하기 전에 단백질을 탈기하는 것입니다. ITC 실험 동안, 지속적인 교반 및 강렬한 퍼징으로 인해 측정 셀 내부에 기포가 발생할 가능성이 있으며, 이는 샘플 용액을 불리하게 스플래터링하거나 샘플 손실(42)을 야기할 수 있다. FEB 기술은 강력한 표적 고정화 화학을 제공하고, 응집 및 버블링을 줄이며, 안정성을 높이고, ITC가 직면 한 농도 의존적 문제를 개선함으로써 ITC의 이러한 과제를 극복합니다.
FEB 장치의 잠재적 단점은 버퍼 조성 및 농도 변화에 대한 감수성이며, 이는 결과의 피팅 및 분석 중에 수정되어야하는 기준선의 드리프트를 일으킬 수 있습니다. 바이오 센서 칩은 pH와 염에도 민감하므로 분석물의 교정 및 측정 중에 사용되는 버퍼는 실험 전반에 걸쳐 동일해야합니다. 보존제(예를 들어, 아지드나트륨) 및 소수성 분자로서 사용되는 화학물질은 센서를 손상시킬 수 있고, 심지어 비특이적 결합의 증가를 야기할 수 있다. 이러한 결점은 측정 단계 전반에 걸친 완충액 일관성, 분석물 스톡으로부터의 간섭 화합물의 투석, 및 표면의 적절한 패시베이션 (예를 들어, 세제, 단백질 차단제, 또는 상이한 PEG 분자의 사용)에 대한 주의로 완화될 수 있다.
요약하면, 우리는 FEB 기술을 사용하여 Hsp90 / Cdc37 간의 강력한 PPI를 성공적으로 시연하고 ITC를 사용하여 상호 작용을 검증하여 PPI 탐지를위한 혁신적인 대안 방법으로 FEB를 지원하는 고무적인 데이터를 제공했습니다. FEB 기술은 약물 발견, 제약, 소분자, 펩티드 및 단백질의 생체 분자 분석, 항체 개발, 약물 검증 및 시험관 내 생물학적 활동을 생체 내 효능으로 쉽게 번역하여 손끝에서 리드 최적화의 다양한 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 제공합니다. FEB 기술의 장점과 PPI, 단백질 및 DNA 또는 RNA 상호 작용뿐만 아니라 단백질 및 소분자 (예 : 약물) 상호 작용을 탐구하는 데있어 엄청난 응용 프로그램을 고려할 때, 우리는 PPI 검출 도구 상자에서 독특하고 유망한 기술이라고 제안합니다. 우리의 경우, FEB 기술은 Hsp90 / Cdc37 PPI 후보 길항제의 결합 효능을 쉽게 평가할 수있는 유용한 도구를 제공하며,이 PPI는이 PPI가 중요한 다양한 질병과 관련된 시험관 내 및 생체 내 평가를위한 유망한 후보를 선택하는 데 도움이됩니다.
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Disclosures
저자는 이해관계, 재정적 또는 다른 이유로 어떠한 충돌도 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Binational Science Foundation (BSF)에서 S.K.S. 및 N.Q.에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated analysis software | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis. |
| COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
biosensor chip |
| Data review software | Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points. |
| Dialysis bag | CelluSep, Membrane filtration products | T2-10-15 CAS number: NA |
T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m) |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) | Cardea (Nanomed) | EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8 |
White powder |
| ITC (Isothermal titration calorimetry) system | Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) | NA CAS number: NA |
|
| MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer | Merck | M3671-50G CAS number: 4432-31-9 |
White powder |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips | Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Graphene-based chip |
| PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 | Bio-Lab | 001623237500 CAS number: 7758-11-4 |
Liquid transparent solution |
| Pipete | Thermo Scientific | 11855231 CAS number: NA |
Finnpipette F3 5-50 µL, yellow |
| Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-002-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-003-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Recombinant protein Cdc37 | Abcam | ab256157 CAS number: NA |
|
| Recombinant protein Hsp90 beta | Abcam | ab80033 CAS number: NA |
|
| Spreadsheet | Excel, Microsoft office | NA CAS number: NA |
|
| Statistical software | GraphPad, Prism | NA CAS number: NA |
Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used |
| Sulfo-NHS | Cardea (Nanomed) | NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7 |
White powder |
| Tips | Alex red | LC 1093-800-000 CAS number: NA |
Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs |
References
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