Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Изучение биомолекулярного взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp90 и его клиентской протеинкиназой Cdc37 с использованием технологии полевого биозондирования

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Полевое биозондирование (FEB) - это метод обнаружения биомолекулярных взаимодействий без меток. Он измеряет электрический ток через графеновый биосенсор, к которому иммобилизованы связывающие мишени. Технология FEB использовалась для оценки биомолекулярных взаимодействий между Hsp90 и Cdc37, и было обнаружено сильное взаимодействие между двумя белками.

Abstract

Биомолекулярные взаимодействия играют разностороннюю роль в многочисленных клеточных процессах, регулируя и координируя функционально значимые биологические события. Биомолекулы, такие как белки, углеводы, витамины, жирные кислоты, нуклеиновые кислоты и ферменты, являются фундаментальными строительными блоками живых существ; они объединяются в сложные сети в биосистемах, чтобы синхронизировать мириады жизненных событий. Белки обычно используют сложные интерактомные сети для выполнения своих функций; следовательно, необходимо оценить такие взаимодействия, чтобы разгадать их важность в клетках как на клеточном, так и на уровне организма. Для достижения этой цели мы внедряем быстро развивающуюся технологию полевого биозондирования (FEB) для определения конкретных биомолекулярных взаимодействий. FEB - это настольный, без маркировки и надежный метод биомолекулярного обнаружения для определения конкретных взаимодействий и использует высококачественные электронные биосенсоры. Технология FEB может контролировать взаимодействия в наномолярном диапазоне благодаря биосовместимым наноматериалам, используемым на поверхности биосенсора. В качестве доказательства концепции было выяснено белково-белковое взаимодействие (PPI) между белком теплового шока 90 (Hsp90) и циклом деления клеток 37 (Cdc37). Hsp90 является АТФ-зависимым молекулярным шапероном, который играет важную роль в сворачивании, стабильности, созревании и контроле качества многих белков, тем самым регулируя множество жизненно важных клеточных функций. Cdc37 рассматривается как специфический для протеинкиназы молекулярный шаперон, поскольку он специально распознает и рекрутирует протеинкиназы в Hsp90 для регулирования их последующих путей передачи сигнала. Таким образом, Cdc37 считается со-шапероном Hsp90. Путь шаперон-киназы (комплекс Hsp90/Cdc37) гиперактивирован при множественных злокачественных новообразованиях, способствующих клеточному росту; поэтому он является потенциальной мишенью для терапии рака. Настоящее исследование демонстрирует эффективность технологии FEB с использованием модельной системы Hsp90/Cdc37. FEB обнаружил сильный PPI между двумя белками (значения KD 0,014 мкМ, 0,053 мкМ и 0,072 мкМ в трех независимых экспериментах). Таким образом, FEB - это платформа обнаружения PPI без меток и экономичная платформа, которая предлагает быстрые и точные измерения.

Introduction

Биомолекулярные взаимодействия:
Белки являются неотъемлемой частью организмов и участвуют в многочисленных молекулярных путях, таких как клеточный метаболизм, клеточная структура, клеточная сигнализация, иммунные реакции, клеточная адгезия и многое другое. В то время как некоторые белки выполняют свою функцию (функции) независимо, большинство белков взаимодействуют с другими белками, используя связующий интерфейс для координации надлежащей биологической активности1.

Биомолекулярные взаимодействия могут быть в основном классифицированы на основе различных структурных и функциональных характеристик вовлеченных белков2, например, на основе белковых поверхностей, комплексной стабильности или персистенции взаимодействий3. Идентификация основных белков и их роли в биомолекулярных взаимодействиях имеет жизненно важное значение для понимания биохимических механизмов на молекулярном уровне4. В настоящее время существуют различные подходы к обнаружению этих взаимодействий5: in vitro6, in silico7, в живых клетках8, ex vivo9 и in vivo10, причем каждый из них имеет свои сильные и слабые стороны.

Анализы in vivo выполняются с использованием всего животного в качестве экспериментального инструмента11, а анализыt he ex vivo выполняются на экстрактах тканей или целых органов (например, сердце, мозг, печень) в контролируемой внешней среде, обеспечивая минимальные изменения в естественных условиях. Наиболее распространенным применением исследований in vivo и ex vivo является оценка фармакокинетики, фармакодинамики и токсичности потенциальных фармакологических агентов до испытаний на людях путем обеспечения их общей безопасности и эффективности12.

Биомолекулярные взаимодействия также могут быть обнаружены в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать динамические взаимодействия, поскольку они выполняют реакции определенного биохимического пути13. Кроме того, методы обнаружения, такие как биолюминесценция или флуоресцентный резонансный перенос энергии, могут предоставить информацию о том, где и когда эти взаимодействия происходят в клетке14. Хотя обнаружение в живых клетках предлагает важные детали, эти методологии обнаружения основаны на оптике и метках, которые могут не отражать нативную биологию; они также менее контролируемы, чем методы in vitro , и требуют специализированных знаний для выполнения15.

Вычислительные методы in silico в основном используются для крупномасштабного скрининга молекул-мишеней перед экспериментами in vitro . Вычислительные методы прогнозирования, компьютерные базы данных, молекулярная стыковка, количественные отношения структура-активность и другие подходы к моделированию молекулярной динамики являются одними из хорошо зарекомендовавших себя инструментов in silico 16. По сравнению с трудоемкими экспериментальными методами, инструменты in silico могут легко делать прогнозы с высокой чувствительностью, но с пониженной точностью в прогностической производительности17.

Анализы in vitro проводятся с микроорганизмами или биологическими молекулами вне их стандартного биологического контекста. Изображение биомолекулярных взаимодействий с помощью методов in vitro имеет решающее значение для понимания функций белка и биологии, стоящей за сложной сетью функционирования клеток. Предпочтительная методология анализа выбирается в соответствии с внутренними свойствами белка, кинетическими значениями, а также режимом и интенсивностью взаимодействий18,19.

Взаимодействие Hsp90/Cdc37:
Путь шаперон-киназы, соединяющий Hsp90 и Cdc37, является перспективной терапевтической мишенью в биологии опухоли20. Hsp90 играет центральную роль в контроле клеточного цикла, сборке белка, выживании клеток и сигнальных путях. Белки, которые полагаются на Hsp90 для своих функций, доставляются в Hsp90 для комплексообразования через ко-шаперон, такой как Cdc37. Комплекс Hsp90/Cdc37 контролирует сворачивание большинства протеинкиназ и служит концентратором для множества внутриклеточных сигнальных сетей21. Это многообещающая противоопухолевая мишень из-за ее повышенной экспрессии при различных злокачественных новообразованиях, включая острый миелобластный лейкоз, множественную миелому и гепатоцеллюлярную карциному22,23.

Широко используемые методы обнаружения биомолекулярного взаимодействия in vitro
Коиммунопреципитация (co-IP) представляет собой метод, основанный на специфичности антиген-антитело для идентификации биологически значимых взаимодействий24. Основным недостатком этого метода является его неспособность обнаруживать низкоаффинные взаимодействия и кинетические значения24. Биофизические методы, такие как изотермическая титрующая калориметрия (ITC), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и технология FEB, являются предпочтительными для определения кинетических значений.

