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Biochemistry

Explorando la interacción biomolecular entre la chaperona molecular Hsp90 y su proteína quinasa cliente Cdc37 utilizando tecnología de biodetección de efecto de campo

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

La biodetección de efectos de campo (FEB) es una técnica sin etiquetas para detectar interacciones biomoleculares. Mide la corriente eléctrica a través del biosensor de grafeno al que se inmovilizan los objetivos de unión. Se utilizó la tecnología FEB para evaluar las interacciones biomoleculares entre Hsp90 y Cdc37 y se detectó una fuerte interacción entre las dos proteínas.

Abstract

Las interacciones biomoleculares desempeñan un papel versátil en numerosos procesos celulares al regular y coordinar eventos biológicos funcionalmente relevantes. Las biomoléculas como proteínas, carbohidratos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos y enzimas son componentes fundamentales de los seres vivos; se ensamblan en redes complejas en biosistemas para sincronizar una miríada de eventos de la vida. Las proteínas suelen utilizar redes complejas de interactomas para llevar a cabo sus funciones; por lo tanto, es obligatorio evaluar tales interacciones para desentrañar su importancia en las células tanto a nivel celular como de organismo. Hacia este objetivo, introducimos una tecnología rápidamente emergente, la biodetección de efecto de campo (FEB), para determinar interacciones biomoleculares específicas. FEB es una técnica de detección biomolecular confiable y de sobremesa, sin etiquetas para determinar interacciones específicas y utiliza biosensores electrónicos de alta calidad. La tecnología FEB puede monitorear las interacciones en el rango nanomolar debido a los nanomateriales biocompatibles utilizados en su superficie de biosensor. Como prueba de concepto, se dilucidó la interacción proteína-proteína (PPI) entre la proteína de choque térmico 90 (Hsp90) y el ciclo de división celular 37 (Cdc37). Hsp90 es una chaperona molecular dependiente de ATP que desempeña un papel esencial en el plegamiento, la estabilidad, la maduración y el control de calidad de muchas proteínas, regulando así múltiples funciones celulares vitales. Cdc37 se considera una chaperona molecular específica de la proteína quinasa, ya que reconoce y recluta específicamente proteínas quinasas para Hsp90 para regular sus vías de transducción de señales aguas abajo. Como tal, Cdc37 se considera un co-chaperone de Hsp90. La vía chaperona-quinasa (complejo Hsp90/Cdc37) está hiperactivada en múltiples neoplasias malignas que promueven el crecimiento celular; por lo tanto, es un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer. El presente estudio demuestra la eficiencia de la tecnología FEB utilizando el sistema modelo Hsp90/Cdc37. FEB detectó un fuerte PPI entre las dos proteínas (valores de KD de 0,014 μM, 0,053 μM y 0,072 μM en tres experimentos independientes). En resumen, FEB es una plataforma de detección de PPI sin etiquetas y rentable, que ofrece mediciones rápidas y precisas.

Introduction

Interacciones biomoleculares:
Las proteínas son partes esenciales de los organismos y participan en numerosas vías moleculares como el metabolismo celular, la estructura celular, la señalización celular, las respuestas inmunes, la adhesión celular y más. Mientras que algunas proteínas realizan su(s) función(es) de forma independiente, la mayoría de las proteínas interactúan con otras proteínas utilizando una interfaz de unión para coordinar la actividad biológica adecuada1.

Las interacciones biomoleculares se pueden clasificar principalmente en función de las distintas características estructurales y funcionales de las proteínas involucradas2, por ejemplo, en función de las superficies de las proteínas, la estabilidad compleja o la persistencia de las interacciones3. La identificación de proteínas esenciales y su papel en las interacciones biomoleculares es vital para comprender los mecanismos bioquímicos a nivel molecular4. Actualmente, existen varios enfoques para detectar estas interacciones5: in vitro6, in silico7, en células vivas8, ex vivo9 e in vivo10, cada una con sus propias fortalezas y debilidades.

Los ensayos in vivo se realizan utilizando todo el animal como herramienta experimental11, ylos ensayos ex vivo se realizan en extractos de tejidos u órganos enteros (por ejemplo, corazón, cerebro, hígado) en un entorno externo controlado proporcionando alteraciones mínimas en condiciones naturales. La aplicación más común de los estudios in vivo y ex vivo es evaluar los efectos farmacocinéticos, farmacodinámicos y de toxicidad de los posibles agentes farmacológicos antes de los ensayos en humanos garantizando su seguridad y eficaciagenerales 12.

Las interacciones biomoleculares también se pueden detectar dentro de las células vivas. Las imágenes de células vivas nos permiten observar interacciones dinámicas a medida que ejecutan las reacciones de una vía bioquímica particular13. Además, las técnicas de detección, como la bioluminiscencia o la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, pueden proporcionar información sobre dónde y cuándo ocurren estas interacciones dentro de la célula14. Aunque la detección en células vivas ofrece detalles cruciales, estas metodologías de detección se basan en ópticas y etiquetas, que pueden no reflejar la biología nativa; también están menos controlados que los métodos in vitro y requieren experiencia especializada para realizar15.

Los métodos computacionales in silico se utilizan principalmente para el cribado a gran escala de moléculas diana antes de los experimentos in vitro . Los métodos de predicción computacional, las bases de datos basadas en computadora, el acoplamiento molecular, las relaciones cuantitativas estructura-actividad y otros enfoques de simulación de dinámica molecular se encuentran entre las herramientas in silico bien establecidas16. En comparación con las laboriosas técnicas experimentales, las herramientas in silico pueden hacer predicciones fácilmente con alta sensibilidad, pero con una precisión reducida en el rendimiento predictivo17.

Los ensayos in vitro se realizan con microorganismos o moléculas biológicas fuera de su contexto biológico estándar. Retratar las interacciones biomoleculares a través de métodos in vitro es fundamental para comprender las funciones de las proteínas y la biología detrás de la compleja red de funcionamiento celular. La metodología de ensayo preferida se elige de acuerdo con las propiedades intrínsecas de la proteína, los valores cinéticos y el modo e intensidad de las interacciones18,19.

La interacción Hsp90/Cdc37:
La vía chaperona-quinasa, que conecta Hsp90 y Cdc37, es una diana terapéutica prometedora en biología tumoral20. Hsp90 desempeña un papel central en el control del ciclo celular, el ensamblaje de proteínas, la supervivencia celular y las vías de señalización. Las proteínas que dependen de Hsp90 para sus funciones se entregan a Hsp90 para su complejación a través de una co-chaperona, como Cdc37. El complejo Hsp90/Cdc37 controla el plegamiento de la mayoría de las proteínas quinasas y sirve como centro para una multitud de redes de señalización intracelular21. Es una diana antitumoral prometedora debido a su elevada expresión en diversas neoplasias malignas, incluyendo leucemia mieloblástica aguda, mieloma múltiple y carcinoma hepatocelular22,23.

Técnicas de detección de interacción biomolecular in vitro de uso común
La coinmunoprecipitación (co-IP) es una técnica que se basa en la especificidad antígeno-anticuerpo para identificar interacciones biológicamente relevantes24. La principal desventaja de este método es su incapacidad para detectar interacciones de baja afinidad y valores cinéticos24. Se prefieren métodos biofísicos como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la resonancia de plasmón de superficie (SPR), la interferometría de biocapa (BLI) y la tecnología FEB para determinar los valores cinéticos.

ItC es un método de detección biofísica basado en la determinación de la energía de unión junto con un análisis termodinámico completo para caracterizar las interacciones biomoleculares25. La principal ventaja de ITC es que no requiere ningún etiquetado o fijación de la proteína objetivo. Las principales dificultades encontradas por el ITC son la alta concentración de proteína objetivo requerida para un experimento y la dificultad para analizar complejos no covalentes debido a pequeñas entalpías de unión26. Tanto SPR como BLI son técnicas biofísicas sin etiquetas que se basan en la inmovilización de la molécula diana en la superficie del sensor, seguida de inyecciones posteriores del analito sobre el objetivo inmovilizado27,28. En SPR se miden alteraciones en el índice de refracción durante las interacciones biomoleculares27; en BLI, la interferencia en la luz reflejada se registra en tiempo real como un cambio en la longitud de onda en función del tiempo28. Tanto SPR como BLI comparten ventajas comunes de ofrecer capacidades de alta especificidad, sensibilidad y detección29. En ambos métodos, la proteína diana se inmoviliza en las superficies de los biosensores y, por lo tanto, puede haber cierta pérdida de la conformación nativa del objetivo, lo que dificulta la discriminación entre interacciones específicas vs. no específicas30. BLI utiliza costosos biosensores desechables de fibra óptica para inmovilizar el objetivo y, por lo tanto, es una técnica costosa31. En comparación con estas herramientas de detección biomolecular bien establecidas, la tecnología FEB ofrece una plataforma confiable y libre de etiquetas mediante el uso de bajas concentraciones nanomolares para la detección biomolecular en tiempo real con caracterización cinética. La tecnología FEB también supera los burbujeantes desafíos que enfrenta el ITC y es más rentable en comparación con SPR o BLI.

Los biosensores basados en transistores de efecto de campo (FET) son un campo emergente para detectar interacciones biomoleculares al ofrecer diversas aplicaciones biomédicas. En el sistema FET, los objetivos se inmovilizan a los chips del biosensor y las interacciones se detectan mediante cambios en la conductancia32. La característica única a considerar en el desarrollo de un biosensor electrónico eficiente son las propiedades fisicoquímicas como la naturaleza semiconductora y la estabilidad química del material de recubrimiento utilizado para fabricar la superficie del sensor33. Los materiales convencionales como el silicio utilizado para FET han limitado la sensibilidad de los sensores porque requiere capas de óxido intercaladas entre el canal del transistor y un entorno específico para un funcionamiento adecuado34. Además, los transistores de silicio son sensibles a ambientes con alto contenido de sal, lo que dificulta la medición de las interacciones biológicas en su entorno natural. El biosensor basado en grafeno se presenta como una alternativa, ya que ofrece una excelente estabilidad química y campo eléctrico. Dado que el grafeno es una sola capa atómica de carbono, es extremadamente sensible como semiconductor y químicamente compatible con soluciones biológicas; ambas cualidades son deseables para generar biosensores electrónicos compatibles35. El notable potencial de carga ultra alta de las biomoléculas ofrecidas por los biosensores recubiertos de grafeno conduce al desarrollo de la tecnología FEB de biosensores basados en grafeno.

Principio de la tecnología FEB: FEB es una técnica de detección biomolecular sin etiqueta que mide la corriente eléctrica a través del biosensor de grafeno al que se inmovilizan los objetivos de unión. Las interacciones entre la proteína inmovilizada y el analito dan lugar a alteraciones en la corriente que se monitorizan en tiempo real, lo que permite mediciones cinéticas precisas36.

Instrumentación: El sistema FEB comprende un chip sensor de transistor de efecto de campo de grafeno (gFET) y un lector electrónico que aplica un voltaje constante durante todo el experimento (Figura 1). El analito se aplica en solución a la proteína diana inmovilizada en la superficie del biosensor. Cuando se produce una interacción, se mide y registra una alteración en la corriente en tiempo real. A medida que aumenta la concentración de analitos, la fracción de analito unido también aumentará, causando mayores alteraciones en la corriente. Utilizando el software de análisis automatizado proporcionado con el instrumento (Tabla de Materiales), I-Response se mide y registra en términos de unidades de biodetección (BU)37. I-Response se define como la alteración en la corriente (I) a través del chip biosensor medida en tiempo real sobre la interacción del objetivo inmovilizado con el analito. El software de análisis automatizado FEB puede analizar tanto la I-Response como la C-Response a eventos de interacción dinámica, donde la C-Response registra las alteraciones en la capacitancia (C). Las variaciones tanto en la I-Response como en la C-Response corresponden directamente a la fracción de analito unido y pueden analizarse más a fondo para generar valores KD . La preferencia predeterminada del software de análisis automatizado es I-Response.

Figure 1
Figura 1: Descripción general de la configuración experimental. (A) Chip basado en grafeno y un lector electrónico. (B) Una visión general de los componentes del chip. El chip está unido a dos electrodos que suministran corriente al sistema. La superficie del chip está cubierta con grafeno, que cuando se activa puede unir al objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Metodología:
Inicialmente, el chip biosensor activado se inserta en el dispositivo FEB (Figura 1) seguido de la ejecución de los pasos descritos a continuación: (1) Calibración: El experimento comienza con la calibración del sistema utilizando 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH = 7.4) para crear la respuesta de equilibrio basal. (2) Asociación: El analito se introduce en el chip, y el I-Response se monitorea hasta que se alcanza la saturación de unión. (3) Disociación: El analito se disocia usando 1x PBS. (4) Regeneración: Los restos del analito se eliminan usando 1x PBS. (5) Lavado: Se realizan un total de cinco lavados utilizando 1x PBS para la eliminación completa de los analitos unidos y no unidos del chip.

Análisis:
El análisis de datos se realiza utilizando el software totalmente automatizado proporcionado con el instrumento. El software de análisis automatizado genera un diagrama de ajuste de Hill con un valor KD . La gráfica de ajuste de Hill describe la asociación de un analito a la proteína objetivo en función de las concentraciones de analitos. La concentración a la que se alcanza una respuesta medio máxima es proporcional al valor KD . Un valor bajo de KD representa una alta afinidad de unión y viceversa.

Para validar los datos obtenidos del experimento FEB, las respuestas I se extraen de cada punto de lectura para cada concentración de analito utilizando el software de revisión / exportación de datos y se pueden exportar a otro software de análisis estadístico (consulte la Tabla de materiales) como se explica a continuación.

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Protocol

NOTA: Las proteínas recombinantes utilizadas en este estudio, Hsp90 y Cdc37, se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales).

1. Activación del chip

NOTA: Todos los materiales que se utilizarán en el experimento se enumeran en la Tabla de materiales. Filtre todas las soluciones preparadas a través de un filtro estéril de 0,2 μm.

  1. Preparar la solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) añadiendo 2 mg de EDC a 2,5 ml de tampón de ácido sulfónico etano (MES) de 1 M de 2-(N-morfolino) (pH = 6,0) en un tubo de 15 ml. Preparar soluciones de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) añadiendo 6 mg de sulfo-NHS a 2,5 ml de tampón MES de 1 M (pH = 6,0) en un tubo separado de 15 ml. Alícuota 50 μL de cada solución en tubos independientes y guárdela a -20 °C para su uso futuro.
  2. Mezclar volúmenes iguales de solución de sulfo-NHS de arena EDC (50 μL de EDC + 50 μL de sulfo-NHS) mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo (no vórtice).
    NOTA: La solución mixta de EDC/sulfo-NHS debe utilizarse en un plazo de 30 minutos para mantener una reticulación efectiva para una correcta funcionalización del chip.
  3. Coloque el chip biosensor (5,7 cm x 2,4 cm; ver Tabla de materiales) suministrado por la empresa en una placa de Petri de vidrio con una tapa ajustada. Se sugiere que todos los pasos de funcionalización involucrados en la activación del chip se realicen dentro de la placa de Petri. Aplique 50 μL de tampón MES de 1 M (pH = 6.0) al chip biosensor, incube durante 1 min a temperatura ambiente y luego aspire el tampón.
  4. Aplique 50 μL de solución EDC/sulfo-NHS inmediatamente al chip del sensor. Cubra la placa de Petri e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución EDC/sulfo-NHS del chip.
  5. Enjuague el chip una vez con 50 μL de tampón MES de 1 M (pH = 6.0); aspirar el tampón MES.

2. Inmovilización de proteínas diana

  1. Enjuague el chip 2x con 50 μL de 1x PBS (pH = 7.4). Aspire el PBS del chip y agregue la molécula objetivo, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
    NOTA: La falta de coincidencia del búfer puede arruinar todo el experimento; por lo tanto, antes del experimento, es importante asegurarse de que la molécula objetivo esté en el mismo tampón que el utilizado para la calibración (por ejemplo, 1x PBS (pH = 7.4)). Si es necesario, realice un intercambio de tampón mediante diálisis durante la noche antes del experimento. En este experimento, se realizó diálisis durante la noche para ambas proteínas recombinantes, Hsp90 y Cdc37, contra 1x PBS (pH = 7.4; ver Tabla de Materiales) con un intercambio tampón adecuado a 4 °C. La concentración del material objetivo (Hsp90 en este caso) puede variar según los diferentes protocolos experimentales y la naturaleza de los materiales objetivo (proteína/péptido/ligandos).
  2. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución que contiene la molécula diana y enjuague 3x con 50 μL de 1x PBS (pH = 7.4). Aspire la solución 1x PBS (pH = 7.4) del chip.
  3. Añadir 50 μL de solución Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol en 1x PBS (pH = 7,4)) al chip. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 min a temperatura ambiente. Aspire la solución Quench 1 del chip.
  4. Añadir 50 μL de solución Quench 2 (1 M de etanolamina (pH = 8,5)) al chip. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución Quench 2 del chip y enjuague el chip 5x usando 50 μL de 1x PBS, dejando la última gota de PBS en el sensor.

3. Preparación de muestras de analitos

  1. Preparar series de dilución de analitos para Cdc37 en el rango de concentración deseado. Para el primer experimento se utilizaron las siguientes concentraciones: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM y 5.000 nM. Para el segundo experimento, se utilizó un conjunto diferente de concentraciones que van desde 0,4 nM a 200 nM.
  2. Diseñe el experimento para incluir al menos ocho concentraciones diferentes de analitos para obtener un valor KD confiable. Preparar las diferentes diluciones de la proteína de analito en el mismo tampón que el utilizado para la calibración y la proteína objetivo; aquí es 1x PBS (pH = 7.4).

4. Carga del chip biosensor activado en el dispositivo FEB

NOTA: El dispositivo FEB consiste en un lector con indicaciones de luz LED y un cartucho para insertar el chip biosensor.

  1. Después de la inmovilización de la proteína objetivo, inserte el chip activado en el cartucho del dispositivo, que está conectado a través de USB a una computadora. Después de la inserción del chip, se mostrará una luz LED verde en el lector que indica que el dispositivo FEB está listo para el experimento. Instale el software automatizado (consulte la Tabla de materiales) suministrado por la empresa en la computadora, a la que está conectado el dispositivo FEB, para monitorear el experimento paso a paso como se describe a continuación.

5. Ejecuta el experimento

  1. Presione el módulo Ejecutar experimento en el software automatizado y elija 10 puntos con regeneración o cualquier otro protocolo deseado. Complete los siguientes detalles: nombre del operador, nombre del experimento, fecha (por ejemplo, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); tampón de regeneración (por ejemplo, tampón PBS); objetivo inmovilizado (por ejemplo, Hsp90); analito en solución (por ejemplo, Cdc37). Consulte la Figura suplementaria S1 para obtener más información.
  2. Pulse el botón Iniciar el experimento que se muestra en el software y siga las instrucciones que muestra el software automatizado como se describe a continuación.
    NOTA: El software está totalmente automatizado, es fácil de usar y guía al usuario a lo largo del experimento paso a paso. Aparecerá una ventana emergente en la pantalla con instrucciones para continuar en cada paso del experimento. El software proporcionará instrucciones para cada paso repetitivo consecutivamente desde la calibración, la asociación de analitos, la disociación, la regeneración y el lavado (5x) para cada concentración de analitos a lo largo del experimento.
  3. Realizar la calibración del instrumento. Para ello, aspire la solución de PBS restante del chip y aplique 50 μL de tampón de calibración (1x PBS; pH = 7.4). Pulse el botón Continuar y espere 5 minutos hasta que finalice el paso de calibración. El software muestra el punto final determinado para el paso de calibración (5 min) con una alarma de advertencia para el seguimiento.
  4. A continuación, realice una asociación de analitos. Para ello, aspire el tampón de calibración del chip y aplique 50 μL de la concentración de analito más baja (25 nM de Cdc37). Pulse el botón Continuar y espere 5 minutos hasta que finalice el paso de asociación. El software muestra el punto final para el paso de asociación (5 min) con una alarma de advertencia para continuar.
  5. Realizar una disociación de analitos. Para ello, aspire la solución de analito del chip y aplique 50 μL del tampón de disociación (1x PBS; pH = 7.4). Pulse el botón Continuar y espere 5 minutos hasta que finalice la duración del paso de disociación (5 min). El software muestra el punto final para el paso de disociación (5 min) con una alarma de advertencia para el seguimiento.
  6. A continuación, realice la regeneración del chip. Aspire la solución de disociación del chip y aplique 50 μL de tampón de regeneración (1x PBS; pH = 7.4). Pulse el botón Continuar y espere 30 s hasta que finalice la duración del paso de regeneración (30 s). El software muestra el punto final para el paso de regeneración (30 s) con una alarma de advertencia para el seguimiento.
  7. Por último, lava el chip. Aspire la solución de regeneración del chip y aplique 50 μL de tampón de lavado (1x PBS; pH = 7.4) al chip. Aspira la solución del chip y repite esto 5x. Deje la última gota de búfer de lavado en el chip y presione el botón Continuar y espere 30 s hasta que finalice la duración del paso de lavado en la pantalla del software.
    NOTA: El software muestra el punto final para el paso de lavado (30 s) con una alarma de advertencia para continuar con el siguiente ciclo del experimento.
  8. Repita los pasos para cada concentración de analito utilizada; los cinco pasos de calibración, asociación de analitos, disociación, regeneración y lavado (5x) constituyen un ciclo. Para el experimento que se muestra aquí, realizamos 10 ciclos para 10 concentraciones de analitos (que van desde 25 nM a 5,000 nM o 0.4 nM a 200 nM; Figura 2).

6. Análisis

  1. Presione el botón Análisis que se encuentra en la parte superior del software de análisis automatizado al final del experimento. Aparecerá una ventana de visualización que contiene todos los puntos experimentales. En la ventana, asegúrese de que las concentraciones de analitos utilizadas para el protocolo prescrito sean correctas.
  2. Pulse el botón Ejecutar análisis para generar el valor KD automáticamente. El software genera una gráfica de ajuste de Hill trazando las concentraciones de analitos contra las I-Respuestas correspondientes a partir de las cuales se calcula la constante de disociación en equilibrio, el valor KD .
  3. Exporte los datos sin procesar para su análisis en otro software de análisis estadístico utilizando el software de revisión/exportación de datos como se describe a continuación.
    1. Copie el archivo R1R creado automáticamente al final del experimento (por ejemplo, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) en una nueva carpeta en el escritorio. Abra el software de revisión/exportación de datos suministrado por la empresa (consulte la figura complementaria S2A).
    2. Haga clic en Procesamiento de datos > procesar archivos R1R > Aceptar en la pantalla de inicio del software de revisión / exportación de datos.
    3. Seleccione la carpeta que contiene los archivos R1R creados en el escritorio en el paso 6.3.1. y pulse el botón OK . Esto crea una copia de los datos originales de R1R, para revisar y editar los datos sin anular el archivo original.
    4. Presione el icono de procesamiento de datos que se ve en la pantalla de inicio del software de revisión / exportación de datos. Presione Cargar archivos R1R procesados > Aceptar. Seleccione la misma carpeta creada en el paso 6.3.1 que contiene los archivos R1R procesados. Pulse OK. En este paso, la carpeta que contiene los archivos del experimento está lista para ser revisada.
    5. En la pantalla de inicio del software de revisión/exportación de datos, pulse Análisis de datos. Seleccione Calibración > Calibrar archivos R1R editados > Aceptar (consulte la Figura suplementaria S2B). Este paso calibra todos los puntos de datos de acuerdo con el primer paso de calibración, para crear una línea de base.
    6. En la pantalla de inicio del software de revisión/exportación de datos, pulse Análisis de datos. Seleccione Revisar y editar archivos R1R > Aceptar. Revise los puntos de datos, elimine puntos o agregue pasos mediante el botón Eliminar/Agregar paso. Asegúrese de que todos los pasos estén en el lugar correcto, por ejemplo, el paso de calibración está en la línea de base, el paso de asociación está en el pico (consulte la Figura suplementaria S3) y, a continuación, presione el botón Guardar para guardar todos los cambios realizados.
    7. En la pantalla de inicio del software de revisión/exportación de datos, pulse Análisis de datos. Seleccione Analizar/Trazar datos, elija los pasos para exportar (consulte la Figura suplementaria S4). Agregue cada paso de asociación (por ejemplo, paso 2, paso 7, etc.) después de restar el paso de calibración (por ejemplo, paso 1, paso 6, etc.) a la lista de exportación antes de exportar los datos.
    8. Pulse Exportar estos datos. El software genera un archivo de hoja de cálculo que contiene la I-Response para cada punto de datos de concentración de analitos de cada transistor (si todos los transistores están funcionando, tendremos tres valores diferentes de I-response para cada punto de concentración). Utilice este archivo de hoja de cálculo para analizar más a fondo los datos en el software estadístico.
  4. Abra el software de análisis estadístico. Crear una tabla XY con tres valores Y; presione Crear. Los datos de esta tabla (valores X, Y) se copian del archivo de hoja de cálculo creado en el paso 6.3.8. El eje x corresponde a la concentración de analito (dependiendo de la concentración utilizada), y los tres valores Y corresponden a las I-Respuestas, obtenidas del software de Revisión de Datos/Exportación suministrado por la empresa.
  5. Pulse Analizar estos datos. Elija Análisis XY > regresión no lineal (ajuste de curva) > saturación de enlace > un sitio > total. El software analizará automáticamente los datos, generará el valor KD y creará un gráfico de los puntos de datos.

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Representative Results

Resultados del experimento 1:
La proteína diana Hsp90 (500 nM) se inmovilizó en el chip siguiendo el protocolo de inmovilización objetivo descrito anteriormente. Para el primer experimento, se prepararon 10 concentraciones de la proteína analito, Cdc37, que van desde 25 nM a 5.000 nM, en base a los datos disponibles en la literatura (ver Tabla 1).

Los pasos del experimento pueden ser monitoreados en tiempo real siguiendo las alteraciones que ocurren en la I-Respuesta (Figura 3A). Uno puede visualizar cómo cada paso incluido en el protocolo afecta la I-Response a lo largo del experimento. Por ejemplo, la I-Response es cercana a cero durante la calibración, y en el paso de asociación, la I-Response aumenta gradualmente con el aumento de las concentraciones de analito (Cdc37). Al observar los datos de este experimento (Figura 3A), se observó un aumento repentino en la I-Response en bajas concentraciones de analitos (50 BU a 25 nM). Se esperaba una baja I-Response a baja concentración de analitos que aumentará gradualmente con el aumento de las concentraciones. Este aumento repentino sugirió que se debería diseñar un experimento que incluyera puntos de concentración de analitos más bajos.

Siguiendo los pasos del protocolo discutidos anteriormente, los datos se analizaron en el software de análisis automatizado proporcionado, que generó automáticamente una gráfica de ajuste de Hill con un valor KD calculado (Figura 3B). El valor KD calculado a partir del software de análisis automatizado para el primer experimento fue de 350.000 ± 76.000 μM. La mayoría de las interacciones biológicas comunes mostraron un valor de KD en el rango bajo de μM o incluso en el rango de nM; por lo tanto, el valor KD generado para el primer experimento es muy alto.

Puede haber varias explicaciones para el alto valor de KD observado: puede haber una unión de baja afinidad entre las dos proteínas específicas estudiadas (Hsp90 / Cdc37), lo que significa que se requiere una alta concentración de ligando para las interacciones moleculares; el experimento podría haber sido diseñado con concentraciones de analitos no ideales y fuera de rango; el alto valor puede deberse a los parámetros incorporados utilizados en el módulo de ajuste del software de análisis. El software de análisis automatizado utiliza un módulo de análisis dosis-respuesta para ajustarse a los puntos de datos, pero algunas interacciones pueden no encajar bien en este modelo, lo que da datos falsos, lo que resulta en valores altos de KD .

Para obtener un valor preciso de KD con una gráfica de Hill saturada, se requiere la estandarización del experimento por ensayo y error que incluye puntos de concentración de analitos más bajos y más altos, para adquirir el valor de KD más bajo con una tasa de error baja.

Teniendo en cuenta todos estos factores, los datos del software de análisis se exportaron a un software de análisis estadístico adicional. La I-Response para cada punto de asociación se extrajo utilizando el software automatizado de revisión/exportación de datos y se resume en la Tabla 2 siguiendo los pasos discutidos anteriormente en el paso de análisis (paso 6).

Los resultados del software de análisis estadístico (Figura 3C) mostraron un valor de KD relativamente bajo con una desviación estándar alta (0,011 ± 0,494 μM) y un valor de R2 bajo de 0,78. La variación significativa observada en el valor KD y el bajo valor R2 sugirieron que los puntos de concentración elegidos para este experimento no son óptimos. Además, también se observó que algunos puntos del gráfico no encajaban bien con la línea de tendencia de la gráfica (Figura 3C); esto reforzó la necesidad de diseñar un segundo experimento mediante la inclusión de diferentes puntos de concentración de analitos.

Los parámetros incorporados utilizados por los dos software de análisis son completamente diferentes, y se reflejan en el proceso de generación de valores KD . Las diferencias en los valores de KD obtenidos de los dos programas de análisis (350.000 ± 76.000 μM vs. 0,011 ± 0,494 μM) se pueden atribuir al hecho de que se utilizaron diferentes módulos de análisis para el cálculo. El análisis realizado en el software de análisis estadístico puede ser un mejor ajuste para esta interacción, dando así un valor KD más bajo.

Sin embargo, si se combinan los resultados de ambos análisis (350.000 ± 76.000 μM y 0,011 ± 0,494 μM), se puede concluir que el primer experimento no fue óptimo y que se requerirían puntos de concentración adicionales.

Para validar este punto, se excluyó el punto gráfico no correlacionado, 3.000 nM (ver Figura suplementaria S5). Los resultados del análisis mostraron un valor KD de 0,006 ± 0,081 μM con un valor R2 de 0,98. Estos resultados indicaron que el próximo experimento debería diseñarse centrándose en concentraciones más relevantes. Por lo tanto, se realizó un segundo experimento para evaluar el IBP Hsp90/Cdc37 utilizando diferentes puntos de prueba con concentraciones por debajo y por encima de la KD predicha.

Resultados del experimento 2:
La proteína objetivo, Hsp90 (500 nM) se inmovilizó en el chip utilizando el protocolo descrito anteriormente. Un total de 10 concentraciones del analito (Cdc37) se prepararon de la siguiente manera: 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM y 200 nM. El segundo experimento fue diseñado mediante la inclusión de diferentes puntos de concentración de analitos, considerando todos los conocimientos obtenidos del experimento anterior como se mencionó anteriormente.

Durante el experimento, cada paso fue monitoreado en tiempo real (Figura 4A). Aquí, el gráfico I-Response en tiempo real (derivado de las bajas concentraciones del analito-0.4 nM, 0.6 nM, 1.6 nM) comienza inicialmente desde cero y aumenta gradualmente al aumentar las concentraciones de analitos en cada ciclo del experimento en comparación con el aumento repentino de I-Response observado en el primer experimento.

Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, los datos fueron analizados utilizando el software de análisis automatizado (Figura 4B). El valor de KD calculado a partir del software de análisis automatizado para este experimento fue de 0,0673 ± 0,0002 μM, lo que sugirió una fuerte interacción entre la proteína diana Hsp90 y el analito Cdc37. La desviación estándar de 0,0002 μM fue mucho menor que la obtenida en el primer experimento, lo que da confianza en que los nuevos datos son mucho más fiables.

Para validar este resultado, exportamos los puntos de datos (Tabla 3) a otro software de análisis estadístico como se explicó anteriormente; los resultados del análisis se resumen en la Figura 4C.

Utilizando el software de análisis estadístico, se encontró que el valor KD para Hsp90/Cdc37 PPI es de 0.014 ± 0.005 μM (Figura 4C). Los bajos valores de KD y la desviación estándar indican una fuerte interacción entre las dos proteínas, Hsp90 y Cdc37. Además, el valor R2 de 0,99 indica que el análisis se ajusta perfectamente a los puntos del gráfico experimental. Ambos programas de análisis mostraron consistencia en los resultados, con valores bajos de KD de aproximadamente 0,0673 ± 0,0002 μM y 0,014 ± 0,005 μM, respectivamente.

Para confirmar la reproducibilidad y precisión del experimento, el mismo experimento se realizó en dos réplicas utilizando Hsp90 (500 nM) como proteína objetivo y Cdc37 como analito con las mismas concentraciones que van desde 0,4 nm a 200 nm que se utilizaron en el segundo experimento. Durante el experimento, cada paso fue monitoreado en tiempo real (Figura Suplementaria S6A y Figura Suplementaria S7A). El valor KD calculado a partir del software de análisis automatizado se muestra en la Figura Suplementaria S6B y la Figura Suplementaria S7B (0,053 ± 0,002 μM y 0,0719 ± 0,0007 μM, respectivamente). Como se mencionó anteriormente, los puntos de datos se exportaron (Tabla suplementaria S1 y Tabla suplementaria S2) a otro software de análisis estadístico, y los resultados se muestran en la Figura suplementaria S6C y la Figura suplementaria S7C (Figura suplementaria S6C: KD es 0.003 ± 0.009 μM y R2 es 0.99; Figura suplementaria S7C: KD es 0.004 ± 0.009 μM y R2 es 0.99). Los resultados de las dos réplicas de ambos software de análisis corroboraron bien y confirmaron la precisión, repetibilidad y reproducibilidad de los datos experimentales de Hsp90 / Cdc37 FEB.

También se realizó un estudio control en el que se dilucidó la interacción biomolecular entre Hsp90 y una proteína control, la albúmina sérica bovina (BSA). El estudio de control utilizando BSA como analito se realizó utilizando una configuración experimental idéntica y concentraciones de analito utilizadas en el segundo experimento. Se prepararon un total de 10 concentraciones de la proteína de control, BSA, que oscilaban entre 0,4 nM y 200 nM en 1x PBS (pH = 7,4) y cada paso del experimento se monitoreó en tiempo real.

Similar al experimento con Hsp90 y Cdc37, el gráfico I-Response en tiempo real comienza inicialmente desde 0; sin embargo, en el estudio de control, la I-Respuesta no aumentó gradualmente tras el aumento de las concentraciones de analitos (Figura suplementaria S8A). Los datos también se analizaron utilizando el software de análisis automatizado (Figura suplementaria S8B), y el software no pudo calcular el valor KD a partir de los puntos de datos de este experimento. Se evidencia, a partir de Hill Plot generado a partir del software, que no hay interacción entre Hsp90 y el analito BSA de control. Para validar este resultado, exportamos los puntos de datos (Tabla suplementaria S3) a otro software de análisis estadístico como se explicó anteriormente. Utilizando el software de análisis estadístico, se encontró que el valor de KD para Hsp90/BSA PPI es negativo (Figura suplementaria S8C; KD es -0.009 ± -0.0003 μM), lo que nuevamente indica que no hay interacción entre las dos proteínas, Hsp90 y BSA. Además, el valor R2 (0,82) indica que el análisis no se ajustó a los puntos del gráfico experimental. Ambos software de análisis mostraron consistencia en los resultados de que Hsp90 y BSA no interactúan.

Al comparar los datos experimentales de Hsp90/Cdc37 FEB con otros datos experimentales disponibles en la literatura, se encontró que los valores de KD obtenidos en este estudio (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM y KD = 0,072 ± 0,001 μM) fueron en dos órdenes de magnitud inferiores a los datos publicados anteriormente (KD = 1,46 μM38 o 6 μM39 ). Estas diferencias se pueden atribuir al uso de construcciones humanas Hsp90 y Cdc37 de longitud completa en los experimentos actuales. Se realizaron estudios previos sobre construcciones de levadura Hsp90 que contenían solo proteínas parciales38 o proteínas homólogas de C. elegans 39 (Tabla 1). Para validar los resultados obtenidos en el sistema FEB, se realizaron experimentos ITC.

Evaluación del IPP Hsp90/Cdc37 utilizando el sistema ITC:
El ITC se considera el estándar de oro para investigar las interacciones biomoleculares. Además, realizamos ITC para determinar la cinética termodinámica del IBP Hsp90/Cdc37, y como validación para el experimento FEB. El Hsp90 y el Cdc37 se someten a diálisis contra PBS (pH = 7.0) antes de la ITC. Aproximadamente 0,25 μM de solución de la proteína diana (Hsp90) y 2,5 μM de solución de proteína de analito (Cdc37) se prepararon en PBS para las valoraciones calorimétricas. Se tituló un volumen total de 80 μL de solución de Cdc37 a intervalos consecutivos desde la jeringa giratoria hasta la célula que contenía 150 μL de solución de Hsp90 a 298,15 K. Cada inyección ocurrió durante una duración de 4 s, y el intervalo de tiempo entre inyecciones consecutivas fue de 150 s. Se realizaron un total de 19 inyecciones de 2 μL cada una con una velocidad de agitación de 500 rpm y una potencia de referencia de 41,9 μW, respectivamente. Se monitoreó la variación de calor resultante de la interacción Hsp90/Cdc37, y los datos finales obtenidos al final de las inyecciones de analito Cdc37 se ajustaron utilizando el software de análisis ITC suministrado por la empresa. Se estimaron las variaciones de calor junto con los parámetros termodinámicos como el cambio de entalpía molar (ΔH), el cambio de entropía (ΔS), el número de sitios de unión (n) y la constante de disociación de equilibrio (KD) entre Hsp90/Cdc37 PPI. El cambio de energía libre de Gibbs (ΔG) también se calculó a partir de la ecuación ΔG = ΔH - TΔS después de obtener parámetros térmicos del termograma ITC.

La gráfica ITC revela la cantidad de calor consumido o liberado durante las interacciones biológicas para dilucidar la naturaleza de las interacciones y las fuerzas intermoleculares que gobiernan el PPI40. Cdc37 (2,5 μM) se tituló en Hsp90 (0,25 μM), y las curvas correspondientes se representan en la Figura 5A, B. Se encontró que la gráfica ITC obtenida era exotérmica y se ajustó en un modelo de sitio de unión único que exhibía una estequiometría de unión (n) de uno, energía de unión, ΔG = -45.9 kJ / mol y valor KD = 0.009 μM. La ligera inconsistencia observada en forma de desplazamiento endotérmico al inicio del termograma ITC (Figura 5A) sugiere la formación de burbujas al valorar la proteína del analito a la célula de medición41,42. Entre los IBP de Hsp90/Cdc37, los experimentos de ITC realizados a concentraciones cada vez más altas, el exceso de 10 veces de Cdc37 (concentración de Hsp90 = 0,25 μM y concentración de Cdc37 = 2,5 μM) exhibió parámetros de unión aceptables al alcanzar una curva de saturación. El valor KD obtenido de ITC (KD = 0,009 μM) se correlacionó bien con el valor KD calculado utilizando la tecnología FEB (KD = 0,014 μM, 0,053 μM y 0,072 μM), lo que respalda fuertemente la sensibilidad y precisión de FEB en la detección de Hsp90/Cdc37 PPI.

Figure 2
Figura 2: Resumen del protocolo. (A) Resumen de los pasos para el proceso de activación del chip. (B) Representación gráfica de los cinco pasos repetidos en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Archivos de datos generados a partir del experimento 1. (A) Datos del experimento monitoreados en tiempo real. El eje y corresponde a la I-Respuesta en unidades biosensores (BU), y el eje x corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. Esta cifra corresponde a los datos del primer experimento. (B) Diagrama hill fit generado a partir del software de análisis automatizado. El eje y corresponde a I-Respuesta, el eje x corresponde a concentraciones de analito (Cdc37) en nM. Para este experimento, el valor KD es de 350.000 ± 76.000 μM. (C) Diagrama de asociación generado utilizando el software de análisis estadístico. El eje y corresponde a I-Response al final de la fase de asociación, el eje x corresponde a las diferentes concentraciones de analito, Cdc37. Esta gráfica se generó utilizando los puntos de datos proporcionados en la Tabla 2. El resumen de los resultados del análisis se proporciona en el gráfico; para este experimento, el valor KD es 0.011 ± 0.494 μM y el valor R2 es 0.78. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Archivos de datos generados a partir del experimento 2. (A) Datos del experimento monitoreados en tiempo real. El eje y corresponde a la I-Respuesta en unidades biosensores (BU), y el eje x corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. Esta cifra corresponde a los datos del segundo experimento. (B) Diagrama hill fit generado a partir del software de análisis automatizado. El eje y corresponde a I-Respuesta, el eje x corresponde a la concentración de analito (Cdc37) en nM. Para este experimento, el valor de KD es 0,0673 ± gráfico de asociación de 0,0002 μM (C) generado utilizando el software de análisis estadístico. El eje y corresponde a I-Response al final de la fase de asociación, el eje x corresponde a las diferentes concentraciones de analito Cdc37. Esta gráfica se generó utilizando los puntos de datos proporcionados en la Tabla 3. El resumen de los resultados del análisis se proporciona en el gráfico; para este experimento, el valor KD es 0.014 ± 0.005 μM y el valor R2 es 0.99. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Termograma ITC de interacción Hsp90 y Cdc37. (A) El panel superior representa las curvas de evolución de calor correspondientes obtenidas debido a inyecciones consecutivas de Cdc37 (2,5 μM) en Hsp90 (0,25 μM) a 298,15 K. La potencia diferencial (DP) representa la potencia diferencial en función del tiempo. (B) Los puntos de datos integrados en el panel inferior designan el calor normalizado correspondiente frente a la relación molar de Hsp90/Cdc37. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Ensayos realizados Análisis FEB KD Análisis de prisma KD Origen de la construcción Aminoácidos Referencias
ITC 1,46 μM y 1,32 μM NA Levadura Hsp90 Dominio N-terminal de Hsp90 36
Cdc humano37
SPR 6 μM NA C. elegans Longitud total 37
FEB - Primera repetición 0,014 μM 0,067 μM Hsp90 humano Longitud total Realizado en este estudio
Cdc humano37
FEB - Segunda repetición 0,053 μM 0,003 μM Hsp90 humano Longitud total Realizado en este estudio
Cdc humano37
FEB - Tercera repetición 0,072 μM 0,004 μM Hsp90 humano Longitud total Realizado en este estudio
Cdc humano37
ITC 0,009 μM NA Hsp90 humano Longitud total Realizado en este estudio
Cdc humano37
FEB- Estudio de control Sin datos (No hubo datos suficientes para calcular la KD) -0,009 μM (el valor KD con valores negativos indica que no hay interacción) Hsp90 humano Longitud total Realizado en este estudio
BSA

Tabla 1: Evaluación del IBP Hsp90/Cdc37 utilizando diferentes métodos reportados en este estudio y en la literatura.

Concentraciones de analitos (nM) Transistor I-Response 1 Transistor I-Response 2 Transistor I-Response 3 Promedio
I-Respuesta
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tabla 2: Resumen de los valores de I-Response generados a partir de tres transistores diferentes de cada chip en cada punto de concentración del primer experimento.

Concentraciones de analitos (nM) Transistor I-Response 1 Transistor I-Response 2 Transistor I-Response 3 Promedio de I-Response
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tabla 3: Resumen de los valores de I-Response generados a partir de tres transistores diferentes de cada chip en cada punto de concentración del segundo experimento.

Figura suplementaria S1: Captura de pantalla de la pantalla principal del software automatizado antes del comienzo del experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S2: Captura de pantalla de la pantalla principal del software automatizado para el procesamiento y análisis de datos. (A) Visualización en la pantalla principal del software de revisión/exportación de datos que muestra las opciones de procesamiento de datos. (B) La pantalla principal del software de revisión/exportación de datos que muestra las opciones de análisis de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Los puntos de datos de revisión obtenidos del software de revisión/exportación. En este paso, revise el experimento y agregue o elimine puntos de datos. Asegúrese de que el punto de asociación (2, 7, 12, 17, 22, etc.) esté siempre en la elección. Por ejemplo, la primera elección de la izquierda es el punto de datos número 2 y luego el punto de datos número 10 (pero debe ser el número 7). Para resolver esto, simplemente elimine los puntos 3, 4 y 5. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S4: Exportar lista de datos, por ejemplo. En este paso, elija qué puntos de experimento se van a exportar. Elija un punto de asociación (2, 7, 12, 17, 22, etc.) y reste los pasos de calibración anteriores (1, 6, 11, 16, 21, etc.). Agregue todos los puntos a la lista de exportación y exporte estos datos para obtener una hoja de cálculo con la I-Response para cada punto de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S5: Gráfico de asociación generado utilizando el software de análisis estadístico. El eje y corresponde a I-Response al final de la fase de asociación, el eje x corresponde a las diferentes concentraciones de analito Cdc37. Esta gráfica se generó utilizando los puntos de datos del primer experimento y excluyó el punto de datos de concentración de 3.000 nM. El resumen de los resultados del análisis se proporciona en el gráfico; para este experimento, el valor KD es 0.006 ± 0.081 μM y el valor R2 es 0.98. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S6: Los archivos de datos generados a partir del experimento 2 replican 1. (A) Datos de experimentos monitoreados en tiempo real. El eje y corresponde a la I-Respuesta en unidades biosensores (BU), y el eje x corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. Esta cifra corresponde a los datos de la segunda repetición realizada en el segundo experimento donde se inmovilizó Hsp90 en el chip (500 nM) y se prepararon 10 concentraciones de analito Cdc37 (0,4-200 nM). El gráfico I-Response en tiempo real comienza inicialmente desde 0 y aumenta gradualmente al aumentar las concentraciones de analitos en cada ciclo del experimento, lo que sugiere que el experimento es exitoso. (B) Diagrama hill fit generado a partir del software de análisis automatizado. El eje y corresponde a I-Respuesta, el eje x corresponde a concentraciones de analito (Cdc37) en nM. Los resultados del análisis automatizado mostraron un valor de KD relativamente bajo y una desviación estándar baja de 0,0531 ± 0,0002 μM, lo que sugiere una fuerte interacción entre Hsp90 y Cdc37. (C) La gráfica de asociación generada utilizando el software de análisis estadístico. El eje y corresponde a I-Response al final de la fase de asociación, el eje x corresponde a las diferentes concentraciones de analito Cdc37. Esta gráfica se generó utilizando los puntos de datos proporcionados en la Tabla S1. El resumen de los resultados del análisis se proporciona en el gráfico; para este experimento, el valor KD es 0.003 ± 0.009 μM y el valor R2 es 0.99. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S7: Los archivos de datos generados a partir del experimento 2 replican 1. (A) Datos de experimentos monitoreados en tiempo real. El eje y corresponde a la I-Respuesta en unidades biosensores (BU), y el eje x corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. Esta cifra corresponde a los datos de la tercera repetición en el segundo experimento donde se inmovilizó Hsp90 en el chip (500 nM) y se prepararon 10 concentraciones de analito Cdc37 (0,4-200 nM). (B) Diagrama hill fit generado a partir del software de análisis automatizado. El eje y corresponde a I-Respuesta, el eje x corresponde a concentraciones de analito (Cdc37) en nM. Los resultados del análisis automatizado mostraron un valor de KD relativamente bajo y una desviación estándar baja de 0,0719 ± 0,0007 μM, lo que sugiere una fuerte interacción entre Hsp90 y Cdc37. (C) Diagrama de asociación generado utilizando el software de análisis estadístico. El eje y corresponde a I-Response al final de la fase de asociación. El eje x corresponde a las diferentes concentraciones de Cdc37 del analito. Esta gráfica se generó utilizando los puntos de datos proporcionados en la Tabla S2. El resumen de los resultados del análisis se proporciona en el gráfico; para este experimento, el valor KD es 0.004 ± 0.009 μM y el valor R2 es 0.99. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S8: Archivos de datos generados a partir del experimento de control. (A) Datos de experimentos monitoreados en tiempo real. El eje y corresponde a la I-Respuesta en unidades biosensores (BU), y el eje x corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. Esta cifra corresponde a los datos del experimento de control donde se inmovilizó Hsp90 en el chip (500 nM) y se prepararon 10 concentraciones de analito BSA (proteína de control) (0,4-200 nM). El gráfico I-Response en tiempo real comienza desde una I-Response baja alrededor de 10-15 BU y no aumenta con un aumento en las concentraciones de analitos en cada ciclo del experimento, lo que sugiere que no hay interacción entre Hsp90 y BSA. (B) Diagrama hill fit generado a partir del software de análisis automatizado. El eje y corresponde a I-Response; el eje x corresponde a concentraciones de analito (BSA) en nM. Los resultados del análisis automatizado mostraron que no hay datos suficientes para calcular el valor de KD , lo que sugiere que no hay interacción entre Hsp90 y BSA. (C) Diagrama de asociación generado utilizando el software de análisis estadístico. El eje y corresponde a I-Response al final de la fase de asociación, el eje x corresponde a las diferentes concentraciones de analito BSA. Esta gráfica se generó utilizando los puntos de datos proporcionados en la Tabla S4. El resumen de los resultados del análisis se proporciona en el gráfico; para este experimento, el valor KD es -0.009 ± -0.0003 μM y el valor R2 es 0.82. Un valor KD negativo cercano a cero indica que no hay interacción entre Hsp90 y BSA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Cuadro suplementario S1: Resumen de los valores de I-Response generados en cada punto de concentración y leídos de los transistores de cada chip (tres transistores diferentes para cada chip). Esta tabla corresponde a los datos extraídos de la segunda repetición realizada para el segundo experimento donde se inmovilizó Hsp90 en el chip (500 nM) y se prepararon 10 concentraciones de analito Cdc37 (0,4-200 nM). Los puntos de datos de esta tabla se utilizaron para el análisis en el software de análisis estadístico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro suplementario S2: Resumen de los valores de I-Response generados en cada punto de concentración y leídos de los transistores de cada chip (tres transistores diferentes para cada chip). Esta tabla corresponde a los datos extraídos de la tercera repetición realizada para el segundo experimento donde se inmovilizó Hsp90 en el chip (500 nM) y se prepararon 10 concentraciones de analito Cdc37 (0,4-200 nM). Los puntos de datos de esta tabla se utilizaron para el análisis en el software de análisis estadístico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro suplementario S3: Resumen de los valores de I-Response generados en cada punto de concentración y leídos del transistor de cada chip (tres transistores diferentes para cada chip). Esta tabla corresponde a los datos del experimento de control donde se inmovilizó Hsp90 en el chip (500 nM) y se prepararon 10 concentraciones de analito BSA (0,4-200 nM). Los puntos de datos de esta tabla se utilizaron para el análisis en el software de análisis estadístico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

En este estudio, se evaluó la viabilidad de utilizar la tecnología FEB (un enfoque de caracterización cinética en tiempo real) para determinar la interacción biomolecular entre Hsp90 y Cdc37. El experimento exploratorio inicial (primer experimento) sugirió que la elección de las concentraciones adecuadas de analito es una parte crítica del experimento y que el experimento debería diseñarse incluyendo puntos de concentración por encima y por debajo del valor de KD , que se predijeron en función de los datos disponibles en la literatura.

Sin embargo, si no hay información preliminar sobre la interacción, sugerimos diseñar un experimento preliminar incluyendo una amplia gama de puntos de concentración en rangos más bajos (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) y superiores (1.000 nM, 2.500 nM, 5.000 nM). El experimento preliminar proporciona una estimación aproximada del valor de KD y permite planificar los experimentos posteriores utilizando los rangos de concentración correctos para obtener un valor preciso de KD . El sistema FEB ofrece una función de protocolo de edición en la que uno es libre de elegir el número de puntos de concentración para el experimento.

Desde nuestra experiencia, los pasos más críticos involucrados en el protocolo FEB son los siguientes. La proteína objetivo y el tampón de analito deben ser los mismos que el tampón de calibración. Incluso un pequeño desajuste del búfer puede causar fluctuaciones en la I-Response y dar resultados poco confiables. Por lo tanto, sugerimos realizar diálisis durante la noche mediante un intercambio de tampón adecuado. El pipeteo cuidadoso en el chip del biosensor al aspirar o aplicar una solución es fundamental durante todo el experimento. El pipeteo descuidado puede provocar transistores rotos o fluctuaciones en la I-Response; mientras pipetea, asegúrese de no tocar la superficie sensible del chip. La solución EDC/sulfo-NHS utilizada en el proceso de activación del chip debe mezclarse fresca antes de cada uso. El uso de una mezcla vieja puede resultar en un chip no funcionalizado. Asegúrese de usar el mismo búfer para los cinco pasos repetitivos (calibración, asociación, disociación, regeneración y lavado) involucrados en todos los ciclos del experimento.

Al comparar la FEB con sistemas de detección biomolecular bien establecidos en el campo, como BLI o SPR, encontramos que los tres métodos comparten ventajas similares 43,44,45 que son: son sistemas sin etiquetas, que no requieren ningún colorante fluorescente costoso para detectar las interacciones; pueden detectar interacciones incluso en pequeños rangos de nM; los chips son reutilizables tanto en SPR como en FEB y se pueden regenerar y reutilizar de manera eficiente para hasta 10 experimentos, y los tres métodos proporcionan datos cinéticos en tiempo real, y el tiempo del experimento es corto.

La principal ventaja de SPR es que proporciona datos más extensos del experimento para que se puedan calcular KD, Kon, Koff, estequiometría y parámetros termodinámicos44. La principal ventaja de BLI es su capacidad para probar múltiples concentraciones en un experimento. Las mediciones cinéticas se pueden realizar simultáneamente para hasta ocho concentraciones mediante el uso de diferentes sensores. Sin embargo, los sensores BLI no son reutilizables, lo que hace que el costo del experimento sea extremadamente alto43.

La principal ventaja de FEB es su software automatizado y fácil de usar que guía al usuario a lo largo del experimento, y su plataforma de pipeteo a mano abierta que permite al usuario agregar el analito al objetivo inmovilizado en cada paso. Este enfoque de pipeteo abierto combinado con un software simple hace que el FEB sea fácil de aprender y requiera poca o incluso ninguna capacitación. Sin embargo, requiere que el usuario tenga un dominio básico del pipeteo manual, y la falta de manejo automatizado de líquidos significa que la reproducibilidad del tiempo de paso depende completamente del usuario. Esta misma falta de manejo integrado de líquidos significa que los chips e instrumentos son rentables en comparación con SPR o BLI. El FEB también exhibe una alta reproducibilidad y confiabilidad en la detección de interacciones biomoleculares debido al proceso de fabricación definido involucrado en la preparación del chip biosensor35.

En comparación con el método de detección DE ITC bien establecido y estándar, FEB utiliza solo 50 μL de volumen de analito a concentraciones nanomolares para todo el experimento, disminuyendo la posibilidad de nucleación o agregación de proteínas. Uno de los mayores problemas con el ITC es la desgasificación de las proteínas antes de la carga para evitar burbujas de aire. Durante el experimento ITC, existe la posibilidad de desarrollar burbujas dentro de la célula de medición debido a la agitación continua y la purga intensa, que puede salpicar negativamente la solución de muestra o causar pérdida de muestra42. La tecnología FEB supera estos desafíos de las TIC al ofrecer una química de inmovilización objetivo robusta, reducir la agregación y el burbujeo, aumentar la estabilidad y mejorar los problemas dependientes de la concentración que enfrentan las TIC.

Un inconveniente potencial de los dispositivos FEB es su susceptibilidad a la composición del tampón y los cambios de concentración, lo que puede causar una deriva en la línea de base que debe corregirse durante el ajuste y análisis de los resultados. El chip biosensor también es sensible al pH y la sal, por lo que los tampones utilizados durante la calibración y medición del analito deben ser los mismos durante todo el experimento. Los productos químicos utilizados como conservantes (por ejemplo, azida de sodio) y las moléculas hidrofóbicas pueden dañar el sensor e incluso pueden causar un aumento en la unión no específica. Estos inconvenientes se pueden mitigar prestando atención a la consistencia del tampón a lo largo de los pasos de medición, la diálisis de los compuestos interferentes del stock de analitos y la pasivación adecuada de la superficie (por ejemplo, el uso de detergentes, bloqueadores de proteínas o diferentes moléculas de PEG).

En resumen, demostramos con éxito un fuerte IBP entre Hsp90/Cdc37 mediante el uso de la tecnología FEB y validamos su interacción utilizando ITC, proporcionando datos alentadores para apoyar la FEB como un método alternativo innovador para la detección de IBP. La tecnología FEB ofrece una amplia gama de aplicaciones en diversos campos de descubrimiento de fármacos, productos farmacéuticos, análisis biomolecular de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas, desarrollo de anticuerpos, validación de fármacos y optimización de plomo a nuestro alcance al traducir fácilmente la actividad biológica in vitro en eficacia in vivo . Teniendo en cuenta las ventajas de la tecnología FEB y sus inmensas aplicaciones en la exploración de las interacciones de PPI, proteínas y ADN o ARN, así como las interacciones de proteínas y moléculas pequeñas (por ejemplo, medicamentos), proponemos que es una tecnología única y prometedora en la caja de herramientas de detección de PPI. En nuestro caso, la tecnología FEB ofrece una herramienta valiosa para evaluar fácilmente la eficacia de unión de los antagonistas candidatos a IBP Hsp90 / Cdc37, que luego ayuda a seleccionar candidatos prometedores para futuras evaluaciones in vitro e in vivo relacionadas con diversas enfermedades en las que este IBP es crítico.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Biational Science Foundation (BSF) a S.K.S. y N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

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References

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Bioquímica Número 181 Ciclo de división celular 37 Cdc37 Proteína de choque térmico 90 Hsp90 Proteína quinasa Biosensor de grafeno Biodetección de efecto de campo Cáncer Interacciones biomoleculares
Explorando la interacción biomolecular entre la chaperona molecular Hsp90 y su proteína quinasa cliente Cdc37 utilizando tecnología de biodetección de efecto de campo
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Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

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