Summary
電界効果バイオセンシング(FEB)は、生体分子相互作用を検出するための標識のない技術です。これは、結合標的が固定化されているグラフェンバイオセンサを通る電流を測定する。FEB技術を用いてHsp90とCdc37の生体分子間相互作用を評価し、2つのタンパク質間の強い相互作用が検出された。
Abstract
生体分子相互作用は、機能的に関連する生物学的事象を調節および調整することによって、多数の細胞プロセスにおいて多目的な役割を果たす。タンパク質、炭水化物、ビタミン、脂肪酸、核酸、酵素などの生体分子は、生物の基本的な構成要素です。それらはバイオシステム内の複雑なネットワークに集まり、無数のライフイベントを同期させます。タンパク質は通常、複雑なインターアクトームネットワークを利用してその機能を果たします。したがって、細胞レベルと生物レベルの両方で細胞におけるその重要性を解明するために、そのような相互作用を評価することが必須である。この目標に向けて、我々は、特定の生体分子相互作用を決定するために、急速に出現する技術、電界効果バイオセンシング(FEB)を導入する。FEBは、ベンチトップ型でラベルフリーで信頼性の高い生体分子検出技術で、特定の相互作用を決定し、高品質の電子ベースのバイオセンサーを使用しています。FEB技術は、バイオセンサー表面で使用される生体適合性ナノ材料によるナノモル範囲の相互作用を監視することができる。概念実証として、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)と細胞分裂サイクル37(Cdc37)との間のタンパク質間相互作用(PPI)を解明した。Hsp90はATP依存性分子シャペロンであり、多くのタンパク質の折り畳み、安定性、成熟、および品質管理に不可欠な役割を果たし、それによって複数の重要な細胞機能を調節する。Cdc37は、プロテインキナーゼを特異的に認識してHsp90にリクルートし、下流のシグナル伝達経路を調節するため、プロテインキナーゼ特異的分子シャペロンとみなされる。そのため、Cdc37はHsp90の共同シャペロンと考えられている。シャペロンキナーゼ経路(Hsp90/Cdc37複合体)は、細胞増殖を促進する複数の悪性腫瘍において過剰活性化される。したがって、それは癌治療の潜在的な標的である。本研究は、Hsp90/Cdc37モデルシステムを用いたFEB技術の効率を実証する。FEBは、2つのタンパク質間に強力なPPIを検出した(3つの独立した実験におけるKD 値は0.014μM、0.053μM、および0.072μM)。要約すると、FEBはラベルフリーで費用対効果の高いPPI検出プラットフォームであり、迅速かつ正確な測定を提供します。
Introduction
生体分子相互作用:
タンパク質は生物の不可欠な部分であり、細胞代謝、細胞構造、細胞シグナル伝達、免疫応答、細胞接着などの多数の分子経路に関与する。一部のタンパク質は独立してその機能を果たすが、ほとんどのタンパク質は結合界面を使用して他のタンパク質と相互作用し、適切な生物学的活性を調整する1。
生体分子相互作用は、主に、タンパク質表面、複合体安定性、または相互作用の持続性に基づいて、関与するタンパク質2の明確な構造的および機能的特性に基づいて分類することができる3。生体分子相互作用における必須タンパク質とその役割を同定することは、分子レベルでの生化学的メカニズムを理解するために不可欠です4。現在、これらの相互作用5を検出するための様々なアプローチがある:インビトロ6、インシリコ7、生細胞8、エキソビボ9、およびインビボ10において、それぞれ独自の長所および短所を有する。
インビボアッセイは、実験ツール11として全動物を用いて行われ、theエキソビボアッセイは、自然条件下で最小限の変化を提供することによって、制御された外部環境において組織抽出物または全器官(例えば、心臓、脳、肝臓)に対して行われる。in vivoおよびex vivo研究の最も一般的な用途は、潜在的な薬理学的薬剤の全体的な安全性および有効性を確保することによって、ヒト試験前に潜在的な薬理学的薬剤の薬物動態、薬力学、および毒性効果を評価することである12。
生体分子相互作用は、生細胞内でも検出することができる。生細胞をイメージングすることで、特定の生化学的経路13の反応を実行する際の動的相互作用を観察することができます。さらに、生物発光または蛍光共鳴エネルギー移動などの検出技術は、これらの相互作用が細胞14内でどこでいつ起こるかについての情報を提供することができる。生細胞での検出は重要な詳細を提供しますが、これらの検出方法は光学と標識に依存しており、ネイティブの生物学を反映していない可能性があります。また、 in vitro 法よりも制御が弱く、15を実行するには専門的な専門知識が必要です。
インシリコ計算法は、主にin vitro実験前の標的分子の大規模スクリーニングに使用されます。計算予測方法、コンピュータベースのデータベース、分子ドッキング、定量的構造活性関係、および他の分子動力学シミュレーションアプローチは、十分に確立されたインシリコツール16の1つである。面倒な実験手法と比較して、in silicoツールは高感度で簡単に予測を行うことができますが、予測性能の精度は低下します17。
インビトロ アッセイは、標準的な生物学的文脈の外側の微生物または生体分子を用いて行われる。 in vitro 法による生体分子相互作用の描写は、タンパク質の機能と細胞機能の複雑なネットワークの背後にある生物学を理解するために不可欠です。好ましいアッセイ方法論は、タンパク質の固有の特性、速度論的値、ならびに相互作用の様式および強度に従って選択される18、19。
Hsp90/Cdc37 の相互作用:
Hsp90とCdc37をつなぐシャペロンキナーゼ経路は、腫瘍生物学20において有望な治療標的である。Hsp90は、細胞周期制御、タンパク質集合、細胞生存、およびシグナル伝達経路において中心的な役割を果たす。Hsp90に依存しているタンパク質は、Cdc37などのコシャペロンを介して複合体形成のためにHsp90に送達されます。Hsp90/Cdc37複合体は、ほとんどのプロテインキナーゼのフォールディングを制御し、多数の細胞内シグナル伝達ネットワーク21のハブとして機能する。これは、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫、および肝細胞癌を含む様々な悪性腫瘍におけるその上昇のために有望な抗腫瘍標的である22,23。
一般的に使用される インビトロ 生体分子相互作用検出技術
共免疫沈降法(co−IP)は、生物学的に関連する相互作用を同定するために抗原抗体特異性に依存する技術である24。この方法の主な欠点は、低親和性相互作用および動力学的値24を検出できないことである。等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)、生体層干渉法(BLI)、FEB技術などの生物物理学的方法が、速度論的値を決定するために好ましい。
ITCは、生体分子相互作用を特徴付けるための完全な熱力学分析とともに結合エネルギーの決定に基づく生物物理学的検出方法である25。ITCの主な利点は、標的タンパク質の標識または固定を必要としないことである。ITCが遭遇する主な困難は、1つの実験に必要な高濃度の標的タンパク質と、小さな結合エンタルピー26による非共有結合複合体の分析の困難さである。SPRおよびBLIはいずれも、センサー表面上の標的分子の固定化に依存し、続いて固定化標的27、28に対する分析物のその後の注入に依存する標識のない生物物理学的技術である。SPRでは、生体分子相互作用中の屈折率の変化が測定される27;BLIでは、反射光の干渉は、時間28の関数として波長の変化としてリアルタイムで記録される。SPRとBLIはどちらも、高い特異性、感度、検出機能を提供するという共通の利点を共有しています29。両方の方法において、標的タンパク質はバイオセンサ表面に固定化されており、したがって、標的の天然の立体構造がいくらか失われる可能性があり、これは特異的相互作用と非特異的相互作用を区別することを困難にする30。BLIは、標的を固定化するために高価な使い捨て光ファイバーバイオセンサを使用するので、コストのかかる技術31である。これらの十分に確立された生体分子検出ツールと比較して、FEB技術は、動力学的特性評価を伴うリアルタイムでの生体分子検出に低ナノモル濃度を使用することにより、信頼性が高くラベルフリーのプラットフォームを提供します。FEB技術は、ITCが直面するバブリングの課題も克服し、SPRやBLIと比較して費用対効果が高くなります。
電界効果トランジスタ(FET)ベースのバイオセンサは、さまざまな生物医学的アプリケーションを提供することにより、生体分子相互作用を検出するための新しい分野です。FETシステムでは、ターゲットはバイオセンサチップに固定化され、相互作用はコンダクタンス32の変化によって検出される。効率的な電子バイオセンサの開発において考慮されるべきユニークな特徴は、センサ表面33を作製するために使用されるコーティング材料の半導電性の性質および化学的安定性などの物理化学的特性である。FETに使用されるシリコンのような従来の材料は、トランジスタチャネルと適切に機能するために特定の環境との間に挟まれた酸化物層を必要とするため、センサの感度を制限してきた34。さらに、シリコントランジスタは高塩分環境に敏感であるため、自然環境での生物学的相互作用を測定することは困難です。グラフェンベースのバイオセンサは、優れた化学的安定性と電場を提供するため、代替品として提示されています。グラフェンは炭素の単一原子層であるため、半導体として非常に敏感であり、生物学的溶液と化学的に互換性があります。これらの品質の両方が、互換性のある電子バイオセンサ35を生成するのに望ましい。グラフェンコーティングされたバイオセンサによって提供される生体分子の顕著な超高負荷ポテンシャルは、グラフェンベースのバイオセンサFEB技術の開発につながる。
FEB技術の原理:FEBは、結合標的が固定化されているグラフェンバイオセンサを通る電流を測定するラベルフリーの生体分子検出技術です。固定化タンパク質と分析物との間の相互作用は、リアルタイムでモニターされる電流の変化をもたらし、正確な動態測定を可能にする36。
計装:FEBシステムは、グラフェン電界効果トランジスタ(gFET)センサーチップと、実験全体を通して一定の電圧を印加する電子リーダで構成されています(図1)。検体は、バイオセンサ表面に固定化された標的タンパク質に溶液中で塗布される。相互作用が発生すると、電流の変化が測定され、リアルタイムで記録されます。分析物濃度が増加するにつれて、結合した分析物の割合も増加し、電流のより高い交替を引き起こします。装置に付属の自動分析ソフトウェア(材料表)を使用して、I-Responseはバイオセンシングユニット(BU)37の観点から測定および記録されます。I-Responseは、固定化ターゲットと分析物との相互作用時にリアルタイムで測定されるバイオセンサーチップを通る電流(I)の変化として定義されます。FEB自動解析ソフトウェアは、C応答が静電容量(C)の変化を記録する動的相互作用イベントに対するI応答とC応答の両方を解析できます。I-ResponseとC-Responseの両方の変動は、結合した分析物のフラクションに直接対応し、さらに分析してKD 値を生成することができます。自動分析ソフトウェアのデフォルトの設定はI-Responseです。
図1:実験セットアップの概要 (A)グラフェンベースのチップと電子リーダ。(B)チップ部品の概要。チップは、システムに電流を供給する2つの電極に取り付けられています。チップの表面はグラフェンで覆われており、活性化されると標的を結合することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
方法論：
最初に、活性化バイオセンサーチップをFEBデバイスに挿入し(図1)、その後、以下に概説する手順を実行します:(1)キャリブレーション:実験は、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH = 7.4)を使用してベースライン平衡化応答を作成するシステムキャリブレーションから始まります。(2)アソシエーション:分析物をチップに導入し、結合飽和に達するまでI-Responseを監視します。(3)解離:分析物を1x PBSを用いて解離させる。(4)再生:1x PBSを用いて検体の残骸を除去する。(5)洗浄:チップから結合および非結合の分析物を完全に除去するために、1x PBSを使用して合計5回の洗浄を行う。
解析：
データ分析は、機器に付属の完全自動ソフトウェアを使用して実行されます。自動解析ソフトウェアは、KD 値を持つヒルフィットプロットを生成します。ヒルフィットプロットは、分析物濃度の関数として、分析物と標的タンパク質との関連を記述します。最大応答の半分が達成される濃度は、KD 値に比例する。低いKD 値は高い結合親和性を表し、その逆も同様である。
FEB実験で得られたデータを検証するために、データレビュー/エクスポートソフトウェアを使用して、各分析物濃度の各読み出しポイントからI-Responseを抽出し、以下で説明するように他の統計分析ソフトウェア( 材料表を参照)にエクスポートすることができます。
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Protocol
注:本研究で用いた組換えタンパク質Hsp90およびCdc37は、商業的に入手した( 材料表を参照)。
1. チップの起動
注:実験で使用するすべての材料は、 材料表にリストされています。調製したすべての溶液を滅菌0.2μmフィルターでろ過します。
- 15 mLチューブ中の1 M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH=6.0)に2 mgのEDCを加えて、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)溶液を調製する。別の 15 mL チューブ内の 2.5 mL の 1 M MES バッファー (pH = 6.0) に 6 mg のスルホ NHS を加えて、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド (スルホ-NHS) 溶液を調製します。各溶液の 50 μL を独立したチューブにアリコートし、将来の使用のために -20 °C で保存します。
- 等量のEDCサンドスルホNHS溶液(50 μLのEDC + 50 μLのスルホ-NHS)を上下にピペッティングして混合します(渦を巻かないでください)。
注:EDC/スルホ-NHSの混合溶液は、適切なチップ機能化のための効果的な架橋を維持するために、30分以内に使用する必要があります。 - 同社から提供されたバイオセンサーチップ(5.7 cm x 2.4 cm、 材料表を参照)を、蓋が取り付けられたガラス製のペトリ皿に入れます。チップの活性化に関連するすべての機能化ステップは、ペトリ皿内で行われることが示唆される。バイオセンサーチップに50 μLの1 M MESバッファー(pH = 6.0)を塗布し、室温で1分間インキュベートしてからバッファーを吸引します。
- 50 μL の EDC/スルホ-NHS 溶液をセンサーチップに直ちに塗布します。シャーレを覆い、室温で 15 分間インキュベートします。チップから EDC/スルホ-NHS 溶液を吸引します。
- チップを50 μLの1 M MESバッファー(pH = 6.0)で1回すすいでください。MES バッファーを吸引します。
2. 標的タンパク質固定化
- チップを50 μLの1x PBS(pH = 7.4)で2xすすぎます。チップからPBSを吸引し、標的分子Hsp90(50 μL; 500 nM)を加える。
注: バッファの不一致は、実験全体を台無しにする可能性があります。したがって、実験の前に、標的分子が較正に使用されたものと同じ緩衝液(例えば、1x PBS(pH = 7.4))中にあることを確認することが重要です。必要に応じて、実験前に一晩透析してバッファー交換を行う。この実験では、組換えタンパク質Hsp90およびCdc37の両方について、1x PBS(pH = 7.4; 材料表を参照)に対して、4°Cで適切なバッファー交換を行い、一晩透析を行った。 標的物質(この場合はHsp90)の濃度は、異なる実験プロトコールおよび標的物質(タンパク質/ペプチド/リガンド)の性質に応じて変化し得る。 - ガラスのシャーレを覆い、室温で30分間インキュベートする。標的分子を含む溶液を吸引し、50 μLの1x PBS(pH = 7.4)で3xをすすいでください。チップから1x PBS(pH = 7.4)溶液を吸引します。
- 50 μL のクエンチ 1 (1x PBS (pH = 7.4) 中の 3.9 mM アミノ-PEG5-アルコール) 溶液をチップに加えます。ガラスシャーレを覆い、室温で 15 分間インキュベートします。チップからクエンチ1溶液を吸引する。
- 50 μLのクエンチ2(1 Mエタノールアミン(pH=8.5))溶液をチップに加える。ガラスのシャーレを覆い、室温で15分間インキュベートする。チップからクエンチ2溶液を吸引し、50μLの1x PBSを使用してチップ5xをすすぎ、最後のPBS液滴をセンサーに残します。
3. 検体サンプルの調製
- 所望の濃度範囲のCdc37の分析物希釈シリーズを調製する。最初の実験では、25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM、1,000 nM、2,000 nM、3,000 nM、および 5,000 nM の濃度を使用しました。2番目の実験では、0.4nM〜200nMの範囲の異なる濃度セットを使用した。
- 信頼できるKD値を得るために、少なくとも8つの異なる分析物濃度を含むように実験を設計し ます。検体タンパク質の異なる希釈物を、較正に使用したものと同じ緩衝液中に調製し、標的タンパク質;ここでは1x PBS(pH = 7.4)です。
4. FEBデバイスへの活性化バイオセンサーチップのロード
メモ:FEBデバイスは、LEDライト表示を備えたリーダーと、バイオセンサーチップを挿入するためのカートリッジで構成されています。
- 標的タンパク質固定化後、活性化チップをUSB 経由で コンピュータに接続するデバイスのカートリッジに挿入します。チップの挿入後、緑色のLEDライトがリーダーに表示され、FEBデバイスが実験の準備ができていることを示します。FEBデバイスが接続されているコンピュータに、同社が提供する自動ソフトウェア( 材料表を参照)をインストールし、以下のように実験を段階的に監視します。
5. 実験を実行する
- 自動ソフトウェアの [実験の実行] モジュールを押し、再生またはその他の任意のプロトコル で 10 ポイント を選択します。次の詳細を入力します:オペレータ名、実験名、日付(例:Yana、Hsp90 + Cdc37、14.03.2021)。再生バッファ(例えば、PBSバッファ);固定化された標的(例えば、Hsp90);溶液中の分析物(例えば、Cdc37)。詳細については 、補足図 S1 を参照してください。
- ソフトウェアに表示される [実験の開始] ボタンを押し、以下で説明するように、自動ソフトウェアによって示される指示に従います。
注:ソフトウェアは完全に自動化され、ユーザーフレンドリーで、実験を段階的にガイドします。ポップアップウィンドウが画面に表示され、実験の各ステップでさらに進むように指示されます。ソフトウェアは、実験全体を通して、各分析物濃度の較正、分析物の関連付け、解離、再生、および洗浄(5倍)から連続して、各反復ステップの指示を提供します。 - 機器のキャリブレーションを実行します。これを行うには、チップから残りのPBS溶液を吸引し、50 μLのキャリブレーションバッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。 続行 ボタンを押し、キャリブレーションステップが完了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、キャリブレーションステップ(5分)用に決定されたエンドポイントを、フォローアップするための警告アラームとともに表示します。
- 次に、検体会合を行う。これを行うには、チップから校正バッファーを吸引し、最低分析物濃度(25 nM の Cdc37)を 50 μL 塗布します。 [続行] ボタンを押し、関連付けの手順が完了するまで 5 分間待ちます。ソフトウェアは、アソシエーション・ステップ(5分)のエンドポイントを表示し、続行する警告アラームを表示します。
- 分析物の解離を行う。これを行うには、チップから分析物溶液を吸引し、50 μLの解離バッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。 [続行] ボタンを押し、解離ステップの継続時間(5分)が終了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、解離ステップ(5分)のエンドポイントを警告アラームとともに表示し、フォローアップします。
- 次に、チップ再生を行います。解離溶液をチップから吸引し、50 μLの再生バッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。 [続行] ボタンを押し、再生ステップの継続時間(30秒)が終了するまで30秒間待ちます。ソフトウェアは、再生ステップ(30秒)のエンドポイントを、フォローアップするための警告アラームとともに表示します。
- 最後に、チップを洗う。再生溶液をチップから吸引し、50 μLの洗浄バッファー(1x PBS、pH = 7.4)をチップに塗布します。チップから溶液を吸引し、これを5回繰り返します。チップ上の洗浄バッファの最後の一滴を残して 続行 ボタンを押し、ソフトウェアディスプレイで洗浄ステップの持続時間が終了するまで30秒間待ちます。
メモ: ソフトウェアは、洗浄ステップ(30秒)のエンドポイントを警告アラームとともに表示し、実験の次のサイクルに進みます。 - 使用する各分析物濃度について手順を繰り返します。較正、分析物の会合、解離、再生、および洗浄の5つのステップ(5x)は、1サイクルを構成する。ここに示す実験では、10の分析物濃度(25nM~5,000nMまたは0.4nM~200nMの範囲; 図2)。
6. 分析
- 実験終了時に自動 解析 ソフトウェアの上部にある解析ボタンを押します。すべての実験ポイントを含む表示ウィンドウが表示されます。ウィンドウで、所定のプロトコルに使用される分析物濃度が正しいことを確認します。
- [解析の実行] ボタンを押して、KD 値を自動的に生成します。ソフトウェアは、平衡時の解離定数KD値が計算される対応するI-応答に対して分析物濃度をプロットすることによってヒルフィットプロットを生成します。
- 生データを他の統計解析ソフトでエクスポートするには、下記のデータレビュー/エクスポートソフトを使用します。
- 実験の終了時に自動的に作成されたR1Rファイル(Hsp90 + Cdc37 14.03.2021など)をデスクトップ上の新しいフォルダにコピーします。会社が提供する データレビュー/エクスポート ソフトウェアを開きます( 補足図S2Aを参照)。
- [データ処理>プロセスR1Rファイル]をクリック>、データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で[OK]をクリックします。
- 手順6.3.1でデスクトップ上に作成したR1Rファイルを含むフォルダを選択します。 をクリックし、OK ボタンを押します。これにより、元のR1Rデータのコピーが作成され、元のファイルを上書きせずにデータを確認および編集できます。
- データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面に表示されるデータ処理アイコンを押します。 OKに「処理済みR1Rファイルのロード」>押します。手順6.3.1で作成した、処理済みのR1Rファイルを含む同じフォルダを選択します。 OKを押します。この手順では、実験ファイルを含むフォルダーを確認する準備が整います。
- データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で、 データ分析を押します。 「キャリブレーション>編集したR1Rファイルのキャリブレーション」>「OK 」を選択します( 補足図S2Bを参照)。このステップは、第1のキャリブレーションステップに従って全てのデータポイントを較正し、ベースラインを作成する。
- データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で、 データ分析を押します。[ R1Rファイルの確認と編集]>[OK]を選択します。データ ポイントの確認、ポイントの削除、または [ステップの追加 /追加] ボタンを使用したステップの追加を行います 。キャリブレーションステップがベースライン上にある、アソシエーションステップがピークにあるなど、すべてのステップが正しい場所にあることを確認し( 補足図S3を参照)、 保存 ボタンを押してすべての変更を保存します。
- データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で、 データ分析を押します。 [データの分析/プロット]を選択し、エクスポートするステップを選択します( 補足図S4を参照)。データをエクスポートする前に、キャリブレーションステップ(ステップ1、ステップ6など)を減算した後、各関連付けステップ(ステップ2、ステップ7など)をエクスポートリストに追加します。
- [このデータのエクスポート] を押します。ソフトウェアは、各トランジスタからの各分析物濃度データポイントのI応答を含むスプレッドシートファイルを生成します(すべてのトランジスタが動作している場合、各濃度ポイントに対して3つの異なるI応答値が得られます)。このスプレッドシートファイルを使用して、統計ソフトウェアでデータをさらに分析します。
- 統計解析ソフトウェアを開きます。3 つの Y 値を持つ XY 表を作成します。 [作成] を押します。この表のデータ (X、Y 値) は、ステップ 6.3.8 で作成したスプレッドシート・ファイルからコピーされます。x軸は分析物濃度(使用した濃度に応じて)に対応し、3つのY値は同社が提供する データレビュー/エクスポート ソフトウェアから取得したI-Responsesに対応します。
- [このデータの分析] を押します。1つのサイト>結合飽和度>合計>非線形回帰(カーブフィット)>XY分析を選択します。ソフトウェアは自動的にデータを分析し、KD値を生成し、データポイントのグラフを作成します。
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Representative Results
実験1の結果:
標的タンパク質Hsp90(500nM)を、上記のような標的固定化プロトコルに従ってチップに固定化した。最初の実験のために、25nM〜5,000nMの範囲の10濃度の分析物タンパク質Cdc37を、文献で入手可能なデータに基づいて調製した( 表1参照)。
実験のステップは、I応答で起こる変化を追跡することによってリアルタイムで監視することができます(図3A)。プロトコルに含まれる各ステップが実験全体を通してI応答にどのように影響するかを視覚化できます。たとえば、キャリブレーション中にI-応答はゼロに近く、アソシエーションステップでは、分析物(Cdc37)濃度の増加とともにI-応答が徐々に増加します。この実験のデータ(図3A)を見ると、低い分析物濃度(25nMで50BU)でI-Responseの急激な増加が観察されました。低い分析物濃度では低いI-Responseが予想され、濃度の増加とともに徐々に増加します。この急激な増加は、より低い分析物濃度点を含む実験を設計するべきであることを示唆した。
上記で説明したプロトコル手順に従って、提供された自動解析ソフトウェアでデータが解析され、計算されたKD 値を持つヒルフィットプロットが自動的に生成されました(図3B)。最初の実験の自動分析ソフトウェアから計算されたKD 値は、350,000±76,000μMであった。一般的な生物学的相互作用のほとんどは、低μMまたはnM範囲のKD 値を示した。したがって、最初の実験のために生成されたKD 値は非常に高いです。
観察された高いKD 値についてはいくつかの説明があり得る:研究された2つの特定のタンパク質(Hsp90/Cdc37)の間には低親和性結合が存在する可能性があり、これは分子相互作用に高いリガンド濃度が必要であることを意味する。実験は、非理想的で範囲外の分析物濃度で設計されている可能性があります。高い値は、解析ソフトウェアのフィッティングモジュールで使用される組み込みパラメータが原因である可能性があります。自動分析ソフトウェアは、線量反応分析モジュールを使用してデータポイントを適合させますが、一部の交互作用はこのモデルにうまく適合しない可能性があるため、誤ったデータが生成され、KD値が高く なります。
飽和ヒルプロットを用いて正確なKD値を得るためには、低い分析物濃度の点と高い分析物濃度の点の両方を含む試行錯誤による実験の標準化が必要であり、低い誤差率で最も低いKD値を取得する。
これらすべての要因を考慮して、分析ソフトウェアからのデータは追加の統計分析ソフトウェアにエクスポートされました。各関連ポイントのI-Responseは、自動データレビュー/エクスポートソフトウェアを使用して抽出され、分析ステップ(ステップ6)で上で説明したステップに従って 表2 に要約されます。
統計解析ソフトウェアの結果(図3C)は、比較的低いKD 値を示し、高い標準偏差(0.011 ± 0.494 μM)および低いR2 値0.78を示した。KD 値および低いR2 値に観察された有意な変動は、この実験のために選択された濃度点が最適ではないことを示唆した。さらに、一部のグラフポイントがプロット近似曲線にうまく適合していないことにも気付きました(図3C)。これにより、異なる分析物濃度ポイントを含めることによって2番目の実験を設計する必要性が強化されました。
2つの解析ソフトウェアで使用される組み込みパラメータはまったく異なり、KD 値生成プロセスに反映されます。2つの解析ソフトウェアから得られたKD 値(350,000 ± 76,000 μM対0.011 ± 0.494 μM)の違いは、計算に異なる解析モジュールが使用されたことに起因します。統計解析ソフトウェアで実行される解析は、この相互作用により適している可能性があり、したがって、KD 値が低くなります。
それにもかかわらず、両方の分析の結果を合わせると(350,000 ± 76,000 μMおよび0.011 ± 0.494 μM)、最初の実験は最適ではなく、追加の濃縮ポイントが必要であると結論付けることができます。
この点を検証するために、相関のないグラフ点から、3,000nMは除外した( 補足図S5参照)。分析の結果、KD 値は0.006±0.081μM、R2 値は0.98であった。これらの結果は、次の実験がより関連性の高い濃度に焦点を当てて設計されるべきであることを示した。そこで、予測KD以下およびそれ以上の濃度を有する異なる試験点を用いてHsp90/Cdc37 PPIを評価するために、第2の実験を実施した。
実験2の結果:
標的タンパク質を、Hsp90(500nM)を上記のようなプロトコルを用いてチップに固定化した。合計10濃度の分析物(Cdc37)を以下のように調製した:0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM、6.4nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、および200nM。2番目の実験は、上記のように前の実験から得られたすべての洞察を考慮することによって、異なる分析物濃度ポイントを含めることによって設計されました。
実験中、各ステップをリアルタイムでモニターした(図4A)。ここで、リアルタイムI-Responseグラフ(低濃度の分析物-0.4nM、0.6nM、1.6nMから導出)は、最初はゼロから始まり、最初の実験で観察されたI-Responseの急激な増加と比較して、実験の各サイクルにおける分析物濃度の増加時に徐々に増加する。
上記のプロトコルに従って、自動分析ソフトウェアを使用してデータを分析しました(図4B)。本実験の自動解析ソフトから算出したKD 値は0.0673±0.0002μMであり、標的タンパク質Hsp90と分析物Cdc37との強い相互作用が示唆された。0.0002 μMの標準偏差は、最初の実験で得られたものよりもはるかに小さかったため、新しいデータの信頼性がはるかに高いという自信が得られます。
この結果を検証するために、前述のように、データポイント(表3)を別の統計分析ソフトウェアにエクスポートしました。分析の結果を 図4Cにまとめた。
統計解析ソフトを用いて、Hsp90/Cdc37 PPIのKD 値は0.014 ± 0.005 μMであることがわかりました(図4C)。KD および標準偏差の低い値は、2つのタンパク質Hsp90およびCdc37間の強い相互作用を示す。さらに、150のR2 値は、分析が実験グラフ点に完全に適合することを示す。両方の解析ソフトウェアは結果に一貫性を示し、KD値はそれぞれ 約0.0673 ± 0.0002 μMおよび0.014 ± 0.005 μMでした。
実験の再現性と精度を確認するため、標的タンパク質としてHsp90(500nM)、分析物としてCdc37を用いた2回の複製で、2回目の実験で用いたのと同濃度の0.4nm~200nmの範囲で同様の実験を行った。実験中、各ステップをリアルタイムでモニターした(補足図S6Aおよび補足図S7A)。自動解析ソフトウェアから計算されたKD値は、補足図S6Bおよび補足図S7B(それぞれ0.053 ± 0.002 μMおよび0.0719 ±0.0007 μM)に示されている。前述のように、データポイントを別の統計分析ソフトウェアにエクスポートし(補足表S1および補足表S2)、その結果を補足図S6Cおよび補足図S7Cに示す(補足図S6C:KDは0.003±0.009μMであり、R2は0.99;補足図S7C:KDは0.004±0.009μMおよびR2は0.99)である。両方の解析ソフトウェアからの2回の反復の結果は、Hsp90/Cdc37 FEB実験データの精度、再現性、再現性を十分に裏付け、確認しました。
また、Hsp90と対照タンパク質であるウシ血清アルブミン(BSA)との生体分子相互作用を解明した対照研究も行った。BSAを分析物として用いた対照研究は、2回目の実験で用いた同一の実験セットアップおよび分析物濃度を用いて行った。0.4 nM~200 nMの範囲のコントロールタンパク質BSAを1x PBS(pH = 7.4)で合計10濃度のコントロールタンパク質を調製し、実験の各ステップをリアルタイムでモニターした。
Hsp90とCdc37の実験と同様に、リアルタイムI応答グラフは最初は0から始まります。しかしながら、対照試験では、I-Responseは検体濃度の増加時に徐々に増加しなかった(補足図S8A)。また、自動解析ソフトを用いてデータを解析したところ(補足図S8B)、本実験のデータ点からKD値を算出することができなかった。ソフトウェアから生成されたヒルプロットから、Hsp90と対照BSA分析物との間に相互作用がないことが証明されています。この結果を検証するために、前述のように、データポイント(補足表S3)を別の統計分析ソフトウェアにエクスポートしました。統計解析ソフトを用いて、Hsp90/BSA PPIのKD値が負であることがわかった(補足図S8C;KDは-0.009±-0.0003 μM)であり、再びHsp90とBSAの2つのタンパク質の間に相互作用がないことを示している。また、R2値(0.82)は、分析が実験グラフ点に合わなかったことを示す。両方の分析ソフトウェアは、Hsp90とBSAが相互作用しないという結果に一貫性を示した。
Hsp90/Cdc37 FEBの実験データを文献で入手可能な他の実験データと比較すると、本研究で得られたKD値(KD = 0.014 ± 0.005 μM、KD = 0.053 ± 0.002 μM、およびKD = 0.072 ± 0.001 μM)は、以前に発表されたデータ(KD = 1.46 μM 38または6 μM 39).これらの相違は、現在の実験における完全長ヒトHsp90およびCdc37構築物の使用に起因する可能性がある。以前の研究は、部分タンパク質38またはC.エレガンスホモログタンパク質39のみを含む酵母Hsp90構築物について実施した(表1)。FEBシステムで得られた結果を検証するために、ITC実験を行った。
ITC システムを使用した Hsp90/Cdc37 PPI の評価:
ITCは、生体分子相互作用を調査するためのゴールドスタンダードと考えられています。我々はさらに、Hsp90/Cdc37 PPIの熱力学的動力学を決定するためにITCを行い、FEB実験の検証を行った。Hsp90およびCdc37をITCの前にPBS(pH=7.0)に対して透析に供する。熱量滴定のために、標的タンパク質(Hsp90)の約0.25 μM溶液および分析物タンパク質(Cdc37)の2.5 μM溶液をPBS中に調製した。連続した間隔で80 μLのCdc37溶液の全量を回転シリンジから、298.15 Kで150 μLのHsp90溶液を含む細胞に滴定した。各注射は4秒の持続時間にわたって行われ、連続した注射間の時間間隔は150秒であった。それぞれ2 μLの注射を合計19回行い、それぞれ攪拌速度500rpm、基準出力41.9 μWで行った。Hsp90/Cdc37相互作用による熱変動をモニターし、Cdc37分析物注入の終了時に得られた最終データを、同社が提供するITC分析ソフトウェアを用いて適合させた。Hsp90/Cdc37 PPI間のモルエンタルピー変化(ΔH)、エントロピー変化(ΔS)、結合部位数(n)、平衡解離定数(KD)などの熱力学的パラメータとともに熱変動を推定した。ギブス自由エネルギー変化(ΔG)も、ITCサーモグラムから熱パラメータを得た後の式ΔG=ΔH-TΔSから計算した。
ITCプロットは、PPI40を支配する相互作用および分子間力の性質を解明するために、生物学的相互作用中に使用または解放された熱の量を明らかにする。Cdc37(2.5 μM)をHsp90(0.25 μM)に滴定し、対応する曲線を 図5A、Bに示します。得られたITCプロットは発熱性であることが判明し、結合エネルギー、ΔG=-45.9 kJ/mol、KD 値=0.009 μMの結合化学量論(n)を示す単一結合部位モデルに適合させた。ITCサーモグラムの開始時に吸熱シフトの形で観察されたわずかな不整合(図5A)は、測定セル41、42に分析物タンパク質を滴定しながら気泡が形成されたことを示唆している。Hsp90/Cdc37 PPIのうち、低濃度および高濃度で行われたITC実験では、10倍過剰のCdc37(Hsp90濃度=0.25μMおよびCdc37濃度=2.5μM)は、飽和曲線を得ることによって許容可能な結合パラメータを示した。ITCから得られたKD 値(KD = 0.009 μM)は、FEB技術を用いて計算されたKD 値(KD = 0.014 μM、0.053 μM、および0.072 μM)とよく相関しており、Hsp90/Cdc37 PPIの検出におけるFEBの感度と精度を強く支持しています。
図 2: プロトコルの概要。 (A) チップのアクティブ化プロセスの手順の概要。(B)プロトコルにおける5つの反復ステップのグラフィカル表現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:実験1から生成されたデータファイル (A)リアルタイムで監視された実験データ。y軸はバイオセンサーユニット(BU)のI応答に対応し、x軸は実験における分析物の異なる時点と濃度に対応します。この図は、最初の実験からのデータに対応する。(B)自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロット。y軸はI応答に対応し、x軸はnM中の分析物(Cdc37)の濃度に対応する。この実験では、KD 値は350,000±76,000μMであり、(C)統計解析ソフトウェアを使用して生成された関連プロット。y軸は関連相の終了時のI-Responseに対応し、x軸は異なる分析物Cdc37濃度に対応します。このプロットは、 表2に提供されたデータ点を使用して生成されました。分析結果の概要はグラフに示されています。この実験では、KD 値は0.011±0.494μMであり、R2 値は0.78である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:実験から生成されたデータファイル 2. (A) リアルタイムで監視された実験データ。y軸はバイオセンサーユニット(BU)のI応答に対応し、x軸は実験における分析物の異なる時点と濃度に対応します。この図は、2回目の実験からのデータに対応する。(B)自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロット。y軸はI応答に対応し、x軸はnM中の分析物(Cdc37)の濃度に対応する。この実験では、KD 値は0.0673±統計解析ソフトウェアを使用して生成された0.0002μM(C)アソシエーションプロットです。y軸は関連相の終端におけるI-Responseに対応し、x軸は異なる分析物Cdc37濃度に対応する。このプロットは、 表3に提供されたデータ点を使用して生成されました。分析結果の概要はグラフに示されています。この実験では、KD 値は0.014±0.005μMであり、R2 値は0.99である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Hsp90とCdc37相互作用のITCサーモグラム。 (A)トップパネルは、Cdc37(2.5μM)を298.15KでHsp90(0.25μM)に連続して注入することによって得られた対応する熱進化曲線を表す。差動電力(DP)は、差動電力を時間の関数として表します。(B) 下部パネルの積分データ ポイントは、Hsp90/Cdc37 のモル比に対する対応する正規化された熱を示します 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| アッセイの実行 | 2月分析KD | プリズム解析KD | 原点の構築 | アミノ酸 | 参照 |
| ティッカー | 1.46 μM、および 1.32 μM | ティッカー | 酵母 Hsp90 | Hsp90のN末端ドメイン | 36 |
| ヒト Cdc37 | |||||
| ティッカー | 6 μM | ティッカー | C. エレガンス | 全長 | 37 |
| 2月 - 最初の繰り返し | 0.014 μM | 0.067 μM | ヒト Hsp90 | 全長 | この研究で実施 |
| ヒト Cdc37 | |||||
| 2月 - 2回目の繰り返し | 0.053 μM | 0.003 μM | ヒト Hsp90 | 全長 | この研究で実施 |
| ヒト Cdc37 | |||||
| 2月 - 3回目の繰り返し | 0.072 μM | 0.004 μM | ヒト Hsp90 | 全長 | この研究で実施 |
| ヒト Cdc37 | |||||
| ティッカー | 0.009 μM | ティッカー | ヒト Hsp90 | 全長 | この研究で実施 |
| ヒト Cdc37 | |||||
| 2月 - 対照研究 | データがありません (KD を計算するのに十分なデータがありませんでした) | -0.009 μM (負の値を持つ KD 値は相互作用がないことを示します) | ヒト Hsp90 | 全長 | この研究で実施 |
| ティッカー |
表1:本研究および文献で報告された異なる方法を用いたHsp90/Cdc37 PPI評価。
| 分析物濃度(nM) | I応答トランジスタ1 | I応答トランジスタ2 | I応答トランジスタ3 | 平均 |
| I-レスポンス | ||||
| 25.00 | 53.540 | 49.406 | 50.590 | 51.178 |
| 50.00 | 71.427 | 65.943 | 67.568 | 68.313 |
| 100.00 | 85.305 | 79.226 | 81.074 | 81.868 |
| 200.00 | 106.652 | 99.320 | 101.502 | 102.491 |
| 400.00 | 122.572 | 114.837 | 117.128 | 118.179 |
| 800.00 | 144.293 | 136.374 | 138.872 | 139.846 |
| 1000.00 | 135.165 | 128.657 | 130.425 | 131.416 |
| 2000.00 | 164.487 | 159.401 | 161.697 | 161.862 |
| 3000.00 | 109.997 | 106.705 | 107.205 | 107.969 |
| 5000.00 | 282.637 | 274.207 | 276.247 | 278.422 |
表2:最初の実験の各濃度点で各チップの3つの異なるトランジスタから生成されたI-Response値の要約。
| 分析物濃度(nM) | I応答トランジスタ1 | I応答トランジスタ2 | I応答トランジスタ3 | 平均I応答 |
| 0.40 | 13.097 | 14.721 | 11.714 | 13.177 |
| 0.80 | 10.183 | 8.861 | 13.240 | 10.762 |
| 1.60 | 24.826 | 20.377 | 25.240 | 23.481 |
| 3.20 | 40.746 | 41.047 | 40.783 | 40.858 |
| 6.40 | 54.938 | 54.224 | 54.913 | 54.691 |
| 12.80 | 83.057 | 81.452 | 82.596 | 82.369 |
| 25.60 | 110.440 | 109.152 | 110.343 | 109.978 |
| 51.20 | 141.161 | 140.363 | 141.125 | 140.883 |
| 102.40 | 164.215 | 162.679 | 164.572 | 163.822 |
| 200.00 | 196.373 | 197.007 | 198.495 | 197.292 |
表3:第2の実験の各濃縮点で各チップの3つの異なるトランジスタから生成されたI-Response値の要約。
補足図S1:実験開始前の自動化ソフトウェアのメイン画面のスクリーンショット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:データ処理および分析のための自動ソフトウェアのメイン画面のスクリーンショット。(A) データ処理オプションを示すデータレビュー/エクスポートソフトウェアのメイン画面表示。 (B) データレビュー/エクスポートソフトウェアのメイン画面表示で、データ分析オプションを表示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:レビュー/エクスポートソフトウェアから取得したレビューデータポイント。 この手順では、実験を確認し、データ ポイントを追加または削除します。関連付けポイント (2、7、12、17、22 など) が常にピックにあることを確認します。たとえば、左から最初に選んだのはデータ ポイント番号 2 で、次にデータ ポイント番号 10 です (ただし、番号 7 にする必要があります)。これを解決するには、ポイント3、4、および5を削除するだけです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:例えば、データ・リストのエクスポート。 この手順では、エクスポートする実験ポイントを選択します。関連付けポイント (2、7、12、17、22 など) を選択し、前のキャリブレーション手順 (1、6、11、16、21 など) を減算します。エクスポート リストにすべてのポイントを追加し、このデータをエクスポートして、各データ ポイントの I-Response を含むスプレッドシートを取得します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S5:統計解析ソフトウェアを用いて生成された関連プロット。 y軸は関連相の終端におけるI-Responseに対応し、x軸は異なる分析物Cdc37濃度に対応する。このプロットは、最初の実験からのデータポイントを使用して生成され、3,000nM濃度データポイントを除外した。分析結果の概要はグラフに示されています。この実験では、KD 値は0.006±0.081μMであり、R2 値は0.98である。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S6:実験2から生成されたデータファイルは1を複製する。(A)リアルタイムで監視される実験データ。y軸はバイオセンサーユニット(BU)のI応答に対応し、x軸は実験における分析物の異なる時点と濃度に対応します。この図は、Hsp90をチップ上に固定化し(500nM)、10濃度のCdc37分析物を調製した(0.4-200nM)第2の実験で行った2回目の繰り返しのデータに対応する。リアルタイムI-Responseグラフは、最初は0から始まり、実験の各サイクルで分析物濃度が増加すると徐々に増加し、実験が成功したことを示唆しています。(B)自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロット。y軸はI応答に対応し、x軸はnM中の分析物(Cdc37)の濃度に対応する。自動分析の結果は、KD値が比較的低く、標準偏差が0.0531 ±0.0002 μMと低く、Hsp90とCdc37の間に強い相互作用があることを示唆した。y軸は関連相の終端におけるI-Responseに対応し、x軸は異なる分析物Cdc37濃度に対応する。このプロットは、表S1に提供されたデータ点を使用して生成されました。分析結果の概要はグラフに示されています。この実験では、KD値は0.003±0.009μMであり、R2値は0.99である。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S7:実験2から生成されたデータファイルは1を複製する。(A)リアルタイムで監視される実験データ。y軸はバイオセンサーユニット(BU)のI応答に対応し、x軸は実験における分析物の異なる時点と濃度に対応します。この図は、Hsp90をチップ上に固定化し(500nM)、10濃度のCdc37分析物を調製した2回目の実験(0.4-200nM)の3回目の繰り返しのデータに対応する。(B)自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロット。y軸はI応答に対応し、x軸はnM中の分析物(Cdc37)の濃度に対応する。自動分析の結果、KD値は比較的低く、標準偏差は0.0719 ±0.0007 μMと低く、Hsp90とCdc37の間に強い相互作用があることが示唆された。Y 軸は、アソシエーション フェーズの終了時の I 応答に対応します。x軸は、異なる分析物Cdc37濃度に対応する。このプロットは、表S2に提供されたデータ点を使用して生成されました。分析結果の概要はグラフに示されています。この実験では、KD値は0.004±0.009μMであり、R2値は0.99である。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S8:対照実験から生成されたデータファイル。 (A)リアルタイムで監視される実験データ。y軸はバイオセンサーユニット(BU)のI応答に対応し、x軸は実験における分析物の異なる時点と濃度に対応します。この図は、Hsp90をチップ上に固定化し(500nM)、10濃度のBSA(対照タンパク質)検体を調製した対照実験(0.4-200nM)のデータに相当する。リアルタイムI応答グラフは、10-15 BU付近の低いI-Responseから始まり、実験の各サイクルで分析物濃度が増加しても増加しないため、Hsp90とBSAの間に相互作用がないことが示唆されます。(B)自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロット。Y 軸は I 応答に対応します。x軸は、nM単位の分析物(BSA)の濃度に対応する。自動分析の結果は、Hsp90とBSAの間に相互作用がないことを示唆するKD 値を計算するには不十分なデータがあることを示した。(c)統計解析ソフトを用いて生成した関連プロット。y軸は関連相の終端におけるI応答に対応し、x軸は異なる分析物BSA濃度に対応する。このプロットは、 表S4に提供されたデータ点を使用して生成されました。分析結果の概要はグラフに示されています。この実験では、KD 値は-0.009±-0.0003μMであり、R2 値は0.82である。ゼロに近い負のKD 値は、Hsp90とBSAの間に相互作用がないことを示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1: 各濃度点で生成され、各チップのトランジスタ(各チップの3つの異なるトランジスタ)から読み取られたI応答値の概要。この表は、Hsp90をチップ上に固定化し(500nM)、10濃度のCdc37分析物を調製した(0.4-200nM)第2の実験に対して行われた第2の繰り返しから抽出されたデータに対応する。この表のデータポイントは、統計解析ソフトウェアでの分析に使用されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2: 各濃度点で生成され、各チップのトランジスタ(各チップの3つの異なるトランジスタ)から読み取られたI応答値の概要。この表は、Hsp90をチップ上に固定化し(500nM)、10濃度のCdc37分析物を調製した(0.4-200nM)第2の実験に対して行われた第3の繰り返しから抽出されたデータに対応する。この表のデータポイントは、統計解析ソフトウェアでの分析に使用されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S3: 各濃度ポイントで生成され、各チップのトランジスタ(各チップに3つの異なるトランジスタ)から読み取られたI-Response値の概要。この表は、Hsp90をチップ上に固定化し(500nM)、10濃度のBSA分析物を調製した対照実験(0.4-200nM)のデータに対応する。この表のデータポイントは、統計解析ソフトウェアでの分析に使用されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、Hsp90とCdc37との間の生体分子相互作用を決定するために、FEB技術(リアルタイム動態特性評価アプローチ)を使用することの実現可能性を評価した。最初の探索的実験(最初の実験)は、適切な分析物濃度の選択が実験の重要な部分であり、文献で入手可能なデータに基づいて予測されたKD 値の上下の濃度点を含めることによって実験を設計するべきであることを示唆した。
それにもかかわらず、相互作用に関する予備的な情報がない場合は、低い範囲(0.08nM、0.16nM、0.4nM、2nM)とより高い範囲(1,000nM、2,500nM、5,000nM)の両方の広い範囲の濃度点を含めることによって予備実験を設計することをお勧めします。予備実験は、 KD値の大まかな推定値を提供し、正確なKD 値を得るために適切な濃度範囲を使用して後続の実験を計画することを可能にする。FEBシステムは、実験の濃度点の数を自由に選択できる編集プロトコル機能を提供します。
私たちの経験から、FEBプロトコルに関連する最も重要なステップは次のとおりです。標的タンパク質および分析物緩衝液は、較正緩衝液と同じであるべきである。バッファの不一致が小さくても、I応答に変動が生じ、信頼性の低い結果が生じる可能性があります。従って、適切なバッファー交換により一晩透析を行うことを提案する。溶液を吸引または塗布しながらバイオセンサーチップに慎重にピペッティングすることは、実験全体を通して重要です。不注意なピペッティングは、トランジスタの破損やI応答の変動につながる可能性があります。ピペッティング中は、チップの敏感な表面に触れないようにしてください。チップの活性化プロセスで使用されるEDC/スルホ-NHS溶液は、使用する前に新鮮な状態で混合する必要があります。古い混合物を使用すると、非機能化されたチップが発生する可能性があります。実験のすべてのサイクルに含まれる 5 つの反復ステップ (キャリブレーション、アソシエーション、解離、再生、洗浄) すべてに同じバッファーを使用してください。
FEBをBLIやSPRなどの現場で十分に確立された生体分子検出システムと比較すると、3つの方法すべてが同様の利点43,44,45を共有していることがわかりました。小さなnM範囲でも相互作用を検出できます。チップはSPRとFEBの両方で再利用可能で、最大10回の実験で効率的に再生および再利用でき、3つの方法はすべてリアルタイムで動力学的データを提供し、実験時間は短いです。
SPRの主な利点は、実験からより広範なデータを提供し、KD、Kon、Koff、化学量論、および熱力学的パラメータ44を計算できることである。BLIの主な利点は、1回の実験で複数の濃度を試験できることです。動力学的測定は、異なるセンサを使用して最大8つの濃度に対して同時に行うことができます。しかし、BLIセンサーは再利用可能ではないため、実験のコストは非常に高い43。
FEBの主な利点は、実験全体を通してユーザーを導く自動化されたユーザーフレンドリーなソフトウェアと、ユーザーが各ステップで固定化ターゲットに分析物を追加できるオープンハンドピペッティングプラットフォームです。このオープンピペッティングアプローチとシンプルなソフトウェアを組み合わせることで、FEBは習得が容易になり、トレーニングはほとんどまたはまったく必要ありません。しかし、それはユーザーが手ピペッティングの基本的な習得を持っている必要があり、自動化された液体処理の欠如は、ステップタイミングの再現性がユーザーに完全に依存することを意味します。統合された液体処理のこの同じ欠如は、チップおよび装置がSPRまたはBLIと比較して費用対効果が高いことを意味する。FEBはまた、バイオセンサチップ調製物35に関与する定義された製造プロセスのために、生体分子相互作用を検出する際に高い再現性および信頼性を示す。
十分に確立された標準的なITC検出法と比較して、FEBは実験全体でナノモル濃度でわずか50μLの分析物量を使用し、タンパク質の核生成または凝集の可能性を低減します。ITCの最大の問題の1つは、気泡を避けるためにロードする前にタンパク質を脱気することです。ITC実験中、連続的な攪拌および激しいパージのために測定セル内で気泡が発達する可能性があり、これは試料溶液に悪影響を及ぼしたり、試料損失42を引き起こしたりする可能性がある。FEB技術は、堅牢なターゲット固定化化学を提供し、凝集とバブリングを低減し、安定性を高め、ITCが直面する濃度依存の問題を改善することによって、ITCのこれらの課題を克服します。
FEBデバイスの潜在的な欠点は、バッファー組成および濃度変化に対する感受性であり、その結果のフィッティングおよび分析中に補正する必要があるベースラインのドリフトを引き起こす可能性があることです。バイオセンサーチップはpHと塩分にも敏感であるため、分析物の校正および測定時に使用されるバッファーは、実験中ずっと同じでなければなりません。防腐剤として使用される化学物質(例えば、アジ化ナトリウム)および疎水性分子は、センサを損傷する可能性があり、非特異的結合の増加を引き起こすことさえあり得る。これらの欠点は、測定ステップ全体にわたるバッファーの一貫性、分析物ストックからの干渉化合物の透析、および表面の適切な不動態化(例えば、洗剤、タンパク質ブロッカー、または異なるPEG分子の使用)に注意を払って軽減することができる。
要約すると、我々はFEB技術を用いてHsp90/Cdc37間の強力なPPIを実証することに成功し、ITCを用いてそれらの相互作用を検証し、PPI検出のための革新的な代替方法としてFEBをサポートするための有望なデータを提供しました。FEB技術は、インビトロの生物学的活性をインビボの有効性に容易に変換することにより、創薬、医薬品、低分子、ペプチド、タンパク質の生体分子分析、抗体開発、薬物検証、リード最適化の多様な分野で幅広いアプリケーションを提供します。FEB技術の利点と、PPI、タンパク質、DNAまたはRNA相互作用、ならびにタンパク質と低分子(例えば、薬物)相互作用の探索におけるその巨大な用途を考慮して、我々は、PPI検出ツールボックスにおけるユニークで有望な技術であることを提案します。我々の例では、FEB技術は、Hsp90/Cdc37 PPI候補アンタゴニストの結合有効性を容易に評価するための貴重なツールを提供し、このPPIが重要な様々な疾患に関するさらなるインビトロおよびインビボ評価のための有望な候補を選択するのに役立つ。
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Disclosures
著者らは、金銭的またはその他の利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、バイナショナル科学財団(BSF)からS.K.S.とN.Q.への助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated analysis software | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis. |
| COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
biosensor chip |
| Data review software | Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points. |
| Dialysis bag | CelluSep, Membrane filtration products | T2-10-15 CAS number: NA |
T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m) |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) | Cardea (Nanomed) | EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8 |
White powder |
| ITC (Isothermal titration calorimetry) system | Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) | NA CAS number: NA |
|
| MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer | Merck | M3671-50G CAS number: 4432-31-9 |
White powder |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips | Cardea (Nanomed) | NA CAS number: NA |
Graphene-based chip |
| PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 | Bio-Lab | 001623237500 CAS number: 7758-11-4 |
Liquid transparent solution |
| Pipete | Thermo Scientific | 11855231 CAS number: NA |
Finnpipette F3 5-50 µL, yellow |
| Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-002-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) | Cardea (Nanomed) | 0105-001-003-001 CAS number: NA |
Liquid, transparent solution |
| Recombinant protein Cdc37 | Abcam | ab256157 CAS number: NA |
|
| Recombinant protein Hsp90 beta | Abcam | ab80033 CAS number: NA |
|
| Spreadsheet | Excel, Microsoft office | NA CAS number: NA |
|
| Statistical software | GraphPad, Prism | NA CAS number: NA |
Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used |
| Sulfo-NHS | Cardea (Nanomed) | NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7 |
White powder |
| Tips | Alex red | LC 1093-800-000 CAS number: NA |
Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs |
References
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