ITC представляет собой биофизический метод обнаружения, основанный на определении энергии связывания наряду с полным термодинамическим анализом для характеристики биомолекулярных взаимодействий25. Основным преимуществом ITC является то, что он не требует какой-либо маркировки или фиксации целевого белка. Основными трудностями, с которыми сталкивается ITC, являются высокая концентрация целевого белка, необходимого для одного эксперимента, и сложность анализа нековалентных комплексов из-за небольших энтальпийсвязывания 26. Как SPR, так и BLI являются биофизическими методами без меток, которые полагаются на иммобилизацию молекулы-мишени на поверхности датчика с последующими инъекциями аналита через иммобилизованную мишень27,28. В SPR измеряются изменения показателя преломления при биомолекулярных взаимодействиях27; в BLI интерференция в отраженном свете регистрируется в режиме реального времени как изменение длины волны в зависимости от времени28. Как SPR, так и BLI имеют общие преимущества, заключающиеся в высокой специфичности, чувствительности и возможностях обнаружения29. В обоих способах белок-мишень иммобилизуется на биосенсорных поверхностях, и, следовательно, может произойти некоторая потеря нативной конформации мишени, что затрудняет различие между конкретными и неспецифическими взаимодействиями30. BLI использует дорогостоящие одноразовые волоконно-оптические биосенсоры для иммобилизации мишени и, следовательно, является дорогостоящим методом31. По сравнению с этими хорошо зарекомендовавшими себя инструментами биомолекулярного обнаружения, технология FEB предлагает надежную и свободную от этикеток платформу, используя низкие наномолярные концентрации для биомолекулярного обнаружения в режиме реального времени с кинетической характеристикой. Технология FEB также преодолевает проблемы, с которыми сталкивается ITC, и является более экономически эффективной по сравнению с SPR или BLI.

Биосенсоры на основе полевых транзисторов (FET) являются новой областью для обнаружения биомолекулярных взаимодействий, предлагая различные биомедицинские приложения. В системе FET мишени иммобилизуются в микросхемы биосенсора, а взаимодействия обнаруживаются изменениями проводимости32. Уникальной особенностью, которую следует учитывать при разработке эффективного электронного биосенсора, являются физико-химические свойства, такие как полупроводниковая природа и химическая стабильность материала покрытия, используемого для изготовления поверхностидатчика 33. Обычные материалы, такие как кремний, используемые для FET, ограничивают чувствительность датчиков, поскольку для правильного функционирования требуются оксидные слои, зажатые между транзисторным каналом и определенной средой34. Кроме того, кремниевые транзисторы чувствительны к средам с высоким содержанием соли, что затрудняет измерение биологических взаимодействий в их естественной среде. Биосенсор на основе графена представлен в качестве альтернативы, поскольку он обеспечивает отличную химическую стабильность и электрическое поле. Поскольку графен представляет собой единый атомный слой углерода, он чрезвычайно чувствителен как полупроводник и химически совместим с биологическими растворами; оба эти качества желательны для генерации совместимых электронных биосенсоров35. Замечательный сверхвысокий нагрузочный потенциал биомолекул, предлагаемых биосенсорами с графеновым покрытием, приводит к разработке технологии биосенсоров FEB на основе графена.

Принцип технологии FEB: FEB - это метод биомолекулярного обнаружения без меток, который измеряет электрический ток через графеновый биосенсор, к которому иммобилизуются связывающие мишени. Взаимодействия между иммобилизованным белком и анализируемым веществом приводят к изменениям тока, которые контролируются в режиме реального времени, что позволяет проводить точные кинетические измерения36.

Контрольно-измерительные приборы: Система FEB содержит графеновый полевой транзистор (gFET) сенсорный чип и электронный считыватель, который подает постоянное напряжение на протяжении всего эксперимента (рисунок 1). Аналит наносят в растворе на целевой белок, иммобилизованный на поверхности биосенсора. Когда происходит взаимодействие, изменение тока измеряется и записывается в режиме реального времени. По мере увеличения концентрации анализируемого вещества доля связанного аналита также будет увеличиваться, вызывая более высокие чередования в токе. С помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения, поставляемого с прибором (Таблица материалов), I-Response измеряется и регистрируется в единицах биозондирования (BU)37. I-Response определяется как изменение тока (I) через чип биосенсора, измеренное в режиме реального времени при взаимодействии иммобилизованной мишени с анализируемым веществом. Программное обеспечение для автоматизированного анализа FEB может анализировать как I-Response, так и C-Response на события динамического взаимодействия, где C-Response регистрирует изменения емкости (C). Вариации как i-response, так и C-Response непосредственно соответствуют доле связанного аналита и могут быть дополнительно проанализированы для получения значений KD . Программное обеспечение для автоматизированного анализа по умолчанию предпочитает I-Response.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор экспериментальной установки. (A) Чип на основе графена и электронный считыватель. (B) Обзор компонентов микросхемы. Чип прикреплен к двум электродам, которые подают ток в систему. Поверхность чипа покрыта графеном, который при активации может связывать мишень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Методология:
Первоначально активированный микросхема биосенсора вставляется в устройство FEB (рисунок 1) с последующим выполнением шагов, описанных ниже: (1) Калибровка: Эксперимент начинается с калибровки системы с использованием 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS; pH = 7,4) для создания базового ответа равновесия. (2) Ассоциация: Анализируемый элемент вводится в чип, и I-Response контролируется до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение связывания. (3) Диссоциация: анализируемый материал диссоциируется с использованием 1x PBS. (4) Регенерация: Остатки анализируемого вещества удаляются с использованием 1x PBS. (5) Стирка: В общей сложности пять стирок выполняются с использованием 1x PBS для тщательного удаления связанных и несвязанных аналитов из чипа.

Анализ:
Анализ данных выполняется с использованием полностью автоматизированного программного обеспечения, поставляемого с прибором. Автоматизированное аналитическое программное обеспечение генерирует график Hill fit со значением KD . График соответствия Хилла описывает связь анализируемого вещества с целевым белком в зависимости от концентраций анализируемого вещества. Концентрация, при которой достигается полумаксимальный отклик, пропорциональна значению KD . Низкое значение KD представляет собой высокое сродство связывания и наоборот.

Для проверки данных, полученных в ходе эксперимента FEB, I-Ответы извлекаются из каждой точки считывания для каждой концентрации анализируемого вещества с использованием программного обеспечения для анализа/экспорта данных и могут быть экспортированы в другое программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу материалов), как описано ниже.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки, используемые в этом исследовании, Hsp90 и Cdc37, были коммерчески получены (см. Таблицу материалов).

1. Активация чипа

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, которые будут использоваться в эксперименте, перечислены в Таблице материалов. Все приготовленные растворы процедить через стерильный фильтр 0,2 мкм.

  1. Готовят 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) раствор, добавляя 2 мг EDC к 2,5 мл 1 M 2-(N-морфолино)этансульфокислоты (MES) буфера (pH = 6,0) в пробирке объемом 15 мл. Готовят растворы N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS), добавляя 6 мг сульфо-NHS в 2,5 мл буфера 1 M MES (pH = 6,0) в отдельной пробирке объемом 15 мл. Аликвот 50 мкл каждого раствора в независимых пробирках и хранят при -20 °C для будущего использования.
  2. Смешайте равные объемы раствора EDC sand sulfo-NHS (50 мкл EDC + 50 мкл сульфо-NHS) путем пипетирования вверх и вниз (не вихрь).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный раствор EDC/sulfo-NHS должен быть использован в течение 30 минут для поддержания эффективного сшивания для правильной функционализации чипа.
  3. Поместите чип биосенсора (5,7 см х 2,4 см; см. Таблицу материалов), поставляемый компанией, в стеклянную чашку Петри со встроенной крышкой. Все этапы функционализации, связанные с активацией чипа, предлагается выполнять в чашке Петри. Нанесите 50 мкл буфера 1 M MES (pH = 6,0) на чип биосенсора, инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем аспирируйте буфер.
  4. Немедленно нанесите 50 мкл раствора EDC/sulfo-NHS на чип датчика. Накройте чашку Петри и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. Аспират EDC/sulfo-NHS раствор из чипа.
  5. Промыть чип один раз 50 мкл буфера MES 1 M (pH = 6,0); аспирировать буфер MES.

2. Иммобилизация целевого белка

  1. Промыть чип 2x с 50 мкл 1x PBS (pH = 7,4). Аспирируйте PBS из чипа и добавьте молекулу-мишень Hsp90 (50 мкл; 500 нМ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несоответствие буфера может разрушить весь эксперимент; следовательно, перед экспериментом важно убедиться, что молекула-мишень находится в том же буфере, что и используемая для калибровки (например, 1x PBS (pH = 7,4)). При необходимости выполните буферный обмен путем ночного диализа перед экспериментом. В этом эксперименте ночной диализ проводили для обоих рекомбинантных белков, Hsp90 и Cdc37, против 1x PBS (pH = 7,4; см. Таблицу материалов) с правильным буферным обменом при 4 °C. Концентрация материала-мишени (hsp90 в данном случае) может варьироваться в зависимости от различных экспериментальных протоколов и природы материалов-мишеней (белок/пептид/лиганды).
  2. Накройте стеклянную чашку Петри и высиживайте в течение 30 мин при комнатной температуре. Аспирировать раствор, содержащий молекулу-мишень, и промыть 3x 50 мкл 1x PBS (pH = 7,4). Аспирируйте 1x PBS (pH = 7,4) раствор из чипа.
  3. Добавьте 50 мкл раствора Quench 1 (3,9 мМ амино-ПЭГ5-спирта в 1x PBS (pH = 7,4)) раствора. Накройте стеклянную чашку Петри и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. Аспирация раствора Quench 1 из чипа.
  4. Добавьте 50 мкл раствора Quench 2 (1 M этаноламина (pH = 8,5)) в чип. Накройте стеклянную чашку Петри и высиживайте в течение 15 мин при комнатной температуре. Аспирировать Гасить раствор 2 из чипа и промыть чип 5x, используя 50 мкл 1x PBS, оставив последнюю каплю PBS на датчике.

3. Подготовка образцов анализируемого вещества

  1. Подготовьте серию разбавления аналита для Cdc37 в желаемом диапазоне концентраций. Для первого эксперимента использовались следующие концентрации: 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 800 нМ, 1000 нМ, 2000 нМ, 3000 нМ и 5 000 нМ. Для второго эксперимента был использован другой набор концентраций в диапазоне от 0,4 нМ до 200 нМ.
  2. Спроектируйте эксперимент таким образом, чтобы включить по меньшей мере восемь различных концентраций анализируемого вещества для получения надежного значения KD . Приготовьте различные разведения анализируемого белка в том же буфере, что и используемый для калибровки, и целевой белок; здесь это 1x PBS (pH = 7,4).

4. Загрузка активированного чипа биосенсора в устройство FEB

ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство FEB состоит из считывателя со светодиодными индикаторами и картриджа для вставки микросхемы биосенсора.

  1. После целевой иммобилизации белка вставьте активированный чип в картридж устройства, который подключается через USB к компьютеру. После вставки чипа на считывателе появится зеленый светодиод, указывающий на то, что устройство FEB готово к эксперименту. Установите автоматизированное программное обеспечение (см. Таблицу материалов), поставляемое компанией, на компьютер, к которому подключено устройство FEB, чтобы отслеживать эксперимент шаг за шагом, как описано ниже.

5. Запустите эксперимент

  1. Нажмите модуль Запустить эксперимент на автоматизированном программном обеспечении и выберите 10 точек с регенерацией или любым другим требуемым протоколом. Заполните следующие данные: имя оператора, название эксперимента, дата (например, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); буфер регенерации (например, буфер PBS); иммобилизованная мишень (например, Hsp90); аналит в растворе (например, Cdc37). Подробности см. на дополнительном рисунке S1 .
  2. Нажмите кнопку Начать эксперимент, отображаемую на программном обеспечении, и следуйте инструкциям, отображаемым автоматизированным программным обеспечением, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение полностью автоматизировано, удобно для пользователя и направляет пользователя на протяжении всего эксперимента шаг за шагом. На экране появится всплывающее окно с инструкциями по дальнейшему прохождению на каждом этапе эксперимента. Программное обеспечение будет предоставлять инструкции для каждого повторяющегося шага последовательно от калибровки, ассоциации анализируемого вещества, диссоциации, регенерации и промывки (5x) для каждой концентрации анализируемого вещества на протяжении всего эксперимента.
  3. Выполните калибровку прибора. Для этого аспирируйте оставшийся раствор PBS из чипа и примените 50 мкл калибровочного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Нажмите кнопку Продолжить и подождите 5 минут, пока шаг калибровки не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку, определенную для этапа калибровки (5 мин), с предупреждающим сигналом для последующих действий.
  4. Затем выполните анализируемую ассоциацию. Для этого аспирируйте калибровочный буфер из чипа и применяйте 50 мкл самой низкой концентрации анализируемого вещества (25 нМ Cdc37). Нажмите кнопку Продолжить и подождите 5 минут, пока шаг ассоциации не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку для этапа ассоциации (5 мин) с предупреждающим сигналом для продолжения.
  5. Выполните диссоциацию аналита. Для этого аспирируют раствор анализируемого вещества из чипа и наносят 50 мкл диссоциационного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Нажмите кнопку Продолжить и подождите 5 минут, пока не закончится продолжительность шага диссоциации (5 мин). Программа отображает конечную точку для шага диссоциации (5 мин) с предупреждающим сигналом для последующих действий.
  6. Затем выполните регенерацию чипа. Аспирировать диссоциационный раствор от чипа и применить 50 мкл буфера регенерации (1x PBS; pH = 7,4). Нажмите кнопку Продолжить и подождите 30 с, пока не закончится длительность шага регенерации (30 с). Программное обеспечение отображает конечную точку для этапа регенерации (30 с) с предупреждающим сигналом для последующих действий.
  7. Наконец, вымойте чип. Аспирируйте регенерационный раствор из чипа и нанесите на чип 50 мкл промывочного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Аспирируйте раствор из чипа и повторите это 5x. Оставьте последнюю каплю буфера стирки на чипе и нажмите кнопку Продолжить и подождите 30 с, пока продолжительность шага стирки не закончится на дисплее программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение отображает конечную точку для этапа стирки (30 с) с предупреждающим сигналом для продолжения следующего цикла эксперимента.
  8. Повторите шаги для каждой используемой концентрации анализируемого вещества; пять этапов калибровки, ассоциации анализируемых веществ, диссоциации, регенерации и промывки (5x) составляют один цикл. Для эксперимента, показанного здесь, мы выполнили 10 циклов для 10 концентраций анализируемых веществ (в диапазоне от 25 нМ до 5000 нМ или от 0,4 нМ до 200 нМ; Рисунок 2).

6. Анализ

  1. Нажмите кнопку «Анализ » в верхней части программного обеспечения для автоматизированного анализа в конце эксперимента. Появится окно отображения, содержащее все экспериментальные точки. В окне убедитесь, что концентрации анализируемого вещества, используемые для предписанного протокола, являются правильными.
  2. Нажмите кнопку Выполнить анализ , чтобы автоматически сгенерировать значение KD . Программное обеспечение генерирует график соответствия Хилла, строя концентрации анализируемого вещества против соответствующих I-ответов, из которых вычисляется константа диссоциации в равновесии, значение KD .
  3. Экспортируйте необработанные данные для анализа в другое программное обеспечение для статистического анализа с помощью программного обеспечения для анализа/экспорта данных, как описано ниже.
    1. Скопируйте файл R1R, созданный автоматически в конце эксперимента (например, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021), в новую папку на рабочем столе. Откройте программное обеспечение для анализа/экспорта данных , поставляемое компанией (см. дополнительный рисунок S2A).
    2. Нажмите «Обработка данных > обработка файлов R1R» > OK на главном экране программного обеспечения для проверки / экспорта данных.
    3. Выберите папку, содержащую файлы R1R, созданные на рабочем столе на шаге 6.3.1. и нажмите кнопку OK . При этом создается копия исходных данных R1R для просмотра и редактирования данных без переопределения исходного файла.
    4. Нажмите значок обработки данных, видимый на главном экране программного обеспечения для проверки/экспорта данных. Нажмите Загрузить обработанные файлы R1R > OK. Выберите ту же папку, созданную на шаге 6.3.1, содержащую обработанные файлы R1R. Нажмите OK. На этом шаге папка, содержащая файлы эксперимента, готова к просмотру.
    5. На главном экране программного обеспечения для просмотра/экспорта данных нажмите Анализ данных. Выберите Калибровка > Калибровка отредактированных файлов R1R > OK (см. дополнительный рисунок S2B). Этот шаг калибрует все точки данных в соответствии с первым этапом калибровки, чтобы создать базовую линию.
    6. На главном экране программного обеспечения для просмотра/экспорта данных нажмите Анализ данных. Выберите Просмотр и редактирование файлов R1R > ОК. Просмотрите точки данных, удалите точки или добавьте шаги с помощью кнопки Удалить/Добавить шаг . Убедитесь, что все шаги находятся в правильном месте, например, шаг калибровки находится на базовой линии, шаг ассоциации находится на пике (см. Дополнительный рисунок S3), а затем нажмите кнопку Сохранить , чтобы сохранить все внесенные изменения.
    7. На главном экране программного обеспечения для просмотра/экспорта данных нажмите Анализ данных. Выберите Analyze/Plot Data, выберите шаги для экспорта (см. дополнительный рисунок S4). Добавьте каждый этап ассоциации (например, шаг 2, шаг 7 и т. д.) после вычитания шага калибровки (например, шаг 1, шаг 6 и т. д.) в список экспорта перед экспортом данных.
    8. Нажмите Экспортировать эти данные. Программное обеспечение генерирует файл электронной таблицы, содержащий I-Response для каждой точки данных концентрации анализируемого вещества из каждого транзистора (если все транзисторы работают, у нас будет три разных значения I-отклика для каждой точки концентрации). Используйте этот файл электронной таблицы для дальнейшего анализа данных в статистическом программном обеспечении.
  4. Откройте программное обеспечение для статистического анализа. Создайте таблицу XY с тремя значениями Y; нажмите кнопку Создать. Данные для этой таблицы (значения X, Y) копируются из файла электронной таблицы, созданного на шаге 6.3.8. Ось X соответствует концентрации анализируемого вещества (в зависимости от используемой концентрации), а три значения Y соответствуют I-ответам, полученным с помощью программного обеспечения data Review/Export , поставляемого компанией.
  5. Нажмите Анализировать эти данные. Выберите XY-анализ > нелинейной регрессии (подгонки кривой) > насыщенности связывания > одном участке > всего. Программное обеспечение автоматически проанализирует данные, сгенерирует значение KD и создаст график точек данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты эксперимента 1:
Целевой белок Hsp90 (500 нМ) иммобилизовали в чип в соответствии с протоколом иммобилизации мишени, как описано выше. Для первого эксперимента 10 концентраций анализируемого белка Cdc37, в диапазоне от 25 нМ до 5000 нМ, были подготовлены на основе данных, имеющихся в литературе (см. Таблицу 1).

Этапы эксперимента можно контролировать в режиме реального времени, следуя изменениям, происходящим в I-Response (рисунок 3A). Можно визуализировать, как каждый шаг, включенный в протокол, влияет на I-Response на протяжении всего эксперимента. Например, I-response близок к нулю во время калибровки, а на ассоциативной стадии I-Response постепенно увеличивается с увеличением концентраций анализируемого вещества (Cdc37). Глядя на данные этого эксперимента (рисунок 3A), внезапное увеличение I-Response наблюдалось при низких концентрациях анализируемого вещества (50 BU при 25 нМ). Низкий I-Response ожидался при низкой концентрации анализируемого вещества, которая будет постепенно увеличиваться с увеличением концентрации. Это внезапное увеличение позволило разработать эксперимент, включающий более низкие точки концентрации анализируемого вещества.

Следуя шагам протокола, рассмотренным выше, данные были проанализированы в предоставленном автоматизированном аналитическом программном обеспечении, которое автоматически генерировало график Hill fit с рассчитанным значением KD (рисунок 3B). Значение KD , рассчитанное с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения для первого эксперимента, составило 350 000 ± 76 000 мкМ. Большинство распространенных биологических взаимодействий показали значение KD в низком мкМ или даже в диапазоне нМ; таким образом, значение KD , полученное для первого эксперимента, очень велико.

Может быть несколько объяснений наблюдаемого высокого значения KD : между двумя изученными специфическими белками может быть связывание с низким сродством (Hsp90/Cdc37), что означает, что для молекулярных взаимодействий требуется высокая концентрация лиганда; эксперимент мог быть разработан с использованием неидеальных, находящихся вне диапазона концентраций анализируемых веществ; высокое значение может быть обусловлено встроенными параметрами, используемыми в модуле установки аналитического программного обеспечения. Автоматизированное аналитическое программное обеспечение использует модуль анализа «доза-реакция» для соответствия точкам данных, но некоторые взаимодействия могут плохо вписываться в эту модель, что дает ложные данные, что приводит к высоким значениям KD .

Для получения точного значения KD с насыщенным графиком Хилла требуется стандартизация эксперимента методом проб и ошибок, которая включает в себя как более низкие, так и более высокие точки концентрации анализируемого вещества, чтобы получить наименьшее значение KD с низкой частотой ошибок.

Учитывая все эти факторы, данные из аналитического программного обеспечения были экспортированы в дополнительное программное обеспечение для статистического анализа. I-Response для каждой точки ассоциации был извлечен с использованием автоматизированного программного обеспечения для анализа/экспорта данных и обобщен в таблице 2 путем выполнения шагов, описанных выше на этапе анализа (шаг 6).

Результаты статистического анализа программного обеспечения (рисунок 3C) показали относительно низкое значение KD с высоким стандартным отклонением (0,011 ± 0,494 мкМ) и низким значениемR2 0,78. Значительные различия, наблюдаемые в значении KD и низком значенииR2 , свидетельствуют о том, что точки концентрации, выбранные для этого эксперимента, не являются оптимальными. Кроме того, было также отмечено, что некоторые точки графика плохо вписываются в линию тренда графика (рисунок 3C); это усилило необходимость разработки второго эксперимента путем включения различных точек концентрации анализируемого вещества.

Встроенные параметры, используемые двумя аналитическими программами, совершенно разные, и это отражается в процессе генерации значений KD . Различия в значениях KD , полученных от двух аналитических программ (350 000 ± 76 000 мкМ против 0,011 ± 0,494 мкМ), можно объяснить тем, что для расчета использовались разные модули анализа. Анализ, выполненный в программном обеспечении статистического анализа, может лучше подходить для этого взаимодействия, тем самым давая более низкое значение KD .

Тем не менее, если объединить результаты обоих анализов (350 000 ± 76 000 мкМ и 0,011 ± 0,494 мкМ), можно сделать вывод, что первый эксперимент не был оптимальным и что потребуются дополнительные точки концентрации.

Чтобы проверить эту точку, некоррелированная точка графа, 3000 нМ, была исключена (см. Дополнительный рисунок S5). Результаты анализа показали значение KD 0,006 ± 0,081 мкМ при значенииR2 0,98. Эти результаты показали, что следующий эксперимент должен быть разработан с акцентом на более релевантные концентрации. Поэтому был проведен второй эксперимент для оценки Hsp90/Cdc37 PPI с использованием различных тестовых точек с концентрациями ниже и выше прогнозируемого KD.

Результаты эксперимента 2:
Целевой белок Hsp90 (500 нМ) иммобилизовали в чип с использованием протокола, описанного выше. В общей сложности 10 концентраций анализируемого вещества (Cdc37) были получены следующим образом: 0,4 нМ, 0,8 нМ, 1,6 нМ, 3,2 нМ, 6,4 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ и 200 нМ. Второй эксперимент был разработан путем включения различных точек концентрации анализируемого вещества, с учетом всех идей, полученных в предыдущем эксперименте, как упоминалось выше.

Во время эксперимента каждый шаг контролировался в режиме реального времени (рисунок 4А). Здесь график I-Response в реальном времени (полученный из низких концентраций анализируемого вещества - 0,4 нМ, 0,6 нМ, 1,6 нМ) начинается первоначально с нуля и постепенно увеличивается при увеличении концентраций анализируемого вещества в каждом цикле эксперимента по сравнению с внезапным увеличением I-отклика, наблюдаемым в первом эксперименте.

Следуя протоколу, упомянутому выше, данные анализировались с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения (рисунок 4B). Значение KD , рассчитанное с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения для этого эксперимента, составило 0,0673 ± 0,0002 мкМ, что свидетельствует о сильном взаимодействии между целевым белком Hsp90 и анализируемым cdc37. Стандартное отклонение в 0,0002 мкМ оказалось значительно меньше, чем полученное в первом эксперименте, что дает уверенность в том, что новые данные гораздо надежнее.

Чтобы проверить этот результат, мы экспортировали точки данных (таблица 3) в другое программное обеспечение для статистического анализа, как объяснялось ранее; результаты анализа обобщены на рисунке 4C.

С помощью программного обеспечения для статистического анализа было установлено, что значение KD для Hsp90/Cdc37 PPI составляет 0,014 ± 0,005 мкМ (рисунок 4C). Низкие значения KD и стандартного отклонения указывают на сильное взаимодействие между двумя белками, Hsp90 и Cdc37. Более того, значениеR2 0,99 указывает на то, что анализ идеально подходит под экспериментальные точки графа. Оба аналитических программного обеспечения показали согласованность результатов, с низкими значениями KD около 0,0673 ± 0,0002 мкМ и 0,014 ± 0,005 мкМ соответственно.

Чтобы подтвердить воспроизводимость и точность эксперимента, тот же эксперимент был выполнен в двух репликах с использованием Hsp90 (500 нМ) в качестве целевого белка и Cdc37 в качестве аналита с теми же концентрациями в диапазоне от 0,4 нм до 200 нм, что и во втором эксперименте. В ходе эксперимента каждый шаг контролировался в режиме реального времени (дополнительный рисунок S6A и дополнительный рисунок S7A). Значение KD , рассчитанное с помощью программного обеспечения для автоматизированного анализа, показано на дополнительном рисунке S6B и дополнительном рисунке S7B (0,053 ± 0,002 мкМ и 0,0719 ± 0,0007 мкМ соответственно). Как упоминалось ранее, точки данных были экспортированы (дополнительная таблица S1 и дополнительная таблица S2) в другое программное обеспечение для статистического анализа, и результаты показаны на дополнительном рисунке S6C и дополнительном рисунке S7C (дополнительный рисунок S6C: KD составляет 0,003 ± 0,009 мкМ, а R2 - 0,99; Дополнительный рисунок S7C: KD равен 0,004 ± 0,009 мкМ, аR2 равен 0,99). Результаты двух реплик из обоих аналитических программ хорошо подтвердили точность, повторяемость и воспроизводимость экспериментальных данных Hsp90 / Cdc37 FEB.

Также было проведено контрольное исследование, в котором было выяснено биомолекулярное взаимодействие между Hsp90 и контрольным белком, бычьим сывороточным альбумином (BSA). Контрольное исследование с использованием BSA в качестве аналита проводилось с использованием идентичной экспериментальной установки и анализируемых концентраций, используемых во втором эксперименте. В общей сложности 10 концентраций контрольного белка, BSA, в диапазоне от 0,4 нМ до 200 нМ, были получены в 1x PBS (pH = 7,4), и каждый этап эксперимента контролировался в режиме реального времени.

Подобно эксперименту с Hsp90 и Cdc37, график I-Response в реальном времени изначально начинается с 0; однако в контрольном исследовании I-Response не увеличивался постепенно при увеличении концентраций анализируемого вещества (дополнительный рисунок S8A). Данные также были проанализированы с использованием автоматизированного аналитического программного обеспечения (Дополнительный рисунок S8B), и программное обеспечение не смогло рассчитать значение KD из точек данных этого эксперимента. Из Hill Plot, сгенерированного программным обеспечением, видно, что нет никакого взаимодействия между Hsp90 и управляющим анализируемым BSA. Чтобы проверить этот результат, мы экспортировали точки данных (Дополнительная таблица S3) в другое программное обеспечение для статистического анализа, как объяснялось ранее. Используя программное обеспечение для статистического анализа, было установлено, что значение KD для Hsp90/BSA PPI отрицательно (дополнительный рисунок S8C; KD составляет -0,009 ± -0,0003 мкМ), что указывает на отсутствие взаимодействия между двумя белками, Hsp90 и BSA. Более того, значениеR2 (0,82) указывает на то, что анализ не соответствовал точкам экспериментального графика. Оба аналитических программного обеспечения показали согласованность в результатах, что Hsp90 и BSA не взаимодействуют.

При сравнении экспериментальных данных Hsp90/Cdc37 FEB с другими экспериментальными данными, имеющимися в литературе, было установлено, что значения KD , полученные в этом исследовании (KD = 0,014 ± 0,005 мкМ, KD = 0,053 ± 0,002 мкМ и KD = 0,072 ± 0,001 мкМ), были на два порядка ниже, чем ранее опубликованные данные (KD = 1,46 мкМ38 или 6 мкМ39 ). Эти различия можно объяснить использованием в текущих экспериментах полнометражных человеческих конструкций Hsp90 и Cdc37. Предыдущие исследования проводились на дрожжевых конструкциях Hsp90, которые содержали только частичный белок38 или гомологические белки C. elegans 39 (таблица 1). Для подтверждения результатов, полученных в системе FEB, были проведены эксперименты ITC.

Оценка PPI Hsp90/Cdc37 с помощью системы ITC:
ITC считается золотым стандартом для исследования биомолекулярных взаимодействий. Далее мы выполнили ITC для определения термодинамической кинетики Hsp90/Cdc37 PPI и в качестве валидации для эксперимента FEB. Hsp90 и Cdc37 подвергаются диализу против PBS (pH = 7,0) до ITC. Около 0,25 мкМ раствора целевого белка (Hsp90) и 2,5 мкМ раствора анализируемого белка (Cdc37) готовили в PBS для калориметрического титрования. Общий объем 80 мкл раствора Cdc37 через последовательные промежутки времени титровали от вращающегося шприца к клетке, содержащей 150 мкл раствора Hsp90 при 298,15 К. Каждая инъекция происходила в течение 4 с, а временной интервал между последовательными инъекциями составлял 150 с. В общей сложности было произведено 19 инъекций по 2 мкл каждая со скоростью перемешивания 500 об/мин и опорной мощностью 41,9 мкВт соответственно. Наблюдалось изменение температуры в результате взаимодействия Hsp90/Cdc37, а окончательные данные, полученные в конце инъекций анализируемого вещества Cdc37, были установлены с использованием аналитического программного обеспечения ITC, поставляемого компанией. Были оценены вариации тепла наряду с термодинамическими параметрами, такими как изменение молярной энтальпии (ΔH), изменение энтропии (ΔS), количество сайтов связывания (n) и константа диссоциации равновесия (KD) между Hsp90 / Cdc37 PPI. Изменение свободной энергии Гиббса (ΔG) также было рассчитано из уравнения ΔG = ΔH - TΔS после получения тепловых параметров из термограммы ITC.

График ITC показывает количество тепла, используемого или высвобождаемого во время биологических взаимодействий, чтобы выяснить природу взаимодействий и межмолекулярных сил, управляющих PPI40. Cdc37 (2,5 мкМ) титровали в Hsp90 (0,25 мкМ), а соответствующие кривые изображены на рисунке 5A,B. Полученный участок КВТ был признан экзотермическим и был включен в единую модель сайта связывания, демонстрирующую стехиометрию связывания (n) одного, энергию связывания, ΔG = -45,9 кДж/моль и значение KD = 0,009 мкМ. Небольшая несогласованность, наблюдаемая в виде эндотермического сдвига в начале термограммы ITC (рисунок 5A), предполагает образование пузырьков при титровании белка анализируемого вещества в измерительную ячейку41,42. Среди экспериментов Hsp90/Cdc37 PPI, проведенных itC при более низких и более высоких концентрациях, 10-кратное превышение Cdc37 (концентрация Hsp90 = 0,25 мкМ и концентрация Cdc37 = 2,5 мкМ) показало приемлемые параметры связывания путем достижения кривой насыщения. Значение KD, полученное из ITC (KD = 0,009 мкМ), хорошо коррелировало со значением KD, рассчитанным с использованием технологии FEB (KD = 0,014 мкМ, 0,053 мкМ и 0,072 мкМ), что убедительно поддерживало чувствительность и точность FEB при обнаружении Hsp90/Cdc37 PPI.

Figure 2
Рисунок 2: Сводка протокола. (A) Краткое изложение этапов процесса активации микросхемы. (B) Графическое представление пяти повторяющихся шагов в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Файлы данных, сгенерированные из эксперимента 1. (A) Данные эксперимента отслеживаются в режиме реального времени. Ось Y соответствует I-Response в биосенсорных единицах (BU), а ось x соответствует различным временным точкам и концентрациям анализируемого вещества в эксперименте. Этот показатель соответствует данным первого эксперимента. (B) График Hill Fit, созданный с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения. Ось y соответствует I-Response, ось x соответствует концентрациям анализируемого вещества (Cdc37) в nM. Для этого эксперимента значение KD составляет 350 000 ± 76 000 мкМ. (C) Ассоциативный график, сгенерированный с помощью программного обеспечения статистического анализа. Ось y соответствует I-Response в конце ассоциативной фазы, ось x соответствует различным концентрациям анализируемого вещества, Cdc37. Этот график был сгенерирован с использованием точек данных, приведенных в таблице 2. Резюме результатов анализа приведено на графике; для этого эксперимента значение KD равно 0,011 ± 0,494 мкМ, а значение R2 равно 0,78. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Файлы данных, сгенерированные из эксперимента 2. (A) Данные эксперимента отслеживаются в режиме реального времени. Ось Y соответствует I-Response в биосенсорных единицах (BU), а ось x соответствует различным временным точкам и концентрациям анализируемого вещества в эксперименте. Этот показатель соответствует данным второго эксперимента. (B) График Hill Fit, созданный с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения. Ось Y соответствует I-Response, ось x соответствует концентрации анализируемого вещества (Cdc37) в nM. Для этого эксперимента значение KD составляет 0,0673 ± 0,0002 мкМ (C) Ассоциативного графика, сгенерированного с помощью программного обеспечения статистического анализа. Ось Y соответствует I-Response в конце ассоциативной фазы, ось x соответствует различным концентрациям анализируемого cdc37. Этот график был сгенерирован с использованием точек данных, приведенных в таблице 3. Резюме результатов анализа приведено на графике; для этого эксперимента значение KD равно 0,014 ± 0,005 мкМ, а значениеR2 равно 0,99. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Термограмма ITC взаимодействия Hsp90 и Cdc37. (A) Верхняя панель представляет соответствующие кривые выделения тепла, полученные в результате последовательных инъекций Cdc37 (2,5 мкМ) в Hsp90 (0,25 мкМ) при 298,15 К. Дифференциальная мощность (DP) представляет дифференциальную мощность как функцию времени. (B) Интегрированные точки данных на нижней панели обозначают соответствующую нормализованную теплоту по сравнению с молярным соотношением Hsp90/Cdc37. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Выполненные анализы Feb анализ KD Призматический анализ KD Происхождение конструкции Аминокислоты Ссылки
МТЦ 1,46 мкМ и 1,32 мкМ Н.А. Дрожжи Hsp90 N-концевой домен Hsp90 36
Человек Cdc37
SPR 6 мкМ Н.А. С. Элеганс Полная длина 37
FEB - Первое повторение 0.014 мкМ 0.067 мкМ Человеческий Hsp90 Полная длина Выполнено в этом исследовании
Человек Cdc37
FEB - Второе повторение 0,053 мкМ 0.003 мкМ Человеческий Hsp90 Полная длина Выполнено в этом исследовании
Человек Cdc37
FEB - Третье повторение 0.072 мкМ 0.004 мкМ Человеческий Hsp90 Полная длина Выполнено в этом исследовании
Человек Cdc37
МТЦ 0.009 мкМ Н.А. Человеческий Hsp90 Полная длина Выполнено в этом исследовании
Человек Cdc37
FEB- Контрольное исследование Нет данных (было недостаточно данных для расчета KD) -0,009 мкМ (значение KD с отрицательными значениями указывает на отсутствие взаимодействия) Человеческий Hsp90 Полная длина Выполнено в этом исследовании
БСА

Таблица 1: Оценка ИЦП Hsp90/Cdc37 с использованием различных методов, о которых сообщалось в данном исследовании и литературе.

Концентрации аналитов (нМ) Транзистор I-Response 1 Транзистор I-Response 2 Транзистор I-Response 3 Средний
I-Response
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Таблица 2: Сводка значений I-Response, полученных от трех различных транзисторов каждого чипа в каждой точке концентрации первого эксперимента.

Концентрации аналитов (нМ) Транзистор I-Response 1 Транзистор I-Response 2 Транзистор I-Response 3 Средний I-отклик
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Таблица 3: Сводка значений I-Response, полученных от трех различных транзисторов каждого чипа в каждой точке концентрации второго эксперимента.

Дополнительный рисунок S1: Скриншот главного экрана автоматизированного программного обеспечения перед началом эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Скриншот главного экрана автоматизированного программного обеспечения для обработки и анализа данных. (A) Отображение на главном экране программного обеспечения для анализа/экспорта данных с указанием вариантов обработки данных. (B) На главном экране отображается программное обеспечение для анализа/экспорта данных, показывающее варианты анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Точки данных обзора, полученные из программного обеспечения для проверки/экспорта. На этом шаге просмотрите эксперимент и добавьте или удалите точки данных. Убедитесь, что точка ассоциации (2, 7, 12, 17, 22 и т. д.) всегда находится на пике. Например, первым выбором слева является точка данных No 2, а затем точка данных No 10 (но это должна быть точка 7). Чтобы решить эту проблему, просто удалите пункты 3, 4 и 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Экспорт списка данных, например. На этом шаге выберите, какие точки эксперимента будут экспортироваться. Выберите точку ассоциации (2, 7, 12, 17, 22 и т. д.) и вычтите предыдущие шаги калибровки (1, 6, 11, 16, 21 и т. д.). Добавьте все точки в список экспорта и экспортируйте эти данные, чтобы получить электронную таблицу с I-Response для каждой точки данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S5: Ассоциативный график, сгенерированный с помощью программного обеспечения статистического анализа. Ось Y соответствует I-Response в конце ассоциативной фазы, ось x соответствует различным концентрациям анализируемого cdc37. Этот график был сгенерирован с использованием точек данных из первого эксперимента и исключал точку данных концентрации 3000 нМ. Резюме результатов анализа приведено на графике; для этого эксперимента значение KD равно 0,006 ± 0,081 мкМ, а значениеR2 равно 0,98. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S6: Файлы данных, сгенерированные в эксперименте 2, реплицируются 1. (A) Экспериментальные данные отслеживаются в режиме реального времени. Ось Y соответствует I-Response в биосенсорных единицах (BU), а ось x соответствует различным временным точкам и концентрациям анализируемого вещества в эксперименте. Эта цифра соответствует данным второго повторения, выполненного во втором эксперименте, где Hsp90 иммобилизовали на чипе (500 нМ) и приготовили 10 концентраций аналита Cdc37 (0,4-200 нМ). График I-Response в реальном времени начинается первоначально с 0 и постепенно увеличивается по мере увеличения концентрации анализируемого вещества в каждом цикле эксперимента, предполагая, что эксперимент успешен. (B) График Hill Fit, созданный с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения. Ось y соответствует I-Response, ось x соответствует концентрациям анализируемого вещества (Cdc37) в nM. Результаты автоматизированного анализа показали относительно низкое значение KD и низкое стандартное отклонение 0,0531 ± 0,0002 мкМ, что свидетельствует о сильном взаимодействии между Hsp90 и Cdc37. (C) Ассоциативный график, сгенерированный с использованием программного обеспечения статистического анализа. Ось Y соответствует I-Response в конце ассоциативной фазы, ось x соответствует различным концентрациям анализируемого cdc37. Этот график был сгенерирован с использованием точек данных, приведенных в таблице S1. Резюме результатов анализа приведено на графике; для этого эксперимента значение KD равно 0,003 ± 0,009 мкМ, а значениеR2 равно 0,99. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S7: Файлы данных, сгенерированные из эксперимента 2, реплицируются 1. (A) Экспериментальные данные отслеживаются в режиме реального времени. Ось Y соответствует I-Response в биосенсорных единицах (BU), а ось x соответствует различным временным точкам и концентрациям анализируемого вещества в эксперименте. Этот показатель соответствует данным третьего повторения во втором эксперименте, где Hsp90 иммобилизовали на чипе (500 нМ) и приготовили 10 концентраций аналита Cdc37 (0,4-200 нМ). (B) График Hill Fit, созданный с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения. Ось y соответствует I-Response, ось x соответствует концентрациям анализируемого вещества (Cdc37) в nM. Результаты автоматизированного анализа показали относительно низкое значение KD и низкое стандартное отклонение 0,0719 ± 0,0007 мкМ, что свидетельствует о сильном взаимодействии между Hsp90 и Cdc37. (C) Ассоциативный график, сгенерированный с использованием программного обеспечения статистического анализа. Ось Y соответствует I-Response в конце ассоциативной фазы. Ось x соответствует различным концентрациям анализируемого cdc37. Этот график был создан с использованием точек данных, приведенных в таблице S2. Резюме результатов анализа приведено на графике; для этого эксперимента значение KD равно 0,004 ± 0,009 мкМ, а значениеR2 равно 0,99. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S8: Файлы данных, сгенерированные в результате контрольного эксперимента. (A) Экспериментальные данные отслеживаются в режиме реального времени. Ось Y соответствует I-Response в биосенсорных единицах (BU), а ось x соответствует различным временным точкам и концентрациям анализируемого вещества в эксперименте. Этот показатель соответствует данным контрольного эксперимента, где Hsp90 иммобилизовали на чипе (500 нМ) и приготовили 10 концентраций анализируемого BSA (контрольного белка) (0,4-200 нМ). График I-Response в реальном времени начинается с низкого I-Response около 10-15 BU и не увеличивается при увеличении концентраций анализируемого вещества в каждом цикле эксперимента, предполагая, что между Hsp90 и BSA нет взаимодействия. (B) График Hill Fit, созданный с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения. Ось Y соответствует I-Response; ось x соответствует концентрациям анализируемого вещества (BSA) в nM. Результаты автоматизированного анализа показали, что недостаточно данных для расчета значения KD , что говорит об отсутствии взаимодействия между Hsp90 и BSA. (C) Ассоциативный график, созданный с использованием программного обеспечения статистического анализа. Ось Y соответствует I-Response в конце ассоциативной фазы, ось x соответствует различным концентрациям BSA анализируемого вещества. Этот график был сгенерирован с использованием точек данных, представленных в таблице S4. Резюме результатов анализа приведено на графике; для этого эксперимента значение KD равно -0,009 ± -0,0003 мкМ, а значение R2 равно 0,82. Отрицательное значение KD , близкое к нулю, указывает на отсутствие взаимодействия между Hsp90 и BSA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Сводка значений I-Response, генерируемых в каждой точке концентрации и считываемых с транзисторов каждого чипа (три разных транзистора для каждого чипа). Эта таблица соответствует данным, извлеченным из второго повторения, выполненного для второго эксперимента, где Hsp90 был иммобилизован на чипе (500 нМ) и получено 10 концентраций анализируемого вещества Cdc37 (0,4-200 нМ). Точки данных из этой таблицы использовались для анализа в программном обеспечении статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S2: Сводка значений I-Response, генерируемых в каждой точке концентрации и считываемых с транзисторов каждого чипа (три разных транзистора для каждого чипа). Эта таблица соответствует данным, извлеченным из третьего повторения, выполненного для второго эксперимента, где Hsp90 был иммобилизован на чипе (500 нМ) и получено 10 концентраций анализируемого вещества Cdc37 (0,4-200 нМ). Точки данных из этой таблицы использовались для анализа в программном обеспечении статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S3: Сводка значений I-Response, генерируемых в каждой точке концентрации и считываемых с транзистора каждого чипа (три разных транзистора для каждого чипа). Эта таблица соответствует данным контрольного эксперимента, где Hsp90 иммобилизовали на чипе (500 нМ) и подготовили 10 концентраций анализируемого BSA (0,4-200 нМ). Точки данных из этой таблицы использовались для анализа в программном обеспечении статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании была оценена возможность использования технологии FEB (подход кинетической характеристики в реальном времени) для определения биомолекулярного взаимодействия между Hsp90 и Cdc37. Первоначальный исследовательский эксперимент (первый эксперимент) показал, что выбор правильных концентраций анализируемого вещества является важной частью эксперимента и что эксперимент должен быть разработан путем включения точек концентрации выше и ниже значения KD , которые были предсказаны на основе данных, доступных в литературе.

Тем не менее, если нет предварительной информации о взаимодействии, мы предлагаем спроектировать предварительный эксперимент, включив широкий диапазон точек концентрации как в более низкие (0,08 нМ, 0,16 нМ, 0,4 нМ, 2 нМ), так и более высокие (1 000 нМ, 2 500 нМ, 5 000 нМ) диапазоны. Предварительный эксперимент дает приблизительную оценку значения KD и позволяет планировать последующие эксперименты с использованием правильных диапазонов концентраций для получения точного значения KD . Система FEB предлагает функцию протокола редактирования, в которой можно свободно выбирать количество точек концентрации для эксперимента.

По нашему опыту, наиболее важные шаги, связанные с протоколом FEB, заключаются в следующем. Целевой белок и буфер аналита должны быть такими же, как калибровочный буфер. Даже небольшое несоответствие буфера может вызвать колебания I-Response и дать ненадежные результаты. Таким образом, мы предлагаем проводить диализ в течение ночи путем правильного буферного обмена. Тщательное пипетирование на чипе биосенсора во время аспирации или применения раствора имеет решающее значение на протяжении всего эксперимента. Небрежное пипетирование может привести к поломке транзисторов или флуктуациям в I-Response; во время пипетки убедитесь, что вы не касаетесь чувствительной поверхности чипа. Раствор EDC/sulfo-NHS, используемый в процессе активации чипа, должен быть смешан свежим перед каждым использованием. Использование старой смеси может привести к нефункционализированному чипу. Обязательно используйте один и тот же буфер для всех пяти повторяющихся шагов (калибровка, ассоциация, диссоциация, регенерация и промывка), участвующих во всех циклах эксперимента.

Сравнивая FEB с хорошо зарекомендовавшими себя биомолекулярными системами обнаружения в полевых условиях, такими как BLI или SPR, мы обнаружили, что все три метода имеют аналогичные преимущества 43,44,45, которые заключаются в следующем: они являются системами без маркировки, которые не требуют каких-либо дорогостоящих флуоресцентных красителей для обнаружения взаимодействий; они могут обнаруживать взаимодействия даже в небольших диапазонах nM; чипы можно использовать повторно как в SPR, так и в FEB, и они могут быть регенерированы и повторно использованы эффективно для 10 экспериментов, и все три метода предоставляют кинетические данные в режиме реального времени, а время эксперимента короткое.

Основным преимуществом SPR является то, что он предоставляет более обширные данные эксперимента, так что можно вычислить KD, Kon, Koff, стехиометрию и термодинамические параметры44. Основным преимуществом BLI является его способность тестировать несколько концентраций в одном эксперименте. Кинетические измерения могут быть выполнены одновременно для восьми концентраций с использованием различных датчиков. Тем не менее, датчики BLI не являются многоразовыми, что делает стоимость эксперимента чрезвычайно высокой43.

Основным преимуществом FEB является его автоматизированное, удобное программное обеспечение, которое направляет пользователя на протяжении всего эксперимента, и его платформа для пипетирования с открытой рукой, которая позволяет пользователю добавлять анализируемый элемент к обездвиженной цели на каждом этапе. Этот подход с открытым пипетированием в сочетании с простым программным обеспечением делает FEB легким в освоении и требует небольшого обучения или даже вообще не требует обучения. Тем не менее, это требует, чтобы пользователь обладал базовым мастерством ручного пипетирования, а отсутствие автоматизированной обработки жидкости означает, что воспроизводимость времени шага полностью зависит от пользователя. Это же отсутствие интегрированной обработки жидкостей означает, что чипы и инструменты являются экономически эффективными по сравнению с SPR или BLI. FEB также демонстрирует высокую воспроизводимость и надежность при обнаружении биомолекулярных взаимодействий благодаря определенному процессу изготовления, участвующему в подготовке биосенсорного чипа35.

По сравнению с хорошо зарекомендовавшим себя и стандартным методом обнаружения ITC, FEB использует только 50 мкл объема анализируемого вещества при наномолярных концентрациях для всего эксперимента, уменьшая вероятность нуклеации или агрегации белков. Одной из самых больших проблем с ITC является дегазация белков перед загрузкой, чтобы избежать пузырьков воздуха. Во время эксперимента ITC существует вероятность развития пузырьков внутри измерительной ячейки из-за непрерывного перемешивания и интенсивной продувки, которые могут отрицательно разбрызгивать раствор образца или вызывать потерю образца42. Технология FEB преодолевает эти проблемы ITC, предлагая надежную химию иммобилизации целей, уменьшая агрегацию и пузырьки, повышая стабильность и улучшая зависящие от концентрации проблемы, с которыми сталкивается ITC.

Потенциальным недостатком устройств FEB является их восприимчивость к изменениям буферного состава и концентрации, что может привести к дрейфу в исходном уровне, который должен быть скорректирован во время установки и анализа результатов. Чип биосенсора также чувствителен к pH и соли, поэтому буферы, используемые во время калибровки и измерения анализируемого вещества, должны быть одинаковыми на протяжении всего эксперимента. Химические вещества, используемые в качестве консервантов (например, азид натрия) и гидрофобные молекулы, могут повредить датчик и даже вызвать увеличение неспецифического связывания. Эти недостатки могут быть смягчены с вниманием к консистенции буфера на всех этапах измерения, диализу интерферирующих соединений из запаса анализируемого вещества и соответствующей пассивации поверхности (например, использование моющих средств, блокаторов белка или различных молекул ПЭГ).

Таким образом, мы успешно продемонстрировали сильный PPI между Hsp90 / Cdc37 с помощью технологии FEB и проверили их взаимодействие с помощью ITC, предоставив обнадеживающие данные для поддержки FEB в качестве инновационного альтернативного метода обнаружения PPI. Технология FEB предлагает широкий спектр применений в различных областях открытия лекарств, фармацевтических препаратов, биомолекулярного анализа малых молекул, пептидов и белков, разработки антител, валидации лекарств и оптимизации свинца на кончиках наших пальцев, легко переводя биологическую активность in vitro в эффективность in vivo . Учитывая преимущества технологии FEB и ее огромные приложения в изучении взаимодействия PPI, белка и ДНК или РНК, а также белковых и низкомолекулярных (например, лекарственных) взаимодействий, мы предполагаем, что это уникальная, многообещающая технология в наборе инструментов обнаружения PPI. В нашем случае технология FEB предлагает ценный инструмент для легкой оценки эффективности связывания антагонистов-кандидатов Hsp90 / Cdc37 PPI, который затем помогает в выборе перспективных кандидатов для дальнейших оценок in vitro и in vivo , относящихся к различным заболеваниям, при которых этот ИПП имеет решающее значение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансовых или иных.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантом Бинационального научного фонда (BSF) S.K.S. и N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

Биохимия Выпуск 181 Цикл деления клеток 37 Cdc37 Белок теплового шока 90 Hsp90 Протеинкиназа Графеновый биосенсор Полевое биозондирование Рак Биомолекулярные взаимодействия
Изучение биомолекулярного взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp90 и его клиентской протеинкиназой Cdc37 с использованием технологии полевого биозондирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter