Summary
本协议描述了光片荧光显微镜和自动化软件辅助方法，以可视化和精确量化完整，清除的器官和组织中的增殖和休眠 克氏锥虫 寄生虫和T细胞。这些技术提供了一种可靠的方法来评估治疗结果，并为寄生虫 - 宿主相互作用提供了新的见解。
Abstract
恰加斯病是一种被忽视的病理学，影响着全世界数百万人，主要是在拉丁美洲。恰加斯病病原体克 氏锥虫 （T. cruzi）是一种专性细胞内寄生虫，具有多种生物学特性，可感染包括人类在内的几种哺乳动物物种，引起心脏和消化系统病变。长期以来，人们需要对 克氏锥虫 体内感染进行可靠的检测，以了解恰加斯病的复杂生物学并准确评估治疗方案的结果。目前的协议展示了一种集成管道，用于在3D重建，清除的器官中自动定量克 氏锥虫感染的细胞。光片荧光显微镜可以准确地观察和量化整个器官或组织中活跃增殖和休眠的 克氏锥虫 寄生虫和免疫效应细胞。此外，还成功采用了CUBIC-HistoVision管道，用抗体和核染色剂对清除的器官进行统一标记。组织清除与3D免疫染色相结合，为全面评估药物治疗方案提供了一种公正的方法，提高了对 克氏锥虫感染组织的细胞组织的理解，并有望推进与抗克氏锥虫 免疫反应、组织损伤和恰加斯病修复相关的发现。
Introduction
由原生动物寄生虫克氏锥虫引起的恰加斯病是世界上最被忽视的热带疾病之一，每年造成约13，000人死亡。感染通常从急性期进展为慢性期，导致 30% 的患者出现心脏病，包括心律失常、心力衰竭和猝死1，2。尽管在急性期引起了针对寄生虫的强烈宿主免疫反应，但少量寄生虫在宿主的整个生命过程中长期存在于心脏和骨骼肌等组织中。有几个因素，包括适应性免疫反应的延迟发作和寄生虫的非复制形式的存在，可能有助于克氏锥虫避免被免疫系统完全消除的能力3，4，5，6。此外，寄生虫的非复制休眠形式显示出对锥虫杀虫药物的低敏感性，并且可能部分导致在许多情况下观察到的治疗失败7，8。
新成像技术的发展为深入了解寄生虫在感染组织中的空间分布及其与参与其控制的免疫细胞的关系提供了机会。这些特征对于更好地了解免疫系统控制寄生虫的过程和跟踪慢性组织中存在的罕见休眠寄生虫至关重要。
光片荧光显微镜（LSFM）是最全面和无偏的方法之一，无需薄切片即可对大型组织或器官进行3D成像。光片显微镜利用薄片光仅激发焦平面中的荧光团，减少样品的光漂白和光毒性，并使用超快相机记录数千个组织层的图像。通过在组织脱脂和脱色后均匀化折射率（RI），从而减少光的散射并呈现高质量的图像，从而获得激光在组织中正确穿透所需的高水平的组织透明度9，10，11。
已经开发了组织清除方法，用于对全小鼠12，13，14，类器官15，16，17，表达报告荧光标记物的器官18，19，20，21，22，23以及最近有限数量的人体组织24进行成像.目前的组织清除方法分为三类：（1）基于有机溶剂的方法，如DISCO协议25，26，（2）基于水凝胶的方法，如CLARITY 27，以及水性方法，如CUBIC（透明，无阻碍的脑/身体成像鸡尾酒和计算分析）18，19，28，29.CUBIC 方案保持器官形状和组织完整性，保留内源性表达报告蛋白的荧光。该技术的最新更新，CUBIC-HistoVision（CUBIC-HV），还允许使用荧光标记抗体和DNA标记检测表位28。
在本协议中，使用CUBIC管道检测在澄清的完整小鼠组织中表达荧光蛋白的克 氏锥虫 。对光学透明组织进行LSFM成像，3D重建，并自动定量每个器官的克 氏锥虫 感染细胞，休眠无鞭毛虫和T细胞的精确总数。此外，该协议已成功采用，以获得具有抗体和核染色的清除器官的统一标记。这些方法对于了解 克氏锥虫 在感染宿主中的扩增和控制至关重要，并且有助于全面评估恰加斯病的化学和免疫疗法。
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Protocol
本研究严格按照《公共卫生服务实验动物人道关怀及使用政策》及实验动物护理评审协会评审及认证指引进行。动物使用协议（控制小鼠克 氏锥虫 感染-A2021 04-011-Y1-A0）已获得佐治亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。B6.C+A2：A44g-Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdTomato）Hze/J，B6.Cg-Gt（ROSA）26Sortm14（CAG-tdTomato）Hze/J和C57BL/6J-Tg（Cd8a*-cre）B8Asin/J小鼠（雌性，1-2个月大）用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。
1.感染、灌注和夹层
- 用分别表达tdTomato或GFP荧光蛋白的哥伦比亚（DTU TcI）或巴西（DTU TcV）克氏锥虫菌株的组织培养衍生的 锥 体鞭毛体腹膜内感染小鼠。感染剂量范围为50，000至200，000个锥体鞭毛体，稀释在100μL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
注意：有关报告寄生虫和感染小鼠模型生成的具体细节可在Canavaci等人中找到。29 和布斯塔曼特等人30。 - 通过以3-7L / min的流速吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死。一旦动物停止表现出任何踏板反射，就从腹部到胸骨通过皮肤进行纵向切口。然后从腹部切开体壁，继续穿过胸部两侧的肋骨，直到胸骨可以抬起，露出心脏。
- 如图 1 所述，在心脏右耳廓切开 2.5 mm 切口，并使用 1 mL 微量移液器吸头收集引流血液。
- 将蝶针（连接到灌注系统的一端）插入左心室的顶点，直到到达升主动脉。使用凝胶胶（见 材料表）密封针头周围的入口孔，并在灌注期间将针保持在适当的位置。
- 用50mL冷肝素-PBS（pH 7.4，10U / mL肝素）灌注小鼠30 ，或直到从小鼠流向收集托盘的液体清除血液。
- 在 PBS 中灌注 50 mL 冷的 4% （w/v） 多聚甲醛 （PFA）（pH 7.4）。
注意：PFA组织固定可能是协议的关键步骤之一，特别是对于维持表位结构和随后的免疫检测。PFA会随着时间的推移而降解，因此必须新鲜制备。溶液的pH值对于避免过度固定也很重要，这可能导致组织清除不良。
注意：PFA通过皮肤接触具有中等毒性。急性暴露对鼻子、眼睛和喉咙也有高度刺激性。长期接触低水平的空气或皮肤可能会引起皮肤刺激，如皮炎和瘙痒，以及哮喘样的呼吸系统问题。佩戴面部和眼睛防护装置，不要吸入灰尘、气体、薄雾、烟雾或蒸气。- PFA灌注后，用100 mL CUBIC-P缓冲液灌注小鼠以达到步骤1.5中提到的澄清水平。
- 要制备CUBIC-P缓冲液，请将10%正丁基二乙醇胺，5%Triton X-100和5%1-N-甲基咪唑溶解在双蒸水中或使用商业混合物（见 材料表）。
注意：步骤 1.6.1.-1.6.2。仅推荐用于高色素沉着的器官，例如心脏和肾脏，因为它们需要预清除步骤以获得更高的透明度。使用CUBIC-P后，解剖器官并直接进行步骤2：组织清除。
- 解剖要成像的组织样品/器官30 ，并在4°C下在PBS（~10mL /整个器官）中的4%（w / v）PFA中固定过夜（ON），在50mL锥形管中轻轻摇动（不超过5x g）。
注意：此后的所有孵育必须在水平放置在20-30°C避光的管上进行。 - 在室温（RT）下轻轻摇动（5 x g）在10mL PBS（补充有0.05%叠氮化钠（NaN 3））中洗涤样品3小时（三次）。
注意：可以通过在PBS中的10mL 30%蔗糖中孵育，并在4°C下在50mL锥形管中轻轻摇动（5× g）来冷冻组织。组织沉入管底部后，将它们嵌入OCT化合物中并保持在-80°C。 室温解冻直至OCT化合物完全融化，然后在4°C的PBS（~10mL /整个器官）中洗涤，在50 mL锥形管中轻轻摇动（5 x g）。继续执行步骤 2。
2. 组织清除
注意：在这项工作中进行的所有组织清除都是使用CUBICR方案I 22完成的。使用了三种不同的鸡尾酒：CUBIC-P用于灌注过程中的脱脂和快速脱色，CUBIC-L用于脱脂和脱色，CUBIC-R用于RI匹配。分别使用CUBIC-HV 1 3D核染色试剂盒和CUBIC-HV 1 3D免疫染色试剂盒进行DNA染色和免疫染色（见 材料表）。
- 将单个器官浸入 10 mL 的 50% 水稀释 CUBIC-L（参见 材料表）中，在室温 （ON） 下轻轻摇动 （5 x g） 在 50 mL 锥形管中。将试管平放在振动板上。
注意：为避免组织损伤，将器官保留在同一管中，并使用真空系统收集溶液。要制备CUBIC-L，请使用商业鸡尾酒将10%正丁基二乙醇胺和10%Triton X-100溶解在双蒸水中（见 材料表）。
注意：CUBIC-L 会导致严重的眼睛损伤。佩戴护目镜和面部防护装置。处置到批准的废物处理厂。 - 将样品浸入 10 mL 的 100% CUBIC-L 中 6 天（在第 3 天刷新溶液）。
注意：在此潜伏期结束时，组织必须几乎完全透明。 - 用PBS（补充有0.05%NaN3）在37°C下轻轻摇动（5× g）洗涤透明器官2小时（三次）。每次洗涤时将组织转移到新的 50 mL 锥形管中，以去除 Triton X-100。
注意：如图2B所述，如果实验的目标是可视化来自转基因克氏锥虫寄生虫或小鼠的内源性表达报告蛋白（图2C-F），请跳过步骤3，4和5并直接继续步骤6。
3. 脱氧核糖核酸染色
- 将市售核酸染料（见 材料表）在 5 mL 染色缓冲液（包含在试剂盒中）中以 1/2，500 稀释度稀释。
- 将组织浸入核染料溶液中，并使用15mL锥形管在站立位置在37°C下轻轻旋转孵育5天。
- 用 15 mL 3D 核染色洗涤缓冲液（包含在试剂盒中）在室温下轻轻摇动 （5 x g） 洗涤 2 小时（三次）。
注意：其他DNA染料可用于这些浓度和孵育时间：DAPI（包含在试剂盒中）：1/200，孵育5天;BOBO-1：1/400，孵育5天;碘化丙啶（PI）（包含在试剂盒中）：1/100，孵育3天;红点2：1/250，孵育3天。如果实验的具体目的是可视化内源性表达的报告蛋白并使用核染色，请跳过步骤4和5并直接继续步骤6。
4. 细胞外基质（ECM）消化
注意：必须进行ECM的透明质酸酶消化，以促进抗体适当地渗透到组织的深层区域28。
- 将单个器官浸入15mL透明质酸酶反应缓冲液中2小时，在37°C的50mL锥形管中，平坦位置避光。
注意：要制备透明质酸酶反应缓冲液，请溶解10 mM的CAPSO;在双蒸水中加入150mM氯化钠（NaCl）和0.05%的NaN3 （见 材料表），并将pH调节至10。 - 通过将 75 μL 20 mg/mL 透明质酸酶原液混合到 425 μL 透明质酸酶反应缓冲液中来制备酶溶液。要制备 20 mg/mL 透明质酸酶原液，请将透明质酸酶溶解在 50 mM 碳酸盐缓冲液、150 mM NaCl、0.01% BSA 和 0.05% NaN3 中（参见 材料表）。将pH调节至10，并在-30°C下以77μL的体积等分。
- 使用移液管丢弃透明质酸酶反应缓冲液，并将器官浸入酶溶液（500μL在15mL锥形管中）中，在37°C下以轻柔摇动（5× g）避光站立24小时。
- 在50mL锥形管中的15mL透明质酸酶洗涤缓冲液中洗涤样品，水平位置避光，在37°C下轻轻摇动（5× g）2小时（三次）。
- 要制备透明质酸酶洗涤缓冲液，请溶解 50 mM 碳酸盐缓冲液、150 mM NaCl、0.1% （v/v） Triton X-100、5% （v/v） 甲醇和 0.05% NaN3。将pH值调节至10。要制备 10x 碳酸盐缓冲液-NaCl 储备液，请将 2.96 g 碳酸钠、1.86 g 碳酸氢钠和 8.77 g NaCl 溶解在含有 0.05% NaN3 的 100 mL 双蒸水中（参见 材料表），并将 pH 值调节至 10。
5. 免疫染色
- 按照以下步骤使用抗α-SMA（α-小肌肌动蛋白，参见 材料表）抗体标记脉管系统。
- 生成一抗和偶联的Fab片段二抗复合物。在染色程序前1.5小时开始该反应。
- 计算所需的一抗和二抗量（按重量比1：0.5混合）。
注意：对于一抗抗α-SMA，需要3.5μg来标记整个心脏或类似尺寸的骨骼肌碎片。对于 2.5 mg/mL 产品，需要 3.5/2.5 = 1.4 μL 抗体溶液。对于二抗AlexaFluor 647抗小鼠Fab片段，需要1.75μg标记整个心脏或类似尺寸的骨骼肌片段。对于 1.7 mg/mL 产品，需要 1.75/1.7 = 1 μL 抗体溶液。 - 在琥珀色2mL管中混合一抗和二抗，并在37°C孵育1.5小时。
- 计算所需的一抗和二抗量（按重量比1：0.5混合）。
- 对于缓冲液置换，将 7.5 mL 的 2x HV1 3D 免疫染色缓冲液（包含在试剂盒中，参见 材料表）与 7.5 mL 双蒸水混合，并将组织样品在 32 °C 下轻轻摇动 （5 x g） 浸入水平位置的 15 mL 锥形管中 1.5 小时。在产生抗体复合物的同时开始该反应（免疫染色程序前1.5小时）。
- 生成一抗和偶联的Fab片段二抗复合物。在染色程序前1.5小时开始该反应。
- 按照以下步骤进行 3D 免疫染色。
- 在 15 mL 锥形管中，按照 补充文件 1 制备抗体染色溶液。
- 从缓冲液交换介质中收集组织样品（步骤5.1.2）并将其浸入抗体染色溶液中。在32°C下单独孵育组织1周，在避光的站立位置轻轻摇动（5× g）管。用石蜡膜密封管子以避免蒸发。
- 移至4°C并以站立姿势孵育。
- 将1x HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液（包含在试剂盒中，参见 材料表）冷却至4°C，并用15mL缓冲液（两次）洗涤样品，每次在4°C下轻轻摇动（5× g）洗涤样品30分钟。将 15 mL 锥形管保持在水平位置，直到步骤 5.2.7。
- 在1x HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液中将福尔马林稀释至1%，并将样品浸入8mL溶液中24小时，在4°C下轻轻摇动（5× g）。
- 在新鲜的1%福尔马林溶液中在37°C轻轻摇动（5× g）孵育1小时。
- 在15mL的PBS中在25°C下轻轻摇动（5× g）洗涤2小时。
- 按照以下步骤使用抗红色荧光蛋白 （RFP） 抗体增强 tdTomato 信号。
- 遵循与步骤5.2.2相同的孵育时间和温度。计算一抗和二抗的量（参见 材料表），并以1：0.5的重量比混合它们。
注意：对于一抗抗RFP，需要5μg来标记整个心脏或类似尺寸的骨骼肌碎片。对于 1.25 mg/mL 产品，需要 5/1.25 = 4 μL 溶液。对于二抗Alexa Fluor 647抗兔Fab片段，需要2.5μg来标记整个心脏或类似尺寸的骨骼肌片段。对于 1.5 mg/mL 产品，需要 2.5/1.5 = 1.7 μL 溶液。 - 按照 补充文件1中所述制备抗体染色溶液。
- 遵循与步骤5.2.2相同的孵育时间和温度。计算一抗和二抗的量（参见 材料表），并以1：0.5的重量比混合它们。
- 按照以下步骤使用抗GFP纳米抗体增强GFP信号。
- 遵循与步骤5.2.2中提到的相同的孵育时间和温度。
注意：抗GFP纳米抗体（参见 材料表）与Alexa Fluor 647偶联，因此无需生成抗体复合物。 - 按照 补充文件1中所述制备抗体染色溶液。
- 遵循与步骤5.2.2中提到的相同的孵育时间和温度。
6. RI 匹配
- 将透明器官浸入 5 mL 的 50% 水稀释 CUBIC-R+ 溶液（参见 材料表）中，室温 （ON） 在 50 mL 锥形管中轻轻摇动 （5 x g）。在整个RI匹配步骤中，将试管保持在静止位置。
注意：在此步骤中，先前实验中回收的CUBIC R +溶液可以重复使用（最多四次）。要制备CUBIC-R+溶液，请将45%的2，3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（安替比林），30%的烟酰胺或N-甲基烟酰胺和0.5%的N-丁基二乙醇胺溶解在双蒸水中或使用商业CUBIC-R +缓冲液（见 材料表）。
注意：CUBIC-R+ 会引起皮肤刺激、严重的眼睛刺激和器官损伤。戴防护手套，确保眼睛和面部保护。不要吸入灰尘、烟雾、气体、薄雾或蒸气。处置到经批准的废物处理厂。 - 用 5 mL 的 100% CUBIC-R + 替换 50% CUBIC-R+，并在室温下轻轻摇动 （5 x g） 孵育 2 天。然后，将纸巾转移到一堆不起毛的湿巾上，并小心地转动纸巾以从器官表面去除CUBIC-R +溶液5分钟。
7. 安装
- 干燥组织后，将它们转移到六孔细胞培养板中的5mL封片溶液（RI = 1.520）（参见 材料表）中，并在室温下孵育（ON）。 经常转动组织以消除气泡，尤其是在器官表面。
注意：器官可以在封片液或CUBIC-R +中储存6个月以上。 - 使用基于氰基丙烯酸酯的凝胶胶将组织粘附在显微镜样品架上。
- 将样品浸入装有 120 mL 封片液的显微镜石英比色皿中，并横向成像到其纵轴。用顶点和主动脉水平对齐粘附心脏。
注意：清除和安装的器官可以用振动切开机切片，并通过共聚焦显微镜以高放大倍率成像。将器官嵌入2%琼脂糖中，切割100-500μm的部分。也可以用锋利的刀片手动切片器官以产生厚组织切片（>1000μm）。切片后，将切片放入玻璃底35毫米培养皿中，使用相同的安装溶液进行安装，用指甲油密封，并用共聚焦显微镜成像。
8. 图像采集
- 用光片显微镜对安装的样品进行成像（参见 材料表）。将单个切片之间的放大倍率和步长设置为 3 μm，并使用厚度为 5 μm 且宽度为 100% 的左右光片激光器。将曝光时间常数设置为50-100 ms，并根据荧光信号强度将激光功率从10%调整到80%。
- 为了共同检测表达tdTomato的寄生虫和DiR染色的休眠无鞭毛体（图2C），分别使用红色（Ex / Em 561 / 620-660 nm）和红外（Ex / Em 785 / 845-55 nm）通道。为了共同检测CD8报告小鼠中的T细胞和表达tdTomato的寄生虫（图2D），分别使用绿色（Ex / Em 488 / 525-50 nm）和红色通道。
- 对于合并感染测定（图2E），以及在细胞核报告小鼠中表达GFP的寄生虫的共同检测（图2F），分别使用绿色和红色通道。为了检测表达tdTomato的寄生虫，核染料和心脏脉管系统（图3B，C），分别使用红色，绿色和远红色（Ex / Em 640 / 680-730 nm）通道。
- 使用远红色通道检测抗RFP抗体，使用绿色通道检测抗GFP纳米抗体（图3D）。
- 转换采集的TIFF图像堆栈，并使用Imaris v9.7.2软件对器官进行3D重建（参见 材料表）。
9. 使用 Imaris 软件进行表面重建和量化
- 选择 表面检测算法 工具，并在图像分析软件中启动向导。
- 在感兴趣的3D区域（随机选择）中进行初始分析，然后将其应用于整个3D器官重建。选择 感兴趣区域（ROI）后，选择要分析的 通道 ，取消选中 平滑按钮，然后选择 背景减法。
注意：背景减法会计算每个体素的唯一局部背景值，并从原始像素值中减去该值。对于 克氏锥虫感染的细胞，适合物体的最大球体的直径必须最大为200μm，T细胞为10μm，单个寄生虫为5μm。 - 使用 直方图 调整分类，使用过滤器下拉列表选择要 分类的测量值。
注意：使用直方图调整分类：建议使用椭圆度（扁平）和球形度测量。 - 完成向导，按 统计 按钮，然后检索寄生虫感染细胞或T细胞的总数作为每个时间点断开连接的组件数。
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Representative Results
用PBS洗涤CUBIC固定组织以除去固定剂，然后与CUBIC-L鸡尾酒一起孵育，CUBIC-L鸡尾酒是一种氨基醇的基本缓冲溶液，可从组织中提取色素和脂质，导致组织脱色，同时保持组织结构。通过组织可以看到纸张中的网格线，表明器官的适当清除（图2A）。脱脂后，将组织洗涤并分别浸入CUBIC-R +和安装溶液中进行RI均质化和成像（图2B）。
野生型小鼠感染用DiR近红外花青染料预先染色的表达tdTomato的色鞭毛体。小鼠在感染后15天被安乐死，完整的心脏被解剖，固定和清除。LSFM成像和3D重建使我们能够可视化表达tdTomato的增殖 克氏锥虫 寄生虫（红色）。红色通道中的自发荧光水平可用于心脏结构和边缘的正确可视化 （图2C i）。LSFM也可用于识别耐药休眠形式7，8。用DiR染料对寄生虫进行感染前染色，可以通过可视化未通过复制稀释染料的寄生虫来跟踪休眠寄生虫，如之前报道的CellTrace Violet7所示。
可以在心脏中识别休眠寄生虫（青色），如3D放大插图（黄色箭头）所示（图2C ii，iii）。Z投影荧光自动分割以生成重建的3D表面模型，用于空间可视化和量化整个3D重建过程中克氏锥虫感染细胞和休眠寄生虫的总数（图2A）。对3D表面模型的分析显示，与心室（63）和整个心脏中的18个休眠寄生虫相比，心房中186个克氏锥虫感染的细胞（123）具有更高的感染细胞比例（图2C i）。在之前的一份报告中，报告了类似的管道，用于监测药物治疗后澄清小鼠组织中克氏锥虫感染细胞和休眠寄生虫的数量31。重要的是要注意，对休眠寄生虫数量的估计可能被低估了，因为染料稀释技术只能检测自初始感染以来未显着复制的寄生虫，但不能检测那些在感染后期进入休眠状态的寄生虫经过多轮分裂。
类似的方法用于监测干扰素（IFN）-γ缺陷小鼠中不同克氏锥虫菌株之间的相互作用。效应T细胞产生IFN-γ对于克氏锥虫的免疫控制至关重要。在IFN-γ缺陷小鼠中，寄生虫以最小的免疫限制增殖，在器官中产生大量感染细胞。这些免疫缺陷模型是研究新药疗效的有用工具，不受免疫识别的限制，从而允许检测治疗后的寄生虫复发。IFN-γ缺陷小鼠与表达tdTomato的哥伦比亚（红色）和表达GFP的巴西（蓝色）克氏锥虫菌株混合感染。小鼠在感染后17天被安乐死，完整的心脏被解剖，固定和清除。在这个免疫缺陷模型中，可以在寄生虫发育的不同阶段观察到感染两种克氏锥虫菌株的宿主细胞，包括大、中、小感染细胞和最近爆发的细胞。切片组织显示心脏心房中不同组织深度的大量寄生虫感染细胞（图2E i-iii和视频1）。
C57BL/6J-Tg（Cd8a*-cre）B8Asin/J和 B6.Cg-Gt（ROSA）26Sor tm14（CAG-tdTomato）Hze/J小鼠的杂交，其中所有T细胞都表达绿色荧光蛋白ZsGreen1，用于监测 克氏锥虫 感染组织中的T细胞募集。小鼠在感染表达tdTomato的寄生虫后14天被安乐死，骨骼肌被切除，清除并通过LSFM成像。可靠地检测到表达T细胞（蓝色）和克氏锥虫感染细胞（红色）的ZsGreen1 （图2D i 和 视频2 ）。 3D重建的3D放大识别了感染细胞区域中的T细胞 （图2D ii）。 同一组织的振动切片机厚切片（200-500μm）使我们能够通过共聚焦显微镜可视化T细胞和宿主感染细胞的界面 （图2D iii）。
监测炎症病灶的另一种方法是基于克氏锥虫感染细胞周围的细胞核积累。报告小鼠其中所有细胞核表达荧光tdTomato蛋白用于此目的。清除过程后，在组织中很容易检测到核tdTomato表达（红色）。一只核报告小鼠感染了表达GFP的克氏锥虫寄生虫（青色），感染后35天被安乐死，骨骼肌被切除，清除，并通过LSFM成像（图2F i-iii）。 骨骼肌的放大光学切片通过沿表达GFP的寄生虫积累红色细胞核来增加细胞（图2F ii）。同一组织的振动切片通过共聚焦显微镜证实了先前描述的红色细胞核沿着表达GFP的寄生虫的积累（图2F iii）。
CUBIC 方案也适用于感染克氏锥虫的完整、清除的器官和组织的免疫染色和 DNA 标记（图 3A）。小鼠在感染表达tdTomato的寄生虫40天后实施安乐死，并解剖，固定和清除心脏。将完整的清除心脏洗涤并用绿色DNA标记染色5天，然后再次洗涤并用抗α-SMA抗体免疫染色7天。对样品进行后固定、洗涤、RI 匹配并用 LSFM 成像。按照该协议，可以同时检测多个荧光信号，包括细胞核、脉管系统和克氏锥虫感染的细胞。α-SMA免疫染色（白色）呈现高信号水平，揭示了心脏复杂的脉管系统（图3B ii和视频3）。 来自心脏深层区域的光学切片描述了α-SMA抗体在既定条件下的组织渗透（图3B v）。 DNA染色（蓝色）也表现出良好的组织渗透性、荧光水平和稳定的体积染色。在不同的心脏位置（图3B i）和骨骼肌纤维周围（图3C i和 视频4）鉴定出一些具有强烈DNA标记的区域。骨骼肌的放大图像显示，在tdTomato寄生虫很少或无法检测到的区域积聚了蓝色细胞核，这表明在当前或先前的克氏锥虫感染部位募集了免疫细胞（图3C ii）。在其他情况下，受感染的宿主细胞几乎没有附近细胞浸润的证据（白色箭头）（图3C i）。与图3C ii相同的组织的振动切片显示通过共聚焦显微镜对细胞和表达tdTomato的寄生虫进行DNA染色（图3C iii）。
先前的实验表明，休眠寄生虫表现出tdTomato或GFP报告蛋白的低表达或可忽略不计（图2C ii和iii）。为了改善这些荧光蛋白的检测，用抗RFP或-GFP抗体对清除的组织进行免疫染色。分别固定、澄清来自感染表达tdTomato或GFP的寄生虫的小鼠的完整骨骼肌组织，并用针对RFP的抗体（RFP助推器）（图3D）或与Alexa Fluor 647（GFP助推器）偶联的GFP纳米抗体进行免疫染色（图3E）。 对样品进行后固定、洗涤、RI 匹配并用 LSFM 成像。在这两种情况下，抗体对GFP和tdTomato信号的增强都产生了强烈的荧光（图3D ii和3E ii ）。使用增强抗体的免疫染色代表了一种多功能工具，将用于检测澄清的整个器官和组织中的克氏锥虫休眠剂，并检测来自RFP或GFP家族成员的报告蛋白的任何代表性不足的信号。
图1：心内灌注期间的针头插入。（A） 示意图，显示通过心脏灌注小鼠之前执行的步骤以及左心室灌注针的正确位置和方向。在右心房做一个小切口，并收集引流血液（1）;将蝴蝶针插入心脏顶点。保持方向，使针不会刺穿隔膜（2）。针周围的入口孔使用凝胶胶（3）密封。肝脏充满血液，灌注前呈红色;然而，灌注后，它失去色素沉着并变得苍白。RA，右耳廓;LA，左耳廓;右心室，右心室;左心室，左心室。 请点击此处查看此图的大图。
图2：克 氏锥虫感染细胞、休眠无鞭毛虫和清除器官中的炎症病灶的可视化。（一） 全器官方案 T. cruzi-在 3D 表面模型中使用组织清除、LSFM 成像和软件辅助定量进行感染细胞检测。(我清除前（左）和清除后（右）的心脏和骨骼肌的明场图像（比例尺：1000μm）。(第二）光片荧光显微镜。(第三） IFN-γ-缺陷小鼠感染2×105 td表达番茄的锥体鞭毛体。在感染后17天，解剖心脏，清除立方体，并对LSFM成像（比例尺：500μm）。(四）Z投影荧光自动分割以生成重建的3D表面模型，用于空间可视化和量化的数量 T. cruzi-受感染的细胞。共 736 条 T. cruzi-在整个心脏中检测到感染的细胞（比例尺：500μm）。(v） 以 （四），其中青色对象表示 T. cruzi-受感染的细胞（比例尺：50μm）。(B立方全器官清除协议。(C增殖和休眠的可视化 T. cruzi 寄生虫在透明的小鼠心脏。(我） 一只野生型小鼠感染了 2 x 105 用DiR近红外花青染料染色的表达td番茄的色鞭毛体。对心脏进行解剖、清除，并对LSFM进行成像。td表达番茄的增殖（红色）和休眠（青色） T. cruzi 可以识别寄生虫。保持自发荧光水平，以便正确观察心脏结构。根据先前工作中发现的寄生虫感染细胞和休眠的无鞭毛虫的峰值（比例尺：400μm），在感染后15天杀死一只小鼠。(第二） 和 （三） 以 （我），其中黄色箭头表示休眠寄生虫（青色）（比例尺：200 μm）。(D）在感染的CD8报告小鼠中检测T细胞募集。(我） 报告小鼠感染了 2 x 105 在感染后14天解剖，清除表达tdTomato的锥体鞭毛体和骨骼肌，并在LSFM成像，这是检测到大量细胞反应的时间点。ZsGreen1 表达 T 细胞（蓝色）以及 T. cruzi-可视化感染细胞（红色）（比例尺：400μm）（另见 电影 2).(第二） 以 （我）（比例尺：50 μm）。(第三） 描述了围绕 T. cruzi-同一器官的组织切片（200μm）中的感染细胞（比例尺：8μm）。(E） 不同之间的交互 T. cruzi 株。(我）IFN-γ缺陷小鼠与2×105 表达td番茄的哥伦比亚语（红色）和表达GFP的巴西语（蓝色） T. cruzi 株。对小鼠实施安乐死，并在感染后17天解剖，固定和清除完整的心脏（比例尺：400μm）。(第二） 以 （我）（比例尺：250 μm）。(第三）显示放大的光学切片，显示感染哥伦比亚（红色）和巴西（蓝色）的细胞 T. cruzi 应变（比例尺：150 μm）。(F）使用细胞核报告小鼠沿感染细胞的细胞可视化。(我） 一只核报告小鼠感染了 2 x 105 在感染后 35 天解剖、清除表达 GFP 的锥体鞭毛和骨骼肌并成像 LSFM。检测到宿主细胞的核tdTomato表达（红色）以及GFP寄生虫表达（青色）（比例尺：400μm）。(第二）显示放大的光学切片显示红色细胞核沿表达GFP的寄生虫（比例尺：90μm）积累。(第三）通过对来自同一器官的组织切片进行共聚焦成像（比例尺：8μm）来确认细胞增加。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用抗体和核染色标记清除的 克氏锥虫感染器官 。 （A） 用于组织清除、3D 免疫染色和整个器官的 DNA 标记的 CUBIC 协议。（B）标记小鼠心脏以进行脉管系统和DNA检测（另见 视频3）。（一至三）野生型小鼠感染了2 x 105 表达tdTomato的寄生虫。小鼠在感染后40天被安乐死，心脏被解剖，固定和清除。清除的心脏用DNA标记物标记，并用抗α-SMA的抗体进行免疫染色。可以同时检测细胞核（蓝色）、脉管系统（白色）和 克氏锥虫感染的细胞（红色）。小鼠在感染后的这个时候被杀死，此时可以评估组织和特殊的脉管系统重塑（比例尺：400μm）。（iv） 显示了 （iii） 心脏深处区域的放大体积，描绘了细胞核、脉管系统和感染细胞（比例尺：90 μm）。（v） 描绘了获得的 （iii） 的光学截面（比例尺：90 μm）。（C）通过整个清除的骨骼肌的DNA标记来增加细胞性。（i）对先前实验中的骨骼肌组织进行DNA染色，显示具有强烈核标记的区域（蓝色）以及 克氏锥虫感染的细胞（红色）（比例尺：200μm）（另见 视频4）。（ii）在tdTomato寄生虫检测较低或未检测到的区域（比例尺：100μm）显示蓝色细胞核的强烈积累。（iii） 高倍率 （60x） 共聚焦成像可识别组织切片中细胞和寄生虫的 DNA 标记（比例尺：10 μm）。（D）在整个清除的骨骼肌中增强tdTomato寄生虫报告标记物。（一至三）将感染表达tdTomato的2 x 105 寄生虫的小鼠的完整骨骼肌组织固定，澄清并用RFP抗体（RFP加强器）免疫染色。在tdTomato信号（红色）（比例尺：100μm）的RFP增强（绿色）之后，在远红色通道中获得强烈而均匀的荧光信号。（E）使用抗GFP纳米抗体增强GFP寄生虫报告标记物。（一至三）将感染表达GFP的2 x 105 寄生虫的小鼠的骨骼肌组织固定，澄清并用Alexa Fluor 647偶联的针对GFP（GFP增强剂）的纳米抗体进行免疫染色。在GFP荧光（青色）的GFP增强（品红色）后，在远红色通道中获得强烈的荧光信号。来自（D）和（E）的小鼠在感染后30天被杀死，因为寄生虫负荷在此时间点达到峰值，并且寄生虫感染的细胞可以很容易地在骨骼肌中检测到（比例尺：100μm）。 请点击此处查看此图的大图。
电影1： IFN-γ缺陷小鼠心脏和骨骼肌的克氏锥虫感染。感染后第17天与2 x 105表达tdTomato的哥伦比亚（红色）和表达GFP的巴西（蓝色）克氏锥虫菌株共同感染的IFN-γ缺陷小鼠的CUBIC澄清组织的3D重建。通过LSFM总共获得了1151个单独的心脏切片和559个骨骼肌。在三种独立的动物中获得了可比的成像结果。请点击这里下载此影片。
视频2：在克氏锥虫感染的CD8报告小鼠 中检测T细胞募集。来自CD8报告小鼠感染2 x 105表达Tdtomato的哥伦比亚克氏锥虫菌株（红色）的CUBIC澄清骨骼肌的3D可视化，并在感染后14天杀死。LSFM总共对668个骨骼肌的单个切片进行了成像。观察表达T细胞（蓝色）和克氏锥虫感染细胞（红色）的ZsGreen1。在两只动物中获得了相当的成像结果。请点击这里下载此影片。
视频3： 克氏锥虫感染和清除心脏 脉管系统的免疫检测。感染2 x 105 tdTomato表达哥伦比亚 克氏锥虫 的野生型小鼠的CUBIC澄清心脏的3D重建，并在感染后40天用抗α-SMA（蓝色）抗体免疫染色。切开心脏可发现心脏错综复杂的脉管系统和 α-SMA 抗体的组织渗透。寄生虫感染的细胞可以观察到心房中的鲜红色斑点（红色，右）。在两只动物中获得了相当的成像结果。 请点击这里下载此影片。
视频4：全器官DNA染色显示细胞增加的区域。 感染后40天感染2 x 105 tdTomato表达哥伦比亚 克氏锥虫 菌株的野生型小鼠CUBIC澄清骨骼肌的3D重建。整个股四头肌区域用绿色核染料染色。克 氏锥虫感染的细胞（红色）和组织中每个细胞的细胞核（蓝色）被可视化。3D重建的放大显示蓝色细胞核沿着很少或没有检测到tdTomato寄生虫的区域积累。在两只动物中获得了相当的成像结果。 请点击这里下载此影片。
补充文件1：研究中使用的抗体染色溶液的组成。请点击此处下载此文件。
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Discussion
缺乏寄生虫的广泛全器官成像和免疫应答限制了对宿主-寄生虫相互作用复杂性的理解，并阻碍了对恰加斯病治疗的评估。本研究采用CUBIC管道对 克氏锥虫感染小鼠的完整器官和组织进行澄清和染色。
本研究测试了多种组织清除方案（PACT32、ECi 33、FLASH34、iDISCO11、26 和 fDISCO13）;然而，只有立方保留了高水平的tdTomato或GFP寄生虫荧光。同样，以前的报告显示，与其他组织清除方法相比，内源性表达标志物的立方保存35。
有限的分辨率能力是传统光片显微镜目前需要注意的问题之一。这在解决严重感染细胞中的单个寄生虫的困难中很明显（图2C）。新开发的平铺光片显微镜具有改进的分辨率和组织扩展技术的适应性，可以解决这个问题36。
来自洗涤缓冲液、清除溶液或其他器官的杂质可能会沉淀在组织中，产生非特异性信号，这些信号可能被误认为是寄生虫感染的细胞、单个寄生虫或其他结构。然而，这些伪影通常在多个通道中发出明亮的荧光，因此在图像分析后，可以通过替代通道（通常是绿色通道）中的成像组织轻松将其从自动计数中丢弃。双色物体被认为是伪影，并被排除在自动定量之外。
核染色 DAPI、PI、RedDot2 和 SYTOX-G 在大多数 CUBIC 清除的器官中表现出良好的组织渗透和信号强度;然而，绿色DNA染料表现出最佳性能（图3B，C和视频4）。
这些结果表明， 克氏锥虫感染的细胞可以很容易地检测和准确定量，同时识别T细胞或细胞核报告小鼠信号。最重要的是，LSFM在复杂的组织环境中检测到罕见的生物事件，例如DiR阳性休眠的无鞭毛体，并具有将其扩展到表位免疫染色和DNA标记的潜在能力。目前的研究也在探索这些方法在监测免疫效应细胞的活化、同一宿主中多种寄生虫菌株之间的相互作用以及恰加斯病中组织损伤和修复的诱导方面的效用。
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Disclosures
提交人声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Etsuo Susaki博士在组织清除和免疫染色方案方面的宝贵帮助和建议。此外，我们感谢CTEGD生物医学显微镜核心的M. Kandasamy使用LSFM和共聚焦成像的技术支持。我们还要感谢塔尔顿研究小组的所有成员在整个研究中提供的有用建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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