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Biochemistry

Exploration de l’interaction biomoléculaire entre le chaperon moléculaire Hsp90 et sa protéine cliente Kinase Cdc37 à l’aide de la technologie de biodétection à effet de champ

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63495
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

La biodétection à effet de champ (FEB) est une technique sans étiquette permettant de détecter les interactions biomoléculaires. Il mesure le courant électrique à travers le biocapteur de graphène auquel les cibles de liaison sont immobilisées. La technologie FEB a été utilisée pour évaluer les interactions biomoléculaires entre Hsp90 et Cdc37 et une forte interaction entre les deux protéines a été détectée.

Abstract

Les interactions biomoléculaires jouent un rôle polyvalent dans de nombreux processus cellulaires en régulant et en coordonnant des événements biologiques fonctionnellement pertinents. Les biomolécules telles que les protéines, les glucides, les vitamines, les acides gras, les acides nucléiques et les enzymes sont des éléments constitutifs fondamentaux des êtres vivants; ils s’assemblent en réseaux complexes dans les biosystèmes pour synchroniser une myriade d’événements de la vie. Les protéines utilisent généralement des réseaux d’interactomes complexes pour remplir leurs fonctions; il est donc obligatoire d’évaluer de telles interactions pour démêler leur importance dans les cellules aux niveaux cellulaire et de l’organisme. Pour atteindre cet objectif, nous introduisons une technologie en émergence rapide, la biodétection à effet de champ (FEB), pour déterminer des interactions biomoléculaires spécifiques. FEB est une technique de détection biomoléculaire fiable et sans étiquette de paillasse pour déterminer des interactions spécifiques et utilise des biocapteurs électroniques de haute qualité. La technologie FEB peut surveiller les interactions dans la gamme nanomolaire en raison des nanomatériaux biocompatibles utilisés sur sa surface de biocapteur. Comme preuve de concept, l’interaction protéine-protéine (IPP) entre la protéine de choc thermique 90 (Hsp90) et le cycle de division cellulaire 37 (Cdc37) a été élucidée. Hsp90 est un chaperon moléculaire dépendant de l’ATP qui joue un rôle essentiel dans le repliement, la stabilité, la maturation et le contrôle de la qualité de nombreuses protéines, régulant ainsi de multiples fonctions cellulaires vitales. Cdc37 est considéré comme un chaperon moléculaire spécifique à la protéine kinase, car il reconnaît et recrute spécifiquement les protéines kinases à Hsp90 pour réguler leurs voies de transduction du signal en aval. En tant que tel, Cdc37 est considéré comme un co-chaperon de Hsp90. La voie chaperon-kinase (complexe Hsp90/Cdc37) est hyper-activée dans de multiples tumeurs malignes favorisant la croissance cellulaire; par conséquent, c’est une cible potentielle pour le traitement du cancer. La présente étude démontre l’efficacité de la technologie FEB à l’aide du système modèle Hsp90/Cdc37. Feb a détecté un fort IPP entre les deux protéines (valeurs KD de 0,014 μM, 0,053 μM et 0,072 μM dans trois expériences indépendantes). En résumé, FEB est une plate-forme de détection PPI sans étiquette et rentable, qui offre des mesures rapides et précises.

Introduction

Interactions biomoléculaires :
Les protéines sont des parties essentielles des organismes et participent à de nombreuses voies moléculaires telles que le métabolisme cellulaire, la structure cellulaire, la signalisation cellulaire, les réponses immunitaires, l’adhésion cellulaire, etc. Alors que certaines protéines remplissent leur(s) fonction(s) indépendamment, la plupart des protéines interagissent avec d’autres protéines en utilisant une interface de liaison pour coordonner l’activité biologique appropriée1.

Les interactions biomoléculaires peuvent principalement être classées en fonction des caractéristiques structurelles et fonctionnelles distinctes des protéines impliquées2, par exemple, en fonction des surfaces protéiques, de la stabilité complexe ou de la persistance des interactions3. L’identification des protéines essentielles et de leurs rôles dans les interactions biomoléculaires est essentielle pour comprendre les mécanismes biochimiques au niveau moléculaire4. Actuellement, il existe différentes approches pour détecter ces interactions5 : in vitro6, in silico7, dans les cellules vivantes8, ex vivo9 et in vivo10, chacune ayant ses propres forces et faiblesses.

Les essais in vivo sont effectués en utilisant l’animal entier comme outil expérimental11, et les essaisex vivo sont effectués sur des extraits de tissus ou des organes entiers (par exemple, le cœur, le cerveau, le foie) dans un environnement externe contrôlé en fournissant des altérations minimales dans les conditions naturelles. L’application la plus courante des études in vivo et ex vivo consiste à évaluer les effets pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et toxiques d’agents pharmacologiques potentiels avant les essais chez l’homme en s’assurant de leur innocuité et de leur efficacitéglobales 12.

Les interactions biomoléculaires peuvent également être détectées au sein des cellules vivantes. L’imagerie des cellules vivantes nous permet d’observer des interactions dynamiques lorsqu’elles exécutent les réactions d’une voie biochimique particulière13. De plus, les techniques de détection, telles que la bioluminescence ou le transfert d’énergie par résonance de fluorescence, peuvent fournir des informations sur l’endroit et le moment où ces interactions se produisent dans la cellule14. Bien que la détection dans les cellules vivantes offre des détails cruciaux, ces méthodologies de détection reposent sur l’optique et les étiquettes, qui peuvent ne pas refléter la biologie native; ils sont également moins contrôlés que les méthodes in vitro et nécessitent une expertise spécialisée pour en effectuer15.

Les méthodes de calcul in silico sont principalement utilisées pour le criblage à grande échelle des molécules cibles avant les expériences in vitro . Les méthodes de prédiction computationnelle, les bases de données informatisées, l’amarrage moléculaire, les relations quantitatives structure-activité et d’autres approches de simulation de la dynamique moléculaire font partie des outils in silico bien établis16. Comparés à des techniques expérimentales laborieuses, les outils in silico peuvent facilement faire des prédictions avec une sensibilité élevée, mais avec une précision réduite dans les performances prédictives17.

Les essais in vitro sont effectués avec des micro-organismes ou des molécules biologiques en dehors de leur contexte biologique standard. La représentation des interactions biomoléculaires par des méthodes in vitro est essentielle à la compréhension des fonctions des protéines et de la biologie derrière le réseau complexe du fonctionnement cellulaire. La méthodologie de dosage préférée est choisie en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, des valeurs cinétiques et du mode et de l’intensité des interactions18,19.

L’interaction Hsp90/Cdc37 :
La voie chaperon-kinase, reliant Hsp90 et Cdc37, est une cible thérapeutique prometteuse en biologie tumorale20. Hsp90 joue un rôle central dans le contrôle du cycle cellulaire, l’assemblage des protéines, la survie cellulaire et les voies de signalisation. Les protéines qui dépendent de Hsp90 pour leurs fonctions sont livrées à Hsp90 pour la complexation par un co-chaperon, tel que Cdc37. Le complexe Hsp90/Cdc37 contrôle le repliement de la plupart des protéines kinases et sert de plaque tournante pour une multitude de réseaux de signalisation intracellulaire21. C’est une cible antitumorale prometteuse en raison de son expression élevée dans diverses tumeurs malignes, y compris la leucémie myéloblastique aiguë, le myélome multiple et le carcinome hépatocellulaire22,23.

Techniques de détection d’interactions biomoléculaires in vitro couramment utilisées
La co-immunoprécipitation (co-IP) est une technique qui repose sur la spécificité antigène-anticorps pour identifier les interactions biologiquement pertinentes24. Le principal inconvénient de cette méthode est son incapacité à détecter les interactions de faible affinité et les valeurs cinétiques24. Les méthodes biophysiques telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie biocouche (BLI) et la technologie FEB sont préférées pour déterminer les valeurs cinétiques.

ITC est une méthode de détection biophysique basée sur la détermination de l’énergie de liaison ainsi qu’une analyse thermodynamique complète pour caractériser les interactions biomoléculaires25. Le principal avantage de l’ITC est qu’il ne nécessite aucun marquage ou fixation de la protéine cible. Les principales difficultés rencontrées par l’ITC sont la forte concentration de protéines cibles requise pour une expérience et la difficulté d’analyser les complexes non covalents en raison de petites enthalpies de liaison26. Spr et BLI sont des techniques biophysiques sans étiquette qui reposent sur l’immobilisation de la molécule cible à la surface du capteur, suivie d’injections ultérieures de l’analyte sur la cible immobilisée27,28. Dans la SPR, les altérations de l’indice de réfraction au cours des interactions biomoléculaires sont mesurées27; dans BLI, l’interférence dans la lumière réfléchie est enregistrée en temps réel sous forme de changement de longueur d’onde en fonction du temps28. SPR et BLI partagent tous deux des avantages communs en offrant des capacités de spécificité, de sensibilité et de détection élevées29. Dans les deux méthodes, la protéine cible est immobilisée sur les surfaces des biocapteurs et, par conséquent, il peut y avoir une certaine perte de la conformation native de la cible, ce qui rend difficile la distinction entre les interactions spécifiques et non spécifiques30. BLI utilise des biocapteurs à fibre optique jetables coûteux pour immobiliser la cible, et est donc une technique coûteuse31. Par rapport à ces outils de détection biomoléculaire bien établis, la technologie FEB offre une plate-forme fiable et sans étiquette en utilisant de faibles concentrations nanomolaires pour la détection biomoléculaire en temps réel avec caractérisation cinétique. La technologie FEB surmonte également les défis bouillonnants rencontrés dans l’ITC et est plus rentable que SPR ou BLI.

Les biocapteurs à transistor à effet de champ (FET) sont un domaine émergent pour la détection des interactions biomoléculaires en offrant des applications biomédicales variées. Dans le système FET, les cibles sont immobilisées sur les puces de biocapteur et les interactions sont détectées par des changements de conductance32. La caractéristique unique à prendre en compte dans le développement d’un biocapteur électronique efficace réside dans les propriétés physico-chimiques telles que la nature semi-conductrice et la stabilité chimique du matériau de revêtement utilisé pour fabriquer la surface du capteur33. Les matériaux conventionnels comme le silicium utilisé pour le FET ont limité la sensibilité des capteurs car ils nécessitent des couches d’oxyde prises en sandwich entre le canal du transistor et un environnement spécifique pour un bon fonctionnement34. De plus, les transistors en silicium sont sensibles aux environnements riches en sel, ce qui rend difficile la mesure des interactions biologiques dans leur environnement naturel. Le biocapteur à base de graphène est présenté comme une alternative car il offre une excellente stabilité chimique et un champ électrique. Étant donné que le graphène est une seule couche atomique de carbone, il est à la fois extrêmement sensible en tant que semi-conducteur et chimiquement compatible avec les solutions biologiques; ces deux qualités sont souhaitables pour générer des biocapteurs électroniques compatibles35. Le remarquable potentiel de charge ultra-élevé des biomolécules offert par les biocapteurs revêtus de graphène conduit au développement de la technologie FEB des biocapteurs à base de graphène.

Principe de la technologie FEB: FEB est une technique de détection biomoléculaire sans étiquette qui mesure le courant électrique à travers le biocapteur de graphène auquel les cibles de liaison sont immobilisées. Les interactions entre la protéine immobilisée et l’analyte entraînent des altérations du courant qui sont surveillées en temps réel, ce qui permet des mesures cinétiques précises36.

Instrumentation : Le système FEB comprend une puce de capteur à transistor à effet de champ en graphène (gFET) et un lecteur électronique qui applique une tension constante tout au long de l’expérience (Figure 1). L’analyte est appliqué en solution sur la protéine cible immobilisée à la surface du biocapteur. Lorsqu’une interaction se produit, une altération du courant est mesurée et enregistrée en temps réel. Au fur et à mesure que la concentration de l’analyte augmente, la fraction d’analyte lié augmentera également, provoquant des alternances plus élevées dans le courant. À l’aide du logiciel d’analyse automatisé fourni avec l’instrument (Table des matériaux), I-Response est mesurée et enregistrée en termes d’unités de biodétection (BU)37. I-Response est définie comme l’altération du courant (I) à travers la puce de biocapteur mesurée en temps réel lors de l’interaction de la cible immobilisée avec l’analyte. Le logiciel d’analyse automatisé FEB peut analyser à la fois la réponse I et la réponse C aux événements d’interaction dynamique, où la réponse C enregistre les altérations de la capacité (C). Les variations de la réponse I et de la réponse C correspondent directement à la fraction de l’analyte lié et peuvent être analysées plus en détail pour générer des valeurs KD . La préférence par défaut du logiciel d’analyse automatisée est I-Response.

Figure 1
Figure 1: Vue d’ensemble de la configuration expérimentale. (A) Puce à base de graphène et lecteur électronique. (B) Une vue d’ensemble des composants de la puce. La puce est fixée à deux électrodes qui fournissent du courant au système. La surface de la puce est recouverte de graphène qui, lorsqu’il est activé, peut lier la cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Méthodologie:
Initialement, la puce de biocapteur activée est insérée dans le dispositif FEB (Figure 1) suivie de l’exécution des étapes décrites ci-dessous: (1) Étalonnage: L’expérience commence par l’étalonnage du système en utilisant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH = 7,4) pour créer la réponse d’équilibrage de base. (2) Association: L’analyte est introduit dans la puce et la réponse I est surveillée jusqu’à ce que la saturation de liaison soit atteinte. (3) Dissociation: L’analyte est dissocié à l’aide de 1x PBS. (4) Régénération: Les restes de l’analyte sont éliminés à l’aide de 1x PBS. (5) Lavage: Un total de cinq lavages sont effectués à l’aide de 1x PBS pour l’élimination complète des analytes liés et non liés de la puce.

Analyse:
L’analyse des données est effectuée à l’aide du logiciel entièrement automatisé fourni avec l’instrument. Le logiciel d’analyse automatisé génère un diagramme d’ajustement de Hill avec une valeur KD . Le diagramme d’ajustement de Hill décrit l’association d’un analyte à la protéine cible en fonction des concentrations d’analyte. La concentration à laquelle une réponse demi-maximale est obtenue est proportionnelle à la valeur KD . Une valeur KD faible représente une affinité de liaison élevée et vice versa.

Pour valider les données obtenues à partir de l’expérience FEB, les réponses I sont extraites de chaque point de lecture pour chaque concentration d’analyte à l’aide du logiciel d’examen/exportation des données et peuvent être exportées vers d’autres logiciels d’analyse statistique (voir tableau des matériaux) comme expliqué ci-dessous.

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Protocol

REMARQUE : Les protéines recombinantes utilisées dans cette étude, Hsp90 et Cdc37, ont été obtenues commercialement (voir tableau des matériaux).

1. Activation de la puce

REMARQUE : Tous les matériaux à utiliser dans l’expérience sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Filtrer toutes les solutions préparées à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 μm.

  1. Préparer une solution de 1-Éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimure (EDC) en ajoutant 2 mg d’EDC à 2,5 mL de tampon d’acide éthane-sulfonique (MES) de 1 M2-(N-morpholino) éthane sulfonique (pH = 6,0) dans un tube de 15 mL. Préparer des solutions de N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) en ajoutant 6 mg de sulfo-NHS à 2,5 mL de tampon MES de 1 M (pH = 6,0) dans un tube séparé de 15 mL. Aliquoter 50 μL de chaque solution dans des tubes indépendants et conserver à -20 °C pour une utilisation future.
  2. Mélanger des volumes égaux de solution de sulfo-NHS de sable EDC (50 μL d’EDC + 50 μL de sulfo-NHS) en pipetant de haut en bas (ne pas vortex).
    REMARQUE: La solution mixte d’EDC / sulfo-NHS doit être utilisée dans les 30 minutes pour maintenir une réticulation efficace pour une fonctionnalisation appropriée de la puce.
  3. Placez la puce de biocapteur (5,7 cm x 2,4 cm; voir Tableau des matériaux) fournie par l’entreprise dans une boîte de Petri en verre avec un couvercle intégré. Toutes les étapes de fonctionnalisation impliquées dans l’activation de la puce sont suggérées à faire dans la boîte de Pétri. Appliquer 50 μL de tampon MES de 1 M (pH = 6,0) sur la puce du biocapteur, incuber pendant 1 min à température ambiante, puis aspirer le tampon.
  4. Appliquer immédiatement 50 μL de solution EDC/sulfo-NHS sur la puce du capteur. Couvrir la boîte de Petri et incuber pendant 15 min à température ambiante. Aspirer la solution EDC/sulfo-NHS de la puce.
  5. Rincez la puce une fois avec 50 μL de tampon MES de 1 M (pH = 6,0); aspirer le tampon MES.

2. Immobilisation des protéines cibles

  1. Rincez la puce 2x avec 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspirer le PBS de la puce et ajouter la molécule cible, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
    REMARQUE: L’incompatibilité de la mémoire tampon peut ruiner toute l’expérience; par conséquent, avant l’expérience, il est important de s’assurer que la molécule cible est dans le même tampon que celui utilisé pour l’étalonnage (par exemple, 1x PBS (pH = 7,4)). Si nécessaire, effectuez un échange tampon par dialyse de nuit avant l’expérience. Dans cette expérience, une dialyse de nuit a été effectuée pour les deux protéines recombinantes, Hsp90 et Cdc37, contre 1x PBS (pH = 7,4; voir tableau des matériaux) avec un échange tampon approprié à 4 ° C. La concentration du matériau cible (Hsp90 dans ce cas) peut varier selon différents protocoles expérimentaux et la nature des matériaux cibles (protéine/peptide/ligands).
  2. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 30 min à température ambiante. Aspirer la solution contenant la molécule cible et rincer 3x avec 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspirer la solution 1x PBS (pH = 7,4) de la puce.
  3. Ajouter 50 μL de Solution Quench 1 (3,9 mM d’amino-PEG5 dans 1x PBS (pH = 7,4)) à la puce. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 15 min à température ambiante. Aspirer la solution Quench 1 de la puce.
  4. Ajouter 50 μL de solution Dench 2 (1 M d’éthanolamine (pH = 8,5)) à la puce. Couvrir la boîte de Petri en verre et incuber pendant 15 min à température ambiante. Aspirer la solution Quench 2 de la puce et rincer la puce 5x en utilisant 50 μL de 1x PBS, en laissant la dernière gouttelette PBS sur le capteur.

3. Préparation d’échantillons d’analytes

  1. Préparer la série de dilution de l’analyte pour Cdc37 dans la plage de concentration souhaitée. Pour la première expérience, les concentrations suivantes ont été utilisées : 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1 000 nM, 2 000 nM, 3 000 nM et 5 000 nM. Pour la deuxième expérience, un ensemble différent de concentrations allant de 0,4 nM à 200 nM a été utilisé.
  2. Concevez l’expérience pour inclure au moins huit concentrations d’analyte différentes afin d’obtenir une valeur KD fiable. Préparer les différentes dilutions de la protéine analytique dans le même tampon que celui utilisé pour l’étalonnage et la protéine cible; ici, c’est 1x PBS (pH = 7,4).

4. Chargement de la puce de biocapteur activée dans le dispositif FEB

REMARQUE: Le dispositif FEB se compose d’un lecteur doté d’indications lumineuses LED et d’une cartouche pour insérer la puce de biocapteur.

  1. Après l’immobilisation de la protéine cible, insérez la puce activée dans la cartouche de l’appareil, qui est connectée via USB à un ordinateur. Après l’insertion de la puce, une lumière LED verte s’affichera sur le lecteur indiquant que l’appareil FEB est prêt pour l’expérience. Installez le logiciel automatisé (voir Tableau des matériaux) fourni par l’entreprise sur l’ordinateur auquel l’appareil FEB est connecté pour surveiller l’expérience étape par étape comme décrit ci-dessous.

5. Exécutez l’expérience

  1. Appuyez sur le module Exécuter l’expérience du logiciel automatisé et choisissez 10 points avec régénération ou tout autre protocole souhaité. Remplissez les détails suivants: nom de l’opérateur, nom de l’expérience, date (par exemple, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); tampon de régénération (p. ex., tampon PBS); cible immobilisée (p. ex., Hsp90); analyte en solution (p. ex. Cdc37). Voir la figure supplémentaire S1 pour plus de détails.
  2. Appuyez sur le bouton Commencer l’expérience affiché sur le logiciel et suivez les instructions indiquées par le logiciel automatisé comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE: Le logiciel est entièrement automatisé, convivial et guide l’utilisateur tout au long de l’expérience étape par étape. Une fenêtre pop-up apparaîtra à l’écran avec des instructions pour aller plus loin à chaque étape de l’expérience. Le logiciel fournira des instructions pour chaque étape répétitive consécutivement à partir de l’étalonnage, de l’association de l’analyte, de la dissociation, de la régénération et du lavage (5x) pour chaque concentration d’analyte tout au long de l’expérience.
  3. Effectuez l’étalonnage de l’instrument. Pour ce faire, aspirez la solution de PBS restante de la puce et appliquez 50 μL de tampon d’étalonnage (1x PBS; pH = 7,4). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 5 minutes jusqu’à ce que l’étape d’étalonnage soit terminée. Le logiciel affiche le point de terminaison déterminé pour l’étape d’étalonnage (5 min) avec une alarme d’avertissement pour le suivi.
  4. Ensuite, effectuez une association d’analyte. Pour ce faire, aspirez le tampon d’étalonnage de la puce et appliquez 50 μL de la concentration d’analyte la plus faible (25 nM de Cdc37). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 5 minutes jusqu’à ce que l’étape d’association soit terminée. Le logiciel affiche le point de terminaison de l’étape d’association (5 min) avec une alarme d’avertissement pour continuer.
  5. Effectuer une dissociation d’analyte. Pour ce faire, aspirer la solution d’analyte de la puce et appliquer 50 μL du tampon de dissociation (1x PBS; pH = 7,4). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 5 min jusqu’à ce que la durée de l’étape de dissociation (5 min) soit terminée. Le logiciel affiche le point de terminaison de l’étape de dissociation (5 min) avec une alarme d’avertissement pour le suivi.
  6. Ensuite, effectuez la régénération de la puce. Aspirer la solution de dissociation de la puce et appliquer 50 μL de tampon de régénération (1x PBS; pH = 7,4). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 30 s jusqu’à ce que la durée de l’étape de régénération (30 s) soit terminée. Le logiciel affiche le point de terminaison pour l’étape de régénération (30 s) avec une alarme d’avertissement pour le suivi.
  7. Enfin, lavez la puce. Aspirer la solution de régénération de la puce et appliquer 50 μL de tampon de lavage (1x PBS; pH = 7,4) sur la puce. Aspirez la solution de la puce et répétez ce 5x. Laissez la dernière goutte de tampon de lavage sur la puce et appuyez sur le bouton Continuer et attendez 30 s jusqu’à ce que la durée de l’étape de lavage soit terminée dans l’écran du logiciel.
    REMARQUE: Le logiciel affiche le point de terminaison de l’étape de lavage (30 s) avec une alarme d’avertissement pour passer au cycle suivant de l’expérience.
  8. Répétez les étapes pour chaque concentration d’analyte utilisée; les cinq étapes d’étalonnage, d’association d’analytes, de dissociation, de régénération et de lavage (5x) constituent un cycle. Pour l’expérience présentée ici, nous avons effectué 10 cycles pour 10 concentrations d’analytes (allant de 25 nM à 5 000 nM ou de 0,4 nM à 200 nM; Graphique 2).

6. Analyse

  1. Appuyez sur le bouton Analyse situé en haut du logiciel d’analyse automatisée à la fin de l’expérience. Une fenêtre d’affichage contenant tous les points expérimentaux apparaîtra. Dans la fenêtre, assurez-vous que les concentrations d’analyte utilisées pour le protocole prescrit sont correctes.
  2. Appuyez sur le bouton Exécuter l’analyse pour générer automatiquement la valeur KD . Le logiciel génère un diagramme d’ajustement de Hill en traçant les concentrations d’analyte par rapport aux I-Réponses correspondantes à partir desquelles la constante de dissociation à l’équilibre, valeur KD , est calculée.
  3. Exportez les données brutes pour analyse dans d’autres logiciels d’analyse statistique à l’aide du logiciel de révision/exportation de données décrit ci-dessous.
    1. Copiez le fichier R1R créé automatiquement à la fin de l’expérience (par exemple, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) dans un nouveau dossier sur le bureau. Ouvrez le logiciel data review/export fourni par l’entreprise (voir la figure supplémentaire S2A).
    2. Cliquez sur Traitement des données > Traiter les fichiers R1R > OK sur l’écran d’accueil du logiciel de révision/exportation de données.
    3. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers R1R créés sur le bureau à l’étape 6.3.1. et appuyez sur le bouton OK . Cela crée une copie des données R1R d’origine, pour examiner et modifier les données sans remplacer le fichier d’origine.
    4. Appuyez sur l’icône de traitement des données affichée sur l’écran d’accueil du logiciel de révision/exportation des données. Appuyez sur Charger les fichiers R1R traités > OK. Sélectionnez le même dossier créé à l’étape 6.3.1 contenant les fichiers R1R traités. Appuyez sur OK. À cette étape, le dossier contenant les fichiers d’expérience est prêt à être examiné.
    5. Sur l’écran d’accueil du logiciel de révision/exportation de données, appuyez sur Analyse des données. Sélectionnez Calibration > Calibrer les fichiers R1R modifiés > OK (voir figure supplémentaire S2B). Cette étape étalonne tous les points de données en fonction de la première étape d’étalonnage, pour créer une ligne de base.
    6. Sur l’écran d’accueil du logiciel de révision/exportation de données, appuyez sur Analyse des données. Sélectionnez Vérifier et modifier les fichiers R1R > OK. Passez en revue les points de données, supprimez des points ou ajoutez des étapes à l’aide du bouton Supprimer/Ajouter une étape . Assurez-vous que toutes les étapes sont au bon endroit, par exemple, l’étape d’étalonnage est sur la ligne de base, l’étape d’association est au sommet (voir figure supplémentaire S3), puis appuyez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer toutes les modifications apportées.
    7. Sur l’écran d’accueil du logiciel de révision/exportation de données, appuyez sur Analyse des données. Sélectionnez Analyser/Tracer les données, choisissez les étapes à exporter (voir figure supplémentaire S4). Ajoutez chaque étape d’association (par exemple, étape 2, étape 7, etc.) après avoir soustrait l’étape d’étalonnage (par exemple, étape 1, étape 6, etc.) à la liste d’exportation avant d’exporter les données.
    8. Appuyez sur Exporter ces données. Le logiciel génère un fichier de feuille de calcul contenant la réponse I pour chaque point de données de concentration d’analyte de chaque transistor (si tous les transistors fonctionnent, nous aurons trois valeurs de réponse I différentes pour chaque point de concentration). Utilisez ce fichier de feuille de calcul pour analyser plus en détail les données dans le logiciel statistique.
  4. Ouvrez le logiciel d’analyse statistique. Créez une table XY avec trois valeurs Y ; appuyez sur Créer. Les données de cette table (valeurs X, Y) sont copiées à partir du fichier de feuille de calcul créé à l’étape 6.3.8. L’axe des x correspond à la concentration de l’analyte (selon la concentration utilisée), et les trois valeurs Y correspondent aux réponses I, obtenues à partir du logiciel d’examen/exportation de données fourni par l’entreprise.
  5. Appuyez sur Analyser ces données. Choisissez analyses XY > régression non linéaire (ajustement de la courbe) > saturation de liaison > un site > total. Le logiciel analysera automatiquement les données, générera la valeur KD et créera un graphique des points de données.

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Representative Results

Résultats de l’expérience 1 :
La protéine cible Hsp90 (500 nM) a été immobilisée sur la puce en suivant le protocole d’immobilisation cible décrit ci-dessus. Pour la première expérience, 10 concentrations de la protéine analytique Cdc37, allant de 25 nM à 5 000 nM, ont été préparées sur la base des données disponibles dans la littérature (voir tableau 1).

Les étapes de l’expérience peuvent être surveillées en temps réel en suivant les altérations qui se produisent dans la réponse I (Figure 3A). On peut visualiser comment chaque étape incluse dans le protocole affecte la réponse I tout au long de l’expérience. Par exemple, la réponse I est proche de zéro pendant l’étalonnage, et dans l’étape d’association, la réponse I augmente progressivement avec l’augmentation des concentrations d’analyte (Cdc37). En examinant les données de cette expérience (figure 3A), une augmentation soudaine de la réponse I a été observée à de faibles concentrations d’analytes (50 BU à 25 nM). On s’attendait à une faible réponse I à une faible concentration d’analyte qui augmentera progressivement avec l’augmentation des concentrations. Cette augmentation soudaine suggère qu’une expérience comprenant des points de concentration d’analyte plus faibles devrait être conçue.

En suivant les étapes du protocole décrites ci-dessus, les données ont été analysées dans le logiciel d’analyse automatisé fourni, qui a généré automatiquement un diagramme d’ajustement de Hill avec une valeur KD calculée (Figure 3B). La valeur KD calculée à partir du logiciel d’analyse automatisé pour la première expérience était de 350 000 ± 76 000 μM. La plupart des interactions biologiques courantes ont montré une valeur KD dans la gamme faible μM ou même dans la gamme nM; ainsi, la valeur KD générée pour la première expérience est très élevée.

Il peut y avoir plusieurs explications à la valeur élevée de KD observée : il peut y avoir une liaison de faible affinité entre les deux protéines spécifiques étudiées (Hsp90/Cdc37), ce qui signifie qu’une concentration élevée de ligand est nécessaire pour les interactions moléculaires ; l’expérience aurait pu être conçue avec des concentrations d’analytes non idéales et hors de portée; la valeur élevée peut être due aux paramètres intégrés utilisés dans le module de montage du logiciel d’analyse. Le logiciel d’analyse automatisé utilise un module d’analyse dose-réponse pour s’adapter aux points de données, mais certaines interactions peuvent ne pas bien s’intégrer dans ce modèle, donnant ainsi de fausses données, ce qui entraîne des valeurs KD élevées.

Pour obtenir une valeur KD précise avec un diagramme de Hill saturé, une normalisation de l’expérience par essais et erreurs est nécessaire, qui comprend à la fois des points de concentration d’analyte plus faibles et plus élevés, afin d’acquérir la valeur KD la plus basse avec un faible taux d’erreur.

Compte tenu de tous ces facteurs, les données du logiciel d’analyse ont été exportées vers un logiciel d’analyse statistique supplémentaire. La réponse I pour chaque point d’association a été extraite à l’aide du logiciel automatisé d’examen et d’exportation des données et est résumée dans le tableau 2 en suivant les étapes décrites ci-dessus à l’étape d’analyse (étape 6).

Les résultats du logiciel d’analyse statistique (Figure 3C) ont montré une valeur KD relativement faible avec un écart-type élevé (0,011 ± 0,494 μM) et une valeur R2 faible de 0,78. La variation significative observée dans la valeur KD et la faible valeur R2 suggère que les points de concentration choisis pour cette expérience ne sont pas optimaux. En outre, il a également été remarqué que certains points du graphique ne correspondaient pas bien à la courbe de tendance du graphique (figure 3C); cela a renforcé la nécessité de concevoir une deuxième expérience en incluant différents points de concentration d’analyte.

Les paramètres intégrés utilisés par les deux logiciels d’analyse sont entièrement différents, et cela se reflète dans le processusde génération de valeurs K D. Les différences dans les valeurs KD obtenues à partir des deux logiciels d’analyse (350 000 ± 76 000 μM contre 0,011 ± 0,494 μM) peuvent être attribuées au fait que différents modules d’analyse ont été utilisés pour le calcul. L’analyse effectuée dans le logiciel d’analyse statistique peut être mieux adaptée à cette interaction, donnant ainsi une valeur KD inférieure.

Néanmoins, si les résultats des deux analyses sont combinés (350 000 ± 76 000 μM et 0,011 ± 0,494 μM), on peut conclure que la première expérience n’était pas optimale et que des points de concentration supplémentaires seraient nécessaires.

Pour valider ce point, le point graphique non corrélé, 3 000 nM a été exclu (voir figure supplémentaire S5). Les résultats de l’analyse ont montré une valeur KD de 0,006 ± 0,081 μM avec une valeur R2 de 0,98. Ces résultats indiquent que la prochaine expérience devrait être conçue en se concentrant sur des concentrations plus pertinentes. Par conséquent, une deuxième expérience a été réalisée pour évaluer l’IPP Hsp90/Cdc37 en utilisant différents points d’essai avec des concentrations inférieures et supérieures au KD prédit.

Résultats de l’expérience 2 :
La protéine cible, Hsp90 (500 nM) a été immobilisée sur la puce en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Au total, 10 concentrations de l’analyte (Cdc37) ont été préparées comme suit : 0,4 nM, 0,8 nM, 1,6 nM, 3,2 nM, 6,4 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM et 200 nM. La deuxième expérience a été conçue en incluant différents points de concentration d’analyte, en tenant compte de toutes les connaissances acquises lors de l’expérience précédente, comme mentionné ci-dessus.

Au cours de l’expérience, chaque étape a été surveillée en temps réel (Figure 4A). Ici, le graphique I-Response en temps réel (dérivé des faibles concentrations de l’analyte-0,4 nM, 0,6 nM, 1,6 nM) commence initialement à partir de zéro et augmente progressivement à l’augmentation des concentrations d’analyte à chaque cycle de l’expérience par rapport à l’augmentation soudaine de I-Response observée dans la première expérience.

Selon le protocole mentionné ci-dessus, les données ont été analysées à l’aide du logiciel d’analyse automatisé (Figure 4B). La valeur KD calculée à partir du logiciel d’analyse automatisé pour cette expérience était de 0,0673 ± 0,0002 μM, ce qui suggérait une forte interaction entre la protéine cible Hsp90 et l’analyte Cdc37. L’écart-type de 0,0002 μM était beaucoup plus petit que celui obtenu lors de la première expérience, ce qui donne l’assurance que les nouvelles données sont beaucoup plus fiables.

Pour valider ce résultat, nous avons exporté les points de données (tableau 3) vers un autre logiciel d’analyse statistique comme expliqué précédemment; les résultats de l’analyse sont résumés à la figure 4C.

À l’aide du logiciel d’analyse statistique, il a été constaté que la valeur KD pour hsp90/Cdc37 PPI est de 0,014 ± 0,005 μM (figure 4C). Les faibles valeurs de KD et l’écart-type indiquent une forte interaction entre les deux protéines, Hsp90 et Cdc37. De plus, la valeurR2 de 0,99 indique que l’analyse correspond parfaitement aux points du graphe expérimental. Les deux logiciels d’analyse ont montré une cohérence dans les résultats, avec de faibles valeurs KD d’environ 0,0673 ± 0,0002 μM et 0,014 ± 0,005 μM, respectivement.

Pour confirmer la reproductibilité et la précision de l’expérience, la même expérience a été réalisée dans deux répliques en utilisant Hsp90 (500 nM) comme protéine cible et Cdc37 comme analyte avec les mêmes concentrations allant de 0,4 nm à 200 nm que celles utilisées dans la deuxième expérience. Au cours de l’expérience, chaque étape a été surveillée en temps réel (figure supplémentaire S6A et figure supplémentaire S7A). La valeur KD calculée à partir du logiciel d’analyse automatisé est représentée dans les figures supplémentaires S6B et S7B supplémentaires (0,053 ± 0,002 μM et 0,0719 ± 0,0007 μM, respectivement). Comme mentionné précédemment, les points de données ont été exportés (tableau supplémentaire S1 et tableau supplémentaire S2) vers un autre logiciel d’analyse statistique, et les résultats sont présentés dans la figure supplémentaire S6C et la figure supplémentaire S7C (figure supplémentaire S6C: KD est 0,003 ± 0,009 μM et R2 est 0,99; Figure supplémentaire S7C : KD est de 0,004 ± 0,009 μM et R2 est de 0,99). Les résultats des deux réplications du logiciel d’analyse ont bien corroboré et confirmé l’exactitude, la répétabilité et la reproductibilité des données expérimentales Hsp90/Cdc37 FEB.

Une étude de contrôle a également été réalisée dans laquelle l’interaction biomoléculaire entre Hsp90 et une protéine témoin, l’albumine sérique bovine (BSA), a été élucidée. L’étude de contrôle utilisant le BSA comme analyte a été réalisée à l’aide d’une configuration expérimentale identique et des concentrations d’analytes utilisées dans la deuxième expérience. Au total, 10 concentrations de la protéine témoin, la BSA, allant de 0,4 nM à 200 nM ont été préparées dans 1x PBS (pH = 7,4) et chaque étape de l’expérience a été surveillée en temps réel.

Semblable à l’expérience avec Hsp90 et Cdc37, le graphique I-Response en temps réel commence initialement à partir de 0; toutefois, dans l’étude témoin, la réponse I n’a pas augmenté graduellement en fonction de l’augmentation des concentrations d’analytes (figure supplémentaire S8A). Les données ont également été analysées à l’aide du logiciel d’analyse automatisé (figure supplémentaire S8B), et le logiciel n’a pas été en mesure de calculer la valeur KD à partir des points de données de cette expérience. Il est prouvé, à partir de Hill Plot généré à partir du logiciel, qu’il n’y a pas d’interaction entre Hsp90 et l’analyte BSA de contrôle. Pour valider ce résultat, nous avons exporté les points de données (tableau supplémentaire S3) vers un autre logiciel d’analyse statistique comme expliqué précédemment. À l’aide du logiciel d’analyse statistique, il a été constaté que la valeur KD pour l’IPP Hsp90/BSA est négative (figure supplémentaire S8C; KD est -0,009 ± -0,0003 μM), ce qui indique à nouveau qu’il n’y a pas d’interaction entre les deux protéines, Hsp90 et BSA. De plus, la valeurR2 (0,82) indique que l’analyse ne correspondait pas aux points du graphique expérimental. Les deux logiciels d’analyse ont montré une cohérence dans les résultats que Hsp90 et BSA n’interagissent pas.

En comparant les données expérimentales de Hsp90/Cdc37 FEB avec d’autres données expérimentales disponibles dans la littérature, il a été constaté que les valeurs KD obtenues dans cette étude (KD = 0,014 ± 0,005 μM, KD = 0,053 ± 0,002 μM et KD = 0,072 ± 0,001 μM) étaient inférieures de deux ordres de grandeur aux données publiées précédemment (KD = 1,46 μM38 ou 6 μM39 ). Ces différences peuvent être attribuées à l’utilisation de constructions humaines Hsp90 et Cdc37 pleine longueur dans les expériences actuelles. Des études antérieures ont été réalisées sur des constructions Hsp90 de levure qui ne contenaient quedes protéines partielles 38 ou des protéines homologues C. elegans 39 (tableau 1). Pour valider les résultats obtenus dans le système FEB, des expériences ITC ont été réalisées.

Évaluation de hsp90/Cdc37 PPI à l’aide du système ITC :
L’ITC est considéré comme l’étalon-or pour étudier les interactions biomoléculaires. Nous avons également effectué l’ITC pour déterminer la cinétique thermodynamique du PPI Hsp90/Cdc37, et comme validation pour l’expérience FEB. Le Hsp90 et le Cdc37 sont soumis à une dialyse contre le PBS (pH = 7,0) avant l’ITC. Environ 0,25 μM de solution de la protéine cible (Hsp90) et 2,5 μM de solution de protéine analytique (Cdc37) ont été préparés dans PBS pour les titrages calorimétriques. Un volume total de 80 μL de solution de Cdc37 à intervalles consécutifs a été titré de la seringue rotative à la cellule contenant 150 μL de solution de Hsp90 à 298,15 K. Chaque injection s’est déroulée sur une durée de 4 s et l’intervalle de temps entre les injections consécutives était de 150 s. Au total, 19 injections de 2 μL chacune ont été effectuées avec une vitesse d’agitation de 500 tr/min et une puissance de référence de 41,9 μW, respectivement. La variation de chaleur résultant de l’interaction Hsp90/Cdc37 a été surveillée et les données finales obtenues à la fin des injections d’analyte Cdc37 ont été ajustées à l’aide du logiciel d’analyse ITC fourni par la société. Les variations de chaleur ainsi que les paramètres thermodynamiques tels que le changement d’enthalpie molaire (ΔH), le changement d’entropie (ΔS), le nombre de sites de liaison (n) et la constante de dissociation d’équilibre (KD) entre Hsp90/Cdc37 PPI ont été estimés. Le changement d’énergie libre de Gibbs (ΔG) a également été calculé à partir de l’équation ΔG = ΔH - TΔS après avoir obtenu les paramètres thermiques du thermogramme ITC.

Le diagramme ITC révèle la quantité de chaleur utilisée ou libérée au cours des interactions biologiques pour élucider la nature des interactions et des forces intermoléculaires régissant l’IPP40. Cdc37 (2,5 μM) a été titré en Hsp90 (0,25 μM), et les courbes correspondantes sont représentées à la figure 5A,B. Le diagramme ITC obtenu s’est avéré exothermique et a été inséré dans un modèle de site de liaison unique présentant une stœchiométrie de liaison (n) d’un, énergie de liaison, ΔG = -45,9 kJ / mol et valeur KD = 0,009 μM. La légère incohérence observée sous la forme d’un décalage endothermique au début du thermogramme ITC (Figure 5A) suggère la formation de bulles lors du titrage de la protéine analytique vers la cellule de mesure41,42. Parmi les IPP Hsp90/Cdc37, les expériences ITC réalisées à des concentrations plus faibles et plus élevées, l’excès 10 fois supérieur de Cdc37 (concentration Hsp90 = 0,25 μM et concentration Cdc37 = 2,5 μM) a présenté des paramètres de liaison acceptables en atteignant une courbe de saturation. La valeur KD obtenue à partir de l’ITC (KD = 0,009 μM) était bien corrélée avec la valeur KD calculée à l’aide de la technologie FEB (KD = 0,014 μM, 0,053 μM et 0,072 μM), ce qui confirme fortement la sensibilité et la précision de FEB dans la détection de l’IPP Hsp90/Cdc37.

Figure 2
Figure 2 : Résumé du protocole. (A) Résumé des étapes du processus d’activation de la puce. B) Représentation graphique des cinq étapes répétées du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Fichiers de données générés à partir de l’expérience 1. (A) Données d’expérience surveillées en temps réel. L’axe des y correspond à la réponse I en unités de biocapteurs (BU), et l’axe des x correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. Ce chiffre correspond aux données de la première expérience. (B) Tracé Hill Fit généré à partir du logiciel d’analyse automatisé. L’axe des y correspond à I-Response, l’axe des x correspond aux concentrations d’analyte (Cdc37) dans nM. Pour cette expérience, la valeur KD est de 350 000 ± 76 000 μM. (C) Diagramme d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe des y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, l’axe des x correspond aux différentes concentrations d’analyte, Cdc37. Ce graphique a été généré à l’aide des points de données fournis dans le tableau 2. Un résumé des résultats de l’analyse est fourni dans le graphique; pour cette expérience, la valeur KD est de 0,011 ± 0,494 μM et la valeurR2 est de 0,78. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Fichiers de données générés à partir de l’expérience 2. (A) Données d’expérience surveillées en temps réel. L’axe des y correspond à la réponse I en unités de biocapteurs (BU), et l’axe des x correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. Ce chiffre correspond aux données de la deuxième expérience. (B) Tracé Hill Fit généré à partir du logiciel d’analyse automatisé. L’axe des y correspond à la réponse I, l’axe des x correspond à la concentration de l’analyte (Cdc37) dans nM. Pour cette expérience, la valeur KD est de 0,0673 ± diagramme d’association de 0,0002 μM (C) généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe des y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, l’axe des x correspond aux différentes concentrations d’analyte Cdc37. Ce graphique a été généré à l’aide des points de données fournis dans le tableau 3. Un résumé des résultats de l’analyse est fourni dans le graphique; pour cette expérience, la valeur KD est de 0,014 ± 0,005 μM et la valeurR2 est de 0,99. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Thermogramme ITC de l’interaction Hsp90 et Cdc37. (A) Le panneau supérieur représente les courbes d’évolution de la chaleur correspondantes obtenues grâce à des injections consécutives de Cdc37 (2,5 μM) dans Hsp90 (0,25 μM) à 298,15 K. La puissance différentielle (DP) représente la puissance différentielle en fonction du temps. (B) Les points de données intégrés dans le panneau inférieur désignent la chaleur normalisée correspondante par rapport au rapport molaire de Hsp90/Cdc37. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Essais effectués Analyse FEB KD Analyse de prisme KD Origine de la construction Acides aminés Références
ITC 1,46 μM et 1,32 μM NA Levure Hsp90 Domaine N-terminal de Hsp90 36
Cdc37 humain
SPR 6 μM NA C. elegans Longueur complète 37
FEB - Première représentation 0,014 μM 0,067 μM Hsp90 humain Longueur complète Réalisé dans cette étude
Cdc37 humain
FEB - Deuxième répétition 0,053 μM 0,003 μM Hsp90 humain Longueur complète Réalisé dans cette étude
Cdc37 humain
FEB - Troisième répétition 0,072 μM 0,004 μM Hsp90 humain Longueur complète Réalisé dans cette étude
Cdc37 humain
ITC 0,009 μM NA Hsp90 humain Longueur complète Réalisé dans cette étude
Cdc37 humain
FEB- Etude de contrôle Aucune donnée (Il n’y avait pas suffisamment de données pour calculer le KD) -0,009 μM (la valeur KD avec des valeurs négatives indique qu’il n’y a pas d’interaction) Hsp90 humain Longueur complète Réalisé dans cette étude
BSA

Tableau 1 : Évaluation de l’IPP Hsp90/Cdc37 à l’aide de différentes méthodes rapportées dans cette étude et dans la littérature.

Concentrations d’analytes (nM) Transistor I-Response 1 Transistor I-Response 2 Transistor I-Response 3 Moyenne
I-Réponse
25.00 53.540 49.406 50.590 51.178
50.00 71.427 65.943 67.568 68.313
100.00 85.305 79.226 81.074 81.868
200.00 106.652 99.320 101.502 102.491
400.00 122.572 114.837 117.128 118.179
800.00 144.293 136.374 138.872 139.846
1000.00 135.165 128.657 130.425 131.416
2000.00 164.487 159.401 161.697 161.862
3000.00 109.997 106.705 107.205 107.969
5000.00 282.637 274.207 276.247 278.422

Tableau 2 : Résumé des valeurs de réponse I générées à partir de trois transistors différents de chaque puce à chaque point de concentration de la première expérience.

Concentrations d’analytes (nM) Transistor I-Response 1 Transistor I-Response 2 Transistor I-Response 3 Réponse I moyenne
0.40 13.097 14.721 11.714 13.177
0.80 10.183 8.861 13.240 10.762
1.60 24.826 20.377 25.240 23.481
3.20 40.746 41.047 40.783 40.858
6.40 54.938 54.224 54.913 54.691
12.80 83.057 81.452 82.596 82.369
25.60 110.440 109.152 110.343 109.978
51.20 141.161 140.363 141.125 140.883
102.40 164.215 162.679 164.572 163.822
200.00 196.373 197.007 198.495 197.292

Tableau 3 : Résumé des valeurs de réponse I générées à partir de trois transistors différents de chaque puce à chaque point de concentration de la deuxième expérience.

Figure supplémentaire S1 : Capture d’écran de l’écran principal du logiciel automatisé avant le début de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2: Capture d’écran de l’écran principal d’un logiciel automatisé pour le traitement et l’analyse des données. (A) Affichage sur l’écran principal du logiciel de révision/exportation des données montrant les options de traitement des données. (B) L’écran principal du logiciel de révision/exportation des données montrant les options d’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Points de données d’examen obtenus à partir d’un logiciel de révision/exportation. Dans cette étape, passez en revue l’expérience et ajoutez ou supprimez des points de données. Assurez-vous que le point d’association (2, 7, 12, 17, 22, etc.) est toujours au choix. Par exemple, le premier choix à partir de la gauche est le point de données numéro 2, puis le point de données numéro 10 (mais il doit être le point 7). Pour résoudre ce problème, supprimez simplement les points 3, 4 et 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Exporter la liste des données par exemple. Dans cette étape, choisissez les points d’expérience à exporter. Choisissez un point d’association (2, 7, 12, 17, 22, etc.) et soustrayez les étapes d’étalonnage précédentes (1, 6, 11, 16, 21, etc.). Ajoutez tous les points à la liste d’exportation et exportez ces données pour obtenir une feuille de calcul avec la réponse I pour chaque point de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S5 : Diagramme d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe des y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, l’axe des x correspond aux différentes concentrations d’analyte Cdc37. Ce graphique a été généré à l’aide des points de données de la première expérience et a exclu le point de données de concentration de 3 000 nM. Un résumé des résultats de l’analyse est fourni dans le graphique; pour cette expérience, la valeur KD est de 0,006 ± 0,081 μM et la valeurR2 est de 0,98. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S6 : Les fichiers de données générés à partir de l’expérience 2 répliquent 1. (A) Données expérimentales surveillées en temps réel. L’axe des y correspond à la réponse I en unités de biocapteurs (BU), et l’axe des x correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. Ce chiffre correspond aux données de la deuxième répétition réalisée dans la deuxième expérience où Hsp90 a été immobilisé sur la puce (500 nM) et 10 concentrations d’analyte Cdc37 ont été préparées (0,4-200 nM). Le graphique I-Response en temps réel commence initialement à partir de 0 et augmente progressivement à mesure que les concentrations d’analytes augmentent à chaque cycle de l’expérience, ce qui suggère que l’expérience est réussie. (B) Tracé Hill Fit généré à partir du logiciel d’analyse automatisé. L’axe des y correspond à I-Response, l’axe des x correspond aux concentrations d’analyte (Cdc37) dans nM. Les résultats de l’analyse automatisée ont montré une valeur KD relativement faible et un faible écart-type de 0,0531 ± 0,0002 μM, suggérant une forte interaction entre Hsp90 et Cdc37. (C) Le diagramme d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe des y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, l’axe des x correspond aux différentes concentrations d’analyte Cdc37. Ce graphique a été généré à l’aide des points de données fournis dans le tableau S1. Un résumé des résultats de l’analyse est fourni dans le graphique; pour cette expérience, la valeur KD est de 0,003 ± 0,009 μM et la valeurR2 est de 0,99. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S7 : Les fichiers de données générés à partir de l’expérience 2 répliquent 1. (A) Données expérimentales surveillées en temps réel. L’axe des y correspond à la réponse I en unités de biocapteurs (BU), et l’axe des x correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. Ce chiffre correspond aux données de la troisième répétition dans la deuxième expérience où Hsp90 a été immobilisé sur la puce (500 nM) et 10 concentrations d’analyte Cdc37 ont été préparées (0,4-200 nM). (B) Tracé Hill Fit généré à partir du logiciel d’analyse automatisé. L’axe des y correspond à I-Response, l’axe des x correspond aux concentrations d’analyte (Cdc37) dans nM. Les résultats de l’analyse automatisée ont montré une valeur KD relativement faible et un faible écart-type de 0,0719 ± 0,0007 μM, suggérant une forte interaction entre Hsp90 et Cdc37. (C) Diagramme d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe des y correspond à I-Response à la fin de la phase d’association. L’axe des x correspond aux différentes concentrations d’analyte Cdc37. Ce graphique a été généré à l’aide des points de données fournis dans le tableau S2. Un résumé des résultats de l’analyse est fourni dans le graphique; pour cette expérience, la valeur KD est de 0,004 ± 0,009 μM et la valeurR2 est de 0,99. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S8 : Fichiers de données générés à partir de l’expérience de contrôle. (A) Données expérimentales surveillées en temps réel. L’axe des y correspond à la réponse I en unités de biocapteurs (BU), et l’axe des x correspond aux différents points temporels et concentrations de l’analyte dans l’expérience. Ce chiffre correspond aux données de l’expérience de contrôle où Hsp90 a été immobilisé sur la puce (500 nM) et où 10 concentrations d’analyte BSA (protéine témoin) ont été préparées (0,4-200 nM). Le graphique I-Response en temps réel part d’une faible I-Response autour de 10-15 BU et n’augmente pas lors d’une augmentation des concentrations d’analyte à chaque cycle de l’expérience, ce qui suggère qu’il n’y a pas d’interaction entre le Hsp90 et le BSA. (B) Tracé Hill Fit généré à partir du logiciel d’analyse automatisé. L’axe des y correspond à I-Response; l’axe des x correspond aux concentrations d’analyte (BSA) dans nM. Les résultats de l’analyse automatisée ont montré qu’il n’y a pas suffisamment de données pour calculer la valeur KD suggérant qu’il n’y a pas d’interaction entre Hsp90 et BSA. (C) Graphique d’association généré à l’aide du logiciel d’analyse statistique. L’axe des y correspond à la réponse I à la fin de la phase d’association, l’axe des x correspond aux différentes concentrations d’analyte BSA. Ce diagramme a été généré à l’aide des points de données fournis dans le tableau S4. Un résumé des résultats de l’analyse est fourni dans le graphique; pour cette expérience, la valeur KD est de -0,009 ± -0,0003 μM et la valeurR2 est de 0,82. Une valeur KD négative proche de zéro indique qu’il n’y a pas d’interaction entre Hsp90 et BSA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Résumé des valeurs I-Response générées à chaque point de concentration et lecture à partir des transistors de chaque puce (trois transistors différents pour chaque puce). Ce tableau correspond aux données extraites de la deuxième répétition réalisée pour la deuxième expérience où Hsp90 a été immobilisé sur la puce (500 nM) et 10 concentrations d’analyte Cdc37 ont été préparées (0,4-200 nM). Les points de données de ce tableau ont été utilisés pour l’analyse dans le logiciel d’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Résumé des valeurs I-Response générées à chaque point de concentration et lecture à partir des transistors de chaque puce (trois transistors différents pour chaque puce). Ce tableau correspond aux données extraites de la troisième répétition réalisée pour la deuxième expérience où Hsp90 a été immobilisé sur la puce (500 nM) et 10 concentrations d’analyte Cdc37 ont été préparées (0,4-200 nM). Les points de données de ce tableau ont été utilisés pour l’analyse dans le logiciel d’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S3: Résumé des valeurs I-Response générées à chaque point de concentration et lues à partir du transistor de chaque puce (trois transistors différents pour chaque puce). Ce tableau correspond aux données de l’expérience témoin où Hsp90 a été immobilisé sur la puce (500 nM) et où 10 concentrations d’analyte de BSA ont été préparées (0,4-200 nM). Les points de données de ce tableau ont été utilisés pour l’analyse dans le logiciel d’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Dans cette étude, la faisabilité de l’utilisation de la technologie FEB (une approche de caractérisation cinétique en temps réel) a été évaluée pour déterminer l’interaction biomoléculaire entre Hsp90 et Cdc37. L’expérience exploratoire initiale (première expérience) suggérait que le choix des concentrations d’analyte appropriées est une partie essentielle de l’expérience et que l’expérience devrait être conçue en incluant des points de concentration au-dessus et au-dessous de la valeur KD , qui ont été prédits sur la base des données disponibles dans la littérature.

Néanmoins, s’il n’y a pas d’informations préliminaires sur l’interaction, nous suggérons de concevoir une expérience préliminaire en incluant une large gamme de points de concentration dans les plages inférieures (0,08 nM, 0,16 nM, 0,4 nM, 2 nM) et supérieures (1 000 nM, 2 500 nM, 5 000 nM). L’expérience préliminaire fournit une estimation approximative de la valeur KD et permet de planifier les expériences ultérieures en utilisant les bonnes plages de concentration pour obtenir une valeur KD précise. Le système FEB offre une fonction de protocole d’édition dans laquelle on est libre de choisir le nombre de points de concentration pour l’expérience.

D’après notre expérience, les étapes les plus critiques impliquées dans le protocole FEB sont les suivantes. La protéine cible et le tampon d’analyte doivent être les mêmes que le tampon d’étalonnage. Même une petite incompatibilité de tampon peut provoquer des fluctuations dans la réponse I et donner des résultats peu fiables. Ainsi, nous suggérons d’effectuer une dialyse pendant la nuit par un échange tampon approprié. Un pipetage minutieux sur la puce du biocapteur lors de l’aspiration ou de l’application d’une solution est essentiel tout au long de l’expérience. Un pipetage négligent peut entraîner des transistors cassés ou des fluctuations de la réponse I; lors du pipetage, assurez-vous de ne pas toucher la surface sensible de la puce. La solution EDC/sulfo-NHS utilisée dans le processus d’activation de la puce doit être mélangée fraîche avant chaque utilisation. L’utilisation d’un vieux mélange peut entraîner une puce non fonctionnalisée. Assurez-vous d’utiliser le même tampon pour les cinq étapes répétitives (étalonnage, association, dissociation, régénération et lavage) impliquées dans tous les cycles de l’expérience.

En comparant feb avec des systèmes de détection biomoléculaire bien établis dans le domaine, tels que BLI ou SPR, nous avons constaté que les trois méthodes partagent des avantages similaires 43,44,45 qui sont: ce sont des systèmes sans étiquette, qui ne nécessitent aucun colorant fluorescent coûteux pour détecter les interactions; ils peuvent détecter les interactions même dans de petites plages de nM; les puces sont réutilisables à la fois en SPR et en FEB et elles peuvent être régénérées et réutilisées efficacement pour un maximum de 10 expériences, et les trois méthodes fournissent des données cinétiques en temps réel, et le temps d’expérience est court.

Le principal avantage du SPR est qu’il fournit des données plus complètes de l’expérience afin que l’on puisse calculer KD, Kon, Koff, stœchiométrie et paramètres thermodynamiques44. Le principal avantage de BLI est sa capacité à tester plusieurs concentrations dans une seule expérience. Les mesures cinétiques peuvent être effectuées simultanément pour un maximum de huit concentrations à l’aide de différents capteurs. Cependant, les capteurs BLI ne sont pas réutilisables, ce qui rend le coût de l’expérience extrêmement élevé43.

Le principal avantage de FEB est son logiciel automatisé et convivial qui guide l’utilisateur tout au long de l’expérience, et sa plate-forme de pipetage à main ouverte qui permet à l’utilisateur d’ajouter l’analyte à la cible immobilisée à chaque étape. Cette approche de pipetage ouvert combinée à un logiciel simple rend le FEB facile à apprendre et nécessite peu ou même pas de formation. Cependant, cela nécessite que l’utilisateur ait une maîtrise de base du pipetage à la main, et l’absence de manipulation automatisée des liquides signifie que la reproductibilité du chronométrage des étapes dépend entièrement de l’utilisateur. Ce même manque de manipulation intégrée des liquides signifie que les puces et les instruments sont rentables par rapport au SPR ou au BLI. Le FEB présente également une reproductibilité et une fiabilité élevées dans la détection des interactions biomoléculaires en raison du processus de fabrication défini impliqué dans la préparation de la puce de biocapteur35.

Par rapport à la méthode de détection ITC bien établie et standard, FEB n’utilise que 50 μL de volume d’analyte à des concentrations nanomolaires pour l’ensemble de l’expérience, ce qui diminue les chances de nucléation ou d’agrégation des protéines. L’un des plus gros problèmes avec l’ITC est le dégazage des protéines avant le chargement pour éviter les bulles d’air. Au cours de l’expérience ITC, il est possible de développer des bulles à l’intérieur de la cellule de mesure en raison d’une agitation continue et d’une purge intense, ce qui peut éclabousser négativement la solution d’échantillon ou provoquer une perte d’échantillon42. La technologie FEB surmonte ces défis de l’ITC en offrant une chimie d’immobilisation cible robuste, en réduisant l’agrégation et le bouillonnement, en augmentant la stabilité et en améliorant les problèmes dépendants de la concentration rencontrés par l’ITC.

Un inconvénient potentiel des dispositifs FEB est leur sensibilité à la composition tampon et aux changements de concentration, ce qui peut provoquer une dérive dans la ligne de base qui doit être corrigée lors de l’ajustement et de l’analyse des résultats. La puce du biocapteur est également sensible au pH et au sel, de sorte que les tampons utilisés lors de l’étalonnage et de la mesure de l’analyte doivent être les mêmes tout au long de l’expérience. Les produits chimiques utilisés comme agents de conservation (p. ex. l’azoture de sodium) et les molécules hydrophobes peuvent endommager le capteur et même causer une augmentation de la liaison non spécifique. Ces inconvénients peuvent être atténués en accordant une attention particulière à la consistance du tampon tout au long des étapes de mesure, à la dialyse des composés interférents du stock d’analyte et à la passivation appropriée de la surface (par exemple, utilisation de détergents, de bloqueurs de protéines ou de différentes molécules de PEG).

En résumé, nous avons démontré avec succès un IPP fort entre Hsp90 / Cdc37 en utilisant la technologie FEB et validé leur interaction à l’aide de l’ITC, fournissant des données encourageantes pour soutenir FEB en tant que méthode alternative innovante pour la détection des IPP. La technologie FEB offre un large éventail d’applications dans divers domaines de la découverte de médicaments, des produits pharmaceutiques, de l’analyse biomoléculaire de petites molécules, de peptides et de protéines, du développement d’anticorps, de la validation de médicaments et de l’optimisation des leads à portée de main en traduisant facilement l’activité biologique in vitro en efficacité in vivo . Compte tenu des avantages de la technologie FEB et de ses immenses applications dans l’exploration des interactions IPP, protéines et ADN ou ARN, ainsi que des interactions protéines et petites molécules (par exemple, médicaments), nous proposons qu’il s’agit d’une technologie unique et prometteuse dans la boîte à outils de détection PPI. Dans notre cas, la technologie FEB offre un outil précieux pour évaluer facilement l’efficacité de liaison des antagonistes candidats IPP Hsp90/Cdc37, ce qui aide ensuite à sélectionner des candidats prometteurs pour d’autres évaluations in vitro et in vivo relatives à diverses maladies dans lesquelles cet IPP est essentiel.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, financier ou autre.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Binational Science Foundation (BSF) à S.K.S. et N.Q.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA		 T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8		 White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9		 White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA		 Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4		 Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA		 Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA		 Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA		 Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7		 White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA		 Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

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References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

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Exploration de l’interaction biomoléculaire entre le chaperon moléculaire Hsp90 et sa protéine cliente Kinase Cdc37 à l’aide de la technologie de biodétection à effet de champ
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Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M.… More

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M. S., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

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