Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Field-Effect Biosensing (FEB) ist eine markierungsfreie Technik zum Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. Es misst den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Die FEB-Technologie wurde verwendet, um biomolekulare Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bewerten und eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen wurde nachgewiesen.

Abstract

Biomolekulare Wechselwirkungen spielen in zahlreichen zellulären Prozessen eine vielseitige Rolle, indem sie funktionell relevante biologische Ereignisse regulieren und koordinieren. Biomoleküle wie Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine, Fettsäuren, Nukleinsäuren und Enzyme sind grundlegende Bausteine von Lebewesen; Sie fügen sich zu komplexen Netzwerken in Biosystemen zusammen, um eine Vielzahl von Lebensereignissen zu synchronisieren. Proteine nutzen typischerweise komplexe Interaktomnetzwerke, um ihre Funktionen auszuführen; Daher ist es zwingend erforderlich, solche Wechselwirkungen zu bewerten, um ihre Bedeutung in Zellen sowohl auf zellulärer als auch auf organismischer Ebene zu entschlüsseln. Um dieses Ziel zu erreichen, führen wir eine schnell aufstrebende Technologie ein, die Feldeffekt-Biosensorik (FEB), um spezifische biomolekulare Wechselwirkungen zu bestimmen. FEB ist eine Benchtop-, markierungsfreie und zuverlässige biomolekulare Detektionstechnik zur Bestimmung spezifischer Wechselwirkungen und verwendet hochwertige elektronisch-basierte Biosensoren. Die FEB-Technologie kann aufgrund der biokompatiblen Nanomaterialien, die auf ihrer Biosensoroberfläche verwendet werden, Wechselwirkungen im nanomolaren Bereich überwachen. Als Proof of Concept wurde die Protein-Protein-Interaktion (PPI) zwischen Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) und Zellteilungszyklus 37 (Cdc37) aufgeklärt. Hsp90 ist ein ATP-abhängiges molekulares Chaperon, das eine wesentliche Rolle bei der Faltung, Stabilität, Reifung und Qualitätskontrolle vieler Proteine spielt und dadurch mehrere lebenswichtige Zellfunktionen reguliert. Cdc37 gilt als Proteinkinase-spezifisches molekulares Chaperon, da es spezifisch Proteinkinasen zu Hsp90 erkennt und rekrutiert, um ihre nachgeschalteten Signaltransduktionswege zu regulieren. Daher gilt Cdc37 als Co-Chaperone von Hsp90. Der Chaperon-Kinase-Signalweg (Hsp90/Cdc37-Komplex) ist bei mehreren Malignomen, die das Zellwachstum fördern, hyperaktiviert; Daher ist es ein potenzielles Ziel für die Krebstherapie. Die vorliegende Studie demonstriert die Effizienz der FEB-Technologie anhand des Modellsystems Hsp90/Cdc37. FEB wies einen starken PPI zwischen den beiden Proteinen nach (K-D-Werte von 0,014 μM, 0,053 μM und 0,072 μM in drei unabhängigen Experimenten). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FEB eine markierungsfreie und kostengünstige PPI-Erkennungsplattform ist, die schnelle und genaue Messungen ermöglicht.

Introduction

Biomolekulare Wechselwirkungen:
Proteine sind wesentliche Bestandteile von Organismen und an zahlreichen molekularen Signalwegen wie Zellstoffwechsel, Zellstruktur, Zellsignalisierung, Immunantwort, Zelladhäsion und mehr beteiligt. Während einige Proteine ihre Funktion(en) unabhängig voneinander ausführen, interagieren die meisten Proteine mit anderen Proteinen über eine Bindungsgrenzfläche, um die richtige biologische Aktivität zu koordinieren1.

Biomolekulare Wechselwirkungen können hauptsächlich auf der Grundlage der unterschiedlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften der beteiligten Proteineklassifiziert werden 2, beispielsweise basierend auf den Proteinoberflächen, der komplexen Stabilität oder der Persistenz von Wechselwirkungen3. Die Identifizierung essentieller Proteine und ihrer Rolle in biomolekularen Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis biochemischer Mechanismen auf molekularer Ebene4. Derzeit gibt es verschiedene Ansätze, um diese Wechselwirkungen5 zu erkennen: in vitro 6, in silico7, in lebenden Zellen8, ex vivo 9 und in vivo10, wobei jede ihre eigenen Stärken und Schwächen hat.

Die In-vivo-Assays werden unter Verwendung des gesamten Tieres als experimentelles Werkzeugdurchgeführt 11, unddie Ex-vivo-Assays werden an Gewebeextrakten oder ganzen Organen (z. B. Herz, Gehirn, Leber) in einer kontrollierten äußeren Umgebung durchgeführt, wobei die natürlichen Bedingungen nur minimal verändert werden. Die häufigste Anwendung von In-vivo- und Ex-vivo-Studien besteht darin, die pharmakokinetischen, pharmakodynamischen und toxischen Wirkungen potenzieller pharmakologischer Wirkstoffe vor Studien am Menschen zu bewerten, indem ihre allgemeine Sicherheit und Wirksamkeit sichergestelltwird 12.

Biomolekulare Wechselwirkungen können auch innerhalb lebender Zellen nachgewiesen werden. Die Bildgebung lebender Zellen ermöglicht es uns, dynamische Wechselwirkungen zu beobachten, während sie die Reaktionen eines bestimmten biochemischen Weges ausführen13. Darüber hinaus können Detektionstechniken wie Biolumineszenz oder Fluoreszenzresonanz-Energietransfer Informationen darüber liefern, wo und wann diese Wechselwirkungen innerhalb der Zelle auftreten14. Obwohl der Nachweis in lebenden Zellen entscheidende Details bietet, stützen sich diese Nachweismethoden auf Optik und Markierungen, die möglicherweise nicht die native Biologie widerspiegeln. Sie sind auch weniger kontrolliert als In-vitro-Methoden und erfordern spezielles Fachwissen, um15 durchzuführen.

Die In-silico-Berechnungsmethoden werden in erster Linie für das groß angelegte Screening von Zielmolekülen vor den In-vitro-Experimenten eingesetzt. Computergestützte Vorhersagemethoden, computergestützte Datenbanken, molekulares Docking, quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und andere molekulardynamische Simulationsansätze gehören zu den etablierten In-silico-Werkzeugen 16. Im Vergleich zu mühsamen experimentellen Techniken können die In-silico-Werkzeuge leicht Vorhersagen mit hoher Empfindlichkeit, aber mit reduzierter Genauigkeit in der Vorhersageleistungtreffen 17.

In-vitro-Assays werden mit Mikroorganismen oder biologischen Molekülen außerhalb ihres biologischen Standardkontexts durchgeführt. Die Darstellung biomolekularer Interaktionen durch In-vitro-Methoden ist entscheidend für das Verständnis von Proteinfunktionen und der Biologie hinter dem komplexen Netzwerk der Zellfunktion. Die bevorzugte Assay-Methodik wird entsprechend den intrinsischen Eigenschaften des Proteins, den kinetischen Werten und dem Modus und der Intensität der Wechselwirkungenausgewählt 18,19.

Die Hsp90/Cdc37-Interaktion:
Der Chaperon-Kinase-Signalweg, der Hsp90 und Cdc37 verbindet, ist ein vielversprechendes therapeutisches Ziel in der Tumorbiologie20. Hsp90 spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Zellzyklus, der Proteinzusammenordnung, dem Zellüberleben und den Signalwegen. Proteine, die für ihre Funktionen auf Hsp90 angewiesen sind, werden zur Komplexierung durch ein Co-Chaperon wie Cdc37 an Hsp90 abgegeben. Der Hsp90/Cdc37-Komplex steuert die Faltung der meisten Proteinkinasen und dient als Drehscheibe für eine Vielzahl von intrazellulären Signalnetzwerken21. Es ist ein vielversprechendes Anti-Tumor-Ziel aufgrund seiner erhöhten Expression bei verschiedenen Malignomen, einschließlich akuter myeloblastischer Leukämie, multiplem Myelom und hepatozellulärem Karzinom22,23.

Häufig verwendete biomolekulare In-vitro-Interaktionsnachweistechniken
Die Co-Immunpräzipitation (Co-IP) ist eine Technik, die sich auf die Spezifität von Antigen-Antikörpern stützt, um biologisch relevante Wechselwirkungen zu identifizieren24. Der Hauptnachteil dieser Methode ist ihre Unfähigkeit, Wechselwirkungen mit geringer Affinität und kinetische Werte zu erkennen24. Biophysikalische Methoden wie die isotherme Titrationkalorimetrie (ITC), die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Biolayer-Interferometrie (BLI) und die FEB-Technologie werden bevorzugt, um die kinetischen Werte zu bestimmen.

ITC ist eine biophysikalische Nachweismethode, die auf der Bestimmung der Bindungsenergie zusammen mit einer vollständigen thermodynamischen Analyse zur Charakterisierung biomolekularer Wechselwirkungenbasiert 25. Der Hauptvorteil von ITC besteht darin, dass keine Markierung oder Fixierung des Zielproteins erforderlich ist. Die Hauptschwierigkeiten, mit denen ITC konfrontiert ist, sind die hohe Konzentration des Zielproteins, die für ein Experiment erforderlich ist, und die Schwierigkeit, nicht-kovalente Komplexe aufgrund kleiner Bindungsenthalpienzu analysieren 26. Sowohl SPR als auch BLI sind markierungsfreie biophysikalische Techniken, die auf der Immobilisierung des Zielmoleküls auf der Sensoroberfläche beruhen, gefolgt von nachfolgenden Injektionen des Analyten über das immobilisierte Ziel27,28. Bei SPR werden Veränderungen des Brechungsindex während biomolekularer Wechselwirkungen gemessen27; In BLI wird die Interferenz im reflektierten Licht in Echtzeit als Änderung der Wellenlänge als Funktion der Zeit28 aufgezeichnet. Sowohl SPR als auch BLI haben gemeinsame Vorteile durch hohe Spezifität, Sensitivität und Erkennungsfunktionen29. Bei beiden Methoden wird das Zielprotein auf Biosensoroberflächen immobilisiert, und daher kann es zu einem gewissen Verlust der nativen Konformation des Ziels kommen, was es schwierig macht, zwischen spezifischen und unspezifischen Wechselwirkungenzu unterscheiden 30. BLI verwendet teure faseroptische Einweg-Biosensoren, um das Ziel zu immobilisieren, und ist daher eine kostspielige Technik31. Im Vergleich zu diesen etablierten biomolekularen Detektionswerkzeugen bietet die FEB-Technologie eine zuverlässige und markierungsfreie Plattform, indem sie niedrige nanomolare Konzentrationen für den biomolekularen Nachweis in Echtzeit mit kinetischer Charakterisierung verwendet. Die FEB-Technologie überwindet auch die sprudelnden Herausforderungen in der ITC und ist im Vergleich zu SPR oder BLI kostengünstiger.

Die auf dem Feldeffekttransistor (FET) basierenden Biosensoren sind ein aufstrebendes Gebiet zur Erkennung biomolekularer Wechselwirkungen, indem sie vielfältige biomedizinische Anwendungen anbieten. Im FET-System werden Ziele für die Biosensorchips immobilisiert und Wechselwirkungen durch Änderungen der Leitfähigkeit32 erkannt. Das Alleinstellungsmerkmal, das bei der Entwicklung eines effizienten elektronischen Biosensors zu berücksichtigen ist, sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften wie die halbleitende Natur und die chemische Stabilität des Beschichtungsmaterials, das zur Herstellung der Sensoroberflächeverwendet wird 33. Herkömmliche Materialien wie Silizium, die für FET verwendet werden, haben die Empfindlichkeit von Sensoren eingeschränkt, da Oxidschichten zwischen dem Transistorkanal und einer spezifischen Umgebung für ein ordnungsgemäßes Funktionierenerforderlich sind 34. Darüber hinaus sind Siliziumtransistoren empfindlich gegenüber salzreichen Umgebungen, was es schwierig macht, biologische Wechselwirkungen in ihrer natürlichen Umgebung zu messen. Der graphenbasierte Biosensor wird als Alternative vorgestellt, da er eine hervorragende chemische Stabilität und ein elektrisches Feld bietet. Da Graphen eine einzelne Atomschicht aus Kohlenstoff ist, ist es sowohl als Halbleiter extrem empfindlich als auch chemisch mit biologischen Lösungen kompatibel; Beide Eigenschaften sind wünschenswert, um kompatible elektronische Biosensoren35 zu erzeugen. Das bemerkenswerte ultrahohe Belastungspotenzial von Biomolekülen, das graphenbeschichtete Biosensoren bieten, führte zur Entwicklung von graphenbasierten Biosensoren FEB-Technologie.

Prinzip der FEB-Technologie: FEB ist eine markierungsfreie biomolekulare Detektionstechnik, die den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor misst, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Wechselwirkungen zwischen dem immobilisierten Protein und dem Analyten führen zu Stromänderungen, die in Echtzeit überwacht werden, was genaue kinetische Messungenermöglicht 36.

Instrumentierung: Das FEB-System besteht aus einem Graphen-Feldeffekttransistor (gFET)-Sensorchip und einem elektronischen Lesegerät, das während des gesamten Experiments eine konstante Spannung anlegt (Abbildung 1). Der Analyt wird in Lösung auf das Zielprotein aufgetragen, das auf der Biosensoroberfläche immobilisiert ist. Wenn eine Wechselwirkung auftritt, wird eine Veränderung des Stroms gemessen und in Echtzeit aufgezeichnet. Wenn die Analytkonzentration zunimmt, nimmt auch der Anteil des gebundenen Analyten zu, was zu höheren Veränderungen in der Strömung führt. Mit der mit dem Gerät gelieferten automatisierten Analysesoftware (Table of Materials) wird I-Response in Form von Biosensing-Einheiten (BU)37 gemessen und aufgezeichnet. I-Response ist definiert als die Veränderung des Stroms (I) durch den Biosensorchip, die in Echtzeit bei der Interaktion des immobilisierten Ziels mit dem Analyten gemessen wird. Die automatisierte Analysesoftware FEB kann sowohl die I-Response als auch die C-Response auf dynamische Interaktionsereignisse analysieren, wobei die C-Response die Änderungen der Kapazität (C) aufzeichnet. Die Variationen sowohl der I-Response als auch der C-Response entsprechen direkt dem Anteil des gebundenen Analyten und können weiter analysiert werden, um KD-Werte zu erzeugen. Die Standardeinstellung der automatisierten Analysesoftware ist I-Response.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über den Versuchsaufbau . (A) Chip auf Graphenbasis und ein elektronisches Lesegerät. (B) Eine Übersicht über die Chipkomponenten. Der Chip ist an zwei Elektroden befestigt, die das System mit Strom versorgen. Die Oberfläche des Chips ist mit Graphen bedeckt, das bei Aktivierung das Ziel binden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Methodologie:
Zunächst wird der aktivierte Biosensorchip in das FEB-Gerät eingesetzt (Abbildung 1), gefolgt von der Ausführung der folgenden Schritte: (1) Kalibrierung: Das Experiment beginnt mit der Systemkalibrierung unter Verwendung von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH = 7,4), um die Ausgangsgleichgewichtsantwort zu erzeugen. (2) Assoziation: Der Analyt wird in den Chip eingeführt und die I-Antwort wird überwacht, bis die Bindungssättigung erreicht ist. (3) Dissoziation: Der Analyt wird mit 1x PBS dissoziiert. (4) Regeneration: Reste des Analyten werden mit 1x PBS entfernt. (5) Waschen: Insgesamt werden fünf Waschungen mit 1x PBS durchgeführt, um die gebundenen und ungebundenen Analyten gründlich vom Chip zu entfernen.

Analyse:
Die Datenanalyse erfolgt mit der vollautomatischen Software, die mit dem Gerät geliefert wird. Die automatisierte Analysesoftware generiert ein Hill-Fit-Diagramm mit einem KD-Wert . Das Hill-Fit-Diagramm beschreibt die Assoziation eines Analyten mit dem Zielprotein als Funktion der Analytkonzentrationen. Die Konzentration, bei der ein halbmaximales Ansprechen erreicht wird, ist proportional zum KD-Wert . Ein niedriger KD-Wert steht für eine hohe Bindungsaffinität und umgekehrt.

Um die aus dem FEB-Experiment gewonnenen Daten zu validieren, werden I-Responses von jedem Auslesepunkt für jede Analytkonzentration mit der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware extrahiert und können in andere statistische Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien) exportiert werden, wie unten erläutert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten Proteine, Hsp90 und Cdc37, wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Chip-Aktivierung

HINWEIS: Alle Materialien, die im Experiment verwendet werden sollen, sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt. Filtern Sie alle vorbereiteten Lösungen durch einen sterilen 0,2-μm-Filter.

  1. Es wird eine 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)-Lösung hergestellt, indem 2 mg EDC zu 2,5 ml 1 M2-(N-morpholino)-Ethansulfonsäure (MES)-Puffer (pH = 6,0) in einem 15-ml-Röhrchen zugegeben werden. Herstellung von N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS)-Lösungen durch Zugabe von 6 mg Sulfo-NHS zu 2,5 ml 1 M MES-Puffer (pH = 6,0) in einem separaten 15-ml-Röhrchen. Aliquot 50 μL jeder Lösung in unabhängigen Röhrchen und bei -20 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
  2. Mischen Sie gleiche Volumina EDC-Sandsulfo-NHS-Lösung (50 μL EDC + 50 μL Sulfo-NHS) durch Pipettieren auf und ab (nicht vortexen).
    HINWEIS: Die gemischte Lösung von EDC / Sulfo-NHS muss innerhalb von 30 Minuten verwendet werden, um eine effektive Vernetzung für eine ordnungsgemäße Chipfunktionalisierung aufrechtzuerhalten.
  3. Legen Sie den vom Unternehmen gelieferten Biosensorchip (5,7 cm x 2,4 cm; siehe Materialtabelle) in eine Glas-Petrischale mit montiertem Deckel. Es wird empfohlen, alle Funktionalisierungsschritte bei der Chipaktivierung in der Petrischale durchzuführen. Tragen Sie 50 μL 1 M MES-Puffer (pH = 6,0) auf den Biosensorchip auf, inkubieren Sie für 1 Minute bei Raumtemperatur und saugen Sie dann den Puffer ab.
  4. Tragen Sie 50 μL EDC/Sulfo-NHS-Lösung sofort auf den Sensorchip auf. Die Petrischale abdecken und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die EDC/Sulfo-NHS-Lösung aus dem Chip ab.
  5. Spülen Sie den Chip einmal mit 50 μL 1 M MES-Puffer (pH = 6,0); den MES-Puffer aspirieren.

2. Deaktivierung des Zielproteins

  1. Spülen Sie den Chip 2x mit 50 μL 1x PBS (pH = 7,4) ab. Saugen Sie das PBS vom Chip ab und fügen Sie das Zielmolekül Hsp90 (50 μL; 500 nM) hinzu.
    HINWEIS: Pufferkonflikte können das gesamte Experiment ruinieren. Daher ist es vor dem Experiment wichtig sicherzustellen, dass sich das Zielmolekül im selben Puffer befindet wie das für die Kalibrierung verwendete (z. B. 1x PBS (pH = 7,4)). Führen Sie bei Bedarf vor dem Experiment einen Pufferaustausch durch Nachtdialyse durch. In diesem Experiment wurde über Nacht eine Dialyse für beide rekombinanten Proteine, Hsp90 und Cdc37, gegen 1x PBS (pH = 7,4; siehe Materialtabelle) mit korrektem Pufferaustausch bei 4 °C durchgeführt. Die Konzentration des Zielmaterials (in diesem Fall Hsp90) kann je nach experimentellen Protokollen und der Art der Zielmaterialien (Protein/Peptid/Liganden) variieren.
  2. Die Glas-Petrischale abdecken und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung, die das Zielmolekül enthält, abpumpen und 3x mit 50 μL 1x PBS (pH = 7,4) abspülen. Saugen Sie die 1x PBS (pH = 7,4) Lösung vom Chip ab.
  3. 50 μL Quench 1 (3,9 mM Amino-PEG5-Alkohol in 1x PBS (pH = 7,4)) Lösung in den Chip geben. Die Glas-Petrischale abdecken und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Saugen Sie die Quench 1-Lösung vom Chip ab.
  4. 50 μL Quench 2 (1 M Ethanolamin (pH = 8,5)) Lösung in den Chip geben. Die Glas-Petrischale abdecken und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie die Quench 2-Lösung aus dem Chip und spülen Sie den Chip 5x mit 50 μL 1x PBS ab, wobei der letzte PBS-Tropfen auf dem Sensor verbleibt.

3. Vorbereitung von Analytproben

  1. Bereiten Sie Analytverdünnungsreihen für Cdc37 im gewünschten Konzentrationsbereich vor. Für das erste Experiment wurden die folgenden Konzentrationen verwendet: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM und 5.000 nM. Für das zweite Experiment wurde ein anderer Satz von Konzentrationen im Bereich von 0,4 nM bis 200 nM verwendet.
  2. Entwerfen Sie das Experiment so, dass es mindestens acht verschiedene Analytkonzentrationen umfasst, um einen zuverlässigen KD-Wert zu erhalten. Bereiten Sie die verschiedenen Verdünnungen des Analytproteins im selben Puffer vor, der für die Kalibrierung und das Zielprotein verwendet wird. hier ist es 1x PBS (pH = 7,4).

4. Laden des aktivierten Biosensor-Chips in das FEB-Gerät

HINWEIS: Das FEB-Gerät besteht aus einem Lesegerät mit LED-Lichtanzeigen und einer Kartusche zum Einsetzen des Biosensorchips.

  1. Setzen Sie nach der Immobilisierung des Zielproteins den aktivierten Chip in die Kartusche des Geräts ein, die über USB mit einem Computer verbunden ist. Nach dem Einsetzen des Chips wird ein grünes LED-Licht am Lesegerät angezeigt, das anzeigt, dass das FEB-Gerät für das Experiment bereit ist. Installieren Sie die vom Unternehmen bereitgestellte automatisierte Software (siehe Materialtabelle) auf dem Computer, an den das FEB-Gerät angeschlossen ist, um das Experiment Schritt für Schritt wie unten beschrieben zu überwachen.

5. Führen Sie das Experiment aus

  1. Drücken Sie das Modul Run Experiment in der automatisierten Software und wählen Sie 10 Punkte mit Regeneration oder ein anderes gewünschtes Protokoll. Geben Sie die folgenden Details ein: Operatorname, Experimentname, Datum (z. B. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); Regenerationspuffer (z. B. PBS-Puffer); immobilisiertes Ziel (z. B. Hsp90); Analyt in Lösung (z. B. Cdc37). Siehe ergänzende Abbildung S1 für Details.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten , die in der Software angezeigt wird, und folgen Sie den Anweisungen der automatisierten Software wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Die Software ist voll automatisiert, benutzerfreundlich und führt den Benutzer Schritt für Schritt durch das Experiment. Auf dem Bildschirm erscheint ein Popup-Fenster mit Anweisungen, bei jedem Schritt des Experiments fortzufahren. Die Software liefert Anweisungen für jeden sich wiederholenden Schritt nacheinander aus Kalibrierung, Analytassoziation, Dissoziation, Regeneration und Waschen (5x) für jede Analytkonzentration während des gesamten Experiments.
  3. Führen Sie eine Gerätekalibrierung durch. Saugen Sie dazu die restliche PBS-Lösung vom Chip ab und legen Sie 50 μL Kalibrierpuffer (1x PBS; pH = 7,4) auf. Drücken Sie die Continue-Taste und warten Sie 5 Minuten, bis der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den für den Kalibrierungsschritt ermittelten Endpunkt (5 min) mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.
  4. Führen Sie als Nächstes eine Analytzuordnung durch. Saugen Sie dazu den Kalibrierpuffer vom Chip ab und legen Sie 50 μL der niedrigsten Analytkonzentration (25 nM Cdc37) auf. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie 5 Minuten, bis der Zuordnungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Assoziationsschritt (5 min) mit einem Warnalarm an, um fortzufahren.
  5. Führen Sie eine Analytdissoziation durch. Saugen Sie dazu die Analytlösung vom Chip ab und tragen Sie 50 μL des Dissoziationspuffers (1x PBS; pH = 7,4) auf. Drücken Sie die Continue-Taste und warten Sie 5 Minuten, bis die Dissoziationsschrittdauer (5 min) beendet ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Dissoziationsschritt (5 min) mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.
  6. Führen Sie als Nächstes eine Chip-Regeneration durch. Die Dissoziationslösung wird vom Chip abgesaugt und 50 μL Regenerationspuffer (1x PBS; pH = 7,4) aufgetragen. Drücken Sie die Weiter-Taste und warten Sie 30 s, bis die Regenerationsschrittdauer (30 s) beendet ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Regenerationsschritt (30 s) mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.
  7. Zum Schluss den Chip waschen. Die Regenerationslösung aus dem Chip abpumpen und 50 μL Waschpuffer (1x PBS; pH = 7,4) auf den Chip auftragen. Saugen Sie die Lösung aus dem Chip und wiederholen Sie dies 5x. Lassen Sie den letzten Tropfen Waschpuffer auf dem Chip und drücken Sie die Weiter-Taste und warten Sie 30 Sekunden, bis die Waschschrittdauer in der Softwareanzeige abgeschlossen ist.
    HINWEIS: Die Software zeigt den Endpunkt für den Waschschritt (30 s) mit einem Warnalarm an, um mit dem nächsten Zyklus des Experiments fortzufahren.
  8. Wiederholen Sie die Schritte für jede verwendete Analytkonzentration. Die fünf Schritte Kalibrierung, Analytassoziation, Dissoziation, Regeneration und Waschung (5x) bilden einen Zyklus. Für das hier gezeigte Experiment führten wir 10 Zyklen für 10 Analytkonzentrationen durch (von 25 nM bis 5.000 nM oder 0,4 nM bis 200 nM; Abbildung 2).

6. Analyse

  1. Drücken Sie die Analysetaste, die sich am Ende des Experiments oben in der automatisierten Analysesoftware befindet. Es erscheint ein Anzeigefenster mit allen experimentellen Punkten. Stellen Sie im Fenster sicher, dass die für das vorgeschriebene Protokoll verwendeten Analytkonzentrationen korrekt sind.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse ausführen , um den KD-Wert automatisch zu generieren. Die Software generiert ein Hill-Fit-Diagramm, indem sie die Analytkonzentrationen gegen die entsprechenden I-Antworten aufzeichnet, aus denen die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht, KD-Wert , berechnet wird.
  3. Exportieren Sie die Rohdaten zur Analyse in andere statistische Analysesoftware, indem Sie die Datenüberprüfungs-/Exportsoftware wie unten beschrieben verwenden.
    1. Kopieren Sie die am Ende des Experiments automatisch erstellte R1R-Datei (z. B. Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) in einen neuen Ordner auf dem Desktop. Öffnen Sie die vom Unternehmen bereitgestellte Datenüberprüfungs-/Exportsoftware (siehe Ergänzende Abbildung S2A).
    2. Klicken Sie auf Datenverarbeitung > R1R-Dateien verarbeiten > auf dem Startbildschirm der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware auf OK.
    3. Wählen Sie den Ordner mit R1R-Dateien aus, die in Schritt 6.3.1 auf dem Desktop erstellt wurden. und drücken Sie die OK-Taste . Dadurch wird eine Kopie der ursprünglichen R1R-Daten erstellt, um die Daten zu überprüfen und zu bearbeiten, ohne die Originaldatei zu überschreiben.
    4. Drücken Sie auf das Datenverarbeitungssymbol, das auf dem Startbildschirm der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware angezeigt wird. Klicken Sie auf Processed R1R-Dateien laden, > OK. Wählen Sie denselben Ordner aus, der in Schritt 6.3.1 erstellt wurde und verarbeitete R1R-Dateien enthält. Drücken Sie OK. In diesem Schritt kann der Ordner, der die Testdateien enthält, überprüft werden.
    5. Drücken Sie auf dem Startbildschirm der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware auf Datenanalyse. Wählen Sie Kalibrierung > Bearbeiten von R1R-Dateien kalibrieren > OK (siehe Ergänzende Abbildung S2B). In diesem Schritt werden alle Datenpunkte gemäß dem ersten Kalibrierungsschritt kalibriert, um eine Baseline zu erstellen.
    6. Drücken Sie auf dem Startbildschirm der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware auf Datenanalyse. Wählen Sie R1R-Dateien überprüfen und bearbeiten > OK aus. Überprüfen Sie die Datenpunkte, löschen Sie Punkte oder fügen Sie Schritte hinzu, indem Sie die Schaltfläche Löschen/Schritt hinzufügen verwenden. Stellen Sie sicher, dass sich alle Schritte an der richtigen Stelle befinden, z. B. der Kalibrierungsschritt auf der Basislinie, der Zuordnungsschritt auf dem Höhepunkt (siehe Ergänzende Abbildung S3), und drücken Sie dann die Schaltfläche Speichern , um alle vorgenommenen Änderungen zu speichern.
    7. Drücken Sie auf dem Startbildschirm der Datenüberprüfungs-/Exportsoftware auf Datenanalyse. Wählen Sie Daten analysieren/plotten, wählen Sie die zu exportierenden Schritte (siehe Ergänzende Abbildung S4). Fügen Sie jeden Zuordnungsschritt (z. B. Schritt 2, Schritt 7 usw.) hinzu, nachdem Sie den Kalibrierungsschritt (z. B. Schritt 1, Schritt 6 usw.) vor dem Exportieren der Daten subtrahiert haben.
    8. Klicken Sie auf Diese Daten exportieren. Die Software generiert eine Tabellenkalkulationsdatei, die die I-Antwort für jeden Analytkonzentrationsdatenpunkt von jedem Transistor enthält (wenn alle Transistoren funktionieren, haben wir drei verschiedene I-Response-Werte für jeden Konzentrationspunkt). Verwenden Sie diese Tabellenkalkulationsdatei, um die Daten in der Statistiksoftware weiter zu analysieren.
  4. Öffnen Sie die statistische Analysesoftware. Erstellen Sie eine XY-Tabelle mit drei Y-Werten. Klicken Sie auf Erstellen. Die Daten für diese Tabelle (X-, Y-Werte) werden aus der in Schritt 6.3.8 erstellten Tabellenkalkulationsdatei kopiert. Die x-Achse entspricht der Analytkonzentration (abhängig von der verwendeten Konzentration), und die drei Y-Werte entsprechen den I-Responses, die von der vom Unternehmen gelieferten Data Review/Export-Software erhalten wurden.
  5. Klicken Sie auf Diese Daten analysieren. Wählen Sie XY-Analysen > Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) > Bindungssättigung > einer Stelle > Summe. Die Software analysiert automatisch die Daten, generiert den KD-Wert und erstellt ein Diagramm der Datenpunkte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ergebnisse aus Experiment 1:
Das Zielprotein Hsp90 (500 nM) wurde nach dem oben beschriebenen Zielimmobilisierungsprotokoll auf den Chip immobilisiert. Für das erste Experiment wurden 10 Konzentrationen des Analytproteins Cdc37 im Bereich von 25 nM bis 5.000 nM auf der Grundlage der in der Literatur verfügbaren Daten hergestellt (siehe Tabelle 1).

Die Schritte des Experiments können in Echtzeit überwacht werden, indem die in der I-Antwort auftretenden Veränderungen verfolgt werden (Abbildung 3A). Man kann visualisieren, wie sich jeder im Protokoll enthaltene Schritt während des gesamten Experiments auf die I-Antwort auswirkt. Zum Beispiel ist die I-Antwort während der Kalibrierung nahe Null, und im Assoziationsschritt steigt die I-Antwort allmählich mit steigenden Analytkonzentrationen (Cdc37) an. Betrachtet man die Daten aus diesem Experiment (Abbildung 3A), so wurde ein plötzlicher Anstieg der I-Response bei niedrigen Analytkonzentrationen (50 BU bei 25 nM) beobachtet. Bei niedriger Analytkonzentration wurde eine niedrige I-Response erwartet, die mit zunehmender Konzentration allmählich ansteigen wird. Dieser plötzliche Anstieg legte nahe, dass ein Experiment mit niedrigeren Analytkonzentrationspunkten entworfen werden sollte.

Nach den oben beschriebenen Protokollschritten wurden die Daten in der mitgelieferten automatisierten Analysesoftware analysiert, die automatisch ein Hill-Fit-Diagramm mit einem berechneten KD-Wert generierte (Abbildung 3B). Der von der automatisierten Analysesoftware für das erste Experiment berechnete KD-Wert betrug 350.000 ± 76.000 μM. Die meisten der üblichen biologischen Wechselwirkungen zeigten einen K D-Wert im niedrigen μM- oder sogar imnM-Bereich ; Daher ist der für das erste Experiment generierte KD-Wert sehr hoch.

Es kann mehrere Erklärungen für den beobachteten hohen KD-Wert geben: Es kann eine Bindung mit geringer Affinität zwischen den beiden untersuchten spezifischen Proteinen (Hsp90/Cdc37) geben, was bedeutet, dass für die molekularen Wechselwirkungen eine hohe Ligandenkonzentration erforderlich ist; Das Experiment könnte mit nicht idealen, außerhalb des Bereichs liegenden Analytkonzentrationen konzipiert worden sein; Der hohe Wert kann auf die eingebauten Parameter zurückzuführen sein, die im Fitting-Modul der Analysesoftware verwendet werden. Die automatisierte Analysesoftware verwendet ein Dosis-Wirkungs-Analysemodul, um die Datenpunkte anzupassen, aber einige Interaktionen passen möglicherweise nicht gut in dieses Modell, wodurch falsche Daten entstehen, was zu hohen KD-Werten führt.

Um einen genauen K D-Wert mit einem gesättigtenHill-Diagramm zu erhalten, ist eine Standardisierung des Experiments durch Versuch und Irrtum erforderlich, die sowohl niedrigere als auch höhere Analytkonzentrationspunkte umfasst, um den niedrigsten KD-Wert mit einer niedrigen Fehlerrate zu erhalten.

Unter Berücksichtigung all dieser Faktoren wurden die Daten aus der Analysesoftware in eine zusätzliche statistische Analysesoftware exportiert. Die I-Antwort für jeden Assoziationspunkt wurde mit der automatisierten Datenüberprüfungs-/Exportsoftware extrahiert und ist in Tabelle 2 zusammengefasst, indem die oben im Analyseschritt (Schritt 6) beschriebenen Schritte ausgeführt werden.

Die Ergebnisse der statistischen Analysesoftware (Abbildung 3C) zeigten einen relativ niedrigen KD-Wert mit einer hohen Standardabweichung (0,011 ± 0,494 μM) und einen niedrigenR2-Wert von 0,78. Die signifikante Variation des K D-Wertes und des niedrigenR2-Wertes deutete darauf hin, dass die für dieses Experiment gewählten Konzentrationspunkte nicht optimal sind. Darüber hinaus wurde auch festgestellt, dass einige Diagrammpunkte nicht gut zur Plottrendlinie passten (Abbildung 3C); Dies verstärkte die Notwendigkeit, ein zweites Experiment zu entwerfen, indem verschiedene Analytkonzentrationspunkte einbezogen wurden.

Die integrierten Parameter, die von den beiden Analyseprogrammen verwendet werden, sind völlig unterschiedlich und spiegeln sich im Generierungsprozess vonK-D-Werten wider. Die Unterschiede in denK-D-Werten der beiden Analysesoftware (350.000 ± 76.000 μM vs. 0,011 ± 0,494 μM) sind darauf zurückzuführen, dass für die Berechnung unterschiedliche Analysemodule verwendet wurden. Die in der statistischen Analysesoftware durchgeführte Analyse kann für diese Interaktion besser geeignet sein, wodurch einniedrigerer K D-Wert entsteht.

Wenn jedoch die Ergebnisse beider Analysen kombiniert werden (350.000 ± 76.000 μM und 0,011 ± 0,494 μM), kann der Schluss gezogen werden, dass das erste Experiment nicht optimal war und zusätzliche Konzentrationspunkte erforderlich wären.

Zur Validierung dieses Punktes wurde der unkorrelierte Graphenpunkt 3.000 nM ausgeschlossen (siehe Ergänzende Abbildung S5). Die Ergebnisse der Analyse zeigten einen K-D-Wert von 0,006 ± 0,081 μM bei einemR2-Wert von 0,98. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das nächste Experiment so konzipiert werden sollte, dass es sich auf relevantere Konzentrationen konzentriert. Daher wurde ein zweites Experiment durchgeführt, um Hsp90/Cdc37 PPI unter Verwendung verschiedener Testpunkte mit Konzentrationen unter und über dem vorhergesagten KD zu bewerten.

Ergebnisse aus Experiment 2:
Das Zielprotein Hsp90 (500 nM) wurde mit dem oben beschriebenen Protokoll auf den Chip immobilisiert. Insgesamt wurden 10 Konzentrationen des Analyten (Cdc37) wie folgt hergestellt: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM und 200 nM. Das zweite Experiment wurde entworfen, indem verschiedene Analytkonzentrationspunkte einbezogen wurden, wobei alle Erkenntnisse aus dem vorherigen Experiment berücksichtigt wurden, wie oben erwähnt.

Während des Experiments wurde jeder Schritt in Echtzeit überwacht (Abbildung 4A). Hier beginnt der Echtzeit-I-Response-Graph (abgeleitet von den niedrigen Konzentrationen des Analyten - 0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) zunächst bei Null und steigt allmählich bei der Erhöhung der Analytkonzentrationen in jedem Zyklus des Experiments im Vergleich zu dem plötzlichen Anstieg der I-Response an, der im ersten Experiment beobachtet wurde.

Nach dem oben genannten Protokoll wurden die Daten mit der automatisierten Analysesoftware analysiert (Abbildung 4B). Der von der automatisierten Analysesoftware für dieses Experiment berechnete KD-Wert betrug 0,0673 ± 0,0002 μM, was auf eine starke Wechselwirkung zwischen dem Zielprotein Hsp90 und dem Analyten Cdc37 hindeutete. Die Standardabweichung von 0,0002 μM war viel kleiner als die im ersten Experiment erhaltene, was die Sicherheit gibt, dass die neuen Daten viel zuverlässiger sind.

Um dieses Ergebnis zu validieren, haben wir die Datenpunkte (Tabelle 3) wie zuvor erläutert in eine andere statistische Analysesoftware exportiert. Die Ergebnisse der Analyse sind in Abbildung 4C zusammengefasst.

Mit der statistischen Analysesoftware wurde festgestellt, dass der KD-Wert für Hsp90/Cdc37 PPI 0,014 ± 0,005 μM beträgt (Abbildung 4C). Die niedrigen Werte von KD und die Standardabweichung deuten auf eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen Hsp90 und Cdc37 hin. Darüber hinaus zeigt derR2-Wert von 0,99 an, dass die Analyse perfekt zu den experimentellen Graphpunkten passt. Beide Analysesoftware zeigte Konsistenz in den Ergebnissen mit niedrigen KD-Werten von etwa 0,0673 ± 0,0002 μM bzw. 0,014 ± 0,005 μM.

Um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit des Experiments zu bestätigen, wurde das gleiche Experiment in zwei Replikaten mit Hsp90 (500 nM) als Zielprotein und Cdc37 als Analyt mit den gleichen Konzentrationen von 0,4 nm bis 200 nm wie im zweiten Experiment durchgeführt. Während des Experiments wurde jeder Schritt in Echtzeit überwacht (Ergänzende Abbildung S6A und Ergänzungsabbildung S7A). Der mit der automatisierten Analysesoftware berechneteK-D-Wert ist in der Ergänzungsfigur S6B und der Ergänzungsfigur S7B (0,053 ± 0,002 μM bzw. 0,0719 ± 0,0007 μM) dargestellt. Wie bereits erwähnt, wurden die Datenpunkte (Ergänzende Tabelle S1 und Ergänzungstabelle S2) in eine andere statistische Analysesoftware exportiert, und die Ergebnisse sind in Ergänzende Abbildung S6C und Ergänzende Abbildung S7C dargestellt (Ergänzende Abbildung S6C: K D ist 0,003 ± 0,009μM und R2 ist 0,99; Ergänzende Abbildung S7C: KD ist 0,004 ± 0,009 μM undR2 ist 0,99). Die Ergebnisse der beiden Replikate aus der Analysesoftware bestätigten gut und bestätigten die Genauigkeit, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit der experimentellen Hsp90/Cdc37 FEB-Daten.

Es wurde auch eine Kontrollstudie durchgeführt, in der die biomolekulare Wechselwirkung zwischen Hsp90 und einem Kontrollprotein, Rinderserumalbumin (BSA), aufgeklärt wurde. Die Kontrollstudie mit BSA als Analyt wurde unter Verwendung eines identischen Versuchsaufbaus und identischer Analytkonzentrationen durchgeführt, die im zweiten Experiment verwendet wurden. Insgesamt wurden 10 Konzentrationen des Kontrollproteins BSA im Bereich von 0,4 nM bis 200 nM in 1x PBS (pH = 7,4) hergestellt und jeder Schritt des Experiments in Echtzeit überwacht.

Ähnlich wie beim Experiment mit Hsp90 und Cdc37 beginnt das Echtzeit-I-Response-Diagramm zunächst bei 0; In der Kontrollstudie stieg die I-Response jedoch nicht allmählich mit dem Anstieg der Analytkonzentrationen an (Ergänzende Abbildung S8A). Die Daten wurden auch mit der automatisierten Analysesoftware (Ergänzende Abbildung S8B) analysiert, und die Software konnte den KD-Wert aus den Datenpunkten dieses Experiments nicht berechnen. Aus Hill Plot, das von der Software generiert wurde, geht hervor, dass es keine Wechselwirkung zwischen Hsp90 und dem BSA-Kontrollanalyten gibt. Um dieses Ergebnis zu validieren, haben wir die Datenpunkte (Ergänzungstabelle S3) wie zuvor erläutert in eine andere statistische Analysesoftware exportiert. Unter Verwendung der statistischen Analysesoftware wurde festgestellt, dass der KD-Wert für Hsp90/BSA PPI negativ ist (Ergänzende Abbildung S8C; KD ist -0,009 ± -0,0003 μM), was wiederum darauf hindeutet, dass es keine Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen Hsp90 und BSA gibt. Darüber hinaus zeigt derR2-Wert (0,82) an, dass die Analyse nicht zu den experimentellen Graphpunkten passte. Beide Analysesoftware zeigte Konsistenz in den Ergebnissen, dass Hsp90 und BSA nicht interagieren.

Beim Vergleich der experimentellen Daten von Hsp90/Cdc37 FEB mit anderen in der Literatur verfügbaren experimentellen Daten wurde festgestellt, dass die in dieser Studie erhaltenen K D-Werte (K D = 0,014 ± 0,005 μM, K D = 0,053 ± 0,002 μM und K D = 0,072 ± 0,001 μM) in zwei Größenordnungen niedriger waren als zuvor veröffentlichte Daten (K D = 1,46 μM 38 oder 6μM 39 ). Diese Unterschiede können auf die Verwendung von humanen Hsp90- und Cdc37-Konstrukten in voller Länge in den aktuellen Experimenten zurückgeführt werden. Frühere Studien wurden an Hefe-Hsp90-Konstrukten durchgeführt, die nur einpartielles Protein 38 oder C. elegans homolog-Proteine39 enthielten (Tabelle 1). Um die im FEB-System erzielten Ergebnisse zu validieren, wurden ITC-Experimente durchgeführt.

Evaluierung von Hsp90/Cdc37 PPI mit dem ITC-System:
ITC gilt als Goldstandard zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen. Wir führten außerdem ITC durch, um die thermodynamische Kinetik des Hsp90/Cdc37 PPI zu bestimmen, und als Validierung für das FEB-Experiment. Die Hsp90 und Cdc37 werden vor der ITC einer Dialyse gegen PBS (pH = 7,0) unterzogen. Etwa 0,25 μM Lösung des Zielproteins (Hsp90) und 2,5 μM Lösung des Analytproteins (Cdc37) wurden in PBS für die kalorimetrischen Titrationen hergestellt. Ein Gesamtvolumen von 80 μL Cdc37-Lösung in aufeinanderfolgenden Abständen wurde von der rotierenden Spritze auf die Zelle titriert, die 150 μL Hsp90-Lösung bei 298,15 K enthielt. Jede Injektion erfolgte über eine Dauer von 4 s, und das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Injektionen betrug 150 s. Insgesamt wurden 19 Injektionen von je 2 μL mit einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min bzw. einer Referenzleistung von 41,9 μW durchgeführt. Die Wärmeschwankung, die sich aus der Hsp90/Cdc37-Wechselwirkung ergibt, wurde überwacht, und die endgültigen Daten, die am Ende der Cdc37-Analytinjektionen erhalten wurden, wurden mit der vom Unternehmen bereitgestellten ITC-Analysesoftware angepasst. Die Wärmeschwankungen wurden zusammen mit den thermodynamischen Parametern wie molare Enthalpieänderung (ΔH), Entropieänderung (ΔS), der Anzahl der Bindungsstellen (n) und der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) zwischen Hsp90 / Cdc37 PPI geschätzt. Die Gibbs-Änderung der freien Energie (ΔG) wurde ebenfalls aus der Gleichung ΔG = ΔH - TΔS berechnet, nachdem thermische Parameter aus dem ITC-Thermogramm erhalten wurden.

Das ITC-Diagramm zeigt die Menge an Wärme, die während der biologischen Wechselwirkungen verbraucht oder freigesetzt wurde, um die Art der Wechselwirkungen und intermolekularen Kräfte zu klären, die den PPI40 steuern. Cdc37 (2,5 μM) wurde in Hsp90 (0,25 μM) titriert, und die entsprechenden Kurven sind in Abbildung 5A,B dargestellt. Das erhaltene ITC-Diagramm erwies sich als exotherm und wurde in ein einzelnes Bindungsstellenmodell eingepasst, das eine Bindungstoichiometrie (n) von einem, Bindungsenergie, ΔG = -45,9 kJ/mol undK-D-Wert = 0,009 μM aufweist. Die leichte Inkonsistenz, die in Form einer endothermen Verschiebung zu Beginn des ITC-Thermogramms beobachtet wurde (Abbildung 5A), deutet auf die Bildung von Blasen bei der Titration des Analytproteins auf die Messzelle41,42 hin. Unter den Hsp90/Cdc37 PPI, ITC-Experimenten, die bei immer höheren Konzentrationen durchgeführt wurden, zeigte der 10-fache Überschuss von Cdc37 (Hsp90-Konzentration = 0,25 μM und Cdc37-Konzentration = 2,5 μM) akzeptable Bindungsparameter durch Erreichen einer Sättigungskurve. Der aus ITC erhaltene KD-Wert (K D = 0,009 μM) korrelierte gut mit dem mit der FEB-Technologie berechneten K-D-Wert (KD = 0,014 μM, 0,053 μM und 0,072 μM) und unterstützt die Empfindlichkeit und Genauigkeit von FEB bei der Erkennung von Hsp90/Cdc37 PPI stark.

Figure 2
Abbildung 2: Protokollzusammenfassung. (A) Zusammenfassung der Schritte für den Chipaktivierungsprozess. (B) Grafische Darstellung der fünf sich wiederholenden Schritte im Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Aus Experiment 1 generierte Datendateien . (A) Experimentdaten, die in Echtzeit überwacht werden. Die y-Achse entspricht der I-Antwort in Biosensoreinheiten (BU), und die x-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Diese Zahl entspricht den Daten aus dem ersten Experiment. (B) Hill Fit-Diagramm, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wird. Die y-Achse entspricht der I-Response, die x-Achse den Konzentrationen des Analyten (Cdc37) in nM. Für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 350.000 ± 76.000 μM. (C) Assoziationsdiagramm, das mit der statistischen Analysesoftware generiert wurde. Die y-Achse entspricht der I-Response am Ende der Assoziationsphase, die x-Achse entspricht den unterschiedlichen Analyt-Cdc37-Konzentrationen. Dieses Diagramm wurde unter Verwendung der in Tabelle 2 angegebenen Datenpunkte generiert. Eine Zusammenfassung der Analyseergebnisse finden Sie in der Grafik; für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 0,011 ± 0,494 μM und derR2-Wert 0,78. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Aus Experiment 2 generierte Datendateien . (A) Experimentdaten, die in Echtzeit überwacht werden. Die y-Achse entspricht der I-Antwort in Biosensoreinheiten (BU), und die x-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Diese Zahl entspricht den Daten aus dem zweiten Experiment. (B) Hill Fit-Diagramm, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wird. Die y-Achse entspricht der I-Response, die x-Achse der Konzentration des Analyten (Cdc37) in nM. Für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 0,0673 ± 0,0002 μM (C) Assoziationsdiagramm, das mit der statistischen Analysesoftware generiert wurde. Die y-Achse entspricht der I-Response am Ende der Assoziationsphase, die x-Achse entspricht den unterschiedlichen Cdc37-Konzentrationen des Analyten. Dieses Diagramm wurde mithilfe der in Tabelle 3 angegebenen Datenpunkte generiert. Eine Zusammenfassung der Analyseergebnisse finden Sie in der Grafik; Für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 0,014 ± 0,005 μM und derR2-Wert 0,99. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: ITC-Thermogramm der Wechselwirkung von Hsp90 und Cdc37. (A) Die obere Platte stellt die entsprechenden Wärmeentwicklungskurven dar, die durch aufeinanderfolgende Injektionen von Cdc37 (2,5 μM) in Hsp90 (0,25 μM) bei 298,15 K erhalten wurden. Die Differenzleistung (DP) stellt die Differenzleistung als Funktion der Zeit dar. (B) Die integrierten Datenpunkte im unteren Bereich bezeichnen die entsprechende normalisierte Wärme gegenüber dem molaren Verhältnis von Hsp90/Cdc37. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Assays durchgeführt FEB-Analyse KD Prismenanalyse KD Konstruktherkunft Aminosäuren Referenzen
ITC 1,46 μM und 1,32 μM NA Hefe Hsp90 N-Terminaldomäne von Hsp90 36
Menschliches Cdc37
SPR 6 μM NA C. elegans Volle Länge 37
FEB - Erste Wiederholung 0,014 μM 0,067 μM Menschliches Hsp90 Volle Länge Durchgeführt in dieser Studie
Menschliches Cdc37
FEB - Zweite Wiederholung 0,053 μM 0,003 μM Menschliches Hsp90 Volle Länge Durchgeführt in dieser Studie
Menschliches Cdc37
FEB - Dritte Wiederholung 0,072 μM 0,004 μM Menschliches Hsp90 Volle Länge Durchgeführt in dieser Studie
Menschliches Cdc37
ITC 0,009 μM NA Menschliches Hsp90 Volle Länge Durchgeführt in dieser Studie
Menschliches Cdc37
FEB- Kontrollstudie Keine Daten (Es gab nicht genügend Daten, um die KD zu berechnen) -0,009 μM (KD-Wert mit negativen Werten zeigt an, dass keine Wechselwirkung vorliegt) Menschliches Hsp90 Volle Länge Durchgeführt in dieser Studie
BSA

Tabelle 1: Hsp90/Cdc37 PPI-Bewertung unter Verwendung verschiedener Methoden, die in dieser Studie und der Literatur beschrieben werden.

Analytkonzentrationen (nM) I-Response-Transistor 1 I-Response-Transistor 2 I-Response Transistor 3 Durchschnitt
I-Antwort
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tabelle 2: Zusammenfassung der I-Response-Werte, die von drei verschiedenen Transistoren jedes Chips an jedem Konzentrationspunkt des ersten Experiments generiert wurden.

Analytkonzentrationen (nM) I-Response-Transistor 1 I-Response-Transistor 2 I-Response Transistor 3 Durchschnittliche I-Antwort
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tabelle 3: Zusammenfassung der I-Response-Werte, die von drei verschiedenen Transistoren jedes Chips an jedem Konzentrationspunkt des zweiten Experiments generiert wurden.

Ergänzende Abbildung S1: Screenshot des Hauptbildschirms automatisierter Software vor Beginn des Experiments. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Screenshot des Hauptbildschirms einer automatisierten Software zur Datenverarbeitung und -analyse. (A) Hauptbildschirm der Datenüberprüfungs- / Exportsoftware mit Datenverarbeitungsoptionen. (B) Die Hauptbildschirmanzeige der Datenüberprüfungs- / Exportsoftware mit Datenanalyseoptionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Die aus Review-/Export-Software gewonnenen Review-Datenpunkte. Überprüfen Sie in diesem Schritt das Experiment, und fügen Sie Datenpunkte hinzu oder löschen Sie sie. Stellen Sie sicher, dass der Zuordnungspunkt (2, 7, 12, 17, 22 usw.) immer bei der Auswahl ist. Die erste Auswahl von links ist beispielsweise der Datenpunkt Nummer 2 und dann der Datenpunkt Nummer 10 (aber es sollte die Nummer 7 sein). Um dies zu lösen, löschen Sie einfach die Punkte 3, 4 und 5. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Datenliste exportieren zum Beispiel. Wählen Sie in diesem Schritt aus, welche Experimentpunkte exportiert werden sollen. Wählen Sie einen Assoziationspunkt (2, 7, 12, 17, 22 usw.) und subtrahieren Sie die vorherigen Kalibrierungsschritte (1, 6, 11, 16, 21 usw.). Fügen Sie alle Punkte zur Exportliste hinzu und exportieren Sie diese Daten, um eine Tabelle mit der I-Antwort für jeden Datenpunkt zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S5: Assoziationsdiagramm, das mit der statistischen Analysesoftware erstellt wurde. Die y-Achse entspricht der I-Response am Ende der Assoziationsphase, die x-Achse entspricht den unterschiedlichen Cdc37-Konzentrationen des Analyten. Dieses Diagramm wurde unter Verwendung der Datenpunkte aus dem ersten Experiment generiert und schloss den 3.000-nM-Konzentrationsdatenpunkt aus. Eine Zusammenfassung der Analyseergebnisse finden Sie in der Grafik; für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 0,006 ± 0,081 μM und derR2-Wert 0,98. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S6: Aus Versuch 2 generierte Datendateien replizieren 1. (A) Experimentdaten, die in Echtzeit überwacht werden. Die y-Achse entspricht der I-Antwort in Biosensoreinheiten (BU), und die x-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Diese Zahl entspricht den Daten der zweiten Wiederholung, die im zweiten Experiment durchgeführt wurde, bei dem Hsp90 auf dem Chip immobilisiert wurde (500 nM) und 10 Konzentrationen von Cdc37-Analyten hergestellt wurden (0,4-200 nM). Das Echtzeit-I-Response-Diagramm beginnt zunächst bei 0 und steigt allmählich mit dem Anstieg der Analytkonzentrationen in jedem Zyklus des Experiments an, was darauf hindeutet, dass das Experiment erfolgreich ist. (B) Hill Fit-Diagramm, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wird. Die y-Achse entspricht der I-Response, die x-Achse den Konzentrationen des Analyten (Cdc37) in nM. Die Ergebnisse der automatisierten Analyse zeigten einen relativ niedrigen KD-Wert und eine geringe Standardabweichung von 0,0531 ± 0,0002 μM, was auf eine starke Wechselwirkung zwischen Hsp90 und Cdc37 hindeutet. (C) Das mit der statistischen Analysesoftware generierte Assoziationsdiagramm. Die y-Achse entspricht der I-Response am Ende der Assoziationsphase, die x-Achse entspricht den unterschiedlichen Cdc37-Konzentrationen des Analyten. Dieses Diagramm wurde mithilfe der in Tabelle S1 angegebenen Datenpunkte generiert. Eine Zusammenfassung der Analyseergebnisse finden Sie in der Grafik; für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 0,003 ± 0,009 μM und derR2-Wert 0,99. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S7: Aus Versuch 2 generierte Datendateien replizieren 1. (A) Experimentdaten, die in Echtzeit überwacht werden. Die y-Achse entspricht der I-Antwort in Biosensoreinheiten (BU), und die x-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Diese Zahl entspricht den Daten aus der dritten Wiederholung im zweiten Experiment, bei dem Hsp90 auf dem Chip immobilisiert wurde (500 nM) und 10 Konzentrationen von Cdc37-Analyten hergestellt wurden (0,4-200 nM). (B) Hill Fit-Diagramm, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wird. Die y-Achse entspricht der I-Response, die x-Achse den Konzentrationen des Analyten (Cdc37) in nM. Die Ergebnisse der automatisierten Analyse zeigten einen relativ niedrigen KD-Wert und eine geringe Standardabweichung von 0,0719 ± 0,0007 μM, was auf eine starke Wechselwirkung zwischen Hsp90 und Cdc37 hindeutet. (C) Assoziationsdiagramm, das mit der statistischen Analysesoftware generiert wurde. Die y-Achse entspricht I-Response am Ende der Assoziationsphase. Die x-Achse entspricht den unterschiedlichen Cdc37-Analytkonzentrationen. Dieses Diagramm wurde mithilfe der in Tabelle S2 angegebenen Datenpunkte generiert. Eine Zusammenfassung der Analyseergebnisse finden Sie in der Grafik; für dieses Experiment beträgt der KD-Wert 0,004 ± 0,009 μM und derR2-Wert 0,99. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S8: Aus dem Kontrollexperiment generierte Datendateien. (A) Experimentdaten, die in Echtzeit überwacht werden. Die y-Achse entspricht der I-Antwort in Biosensoreinheiten (BU), und die x-Achse entspricht den verschiedenen Zeitpunkten und Konzentrationen des Analyten im Experiment. Diese Zahl entspricht den Daten des Kontrollexperiments, bei dem Hsp90 auf dem Chip immobilisiert wurde (500 nM) und 10 Konzentrationen von BSA-Analyten (Kontrollprotein) hergestellt wurden (0,4-200 nM). Das Echtzeit-I-Response-Diagramm beginnt mit einer niedrigen I-Response um 10-15 BU und steigt nicht bei einem Anstieg der Analytkonzentrationen in jedem Zyklus des Experiments an, was darauf hindeutet, dass es keine Wechselwirkung zwischen Hsp90 und BSA gibt. (B) Hill Fit-Diagramm, das von der automatisierten Analysesoftware generiert wird. Die y-Achse entspricht I-Response; die x-Achse entspricht den Analytkonzentrationen (BSA) in nM. Die Ergebnisse der automatisierten Analyse zeigten, dass es nicht genügend Daten gibt, um den KD-Wert zu berechnen, was darauf hindeutet, dass es keine Wechselwirkung zwischen Hsp90 und BSA gibt. (C) Assoziationsdiagramm, das mit der statistischen Analysesoftware erstellt wurde. Die y-Achse entspricht der I-Response am Ende der Assoziationsphase, die x-Achse den unterschiedlichen Analyt-BSA-Konzentrationen. Dieses Diagramm wurde mithilfe der in Tabelle S4 angegebenen Datenpunkte generiert. Eine Zusammenfassung der Analyseergebnisse finden Sie in der Grafik; Für dieses Experiment beträgt der K D-Wert -0,009 ± -0,0003 μM und derR2-Wert 0,82. Ein negativerK-D-Wert nahe Null zeigt an, dass keine Wechselwirkung zwischen Hsp90 und BSA besteht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Zusammenfassung der I-Response-Werte, die an jedem Konzentrationspunkt generiert und von den Transistoren jedes Chips (drei verschiedene Transistoren für jeden Chip) gelesen werden. Diese Tabelle entspricht den Daten, die aus der zweiten Wiederholung extrahiert wurden, die für das zweite Experiment durchgeführt wurde, bei dem Hsp90 auf dem Chip immobilisiert wurde (500 nM) und 10 Konzentrationen von Cdc37-Analyten hergestellt wurden (0,4-200 nM). Die Datenpunkte aus dieser Tabelle wurden für die Analyse in der statistischen Analysesoftware verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2: Zusammenfassung der I-Response-Werte, die an jedem Konzentrationspunkt generiert und von den Transistoren jedes Chips (drei verschiedene Transistoren für jeden Chip) gelesen werden. Diese Tabelle entspricht den Daten, die aus der dritten Wiederholung extrahiert wurden, die für das zweite Experiment durchgeführt wurde, bei dem Hsp90 auf dem Chip immobilisiert wurde (500 nM) und 10 Konzentrationen von Cdc37-Analyten hergestellt wurden (0,4-200 nM). Die Datenpunkte aus dieser Tabelle wurden für die Analyse in der statistischen Analysesoftware verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S3: Zusammenfassung der I-Response-Werte, die an jedem Konzentrationspunkt generiert und vom Transistor jedes Chips (drei verschiedene Transistoren für jeden Chip) gelesen werden. Diese Tabelle entspricht den Daten des Kontrollexperiments, bei dem Hsp90 auf dem Chip immobilisiert wurde (500 nM) und 10 Konzentrationen von BSA-Analyten hergestellt wurden (0,4-200 nM). Die Datenpunkte aus dieser Tabelle wurden für die Analyse in der statistischen Analysesoftware verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dieser Studie wurde die Machbarkeit der Verwendung der FEB-Technologie (ein kinetischer Charakterisierungsansatz in Echtzeit) bewertet, um die biomolekulare Wechselwirkung zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bestimmen. Das erste explorative Experiment (erstes Experiment) schlug vor, dass die Auswahl der richtigen Analytkonzentrationen ein kritischer Teil des Experiments ist und dass das Experiment durch Einbeziehung von Konzentrationspunkten über und unter dem KD-Wert entworfen werden sollte, die auf der Grundlage der in der Literatur verfügbaren Daten vorhergesagt wurden.

Wenn es jedoch keine vorläufigen Informationen über die Wechselwirkung gibt, schlagen wir vor, ein vorläufiges Experiment zu entwerfen, indem ein breiter Bereich von Konzentrationspunkten sowohl in niedrigeren (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) als auch in höheren (1.000 nM, 2.500 nM, 5.000 nM) Bereichen einbezogen wird. Das vorläufige Experiment liefert eine grobe Schätzung des K D-Wertes und ermöglicht es, die nachfolgenden Experimente mit den richtigen Konzentrationsbereichen zu planen, um einen genauen KD-Wert zu erhalten. Das FEB-System bietet eine Edit-Protokoll-Funktion, bei der man die Anzahl der Konzentrationspunkte für das Experiment frei wählen kann.

Aus unserer Erfahrung sind die wichtigsten Schritte im FEB-Protokoll wie folgt. Der Zielprotein- und Analytpuffer sollte mit dem Kalibrierungspuffer identisch sein. Selbst ein kleines Puffer-Mismatch kann zu Schwankungen in der I-Response führen und unzuverlässige Ergebnisse liefern. Daher empfehlen wir, die Dialyse über Nacht durch einen ordnungsgemäßen Pufferaustausch durchzuführen. Das sorgfältige Pipettieren auf dem Biosensorchip während des Ansaugens oder Auftragens einer Lösung ist während des gesamten Experiments von entscheidender Bedeutung. Unvorsichtiges Pipettieren kann zu gebrochenen Transistoren oder Schwankungen in der I-Antwort führen; Achten Sie beim Pipettieren darauf, die empfindliche Oberfläche des Chips nicht zu berühren. Die EDC/Sulfo-NHS-Lösung, die im Chipaktivierungsprozess verwendet wird, sollte vor jeder Verwendung frisch gemischt werden. Die Verwendung einer alten Mischung kann zu einem nicht funktionalisierten Chip führen. Stellen Sie sicher, dass Sie für alle fünf sich wiederholenden Schritte (Kalibrierung, Assoziation, Dissoziation, Regeneration und Waschen), die an allen Zyklen des Experiments beteiligt sind, denselben Puffer verwenden.

Beim Vergleich von FEB mit gut etablierten biomolekularen Detektionssystemen auf dem Gebiet, wie BLI oder SPR, fanden wir heraus, dass alle drei Methoden ähnliche Vorteile haben43,44,45, nämlich: Sie sind markierungsfreie Systeme, die keine teuren Fluoreszenzfarbstoffe benötigen, um die Wechselwirkungen zu erkennen; sie können Wechselwirkungen auch in kleinen nM-Bereichen erkennen; Die Chips sind sowohl in SPR als auch in FEB wiederverwendbar und können für bis zu 10 Experimente effizient regeneriert und wiederverwendet werden, und alle drei Methoden liefern kinetische Daten in Echtzeit, und die Experimentierzeit ist kurz.

Der Hauptvorteil von SPR besteht darin, dass es umfangreichere Daten aus dem Experiment liefert, so dass man KD, Kon, Koff, Stöchiometrie und thermodynamische Parameter44 berechnen kann. Der Hauptvorteil von BLI ist seine Fähigkeit, mehrere Konzentrationen in einem Experiment zu testen. Die kinetischen Messungen können gleichzeitig für bis zu acht Konzentrationen durchgeführt werden, indem verschiedene Sensoren verwendet werden. Die BLI-Sensoren sind jedoch nicht wiederverwendbar, wodurch die Kosten des Experiments extrem hochsind 43.

Der Hauptvorteil von FEB ist seine automatisierte, benutzerfreundliche Software, die den Benutzer durch das Experiment führt, und seine offene Pipettierplattform, die es dem Benutzer ermöglicht, den Analyten bei jedem Schritt zum immobilisierten Ziel hinzuzufügen. Dieser offene Pipettieransatz in Kombination mit einer einfachen Software macht den FEB leicht zu erlernen und erfordert wenig oder gar kein Training. Es erfordert jedoch, dass der Benutzer eine grundlegende Beherrschung des Handpipettierens hat, und das Fehlen eines automatisierten Liquid Handling bedeutet, dass die Reproduzierbarkeit des Schritt-Timings vollständig vom Benutzer abhängt. Das gleiche Fehlen eines integrierten Liquid Handling bedeutet, dass die Chips und Instrumente im Vergleich zu SPR oder BLI kostengünstig sind. Das FEB weist auch eine hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit bei der Erkennung biomolekularer Wechselwirkungen aufgrund des definierten Herstellungsprozesses auf, der an der Herstellung von Biosensorchips beteiligt ist35.

Im Vergleich zur etablierten und standardmäßigen ITC-Detektionsmethode verwendet FEB während des gesamten Experiments nur 50 μL Analytvolumen bei nanomolaren Konzentrationen, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Keimbildung oder Aggregation von Proteinen verringert wird. Eines der größten Probleme bei ITC ist die Entgasung der Proteine vor dem Beladen, um Luftblasen zu vermeiden. Während des ITC-Experiments besteht die Möglichkeit, dass sich durch kontinuierliches Rühren und intensives Spülen Blasen in der Messzelle entwickeln, die die Probenlösung nachteilig spritzen oder zu Probenverlust führenkönnen 42. Die FEB-Technologie überwindet diese Herausforderungen der ITC, indem sie eine robuste Zielimmobilisierungschemie bietet, die Aggregation und das Blubbern reduziert, die Stabilität erhöht und die konzentrationsabhängigen Probleme der ITC verbessert.

Ein potenzieller Nachteil von FEB-Geräten ist ihre Anfälligkeit für Pufferzusammensetzungs- und Konzentrationsänderungen, die zu einer Drift in der Baseline führen können, die während der Anpassung und Analyse der Ergebnisse korrigiert werden sollte. Der Biosensorchip ist auch empfindlich gegenüber pH-Wert und Salz, so dass die Puffer, die während der Kalibrierung und Messung des Analyten verwendet werden, während des gesamten Experiments gleich sein müssen. Chemikalien, die als Konservierungsmittel (z. B. Natriumazid) und hydrophobe Moleküle verwendet werden, können den Sensor schädigen und sogar zu einer Zunahme der unspezifischen Bindung führen. Diese Nachteile können durch Beachtung der Pufferkonsistenz während der gesamten Messschritte, der Dialyse von störenden Verbindungen aus dem Analytbestand und einer geeigneten Passivierung der Oberfläche (z. B. Verwendung von Reinigungsmitteln, Proteinblockern oder verschiedenen PEG-Molekülen) gemildert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir erfolgreich starke PPI zwischen Hsp90/Cdc37 unter Verwendung der FEB-Technologie demonstrierten und ihre Interaktion mit ITC validierten, was ermutigende Daten zur Unterstützung von FEB als innovative alternative Methode für die PPI-Erkennung lieferte. Die FEB-Technologie bietet eine breite Palette von Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Arzneimittelforschung, Pharmazeutika, biomolekularen Analyse von kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen, Antikörperentwicklung, Arzneimittelvalidierung und Leitlinienoptimierung an unseren Fingerspitzen, indem sie die biologische In-vitro-Aktivität leicht in In-vivo-Wirksamkeit umsetzt. In Anbetracht der Vorteile der FEB-Technologie und ihrer immensen Anwendungen bei der Erforschung von PPI-, Protein- und DNA- oder RNA-Interaktionen sowie von Protein- und niedermolekularen (z. B. Arzneimittel-) Interaktionen schlagen wir vor, dass es sich um eine einzigartige, vielversprechende Technologie in der PPI-Detektions-Toolbox handelt. In unserem Fall bietet die FEB-Technologie ein wertvolles Werkzeug, um die Bindungswirksamkeit von Hsp90/Cdc37-PPI-Kandidatenantagonisten leicht zu bewerten, was dann bei der Auswahl vielversprechender Kandidaten für weitere In-vitro- und In-vivo-Bewertungen zu verschiedenen Krankheiten hilft, bei denen dieser PPI kritisch ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte, weder finanziell noch anderweitig.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss der Binational Science Foundation (BSF) an S.K.S. und N.Q. unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

Biochemie Ausgabe 181 Zellteilungszyklus 37 Cdc37 Hitzeschockprotein 90 Hsp90 Proteinkinase Graphen-Biosensor Feldeffekt-Biosensorik Krebs Biomolekulare Interaktionen
Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter