Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

ביוסנסינג של אפקט שדה (FEB) היא טכניקה נטולת תוויות לאיתור אינטראקציות ביומולקולריות. הוא מודד את הזרם החשמלי דרך הביו-סנסור של הגרפן שאליו משותקות מטרות הקשירה. טכנולוגיית FEB שימשה להערכת אינטראקציות ביומולקולריות בין Hsp90 ל-Cdc37 וזוהתה אינטראקציה חזקה בין שני החלבונים.

Abstract

אינטראקציות ביומולקולריות ממלאות תפקידים רב-תכליתיים בתהליכים תאיים רבים על-ידי ויסות ותיאום של אירועים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה תפקודית. ביו-מולקולות כגון חלבונים, פחמימות, ויטמינים, חומצות שומן, חומצות גרעין ואנזימים הם אבני בניין בסיסיות של יצורים חיים; הם מתכנסים לרשתות מורכבות במערכות ביולוגיות כדי לסנכרן מספר עצום של אירועי חיים. חלבונים בדרך כלל משתמשים ברשתות אינטראקציה מורכבות כדי לבצע את תפקידיהם; לפיכך חובה להעריך אינטראקציות כאלה כדי לפענח את חשיבותן בתאים הן ברמת התא והן ברמת האורגניזם. לקראת מטרה זו, אנו מציגים טכנולוגיה המתפתחת במהירות, ביוסנסינג בעל אפקט שדה (FEB), כדי לקבוע אינטראקציות ביומולקולריות ספציפיות. FEB היא טכניקת זיהוי ביומולקולרית, נטולת תוויות ואמינה לקביעת אינטראקציות ספציפיות ומשתמשת בביו-סנסורים מבוססי אלקטרוניקה באיכות גבוהה. טכנולוגיית FEB יכולה לנטר אינטראקציות בטווח הננו-מולארי בשל הננו-חומרים הניתנים להתאמה ביולוגית המשמשים על פני השטח של הביו-סנסור שלה. כהוכחת היתכנות, הוברה האינטראקציה בין חלבון-חלבון (PPI) בין חלבון הלם חום 90 (Hsp90) לבין מחזור חלוקת התא 37 (Cdc37). Hsp90 הוא מלווה מולקולרי תלוי ATP הממלא תפקיד חיוני בקיפול, יציבות, התבגרות ובקרת איכות של חלבונים רבים, ובכך מווסת פונקציות תאיות חיוניות מרובות. Cdc37 נחשב למלווה מולקולרי ספציפי לחלבון קינאז, מכיוון שהוא מזהה ומגייס באופן ספציפי קינאזות חלבונים ל-Hsp90 כדי לווסת את מסלולי התמרת האותות במורד הזרם. ככזה, Cdc37 נחשב למלווה משותף של Hsp90. מסלול המלווה-קינאז (קומפלקס Hsp90/Cdc37) מופעל יתר על המידה בממאירות מרובה המקדמת את צמיחת התאים; לכן, זהו יעד פוטנציאלי לטיפול בסרטן. המחקר הנוכחי מדגים את היעילות של טכנולוגיית FEB באמצעות מערכת המודל Hsp90/Cdc37. FEB זיהה PPI חזק בין שני החלבונים (ערכי KD של 0.014 μM, 0.053 μM ו-0.072 μM בשלושה ניסויים בלתי תלויים). לסיכום, FEB היא פלטפורמת זיהוי PPI ללא תווית וחסכונית, המציעה מדידות מהירות ומדויקות.

Introduction

אינטראקציות ביומולקולריות:
חלבונים הם חלקים חיוניים של אורגניזמים ומשתתפים במסלולים מולקולריים רבים כגון חילוף חומרים של תאים, מבנה התא, איתות תאים, תגובות חיסוניות, הידבקות תאים ועוד. בעוד שחלבונים מסוימים מבצעים את תפקידם באופן עצמאי, רוב החלבונים מקיימים אינטראקציה עם חלבונים אחרים באמצעות ממשק מקשר כדי לתאם פעילות ביולוגית תקינה1.

ניתן לסווג אינטראקציות ביומולקולריות בעיקר על סמך המאפיינים המבניים והתפקודיים המובהקים של חלבונים המעורבים2, למשל, בהתבסס על משטחי החלבון, היציבות המורכבת או ההתמדה של אינטראקציות3. זיהוי חלבונים חיוניים ותפקידם באינטראקציות ביומולקולריות הוא חיוני להבנת מנגנונים ביוכימיים ברמה המולקולרית4. נכון לעכשיו, ישנן גישות שונות לזיהוי אינטראקציות אלה5: in vitro6, בסיליקו7, בתאים חיים8, ex vivo9, ו in vivo10 כאשר לכל אחד מהם יש חוזקות וחולשות משלו.

מבחני in vivo מבוצעים תוך שימוש בחיה כולה ככלי ניסיוני11, ומבחניה- ex vivo מבוצעים על תמציות רקמה או על איברים שלמים (למשל, לב, מוח, כבד) בסביבה חיצונית מבוקרת על ידי מתן שינויים מינימליים בתנאים טבעיים. היישום הנפוץ ביותר של מחקרי in vivo ו - ex vivo הוא להעריך את הפרמקוקינטיקה, הפרמקודינמיקה והשפעות הרעילות של חומרים פרמקולוגיים פוטנציאליים לפני ניסויים בבני אדם על ידי הבטחת הבטיחות והיעילות הכוללות שלהם12.

ניתן לזהות אינטראקציות ביומולקולריות גם בתוך תאים חיים. הדמיית תאים חיים מאפשרת לנו לצפות באינטראקציות דינמיות בזמן שהם מבצעים את התגובות של מסלול ביוכימי מסוים13. יתר על כן, טכניקות זיהוי, כגון ביולומינסנציה או העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית, יכולות לספק מידע על היכן ומתי אינטראקציות אלה מתרחשות בתוך תא14. אף על פי שזיהוי בתאים חיים מציע פרטים חיוניים, מתודולוגיות זיהוי אלה מסתמכות על אופטיקה ותוויות, שייתכן שאינן משקפות את הביולוגיה המקורית; הם גם פחות מבוקרים משיטות במבחנה ודורשים מומחיות מיוחדת כדי לבצע15.

השיטות החישוביות של in silico משמשות בעיקר לסינון בקנה מידה גדול של מולקולות מטרה לפני הניסויים במבחנה . שיטות חיזוי חישוביות, מסדי נתונים מבוססי מחשב, עגינה מולקולרית, יחסי מבנה-פעילות כמותיים וגישות סימולציה אחרות של דינמיקה מולקולרית הם בין המבוססים היטב בכלי סיליקו 16. בהשוואה לטכניקות ניסיוניות מייגעות, הכלים בסיליקו יכולים בקלות לבצע תחזיות עם רגישות גבוהה, אך עם דיוק מופחת בביצועי החיזוי17.

בדיקות במבחנה מבוצעות עם מיקרואורגניזמים או מולקולות ביולוגיות מחוץ להקשר הביולוגי הסטנדרטי שלהם. הצגת אינטראקציות ביומולקולריות באמצעות שיטות במבחנה היא קריטית להבנת תפקודי החלבון והביולוגיה שמאחורי הרשת המורכבת של תפקוד התאים. מתודולוגיית הבדיקה המועדפת נבחרת על פי התכונות הפנימיות של החלבון, הערכים הקינטיים והאופן והעוצמה של האינטראקציות18,19.

האינטראקציה Hsp90/Cdc37:
מסלול המלווה-קינאז, המחבר בין Hsp90 ל-Cdc37, הוא מטרה טיפולית מבטיחה בביולוגיה של הגידול20. Hsp90 ממלא תפקיד מרכזי בבקרת מחזור התא, בהרכבת חלבונים, בהישרדות התאים ובמסלולי איתות. חלבונים המסתמכים על Hsp90 לצורך תפקודם מועברים ל-Hsp90 לצורך קומפלקסציה באמצעות מלווה משותף, כגון Cdc37. קומפלקס Hsp90/Cdc37 שולט בקיפול של רוב החלבון קינאזות ומשמש כמרכז לשלל רשתות איתותתוך-תאיות 21. זוהי מטרה אנטי-סרטנית מבטיחה בשל הביטוי המוגבה שלה בממאירות שונות, כולל לוקמיה מיאלובלסטית חריפה, מיאלומה נפוצה וקרצינומה הפטוצלולרית22,23.

טכניקות נפוצות לזיהוי אינטראקציה ביומולקולרית במבחנה
Co-immunoprecipitation (co-IP) היא טכניקה המסתמכת על ספציפיות אנטיגן-נוגדנים כדי לזהות אינטראקציות רלוונטיות ביולוגית24. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא חוסר היכולת שלה לזהות אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה וערכים קינטיים24. שיטות ביופיזיות כגון קלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC), תהודת פלסמון פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וטכנולוגיית FEB עדיפות לקביעת הערכים הקינטיים.

ITC היא שיטת זיהוי ביו-פיזיקלית המבוססת על קביעת אנרגיית קשירת יחד עם ניתוח תרמודינמיקה מלא לאפיון אינטראקציות ביומולקולריות25. היתרון העיקרי של ITC הוא שהוא אינו דורש כל תיוג או קיבוע של חלבון המטרה. הקשיים העיקריים שבהם נתקל ITC הם הריכוז הגבוה של חלבון המטרה הנדרש לניסוי אחד והקושי לנתח קומפלקסים לא קוולנטיים עקב אנתלפיות קישור קטנות26. גם SPR וגם BLI הן טכניקות ביופיזיות נטולות תוויות המסתמכות על אימוביליזציה של מולקולת המטרה על משטח החיישנים, ולאחר מכן זריקות של האנליט מעל המטרה המשותקת27,28. ב- SPR, שינויים במקדם השבירה במהלך אינטראקציות ביומולקולריות נמדדים27; ב-BLI, ההתאבכות באור המוחזר נרשמת בזמן אמת כשינוי באורך הגל כפונקציה של הזמן28. גם SPR וגם BLI חולקים יתרונות משותפים של הצעת יכולות ספציפיות, רגישות וזיהוי גבוהות29. בשתי השיטות, חלבון המטרה משותק על משטחי ביוסנסור, ולכן, ייתכן שיש אובדן מסוים של הקונפורמציה הטבעית של המטרה, מה שמקשה על הבחנה בין אינטראקציות ספציפיות לעומת לא ספציפיות30. BLI משתמשת בביו-סנסורים חד-פעמיים חד-פעמיים יקרים כדי לשתק את המטרה, ולכן היא טכניקה יקרה31. בהשוואה לכלי זיהוי ביומולקולריים מבוססים אלה, טכנולוגיית FEB מציעה פלטפורמה אמינה ונטולת תוויות על ידי שימוש בריכוזי ננומולארים נמוכים לזיהוי ביומולקולרי בזמן אמת עם אפיון קינטי. טכנולוגיית FEB גם מתגברת על האתגרים המבעבעים העומדים בפני ITC והיא חסכונית יותר בהשוואה ל- SPR או BLI.

ביוסנסורים מבוססי טרנזיסטור בעל אפקט שדה (FET) הוא תחום מתפתח לאיתור אינטראקציות ביומולקולריות על ידי הצעת יישומים ביו-רפואיים מגוונים. במערכת FET, מטרות משותקות לשבבי הביו-סנסור ואינטראקציות מזוהות על ידי שינויים בהולכה32. התכונה הייחודית שיש לקחת בחשבון בפיתוח ביוסנסור אלקטרוני יעיל היא התכונות הפיזיקוכימיות כגון האופי המוליך למחצה והיציבות הכימית של חומר הציפוי המשמש לייצור משטח החיישן33. חומרים קונבנציונליים כמו סיליקון המשמש ל-FET הגבילו את הרגישות של חיישנים משום שהם דורשים שכבות תחמוצת דחוקות בין תעלת הטרנזיסטור לבין סביבה מסוימת לתפקוד תקיןשל 34. יתר על כן, טרנזיסטורים של סיליקון רגישים לסביבות מלח גבוהות, ובכך מקשים על מדידת אינטראקציות ביולוגיות בסביבתם הטבעית. הביוסנסור מבוסס הגרפן מוצג כחלופה מכיוון שהוא מציע יציבות כימית מעולה ושדה חשמלי. מאחר שגרפן הוא שכבה אטומית יחידה של פחמן, הוא גם רגיש ביותר כמוליכה למחצה וגם תואם כימית לתמיסות ביולוגיות; שתי התכונות הללו רצויות כדי ליצור ביוסנסורים אלקטרוניים תואמים35. פוטנציאל ההעמסה האולטרה-גבוה המדהים של ביו-מולקולות המוצע על ידי ביוסנסורים מצופים גרפן מוביל לפיתוח טכנולוגיית FEB מבוססת-גרפן.

עקרון טכנולוגיית FEB: FEB היא טכניקת זיהוי ביומולקולרית נטולת תוויות המודדת את הזרם החשמלי דרך הביו-סנסור של הגרפן שאליו משותקות מטרות הקישור. אינטראקציות בין החלבון המשותק לבין האנליט גורמות לשינויים בזרם המנוטרים בזמן אמת, ומאפשרים מדידות קינטיות מדויקות36.

מכשור: מערכת FEB כוללת שבב חיישן טרנזיסטור בעל אפקט שדה גרפן (gFET) וקורא אלקטרוני שמפעיל מתח קבוע לאורך כל הניסוי (איור 1). האנליט מיושם בתמיסה על חלבון המטרה המשותק על פני השטח של הביו-סנסור. כאשר מתרחשת אינטראקציה, שינוי בזרם נמדד ומתועד בזמן אמת. ככל שריכוז האנליטים עולה, גם החלק של האנליט המאוגד יגדל, מה שיגרום לחילופים גבוהים יותר בזרם. באמצעות תוכנת הניתוח האוטומטית המסופקת עם המכשיר (טבלת החומרים), I-Response נמדדת ומתועדת במונחים של יחידות ביוסנסינג (BU)37. I-Response מוגדר כשינוי בזרם (I) באמצעות שבב הביו-סנסור הנמדד בזמן אמת על סמך האינטראקציה של המטרה המשותקת עם האנליט. תוכנת הניתוח האוטומטית FEB יכולה לנתח הן את ה-I-Response והן את ה-C-Response לאירועי אינטראקציה דינמיים, כאשר ה-C-Response מתעד את השינויים בקיבוליות (C). הווריאציות הן ב-I-Response והן ב-C-Response מתאימות ישירות לשבריר של האנליט המאוגד וניתן לנתח אותן עוד יותר כדי ליצור ערכי KD . העדפת ברירת המחדל של תוכנת הניתוח האוטומטית היא I-Response.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של מערך הניסוי. (B) סקירה כללית של רכיבי השבב. השבב מחובר לשתי אלקטרודות המספקות זרם למערכת. פני השטח של השבב מכוסים בגרפן, שכאשר הוא מופעל יכול לקשור את המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מתודולוגיה:
בתחילה, שבב הביוסנסור המופעל מוכנס למכשיר FEB (איור 1) ולאחר מכן ביצוע השלבים המתוארים להלן: (1) כיול: (1) כיול: הניסוי מתחיל בכיול המערכת באמצעות 1x מי מלח עם מאגר פוספט (PBS; pH = 7.4) כדי ליצור את תגובת שיווי המשקל הבסיסית. (2) שיוך: האנליט מוצג בשבב, וה-I-Response מנוטר עד להגשמת רוויית הקשירה. (3) דיסוציאציה: האנליט מנותק באמצעות 1x PBS. (4) התחדשות: שרידי האנליט מוסרים באמצעות 1x PBS. (5) כביסה: בסך הכל חמש שטיפות מבוצעות באמצעות 1x PBS להסרה יסודית של האנליטים הכבולים והלא מאוגדים מהשבב.

ניתוח:
ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות התוכנה האוטומטית לחלוטין המסופקת עם המכשיר. תוכנת הניתוח האוטומטית יוצרת עלילת היל פיט עם ערך KD . עלילת ההתאמה של היל מתארת את הקשר של אנליט לחלבון המטרה כפונקציה של ריכוזי אנליטים. הריכוז שבו מושגת תגובה חצי מקסימלית הוא פרופורציונלי לערך KD . ערך KD נמוך מייצג זיקת קשירה גבוהה ולהיפך.

כדי לאמת את הנתונים המתקבלים מניסוי FEB, תגובות I מופקות מכל נקודת קריאה עבור כל ריכוז אנאליטים באמצעות תוכנת סקירת/ייצוא הנתונים וניתן לייצא אותן לתוכנות ניתוח סטטיסטיות אחרות (ראה טבלת חומרים) כפי שיוסבר להלן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: החלבונים הרקומביננטיים ששימשו במחקר זה, Hsp90 ו-Cdc37, התקבלו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הפעלת שבב

הערה: כל החומרים שיש להשתמש בהם בניסוי מפורטים בטבלת החומרים. סנן את כל הפתרונות המוכנים באמצעות מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר.

  1. הכן תמיסת קרבודימיד (EDC) של 1-אתיל-3-(3-דימתילאמינו) על-ידי הוספת 2 מ"ג של EDC ל-2.5 מ"ל של 1 M 2-(N-morpholino) חומצה אתאנית סולפונית (MES) (pH = 6.0) בצינור של 15 מ"ל. הכן תמיסות N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) על ידי הוספת 6 מ"ג של סולפו-NHS ל-2.5 מ"ל של 1 M MES buffer (pH = 6.0) בצינור נפרד של 15 מ"ל. Aliquot 50 μL של כל תמיסה בצינורות עצמאיים ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
  2. מערבבים נפחים שווים של תמיסת EDC sand sulfo-NHS (50 μL של EDC + 50 μL של sulfo-NHS) על ידי צנרת למעלה ולמטה (אין מערבולת).
    הערה: יש להשתמש בתמיסה המעורבת של EDC/sulfo-NHS תוך 30 דקות כדי לשמור על קישור צולב יעיל לתפקוד נכון של השבבים.
  3. מניחים את שבב הביו-סנסור (5.7 ס"מ x 2.4 ס"מ; ראו טבלת חומרים) המסופק על ידי החברה בצלחת פטרי מזכוכית עם מכסה מותאם. כל שלבי הפונקציונליזציה הכרוכים בהפעלת שבבים מוצעים להיעשות בתוך צלחת פטרי. החל 50 μL של 1 M MES buffer (pH = 6.0) על שבב ביוסנסור, דגירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאף את המאגר.
  4. החל 50 μL של פתרון EDC/sulfo-NHS באופן מיידי על שבב החיישן. כסו את צלחת הפטרי ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.שאפו לתמיסת EDC/sulfo-NHS מהשבב.
  5. לשטוף את השבב פעם אחת עם 50 μL של 1 M MES buffer (pH = 6.0); שאפו את מאגר ה-MES.

2. מיקוד אימוביליזציה של חלבונים

  1. יש לשטוף את השבב 2x עם 50 μL של 1x PBS (pH = 7.4). שאפו את ה-PBS מהשבב והוסיפו את מולקולת המטרה, Hsp90 (50 μL; 500 ננומטר).
    הערה: אי-התאמה של מאגר עלולה להרוס את הניסוי כולו; לפיכך, לפני הניסוי, חשוב לוודא כי מולקולת המטרה נמצאת באותו מאגר כמו זה המשמש לכיול (למשל, 1x PBS (pH = 7.4)). במידת הצורך, בצע חילופי חיץ על ידי דיאליזה לילית לפני הניסוי. בניסוי זה, דיאליזה לילית בוצעה עבור שני החלבונים הרקומביננטיים, Hsp90 ו- Cdc37, כנגד 1x PBS (pH = 7.4; ראה טבלת חומרים) עם חילופי חיץ מתאימים ב- 4 °C . ריכוז חומר המטרה (Hsp90 במקרה זה) עשוי להשתנות בהתאם לפרוטוקולים ניסיוניים שונים ולאופיים של חומרי המטרה (חלבון/פפטיד/ליגנדות).
  2. מכסים את צלחת הפטרי מזכוכית ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את התמיסה המכילה את מולקולת המטרה ושטפו פי 3 ב-50 מיקרול'ל של 1x PBS (pH = 7.4). שאפו את תמיסת 1x PBS (pH = 7.4) מהשבב.
  3. הוסיפו 50 μL של תמיסת Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol ב-1x PBS (pH = 7.4)) לתמיסת ה-Chip. כסו את צלחת הפטרי מזכוכית ודגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו לפתרון Quench 1 מהשבב.
  4. הוסף 50 μL של תמיסת Quench 2 (1 M אתנולמין (pH = 8.5)) לשבב. מכסים את צלחת הפטרי הזכוכית ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו לתמיסת Quench 2 מהשבב ושטפו את השבב 5x באמצעות 50 μL של 1x PBS, והשאירו את טיפת ה-PBS האחרונה על החיישן.

3. הכנת דוגמאות אנליטה

  1. הכן סדרת דילול אנאליטים עבור Cdc37 בטווח הריכוזים הרצוי. עבור הניסוי הראשון נעשה שימוש בריכוזים הבאים: 25 ננומטר, 50 ננומטר, 100 ננומטר, 200 ננומטר, 400 ננומטר, 800 ננומטר, 1,000 ננומטר, 2,000 ננומטר, 3,000 ננומטר ו-5,000 ננומטר. עבור הניסוי השני, נעשה שימוש בקבוצה שונה של ריכוזים הנעים בין 0.4 ננומטר ל-200 ננומטר.
  2. תכנן שהניסוי יכלול לפחות שמונה ריכוזי אנליטים שונים כדי לקבל ערך KD אמין. הכינו את הדילולים השונים של חלבון האנליט באותו מאגר כמו זה המשמש לכיול וחלבון מטרה; הנה זה 1x PBS (pH = 7.4).

4. טעינת שבב הביוסנסור המופעל להתקן FEB

הערה: התקן FEB מורכב מקורא הכולל חיוויים של תאורת LED ומחסנית להכנסת שבב הביוסנסור.

  1. לאחר אימוביליזציה של חלבון מטרה, הכנס את השבב המופעל למחסנית של המכשיר, המחובר באמצעות USB למחשב. לאחר החדרת השבב, תוצג בקורא נורית LED ירוקה המציינת שהתקן ה-FEB מוכן לניסוי. התקן את התוכנה האוטומטית (ראה טבלת חומרים) המסופקת על ידי החברה במחשב, שאליו מחובר מכשיר ה- FEB, כדי לנטר את הניסוי צעד אחר צעד כמתואר להלן.

5. הפעל את הניסוי

  1. לחץ על מודול הפעל ניסוי בתוכנה האוטומטית ובחר 10 נקודות עם התחדשות או כל פרוטוקול רצוי אחר. מלא את הפרטים הבאים: שם המפעיל, שם הניסוי, תאריך (לדוגמה, יאנה, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); מאגר התחדשות (למשל, מאגר PBS); מטרה משותקת (למשל, Hsp90); analyte in solution (למשל, Cdc37). ראה איור משלים S1 לקבלת פרטים.
  2. לחץ על לחצן התחל את הניסוי המוצג בתוכנה ופעל לפי ההוראות המוצגות על-ידי התוכנה האוטומטית כמתואר להלן.
    הערה: התוכנה אוטומטית לחלוטין, ידידותית למשתמש ומנחה את המשתמש לאורך הניסוי צעד אחר צעד. חלון קופץ יופיע על המסך עם הוראות להמשיך הלאה בכל שלב בניסוי. התוכנה תספק הוראות לכל שלב שחוזר על עצמו ברצף החל מכיול, אסוציאציה אנליטית, דיסוציאציה, התחדשות ושטיפה (5x) עבור כל ריכוז אנליט לאורך הניסוי.
  3. בצע כיול מכשירים. לשם כך, שאפו את פתרון ה-PBS הנותר מהשבב והחלו 50 μL של מאגר כיול (1x PBS; pH = 7.4). לחץ על כפתור המשך והמתן 5 דקות עד ששלב הכיול יסתיים. התוכנה מציגה את נקודת הקצה שנקבעה עבור שלב הכיול (5 דקות) עם אזעקת אזהרה למעקב.
  4. לאחר מכן, בצע אסוציאציה אנאליטית. לשם כך, שאפו את מאגר הכיול מהשבב והחלו 50 μL של ריכוז האנאליטים הנמוך ביותר (25 ננומטר של Cdc37). לחץ על המשך כפתור והמתן 5 דקות עד לסיום שלב האסוציאציה. התוכנה מציגה את נקודת הקצה של שלב השיוך (5 דקות) עם אזעקת אזהרה להמשך.
  5. בצע דיסוציאציה אנאליטית. לשם כך, שאפו את תמיסת האנליט מהשבב והחלו 50 μL של מאגר הדיסוציאציה (1x PBS; pH = 7.4). לחץ על כפתור המשך והמתן 5 דקות עד לסיום משך שלב הדיסוציאציה (5 דקות). התוכנה מציגה את נקודת הקצה לשלב הדיסוציאציה (5 דקות) עם אזעקת אזהרה למעקב.
  6. לאחר מכן, בצע התחדשות שבבים. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה מהשבב והחלו 50 μL של מאגר התחדשות (1x PBS; pH = 7.4). לחץ על לחצן המשך והמתן 30 שניות עד לסיום שלב ההתחדשות (30 שניות). התוכנה מציגה את נקודת הקצה לשלב ההתחדשות (30 שניות) עם אזעקת אזהרה למעקב.
  7. לבסוף, לשטוף את השבב. שאפו את תמיסת ההתחדשות מהשבב והחלו 50 μL של מאגר שטיפה (1x PBS; pH = 7.4) על השבב. לשאוף את הפתרון מן השבב ולחזור על זה 5x. השאירו את הטיפה האחרונה של מאגר הכביסה על השבב ולחצו על כפתור המשך והמתינו 30 שניות עד שמשך שלב הכביסה יסתיים בתצוגת התוכנה.
    הערה: התוכנה מציגה את נקודת הקצה של שלב הכביסה (30 שניות) עם אזעקת אזהרה כדי להמשיך במחזור הבא של הניסוי.
  8. חזור על השלבים עבור כל ריכוז אנאליט שבו נעשה שימוש; חמשת השלבים של כיול, אסוציאציה אנליטית, דיסוציאציה, התחדשות ושטיפה (5x) מהווים מחזור אחד. עבור הניסוי שהוצג כאן, ביצענו 10 מחזורים עבור 10 ריכוזי אנאליטים (שנעו בין 25 ננומטר ל-5,000 ננומטר או 0.4 ננומטר עד 200 ננומטר; איור 2).

6. ניתוח

  1. לחץ על לחצן ניתוח שנראה בחלק העליון של תוכנת הניתוח האוטומטית בסוף הניסוי. יופיע חלון תצוגה המכיל את כל נקודות הניסוי. בחלון, ודא שריכוזי האנליטים המשמשים לפרוטוקול שנקבע נכונים.
  2. לחץ על לחצן הפעל ניתוח כדי ליצור את ערך KD באופן אוטומטי. התוכנה יוצרת עלילת היל fit על ידי התוויית ריכוזי האנאליטים כנגד תגובות ה-I המתאימות שמהן מחושב קבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל, ערך KD .
  3. ייצא את הנתונים הגולמיים לניתוח בתוכנות ניתוח סטטיסטיות אחרות באמצעות תוכנת סקירת/ייצוא הנתונים כמתואר להלן.
    1. העתק את קובץ R1R שנוצר באופן אוטומטי בסוף הניסוי (לדוגמה, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) לתיקיה חדשה בשולחן העבודה. פתח את תוכנת סקירת/ייצוא הנתונים שסופקה על-ידי החברה (ראה איור משלים S2A).
    2. לחץ על עיבוד נתונים > עיבוד קבצי R1R > אישור במסך הבית של תוכנת סקירת /ייצוא הנתונים.
    3. בחר את התיקיה המכילה קבצי R1R שנוצרו בשולחן העבודה בשלב 6.3.1. ולחץ על כפתור אישור . פעולה זו יוצרת עותק של נתוני R1R המקוריים, כדי לסקור ולערוך את הנתונים מבלי לעקוף את הקובץ המקורי.
    4. לחץ על סמל עיבוד הנתונים המוצג במסך הבית של תוכנת סקירת/ייצוא הנתונים. לחץ על טען קבצי R1R מעובדים > אישור. בחר את אותה תיקיה שנוצרה בשלב 6.3.1 המכילה קבצי R1R מעובדים. לחץ על אישור. בשלב זה, התיקיה המכילה את קבצי הניסוי מוכנה לבדיקה.
    5. במסך הבית של תוכנת סקירת/ייצוא נתונים, לחץ על ניתוח נתונים. בחר כיול > כיול קבצי R1R ערוכים > אישור (ראה איור משלים S2B). שלב זה מכייל את כל נקודות הנתונים בהתאם לשלב הכיול הראשון, כדי ליצור קו בסיס.
    6. במסך הבית של תוכנת סקירת/ייצוא נתונים, לחץ על ניתוח נתונים. בחר סקור וערוך קבצי R1R > אישור. סקור את נקודות הנתונים, מחק נקודות או הוסף שלבים באמצעות לחצן מחק/הוסף שלב . ודא שכל השלבים נמצאים במקום הנכון, לדוגמה, שלב הכיול נמצא בקו הבסיס, שלב השיוך נמצא בשיא (ראה איור משלים S3) ולאחר מכן לחץ על לחצן שמור כדי לשמור את כל השינויים שבוצעו.
    7. במסך הבית של תוכנת סקירת/ייצוא נתונים, לחץ על ניתוח נתונים. בחר נתח/תרשים נתונים, בחר את השלבים לייצוא (ראה איור משלים S4). הוסף כל שלב שיוך (לדוגמה, שלב 2, שלב 7 וכן הלאה) לאחר חיסור שלב הכיול (לדוגמה, שלב 1, שלב 6 וכן הלאה) לרשימת הייצוא לפני ייצוא הנתונים.
    8. לחץ על ייצוא נתונים אלה. התוכנה מייצרת קובץ גיליון אלקטרוני המכיל את ה- I-Response עבור כל נקודת נתונים של ריכוז אנאליט מכל טרנזיסטור (אם כל הטרנזיסטורים פועלים, יהיו לנו שלושה ערכי I-response שונים עבור כל נקודת ריכוז). השתמש בקובץ גיליון אלקטרוני זה כדי לנתח עוד יותר את הנתונים בתוכנה הסטטיסטית.
  4. פתח את תוכנת הניתוח הסטטיסטי. צור טבלת XY עם שלושה ערכי Y; הקש צור. הנתונים עבור טבלה זו (ערכי X, Y) מועתקים מקובץ הגיליון האלקטרוני שנוצר בשלב 6.3.8. ציר ה-x מתאים לריכוז האנליט (בהתאם לריכוז שבו נעשה שימוש), ושלושת ערכי ה-Y תואמים את ה-I-Responses, שהתקבלו מתוכנת סקירת/ייצוא הנתונים שסופקה על ידי החברה.
  5. לחץ על נתח נתונים אלה. בחר ניתוחי XY > רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) > רוויית קשירה > אתר אחד > סה"כ. התוכנה תנתח את הנתונים באופן אוטומטי, תיצור את הערך KD ותיצור גרף של נקודות הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות מניסוי 1:
חלבון המטרה Hsp90 (500 ננומטר) היה משותק לשבב בעקבות פרוטוקול אימוביליזציה של המטרה כפי שתואר לעיל. עבור הניסוי הראשון הוכנו 10 ריכוזים של חלבון האנאליטים, Cdc37, שנעו בין 25 ננומטר ל-5,000 ננומטר, בהתבסס על הנתונים הזמינים בספרות (ראו טבלה 1).

ניתן לעקוב אחר שלבי הניסוי בזמן אמת על-ידי מעקב אחר השינויים המתרחשים ב-I-Response (איור 3A). ניתן לדמיין כיצד כל שלב הכלול בפרוטוקול משפיע על תגובת ה- I לאורך הניסוי. לדוגמה, תגובת ה-I קרובה לאפס במהלך הכיול, ובשלב האסוציאציה, תגובת ה-I עולה בהדרגה עם עלייה בריכוזי האנאליטים (Cdc37). בהסתכלות על הנתונים מניסוי זה (איור 3A), נצפתה עלייה פתאומית בתגובת ה-I בריכוזי אנאליטים נמוכים (50 BU ב-25 ננומטר). תגובת I נמוכה הייתה צפויה בריכוז אנאליטים נמוך שיעלה בהדרגה עם העלייה בריכוזים. העלייה הפתאומית הזו הציעה כי יש לתכנן ניסוי הכולל נקודות ריכוז נמוכות יותר של אנליטים.

בהתאם לשלבי הפרוטוקול שנדונו לעיל, הנתונים נותחו בתוכנת הניתוח האוטומטי שסופקה, אשר יצרה באופן אוטומטי חלקת היל fit עם ערך KD מחושב (איור 3B). ערך KD שחושב מתוכנת הניתוח האוטומטית עבור הניסוי הראשון היה 350,000 ± 76,000 μM. רוב האינטראקציות הביולוגיות הנפוצות הראו ערך KD ב-μM הנמוך או אפילו בתחום ה-nM; לפיכך, ערך KD שנוצר עבור הניסוי הראשון הוא גבוה מאוד.

יכולים להיות מספר הסברים לערך KD הגבוה שנצפה: ייתכן שיש זיקה נמוכה בין שני החלבונים הספציפיים שנחקרו (Hsp90/Cdc37), כלומר נדרש ריכוז ליגנד גבוה לאינטראקציות המולקולריות; ייתכן שהניסוי תוכנן עם ריכוזי אנאליטים לא אידיאליים, מחוץ לטווח; הערך הגבוה יכול להיות בשל הפרמטרים המובנים המשמשים במודול המתאים של תוכנת הניתוח. תוכנת הניתוח האוטומטית משתמשת במודול ניתוח מינון-תגובה כדי להתאים לנקודות הנתונים, אך אינטראקציות מסוימות עשויות שלא להתאים היטב למודל זה, ובכך לספק נתונים כוזבים, וכתוצאה מכך ערכי KD גבוהים.

כדי לקבל ערך KD מדויק עם עלילת היל רוויה, נדרשת סטנדרטיזציה של הניסוי על ידי ניסוי וטעייה הכוללת נקודות ריכוזי אנאליט נמוכים וגבוהים יותר, כדי לרכוש את ערך KD הנמוך ביותר עם שיעור שגיאה נמוך.

בהתחשב בכל הגורמים הללו, הנתונים מתוכנת הניתוח יוצאו לתוכנת ניתוח סטטיסטית נוספת. תגובת ה- I עבור כל נקודת שיוך חולצה באמצעות תוכנת סקירת/ייצוא הנתונים האוטומטית ומסוכמת בטבלה 2 על-ידי ביצוע השלבים שנדונו לעיל בשלב הניתוח (שלב 6).

תוצאות תוכנת הניתוח הסטטיסטי (איור 3C) הראו ערך KD נמוך יחסית עם סטיית תקן גבוהה (0.011 ± 0.494 μM) וערך R2 נמוך של 0.78. השונות המשמעותית שנצפתה בערך KD ובערך R2 הנמוך הצביעה על כך שנקודות הריכוז שנבחרו לניסוי זה אינן אופטימליות. בנוסף, הבחין גם שחלק מנקודות הגרף לא התאימו היטב לקו המגמה של העלילה (איור 3C); זה חיזק את הצורך לתכנן ניסוי שני על ידי הכללת נקודות ריכוז אנאליטיות שונות.

הפרמטרים המובנים המשמשים את שתי תוכנות הניתוח שונים לחלוטין, וזה בא לידי ביטוי בתהליך יצירת ערכי KD . את ההבדלים בערכי KD שהתקבלו משתי תוכנות הניתוח (350,000 ± 76,000 μM לעומת 0.011 ± 0.494 μM) ניתן לייחס לעובדה שמודולי ניתוח שונים שימשו לחישוב. הניתוח המבוצע בתוכנת הניתוח הסטטיסטי עשוי להתאים יותר לאינטראקציה זו, ובכך לתת ערך KD נמוך יותר.

עם זאת, אם התוצאות משני הניתוחים משולבות (350,000 ± 76,000 μM ו- 0.011 ± 0.494 μM), ניתן להסיק כי הניסוי הראשון לא היה אופטימלי וכי יידרשו נקודות ריכוז נוספות.

כדי לאמת נקודה זו, נקודת הגרף הלא מתואמת, 3,000 ננומטר לא נכללה (ראו איור משלים S5). תוצאות הניתוח הראו ערך KD של 0.006 ± 0.081 μM עם ערך R2 של 0.98. תוצאות אלה הצביעו על כך שהניסוי הבא צריך להיות מתוכנן תוך התמקדות בריכוזים רלוונטיים יותר. לכן, בוצע ניסוי שני להערכת Hsp90/Cdc37 PPI באמצעות נקודות בדיקה שונות עם ריכוזים מתחת ומעל ל-KD החזוי.

תוצאות מניסוי 2:
חלבון המטרה, Hsp90 (500 ננומטר) היה משותק לשבב באמצעות הפרוטוקול כמתואר לעיל. בסך הכל הוכנו 10 ריכוזים של האנליט (Cdc37) כדלקמן: 0.4 ננומטר, 0.8 ננומטר, 1.6 ננומטר, 3.2 ננומטר, 6.4 ננומטר, 12.5 ננומטר, 25 ננומטר, 50 ננומטר, 100 ננומטר ו-200 ננומטר. הניסוי השני תוכנן על ידי הכללת נקודות ריכוז אנאליטיות שונות, על ידי התחשבות בכל התובנות שהתקבלו מהניסוי הקודם כאמור לעיל.

במהלך הניסוי, כל שלב היה מנוטר בזמן אמת (איור 4A). כאן, גרף ה-I-Response בזמן אמת (הנגזר מהריכוזים הנמוכים של האנליט-0.4 ננומטר, 0.6 ננומטר, 1.6 ננומטר) מתחיל בתחילה מאפס ועולה בהדרגה עם עליית ריכוזי האנליטים בכל מחזור של הניסוי בהשוואה לעלייה הפתאומית של I-Response שנצפתה בניסוי הראשון.

בעקבות הפרוטוקול שהוזכר לעיל, הנתונים נותחו באמצעות תוכנת הניתוח האוטומטית (איור 4B). ערך KD שחושב מתוכנת האנליזה האוטומטית עבור ניסוי זה היה 0.0673 ± 0.0002 μM, מה שהציע אינטראקציה חזקה בין חלבון המטרה Hsp90 לאנליט Cdc37. סטיית התקן של 0.0002 μM הייתה קטנה בהרבה מזו שהתקבלה בניסוי הראשון, מה שנותן ביטחון שהנתונים החדשים אמינים הרבה יותר.

כדי לאמת תוצאה זו, ייצאנו את נקודות הנתונים (טבלה 3) לתוכנת ניתוח סטטיסטית אחרת כפי שהוסבר קודם לכן; התוצאות מהניתוח מסוכמות באיור 4C.

באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי, נמצא כי הערך KD עבור Hsp90/Cdc37 PPI הוא 0.014 ± 0.005 μM (איור 4C). הערכים הנמוכים של KD וסטיית התקן מצביעים על אינטראקציה חזקה בין שני החלבונים, Hsp90 ו- Cdc37. יתר על כן, ערך R2 של 0.99 מציין כי הניתוח מתאים באופן מושלם לנקודות הגרף הניסיוניות. שתי תוכנות הניתוח הראו עקביות בתוצאות, עם ערכי KD נמוכים של כ- 0.0673 ± 0.0002 μM ו- 0.014 ± 0.005 μM, בהתאמה.

כדי לאשר את יכולת השחזור והדיוק של הניסוי, אותו ניסוי בוצע בשני שכפולים תוך שימוש ב-Hsp90 (500 ננומטר) כחלבון מטרה וב-Cdc37 כאנליט עם אותם ריכוזים הנעים בין 0.4 ננומטר ל-200 ננומטר כפי שנעשה בהם שימוש בניסוי השני. במהלך הניסוי, כל שלב היה מנוטר בזמן אמת (איור משלים S6A ואיור משלים S7A). ערך KD המחושב מתוכנת הניתוח האוטומטית מתואר באיור משלים S6B ובאיור משלים S7B (0.053 ± 0.002 μM ו- 0.0719 ± 0.0007 μM, בהתאמה). כאמור, נקודות הנתונים יוצאו (טבלה משלימה S1 וטבלה משלימה S2) לתוכנת ניתוח סטטיסטית אחרת, והתוצאות מוצגות באיור המשלים S6C ובאיור המשלים S7C (איור משלים S6C: KD הוא 0.003 ± 0.009 μM ו-R2 הוא 0.99; איור משלים S7C: KD הוא 0.004 ± 0.009 μM ו-R2 הוא 0.99). התוצאות של שני השכפולים מתוכנת הניתוח אומתו היטב ואישרו את הדיוק, יכולת החזרה ויכולת השכפול של נתוני הניסוי Hsp90/Cdc37 FEB.

כמו כן נערך מחקר בקרה שבו הובהרה האינטראקציה הביומולקולרית בין Hsp90 לבין חלבון בקרה, אלבומין בסרום בקר (BSA). מחקר הבקרה תוך שימוש ב-BSA כאנליט נעשה תוך שימוש במערך ניסויי זהה ובריכוזי אנאליטים ששימשו בניסוי השני. בסך הכל הוכנו 10 ריכוזים של חלבון הבקרה, BSA, הנעים בין 0.4 ננומטר ל-200 ננומטר ב-1x PBS (pH = 7.4) וכל שלב בניסוי היה מנוטר בזמן אמת.

בדומה לניסוי עם Hsp90 ו-Cdc37, גרף ה-I-Response בזמן אמת מתחיל בתחילה מ-0; עם זאת, במחקר הבקרה, תגובת ה-I לא עלתה בהדרגה עם העלייה בריכוזי האנליטים (איור משלים S8A). הנתונים נותחו גם באמצעות תוכנת הניתוח האוטומטית (איור משלים S8B), והתוכנה לא הצליחה לחשב את ערך KD מנקודות הנתונים של ניסוי זה. עדות לכך, מ-Hill Plot שנוצרה מהתוכנה, אין אינטראקציה בין Hsp90 לבין ה-BSA analyte של הבקרה. כדי לאמת תוצאה זו, ייצאנו את נקודות הנתונים (טבלה משלימה S3) לתוכנת ניתוח סטטיסטית אחרת כפי שהוסבר קודם לכן. באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי נמצא כי ערך KD עבור Hsp90/BSA PPI הוא שלילי (איור משלים S8C; KD הוא -0.009 ± -0.0003 μM), מה שמצביע שוב על כך שאין אינטראקציה בין שני החלבונים, Hsp90 ו- BSA. יתר על כן, ערך R2 (0.82) מציין כי הניתוח לא התאים לנקודות הגרף הניסיוניות. שתי תוכנות הניתוח הראו עקביות בתוצאות ש-Hsp90 ו-BSA אינן מתקשרות זו עם זו.

כאשר משווים את הנתונים הניסוייים של Hsp90/Cdc37 FEB עם נתונים ניסיוניים אחרים הזמינים בספרות, נמצא כי ערכי KD שהתקבלו במחקר זה (KD = 0.014 ± 0.005 μM, KD = 0.053 ± 0.002 μM, ו- KD = 0.072 ± 0.001 μM) היו בשני סדרי גודל נמוכים יותר מהנתונים שפורסמו בעבר (K D = 1.46 μM 38 או 6 μM 39) היו בשני סדרי גודל נמוכים יותר מהנתונים שפורסמו בעבר (KD = 1.46 μM38 או 6 μMμM 39 ). ניתן לייחס הבדלים אלה לשימוש במבנים אנושיים באורך מלא של Hsp90 ו- Cdc37 בניסויים הנוכחיים. מחקרים קודמים בוצעו על מבני שמרים Hsp90 שהכילו רק חלבון חלקי38 או C. elegans חלבונים הומולוגיים39 (טבלה 1). כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו במערכת FEB, בוצעו ניסויי ITC.

הערכת Hsp90/Cdc37 PPI באמצעות מערכת ITC:
ITC נחשב לתקן הזהב לחקר אינטראקציות ביומולקולריות. בנוסף, ביצענו את ITC כדי לקבוע את הקינטיקה התרמודינמית של Hsp90/Cdc37 PPI, וכאימות לניסוי FEB. Hsp90 ו- Cdc37 נתונים לדיאליזה נגד PBS (pH = 7.0) לפני ITC. כ-0.25 μM תמיסה של חלבון המטרה (Hsp90) ותמיסת 2.5 μM של חלבון אנאליט (Cdc37) הוכנו ב-PBS עבור הטיטרציות הקלורימטריות. נפח כולל של 80 μL של תמיסת Cdc37 במרווחי זמן עוקבים הועתק מהמזרק המסתובב לתא המכיל 150 μL של תמיסת Hsp90 ב-298.15 K. כל זריקה התרחשה במשך 4 שניות, ומרווח הזמן בין הזריקות הרצופות היה 150 שניות. בסך הכל נעשו 19 זריקות של 2 מיקרול" כל אחת עם מהירות ערבוב של 500 סל"ד וכוח ייחוס של 41.9 מיקרו-וואט, בהתאמה. שינוי החום שנבע מהאינטראקציה Hsp90/Cdc37 היה מנוטר, והנתונים הסופיים שהתקבלו בסוף זריקות האנאליט של Cdc37 הותקנו באמצעות תוכנת ניתוח ITC שסופקה על ידי החברה. הוערכו שינויי החום יחד עם הפרמטרים התרמודינמיים כגון שינוי אנתלפיה טוחנת (ΔH), שינוי אנטרופיה (ΔS), מספר אתרי הקשירה (n) וקבוע דיסוציאציית שיווי המשקל (KD) בין Hsp90/Cdc37 PPI. שינוי האנרגיה החופשית של גיבס (ΔG) חושב גם הוא מהמשוואה ΔG = ΔH - TΔS לאחר קבלת פרמטרים תרמיים מהתרמוגרמה של ITC.

תוכנית ITC חושפת את כמות החום המשמשת או משוחררת במהלך האינטראקציות הביולוגיות כדי להבהיר את אופי האינטראקציות והכוחות הבין-מולקולריים השולטים ב- PPI40. Cdc37 (2.5 μM) הוכנס ל-Hsp90 (0.25 μM), והעקומות המתאימות מתוארות באיור 5A,B. חלקת ה-ITC שהתקבלה נמצאה כאקסותרמית והותאמה למודל אתר קשירה יחיד המציג סטויכיומטריית קשירה (n) של אחת, אנרגיית קישור, ΔG = -45.9 kJ/mol, וערך KD = 0.009 μM. חוסר העקביות הקל שנצפה בצורה של תזוזה אנדותרמית בתחילת התרמוגרמה של ITC (איור 5A) מרמז על היווצרות בועות תוך כדי הצמדת חלבון האנליט לתא המדידה41,42. בקרב Hsp90/Cdc37 PPI, ניסויי ITC שבוצעו בריכוזים נמוכים וגבוהים יותר, העודף פי 10 של Cdc37 (ריכוז Hsp90 = 0.25 μM וריכוז Cdc37 = 2.5 μM) הציג פרמטרים מחייבים מקובלים על ידי השגת עקומת רוויה. ערך KD שהתקבל מ- ITC (KD = 0.009 μM) תואם היטב את ערך KD המחושב באמצעות טכנולוגיית FEB (KD = 0.014 μM, 0.053 μM ו- 0.072 μM), מה שתומך מאוד ברגישות ובדיוק של FEB באיתור Hsp90/Cdc37 PPI.

Figure 2
איור 2: סיכום פרוטוקול. (A) סיכום השלבים עבור תהליך הפעלת השבב. (B) ייצוג גרפי של חמשת השלבים החוזרים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: קבצי נתונים שנוצרו מניסוי 1. (A) נתוני ניסוי מנוטרים בזמן אמת. ציר ה-y מתאים ל-I-Response ביחידות ביוסנסורים (BU), וציר ה-x מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. נתון זה תואם את הנתונים מהניסוי הראשון. (B) עלילת Hill Fit שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-y מתאים ל-I-Response, ציר ה-x מתאים לריכוזים של אנאליט (Cdc37) ב-nM. עבור ניסוי זה, ערך KD הוא 350,000 ± 76,000 μM. (C) תרשים האגודה שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-y מתאים ל-I-Response בסוף שלב האסוציאציה, ציר ה-x מתאים לריכוזים השונים של האנליט, Cdc37. חלקה זו נוצרה באמצעות נקודות הנתונים שסופקו בטבלה 2. סיכום תוצאות הניתוח מובאות בגרף; עבור ניסוי זה, ערך KD הוא 0.011 ± 0.494 μM והערך R2 הוא 0.78. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: קבצי נתונים שנוצרו מניסוי 2. (A) נתוני ניסוי מנוטרים בזמן אמת. ציר ה-y מתאים ל-I-Response ביחידות ביוסנסורים (BU), וציר ה-x מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. נתון זה תואם את הנתונים מהניסוי השני. (B) עלילת Hill Fit שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-y מתאים ל-I-Response, ציר ה-x מתאים לריכוז האנליט (Cdc37) ב-nM. עבור ניסוי זה, ערך KD הוא 0.0673 ± 0.0002 μM (C) תרשים האגודה שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-y מתאים ל-I-Response בסוף שלב האסוציאציה, ציר ה-x מתאים לריכוזי האנליט השונים של Cdc37. חלקה זו נוצרה באמצעות נקודות הנתונים שסופקו בטבלה 3. סיכום תוצאות הניתוח מובאות בגרף; עבור ניסוי זה, הערך KD הוא 0.014 ± 0.005 μM והערך R2 הוא 0.99. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תרמוגרמה ITC של אינטראקציית Hsp90 ו-Cdc37. (A) הלוח העליון מייצג את עקומות התפתחות החום המתאימות שהתקבלו כתוצאה מזריקות עוקבות של Cdc37 (2.5 μM) לתוך Hsp90 (0.25 μM) ב-298.15 K. הכוח הדיפרנציאלי (DP) מייצג את העוצמה הדיפרנציאלית כפונקציה של הזמן. (B) נקודות הנתונים המשולבות בלוח התחתון מציינות את החום המנורמל המתאים לעומת היחס הטוחנות של Hsp90/Cdc37. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בדיקות שבוצעו ניתוח FEB KD ניתוח פריזמה KD מקור הבנייה חומצות אמינו הפניות
ITC 1.46 מיקרומטר ו- 1.32 מיקרומטר נה שמרים Hsp90 תחום N-מסוף של Hsp90 36
Cdc37 אנושי
SPR 6 מיקרומטר נה C. elegans אורך מלא 37
FEB - חזרה ראשונה 0.014 מיקרומטר 0.067 מיקרומטר Hsp90 אנושי אורך מלא בוצע במחקר זה
Cdc37 אנושי
FEB - חזרה שנייה 0.053 מיקרומטר 0.003 מיקרומטר Hsp90 אנושי אורך מלא בוצע במחקר זה
Cdc37 אנושי
FEB - חזרה שלישית 0.072 מיקרומטר 0.004 מיקרומטר Hsp90 אנושי אורך מלא בוצע במחקר זה
Cdc37 אנושי
ITC 0.009 מיקרומטר נה Hsp90 אנושי אורך מלא בוצע במחקר זה
Cdc37 אנושי
FEB- מחקר בקרה לא היו נתונים (לא היו מספיק נתונים כדי לחשב את ה- KD) -0.009 μM (ערך KD עם ערכים שליליים מציין שאין אינטראקציה) Hsp90 אנושי אורך מלא בוצע במחקר זה
בס"א

טבלה 1: הערכת PPI Hsp90/Cdc37 בשיטות שונות שדווחו במחקר זה ובספרות.

ריכוזי אנאליטים (nM) טרנזיסטור I-Response 1 טרנזיסטור I-Response 2 טרנזיסטור I-Response 3 ממוצע
אני-תגובה
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

טבלה 2: סיכום ערכי I-Response שנוצרו משלושה טרנזיסטורים שונים של כל שבב בכל נקודת ריכוז של הניסוי הראשון.

ריכוזי אנאליטים (nM) טרנזיסטור I-Response 1 טרנזיסטור I-Response 2 טרנזיסטור I-Response 3 I-Response ממוצע
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

טבלה 3: סיכום ערכי ה-I-Response שנוצרו משלושה טרנזיסטורים שונים של כל שבב בכל נקודת ריכוז של הניסוי השני.

איור משלים S1: צילום מסך של המסך הראשי של תוכנה אוטומטית לפני תחילת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: צילום מסך של המסך הראשי של תוכנה אוטומטית לעיבוד וניתוח נתונים. (A) תצוגת מסך ראשית של תוכנת סקירת/ייצוא נתונים המציגה אפשרויות עיבוד נתונים. (B) תצוגת המסך הראשית של תוכנת סקירת/ייצוא נתונים המציגה אפשרויות ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: נקודות נתוני הסקירה שהתקבלו מתוכנת סקירה/ייצוא. בשלב זה, סקור את הניסוי והוסף או מחק נקודות נתונים. ודא שנקודת האסוציאציה (2, 7, 12, 17, 22 וכן הלאה) היא תמיד בבחירה. לדוגמה, הבחירה הראשונה משמאל היא נקודת נתונים מספר 2, ולאחר מכן נקודת נתונים מספר 10 (אך היא צריכה להיות מספר 7). כדי לפתור זאת פשוט מחק נקודות 3, 4 ו-5. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: ייצא רשימת נתונים לדוגמה. בשלב זה, בחר אילו נקודות ניסוי יש לייצא. בחר נקודת שיוך (2, 7, 12, 17, 22 וכן הלאה) והפחת את שלבי הכיול הקודמים (1, 6, 11, 16, 21 וכן הלאה). הוסף את כל הנקודות לרשימת הייצוא וייצא נתונים אלה כדי לקבל גיליון אלקטרוני עם I-Response עבור כל נקודת נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S5: תרשים אסוציאציה שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-y מתאים ל-I-Response בסוף שלב האסוציאציה, ציר ה-x מתאים לריכוזי האנליט השונים של Cdc37. חלקה זו נוצרה באמצעות נקודות הנתונים מהניסוי הראשון ולא כללה את נקודת הנתונים של ריכוז 3,000 ננומטר. סיכום תוצאות הניתוח מובאות בגרף; עבור ניסוי זה, הערך KD הוא 0.006 ± 0.081 μM והערך R2 הוא 0.98. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S6 משלים: קבצי נתונים שנוצרו מניסוי 2 משכפלים 1. (A) נתוני הניסוי מנוטרים בזמן אמת. ציר ה-y מתאים ל-I-Response ביחידות ביוסנסורים (BU), וציר ה-x מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. נתון זה תואם את הנתונים מהחזרה השנייה שבוצעו בניסוי השני שבו Hsp90 היה משותק על השבב (500 ננומטר) והוכנו 10 ריכוזים של אנליט Cdc37 (0.4-200 ננומטר). גרף ה-I-Response בזמן אמת מתחיל בתחילה מ-0 ועולה בהדרגה עם העלייה בריכוזי האנליטים בכל מחזור של הניסוי, מה שמרמז על כך שהניסוי מוצלח. (B) עלילת Hill Fit שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-y מתאים ל-I-Response, ציר ה-x מתאים לריכוזים של אנאליט (Cdc37) ב-nM. התוצאות מהניתוח האוטומטי הראו ערך KD נמוך יחסית וסטיית תקן נמוכה של 0.0531 ± 0.0002 μM, מה שמרמז על אינטראקציה חזקה בין Hsp90 ל- Cdc37. (C) תרשים הקשר שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-y מתאים ל-I-Response בסוף שלב האסוציאציה, ציר ה-x מתאים לריכוזי האנליט השונים של Cdc37. חלקה זו נוצרה באמצעות נקודות הנתונים שסופקו בטבלה S1. סיכום תוצאות הניתוח מובאות בגרף; עבור ניסוי זה, הערך KD הוא 0.003 ± 0.009 μM והערך R2 הוא 0.99. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S7 משלים: קבצי נתונים שנוצרו מניסוי 2 משכפלים 1. (A) נתוני הניסוי מנוטרים בזמן אמת. ציר ה-y מתאים ל-I-Response ביחידות ביוסנסורים (BU), וציר ה-x מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. נתון זה תואם את הנתונים מהחזרה השלישית בניסוי השני שבו Hsp90 היה משותק על השבב (500 ננומטר) והוכנו 10 ריכוזים של Cdc37 analyte (0.4-200 ננומטר). (B) עלילת Hill Fit שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-y מתאים ל-I-Response, ציר ה-x מתאים לריכוזים של אנאליט (Cdc37) ב-nM. התוצאות מהניתוח האוטומטי הראו ערך KD נמוך יחסית וסטיית תקן נמוכה של 0.0719 ± 0.0007 μM, מה שמרמז על אינטראקציה חזקה בין Hsp90 ל- Cdc37. (C) תרשים האגודה שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-y מתאים ל-I-Response בסוף שלב האסוציאציה. ציר ה-x מתאים לריכוזי האנליט השונים של Cdc37. חלקה זו נוצרה באמצעות נקודות הנתונים שסופקו בטבלה S2. סיכום תוצאות הניתוח מובאות בגרף; עבור ניסוי זה, הערך KD הוא 0.004 ± 0.009 μM והערך R2 הוא 0.99. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S8 משלים: קבצי נתונים שנוצרו מניסוי הבקרה. (A) נתוני הניסוי מנוטרים בזמן אמת. ציר ה-y מתאים ל-I-Response ביחידות ביוסנסורים (BU), וציר ה-x מתאים לנקודות הזמן והריכוזים השונים של האנליט בניסוי. נתון זה תואם את הנתונים מניסוי הבקרה שבו Hsp90 היה משותק על השבב (500 ננומטר) והוכנו 10 ריכוזים של BSA (חלבון בקרה) אנאליט (0.4-200 ננומטר). גרף ה-I-Response בזמן אמת מתחיל מתגובת I נמוכה סביב 10-15 BU ואינו עולה עם עלייה בריכוזי האנאליטים בכל מחזור של הניסוי, מה שמרמז על כך שאין אינטראקציה בין Hsp90 ל-BSA. (B) עלילת Hill Fit שנוצרה מתוכנת הניתוח האוטומטית. ציר ה-y מתאים ל-I-Response; ציר ה-x מתאים לריכוזים של אנאליט (BSA) ב-nM. התוצאות מהניתוח האוטומטי הראו כי אין מספיק נתונים כדי לחשב את ערך KD המצביעים על כך שאין אינטראקציה בין Hsp90 ל- BSA. (ג) תרשים האגודה שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי. ציר ה-y מתאים ל-I-Response בסוף שלב האסוציאציה, ציר ה-x מתאים לריכוזי ה-BSA האנליטיים השונים. חלקה זו נוצרה באמצעות נקודות הנתונים שסופקו בטבלה S4. סיכום תוצאות הניתוח מובאות בגרף; עבור ניסוי זה, הערך KD הוא -0.009 ± -0.0003 μM והערך R2 הוא 0.82. ערך KD שלילי הקרוב לאפס מציין שאין אינטראקציה בין Hsp90 ל- BSA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: סיכום ערכי I-Response הנוצרים בכל נקודת ריכוז ונקראים מטרנזיסטורים של כל שבב (שלושה טרנזיסטורים שונים עבור כל שבב). טבלה זו תואמת את הנתונים שחולצו מהחזרה השנייה שבוצעה עבור הניסוי השני שבו Hsp90 היה משותק על השבב (500 ננומטר) והוכנו 10 ריכוזים של אנליט Cdc37 (0.4-200 ננומטר). נקודות הנתונים מטבלה זו שימשו לניתוח בתוכנת הניתוח הסטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S2: סיכום ערכי I-Response הנוצרים בכל נקודת ריכוז ונקראים מטרנזיסטורים של כל שבב (שלושה טרנזיסטורים שונים עבור כל שבב). טבלה זו תואמת את הנתונים שחולצו מהחזרה השלישית שבוצעה עבור הניסוי השני שבו Hsp90 היה משותק על השבב (500 ננומטר) והוכנו 10 ריכוזים של אנליט Cdc37 (0.4-200 ננומטר). נקודות הנתונים מטבלה זו שימשו לניתוח בתוכנת הניתוח הסטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S3: סיכום ערכי ה-I-Response הנוצרים בכל נקודת ריכוז ונקראים מהטרנזיסטור של כל שבב (שלושה טרנזיסטורים שונים עבור כל שבב). טבלה זו תואמת את הנתונים מניסוי הבקרה שבו Hsp90 היה משותק על השבב (500 ננומטר) והוכנו 10 ריכוזים של BSA analyte (0.4-200 ננומטר). נקודות הנתונים מטבלה זו שימשו לניתוח בתוכנת הניתוח הסטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה הוערכה ההיתכנות של שימוש בטכנולוגיית FEB (גישת אפיון קינטי בזמן אמת) כדי לקבוע את האינטראקציה הביומולקולרית בין Hsp90 ל-Cdc37. ניסוי החקר הראשוני (הניסוי הראשון) הציע כי בחירת ריכוזי האנליטים הנכונים היא חלק קריטי בניסוי וכי יש לתכנן את הניסוי על ידי הכללת נקודות ריכוז מעל ומתחת לערך KD , שנחזו על סמך הנתונים הזמינים בספרות.

עם זאת, אם אין מידע ראשוני על האינטראקציה, אנו מציעים לתכנן ניסוי ראשוני על ידי הכללת טווח רחב של נקודות ריכוז הן בטווחים נמוכים יותר (0.08 ננומטר, 0.16 ננומטר, 0.4 ננומטר, 2 ננומטר) והן בטווחים גבוהים יותר (1,000 ננומטר, 2,500 ננומטר, 5,000 ננומטר). הניסוי הראשוני מספק הערכה גסה של ערך KD ומאפשר לתכנן את הניסויים הבאים באמצעות טווחי הריכוז הנכונים כדי לקבל ערך KD מדויק. מערכת FEB מציעה פונקציית פרוטוקול עריכה שבה ניתן לבחור את מספר נקודות הריכוז לניסוי.

מניסיוננו, השלבים הקריטיים ביותר המעורבים בפרוטוקול FEB הם כדלקמן. חלבון המטרה ומאגר האנליט צריכים להיות זהים למאגר הכיול. אפילו אי התאמה קטנה במאגר עלולה לגרום לתנודות ב-I-Response ולתת תוצאות לא אמינות. לפיכך, אנו מציעים לבצע דיאליזה בן לילה על ידי החלפת מאגרים נכונה. צנרת זהירה על שבב הביוסנסור תוך כדי שאיפה או יישום של תמיסה היא קריטית לאורך כל הניסוי. צנרת רשלנית עלולה להוביל לטרנזיסטורים שבורים או לתנודות ב-I-Response; תוך כדי צנרת, הקפידו לא לגעת במשטח הרגיש של השבב. יש לערבב את פתרון ה-EDC/sulfo-NHS המשמש בתהליך הפעלת השבב לפני כל שימוש. שימוש בתערובת ישנה עלול לגרום לשבב שאינו מתפקד. הקפידו להשתמש באותו מאגר עבור כל חמשת השלבים החוזרים על עצמם (כיול, אסוציאציה, דיסוציאציה, התחדשות ושטיפה) המעורבים בכל מחזורי הניסוי.

כאשר השווינו את FEB עם מערכות זיהוי ביומולקולריות מבוססות היטב בתחום, כגון BLI או SPR, מצאנו כי כל שלוש השיטות חולקות יתרונות דומים 43,44,45 שהם: מדובר במערכות נטולות תוויות, שאינן דורשות צבעים פלואורסצנטיים יקרים כדי לזהות את האינטראקציות; הם יכולים לזהות אינטראקציות אפילו בטווחי nM קטנים; השבבים ניתנים לשימוש חוזר הן ב-SPR והן ב-FEB וניתן לחדש אותם ולעשות בהם שימוש חוזר ביעילות למשך עד 10 ניסויים, וכל שלוש השיטות מספקות נתונים קינטיים בזמן אמת, וזמן הניסוי קצר.

היתרון העיקרי של SPR הוא שהוא מספק נתונים נרחבים יותר מהניסוי, כך שניתן לחשב KD, Kon, Koff, Stoichiometry ופרמטרים תרמודינמיים44. היתרון העיקרי של BLI הוא היכולת שלו לבחון ריכוזים מרובים בניסוי אחד. המדידות הקינטיות יכולות להיעשות בו זמנית עבור עד שמונה ריכוזים על ידי שימוש בחיישנים שונים. עם זאת, חיישני ה- BLI אינם ניתנים לשימוש חוזר, ובכך הופכים את עלות הניסוי לגבוהה ביותר43.

היתרון העיקרי של FEB הוא התוכנה האוטומטית והידידותית למשתמש שלה שמנחה את המשתמש לאורך כל הניסוי, ופלטפורמת הצינורות הפתוחה שלה המאפשרת למשתמש להוסיף את האנליטה למטרה המשותקת בכל שלב. גישת ה-open-pipetting הזו בשילוב עם תוכנה פשוטה הופכת את ה-FEB לקל ללמידה ודורשת מעט מאוד או אפילו ללא הכשרה כלל. עם זאת, היא דורשת שלמשתמש תהיה שליטה בסיסית בצינורות ידניים, והיעדר טיפול אוטומטי בנוזלים פירושו שהשכפול של תזמון הצעד תלוי לחלוטין במשתמש. אותו חוסר של טיפול משולב בנוזלים פירושו שהשבבים והמכשירים חסכוניים בהשוואה ל- SPR או BLI. ה- FEB מפגין גם יכולת שכפול ואמינות גבוהה באיתור אינטראקציות ביומולקולריות עקב תהליך הייצור המוגדר המעורב בהכנת שבב ביוסנסור35.

בהשוואה לשיטת זיהוי ITC מבוססת וסטנדרטית היטב, FEB משתמשת רק ב-50 μL של נפח אנאליטים בריכוזי ננו-מולארים עבור הניסוי כולו, מה שמקטין את הסיכוי לנוקלאציה או לצבירה של חלבונים. אחת הבעיות הגדולות ביותר עם ITC היא פירוק של חלבונים לפני הטעינה כדי למנוע בועות אוויר. במהלך ניסוי ITC, קיים סיכוי לפתח בועות בתוך תא המדידה עקב ערבוב מתמשך וטיהור אינטנסיבי, אשר עלול להתיז לרעה את תמיסת הדגימה או לגרום לאובדן דגימה42. טכנולוגיית FEB מתגברת על אתגרים אלה של ITC על ידי הצעת כימיה חזקה של אימוביליזציה למטרות, הפחתת צבירה ומבעבעת, הגברת היציבות ושיפור בעיות תלויות ריכוז העומדות בפני ITC.

חיסרון פוטנציאלי של מכשירי FEB הוא הרגישות שלהם להרכב המאגר ולשינויים בריכוז, שעלולים לגרום לסחף בקו הבסיס שיש לתקן במהלך ההתאמה והניתוח של התוצאות. שבב הביוסנסור רגיש גם ל-pH ולמלח, ולכן מאגרים המשמשים במהלך הכיול והמדידה של האנליט חייבים להיות זהים לאורך כל הניסוי. כימיקלים המשמשים כחומרים משמרים (למשל, נתרן אזיד) ומולקולות הידרופוביות עלולים לפגוע בחיישן ואף עלולים לגרום לעלייה בקשירת קשרים לא ספציפיים. ניתן למתן את החסרונות הללו עם תשומת לב לעקביות המאגר לאורך שלבי המדידה, דיאליזה של תרכובות מפריעות ממלאי האנליטים, ופסייבציה מתאימה של פני השטח (למשל, שימוש בדטרגנטים, חוסמי חלבונים או מולקולות PEG שונות).

לסיכום, הדגמנו בהצלחה PPI חזק בין Hsp90/Cdc37 על ידי שימוש בטכנולוגיית FEB ואימתנו את האינטראקציה שלהם באמצעות ITC, תוך מתן נתונים מעודדים לתמיכה ב- FEB כשיטה חלופית חדשנית לזיהוי PPI. טכנולוגיית FEB מציעה מגוון רחב של יישומים בתחומים מגוונים של גילוי תרופות, תרופות, ניתוח ביומולקולרי של מולקולות קטנות, פפטידים וחלבונים, פיתוח נוגדנים, אימות תרופות ואופטימיזציה של עופרת בקצות אצבעותינו על ידי תרגום פעילות ביולוגית במבחנה בקלות ליעילות in vivo. בהתחשב ביתרונות של טכנולוגיית FEB וביישומים העצומים שלה בחקר אינטראקציות PPI, חלבונים ודנ"א או רנ"א, כמו גם אינטראקציות של חלבונים ומולקולות קטנות (למשל, תרופות), אנו מציעים שזוהי טכנולוגיה ייחודית ומבטיחה בארגז הכלים לזיהוי PPI. במקרה שלנו, טכנולוגיית FEB מציעה כלי רב ערך כדי להעריך בקלות את היעילות המחייבת של אנטגוניסטים מועמדים ל-Hsp90/Cdc37 PPI, אשר לאחר מכן מסייע בבחירת מועמדים מבטיחים להערכות in vitro ו-in vivo נוספות הנוגעות למחלות שונות שבהן PPI זה הוא קריטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים, כספיים או אחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק מהקרן הדו-לאומית למדע (BSF) ל- S.K.S. ו- N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 181 מחזור חלוקת תאים 37 Cdc37 חלבון הלם חום 90 Hsp90 חלבון קינאז ביוסנסור גרפן ביוסנסור אפקט שדה סרטן אינטראקציות ביומולקולריות
חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter