Summary
Detta protokoll beskriver ljusark fluorescerande mikroskopi och automatiserade mjukvaruassisterade metoder för att visualisera och exakt kvantifiera prolifererande och vilande Trypanosoma cruzi-parasiter och T-celler i intakta, rensade organ och vävnader. Dessa tekniker ger ett tillförlitligt sätt att utvärdera behandlingsresultat och erbjuda nya insikter i parasit-värdinteraktioner.
Abstract
Chagas sjukdom är en försummad patologi som drabbar miljontals människor världen över, främst i Latinamerika. Chagas sjukdomsmedel, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), är en obligatorisk intracellulär parasit med en mångsidig biologi som infekterar flera däggdjursarter, inklusive människor, vilket orsakar hjärt- och matsmältningspatologier. Tillförlitlig detektion av T. cruzi in vivo-infektioner har länge behövts för att förstå Chagas sjukdoms komplexa biologi och noggrant utvärdera resultatet av behandlingsregimer. Det nuvarande protokollet visar en integrerad pipeline för automatiserad kvantifiering av T. cruzi-infekterade celler i 3D-rekonstruerade, rensade organ. Ljusark fluorescerande mikroskopi möjliggör exakt visualisering och kvantifiering av aktivt prolifererande och vilande T. cruzi-parasiter och immuneffektorceller i hela organ eller vävnader. Dessutom antogs CUBIC-HistoVision-rörledningen för att erhålla enhetlig märkning av rensade organ med antikroppar och kärnfläckar. Vävnadsrensning i kombination med 3D-immunfärgning ger ett opartiskt tillvägagångssätt för att omfattande utvärdera läkemedelsbehandlingsprotokoll, förbättra förståelsen för den cellulära organisationen av T. cruzi-infekterade vävnader och förväntas främja upptäckter relaterade till anti-T. cruzi-immunsvar, vävnadsskada och reparation vid Chagas sjukdom.
Introduction
Chagas sjukdom, orsakad av protozoparasiten T. cruzi, är bland världens mest försummade tropiska sjukdomar och orsakar cirka 13 000 årliga dödsfall. Infektionen fortskrider ofta från ett akut till ett kroniskt stadium som producerar hjärtpatologi hos 30% av patienterna, inklusive arytmier, hjärtsvikt och plötslig död 1,2. Trots det starka värdimmunsvaret som framkallas mot parasiten under den akuta fasen, kvarstår ett lågt antal parasiter kroniskt under värdens liv i vävnader som hjärtat och skelettmuskeln. Flera faktorer, inklusive den fördröjda uppkomsten av adaptiva immunsvar och närvaron av icke-replikerande former av parasiten, kan bidra till kapaciteten hos T. cruzi att undvika en fullständig eliminering av immunsystemet 3,4,5,6. Dessutom uppvisar icke-replikerande vilande former av parasiten en låg mottaglighet för trypanocidala läkemedel och kan delvis vara ansvariga för det behandlingsmisslyckande som observerats i många fall 7,8.
Utvecklingen av nya avbildningstekniker ger en möjlighet att få insikt i den rumsliga fördelningen av parasiterna i de infekterade vävnaderna och deras förhållande till immuncellerna som är involverade i deras kontroll. Dessa egenskaper är avgörande för en bättre förståelse av processerna för parasitkontroll av immunsystemet och spårning av de sällsynta vilande parasiterna som finns i kroniska vävnader.
Light-sheet fluorescensmikroskopi (LSFM) är en av de mest omfattande och opartiska metoderna för 3D-avbildning av stora vävnader eller organ utan tunnsektion. Ljusarkmikroskop använder ett tunt ljusark för att bara excitera fluoroforerna i fokalplanet, minska fotoblekning och fototoxicitet hos prover och spela in bilder av tusentals vävnadsskikt med ultrasnabba kameror. Den höga nivån av vävnadstransparens som är nödvändig för korrekt penetrering av laserljuset i vävnader erhålls genom homogenisering av brytningsindexet (RI) efter vävnadsavfettning och avfärgning, vilket minskar spridningen av ljus och ger högkvalitativa bilder 9,10,11.
Vävnadsrensningsmetoder har utvecklats för avbildning av hela möss 12,13,14, organoider 15,16,17, organ som uttrycker reporterfluorescerande markörer 18,19,20,21,22,23 och nyligen ett begränsat antal mänskliga vävnader 24 . De nuvarande metoderna för vävnadsrensning klassificeras i tre familjer: (1) organiska lösningsmedelsbaserade metoder som DISCO-protokoll 25,26, (2) hydrogelbaserade metoder, såsom CLARITY27, och vattenhaltiga metoder, såsom CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . KUBISKA protokoll upprätthåller organform och vävnadsintegritet och bevarar fluorescensen hos endogent uttryckta reporterproteiner. Den senaste uppdateringen av denna teknik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), tillåter också detektion av epitoper med hjälp av fluorescerande märkta antikroppar och DNA-märkning28.
I detta protokoll användes CUBIC-rörledningen för detektion av T. cruzi som uttrycker fluorescerande proteiner i klargjorda intakta musvävnader. Optiskt transparenta vävnader avbildades LSFM, 3D-rekonstruerades och det exakta totala antalet T. cruzi-infekterade celler, vilande amastigotes och T-celler per organ kvantifierades automatiskt. Även detta protokoll antogs framgångsrikt för att erhålla enhetlig märkning av rensade organ med antikroppar och kärnfläckar. Dessa tillvägagångssätt är viktiga för att förstå expansionen och kontrollen av T. cruzi hos infekterade värdar och är användbara för att fullt ut utvärdera kemo- och immunterapier för Chagas sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med folkhälsomyndighetens policy för human vård och användning av försöksdjur och Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care ackrediteringsriktlinjer. Animal Use Protocol (kontroll av T. cruzi-infektion hos möss-A2021 04-011-Y1-A0) godkändes av University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J och C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J möss (hona,1-2 månader gamla) användes för denna studie. Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Infektion, perfusion och dissektion
- Intraperitonealt infektera möss med vävnadsodlings-härledda trypomastigotes av Colombiana (DTU TcI) eller Brasilien (DTU TcV) T. cruzi-stam som uttrycker tdTomato- respektive GFP-fluorescerande proteiner. Infektionsdosen kan variera från 50 000 till 200 000 trypomastigotes utspädda i 100 μl 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: Specifika detaljer om genereringen av reporterparasiter och musmodeller av infektion finns i Canavaci et al. 29 och Bustamante et al.30. - Avliva mössen genom koldioxidinandning med en flödeshastighet på 3-7 L/min. Så snart djuren slutar visa någon pedalreflex, gör ett längsgående snitt genom huden från buken mot bröstbenet. Skär sedan kroppsväggen från buken och fortsätt genom revbenen på varje sida av bröstkorgen tills bröstbenet kan lyftas bort och exponera hjärtat.
- Som beskrivs i figur 1, gör ett 2,5 mm snitt i hjärtats högra aurikel och samla det dränerande blodet med en 1 ml mikropipettspets.
- Sätt in en fjärilsnål (ansluten till ena änden av perfusionssystemet) i toppen av vänster ventrikel tills den når den stigande aortan. Använd gelbaserat lim (se materialtabell) för att täta inloppshålet runt nålen och hålla nålen på plats under perfusioner.
- Persufa mössen 30 med 50 ml kallt heparin-PBS (pH 7,4,10 U / ml heparin) eller tills vätskan som kommer ut ur musen mot uppsamlingsbrickan är fri från blod.
- Genomströms med 50 ml kall 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA) (pH 7,4) i PBS.
OBS: PFA-vävnadsfixering är sannolikt ett av de kritiska stegen i protokollet, särskilt för att upprätthålla epitopstrukturer och efterföljande immundetektion. PFA bryts ned med tiden, så det måste vara nyberedt. Lösningens pH är också viktigt för att undvika överfixering, vilket kan leda till dålig rensning av vävnader.
VARNING: PFA är måttligt giftigt vid hudkontakt. Akut exponering är också mycket irriterande för näsan, ögonen och halsen. Långvarig exponering för låga nivåer i luften eller huden kan orsaka hudirritation som dermatit och klåda och astmaliknande andningsproblem. Använd ansikts- och ögonskydd och andas inte in damm, gas, dimma, ångor eller ångor.- Efter PFA-perfusionen, perfusa musen med 100 ml KUBIK-P-buffert för att nå de förtydligande nivåer som nämns i steg 1.5.
- För att förbereda CUBIC-P-buffert, lös upp 10% N-butyldietanolamin, 5% Triton X-100 och 5% 1-N-metylimidazol i dubbeldestillerat vatten eller använd de kommersiella cocktailsna (se materialtabell).
OBS: Steg 1.6.1-1.6.2. rekommenderas endast för högpigmenterade organ som hjärta och njure eftersom de kräver ett förrensningssteg för att få ökad transparens. Efter användning av CUBIC-P, dissekera organen och fortsätt direkt till steg 2: Vävnadsrensning.
- Dissekera vävnadsproverna/organen 30 som ska avbildas och efterfixera dem i 4% (w/v) PFA i PBS (~ 10 ml / hela organet) över natten (ON) vid 4 ° C med mild skakning (högst 5 x g) i50 ml koniska rör.
OBS: Alla inkubationer från nedan måste utföras på rör som ligger horisontellt vid 20-30 °C skyddade mot ljus. - Tvätta provet i 10 ml PBS (kompletterat med 0,05% natriumazid (NaN3) i 3 timmar (tre gånger) vid rumstemperatur (RT) med försiktig skakning (5 x g).
OBS: Vävnader kan frysas genom att inkubera i 10 ml 30% sackaros i PBS med försiktig skakning (5 x g) vid 4 ° C ON i 50 ml koniska rör. När vävnaderna har sjunkit till botten av röret, bädda in dem i OCT-föreningen och håll dem vid -80 °C. Tina vid RT tills OCT-föreningen smälter helt och tvätta sedan i PBS (~ 10 ml / hela organet) PÅ vid 4 ° C med försiktig skakning (5 x g) i 50 ml koniska rör. Fortsätt till steg 2.
2. Rensning av vävnader
OBS: Alla vävnadsrensningar som utfördes i detta arbete gjordes med hjälp av CUBIC-protokoll I22. Tre olika cocktails användes: CUBIC-P för delipidering och snabb avfärgning under perfusioner, CUBIC-L för delipidering och avfärgning och CUBIC-R för RI-matchning. DNA-färgning och immunfärgning utfördes med användning av CUBIC-HV 1 3D-kärnfärgningssats respektive CUBIC-HV 1 3D-immunfärgningssats (se materialförteckning).
- Sänk ner enskilda organ i 10 ml 50% vattenutspädd KUBIK-L (se materialtabell) med försiktig skakning (5 x g) vid RT (ON) i 50 ml koniska rör. Håll rören platta på skakningsplattan.
OBS: För att undvika vävnadsskador hålls organ i samma rör och lösningar samlas upp med hjälp av ett vakuumsystem. För att bereda CUBIC-L, lös upp 10% N-butyldietanolamin och 10% Triton X-100 i dubbeldestillerat vatten med hjälp av kommersiella cocktails (se materialtabell).
VARNING: CUBIC-L orsakar allvarliga ögonskador. Använd ögon- och ansiktsskydd. Kassera till en godkänd avfallshanteringsanläggning. - Sänk ner provet i 10 ml 100% KUBIK-L i 6 dagar (uppfriskande lösningen på dag 3).
OBS: I slutet av denna inkubationsperiod måste vävnaderna vara nästan helt transparenta. - Tvätta de genomskinliga organen med PBS (kompletterat med 0,05% NaN3) i 2 timmar (tre gånger) vid 37 °C med försiktig skakning (5 x g). Överför vävnader till ett nytt 50 ml koniskt rör med varje tvätt för att ta bort Triton X-100.
OBS: Som beskrivs i figur 2B, om målet med experimentet är att visualisera endogent uttryckta reporterproteiner från transgena T. cruzi-parasiter eller möss (figur 2C-F), hoppa över steg 3, 4 och 5 och fortsätt direkt till steg 6.
3. DNA-färgning
- Späd det kommersiellt tillgängliga nukleinsyrafärgämnet (se materialtabell) i 5 ml färgningsbuffert (ingår i satsen) vid 1/2 500 utspädning.
- Sänk ned vävnaden i kärnfärglösningen och inkubera vid 37 °C med försiktig rotation i 5 dagar med 15 ml koniska rör i stående läge.
- Tvätta med 15 ml 3D-kärnfärgningsbuffert (ingår i satsen) i 2 timmar (tre gånger) vid RT med försiktig skakning (5 x g).
OBS: Andra DNA-färgämnen kan användas i dessa koncentrationer och inkubationstider: DAPI (ingår i satsen): 1/200, 5 dagars inkubation; BOBO-1: 1/400, 5 dagars inkubation; Propidiumjodid (PI) (ingår i satsen): 1/100, 3 dagars inkubation; RedDot2: 1/250, 3 dagars inkubation. Om det specifika syftet med experimentet är att visualisera både endogent uttryckta reporterproteiner och använda kärnfläckar, hoppa över steg 4 och 5 och fortsätt direkt till steg 6.
4. Extracellulär matris (ECM) matsmältning
OBS: Hyaluronidassmältningen av ECM måste utföras för att underlätta korrekt penetrering av antikropparna i djupa regioner i vävnaderna28.
- Sänk ned enskilda organ i 15 ml hyaluronidasreaktionsbuffert i 2 timmar vid 37 °C i ett 50 ml koniskt rör i plant läge skyddat från ljus.
OBS: För att bereda hyaluronidasreaktionsbuffert, lös upp 10 mM CAPSO; 150 mM natriumklorid (NaCl) och 0,05 %NaN3 (se materialtabell) i dubbeldestillerat vatten och justera pH till 10. - Bered enzymlösning genom att blanda 75 μl 20 mg/ml hyaluronidasstam i 425 μl hyaluronidasreaktionsbuffert. För att bereda 20 mg/ml hyaluronidasbuljong, lös upp hyaluronidas i 50 mM karbonatbuffert, 150 mM NaCl, 0,01 % BSA och 0,05 %NaN3 (se materialförteckning). Justera pH-värdet till 10 och alikvotera i volymer på 77 μl vid -30 °C.
- Kassera hyaluronidasreaktionsbufferten med hjälp av en pipett och sänk ned organet i enzymlösningen (500 μl i ett 15 ml koniskt rör) i ett stående läge skyddat från ljus i 24 timmar vid 37 °C vid försiktig skakning (5 x g).
- Tvätta provet i 15 ml hyaluronidastvättbuffert i ett 50 ml koniskt rör i ett horisontellt läge skyddat från ljus i 2 timmar (tre gånger) vid 37 °C med försiktig skakning (5 x g).
- För att bereda hyaluronidastvättbuffert, lös upp 50 mM karbonatbuffert, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 5% (v/v) metanol och 0,05%NaN3. Justera pH till 10. För att bereda 10x karbonatbuffert-NaCl-stam, lös upp 2,96 g natriumkarbonat, 1,86 g natriumvätekarbonat och 8,77 g NaCl i 100 ml dubbeldestillerat vatten med 0,05%NaN3 (se materialtabell) och justera pH till 10.
5. Immunfärgning
- Märk kärl med anti-α-SMA (alfa-liten muskelaktin, se Materialförteckning) antikroppar enligt stegen nedan.
- Generera primärt plus konjugerat Fab-fragment sekundärt antikroppskomplex. Starta denna reaktion 1,5 h före färgningsproceduren.
- Beräkna den erforderliga mängden primära och sekundära antikroppar (blanda i förhållandet 1: 0,5 i vikt).
OBS: För den primära antikroppen anti-α-SMA behövs 3,5 μg för att märka hela hjärtat eller ett fragment av skelettmuskulaturen med liknande dimensioner. För 2,5 mg/ml produkt behövs 3,5/2,5 = 1,4 μl antikroppslösning. För sekundär antikropp AlexaFluor 647 anti-mus Fab-fragment behövs 1,75 μg för att märka hela hjärtat eller ett fragment av skelettmuskulaturen med liknande dimensioner. För 1,7 mg/ml produkt behövs 1,75/1,7 = 1 μl antikroppslösning. - Blanda primära och sekundära antikroppar i ett bärnstensfärgat 2 ml rör och inkubera i 1,5 timmar vid 37 °C.
- Beräkna den erforderliga mängden primära och sekundära antikroppar (blanda i förhållandet 1: 0,5 i vikt).
- För buffertutbyte, blanda 7,5 ml 2x HV1 3D-immunfärgningsbuffert (ingår i satsen, se materialförteckning) med 7,5 ml dubbeldestillerat vatten och sänk ned vävnadsprovet i 1,5 timmar vid 32 °C med försiktig skakning (5 x g) i ett 15 ml koniskt rör i horisontellt läge. Starta denna reaktion samtidigt som genereringen av antikroppskomplex (1,5 timmar före immunfärgningsproceduren).
- Generera primärt plus konjugerat Fab-fragment sekundärt antikroppskomplex. Starta denna reaktion 1,5 h före färgningsproceduren.
- Utför 3D-immunfärgning enligt stegen nedan.
- Bered antikroppsfärgningslösningen i ett 15 ml koniskt rör efter tilläggsfil 1.
- Samla vävnadsprovet från buffertutbytesmediet (steg 5.1.2) och sänk ned det i antikroppsfärgningslösningen. Inkubera vävnader individuellt i 1 vecka vid 32 °C med försiktig skakning (5 x g) av rören i stående läge skyddat från ljus. Försegla röret med paraffinfilm för att undvika avdunstning.
- Flytta till 4 °C och inkubera ON i stående läge.
- Kyl tvättbufferten för 1x HV1 3D-immunfärgning (ingår i satsen, se materialförteckningen) till 4 °C och tvätta provet med 15 ml buffert (två gånger) i 30 minuter vardera vid 4 °C med försiktig skakning (5 x g). Håll 15 ml koniska rör i horisontellt läge tills steg 5.2.7.
- Späd formalin till 1 % i tvättbufferten för 1x HV1 3D-immunfärgning och sänk ned provet i 8 ml av lösningen i 24 timmar vid 4 °C vid försiktig skakning (5 x g).
- Inkubera i färsk 1% formalinlösning i 1 timme vid 37 °C vid försiktig skakning (5 x g).
- Tvätta i 15 ml PBS i 2 timmar vid 25 °C med försiktig skakning (5 x g).
- Öka tdTomato-signalen med anti-röda fluorescerande protein (RFP) antikroppar enligt stegen nedan.
- Följ samma inkubationstider och temperaturer som i steg 5.2.2. Beräkna mängden primära och sekundära antikroppar (se materialförteckning) och blanda dem i förhållandet 1:0,5 i vikt.
OBS: För primär antikroppsanti-RFP behövs 5 μg för att märka hela hjärtat eller ett fragment av skelettmuskulaturen av liknande dimensioner. För 1,25 mg/ml produkt krävs 5/1,25 = 4 μl av lösningen. För sekundär antikropp Alexa Fluor 647 anti-kanin Fab-fragment behövs 2,5 μg för att märka hela hjärtat eller ett fragment av skelettmuskulaturen med liknande dimensioner. För 1,5 mg/ml produkt behövs 2,5/1,5 = 1,7 μl av lösningen. - Bered antikroppsfärgningslösningen enligt vad som anges i tilläggsfil 1.
- Följ samma inkubationstider och temperaturer som i steg 5.2.2. Beräkna mängden primära och sekundära antikroppar (se materialförteckning) och blanda dem i förhållandet 1:0,5 i vikt.
- Öka GFP-signaler med anti-GFP-nanokroppar enligt stegen nedan.
- Följ samma inkubationstider och temperaturer som nämns i steg 5.2.2.
OBS: Anti-GFP-nanokroppar (se materialtabell) är konjugerade med Alexa Fluor 647, så genereringen av antikroppskomplexet är onödigt. - Bered antikroppsfärgningslösningen enligt vad som anges i tilläggsfil 1.
- Följ samma inkubationstider och temperaturer som nämns i steg 5.2.2.
6. RI-matchning
- Sänk ned genomskinliga organ i 5 ml 50% vattenutspädd CUBIC-R+-lösning (se materialtabell) vid RT (ON) med försiktig skakning (5 x g) i ett 50 ml koniskt rör. Håll rören i stående läge under hela RI:s matchande steg.
OBS: Återvunna CUBIC R+-lösningar från tidigare experiment kan återanvändas (upp till fyra gånger) i detta steg. För att bereda CUBIC-R+-lösning, lös upp 45% av 2,3-Dimetyl-1-fenyl-5-pyrazolon (antipyrin), 30% nikotinamid eller N-metylnikotinamid och 0,5% N-butyldietanolamin i dubbeldestillerat vatten eller använd den kommersiella CUBIC-R+-bufferten (se materialförteckning).
VARNING: CUBIC-R+ orsakar hudirritation, allvarlig ögonirritation och skador på organ. Använd skyddshandskar och se till att ögon- och ansiktsskydd. Andas inte in damm, ångor, gas, dimma eller ångor. Kassera till en godkänd avfallshanteringsanläggning. - Byt ut 50% KUBIK-R+ mot 5 ml 100% KUBIK-R+ och inkubera med försiktig skakning (5 x g) vid RT i 2 dagar. Överför sedan vävnaderna till en bunt luddfria våtservetter och vrid försiktigt vävnaderna för att ta bort CUBIC-R + -lösningen från organytorna i 5 minuter.
7. Montering
- Efter torkning av vävnaderna, överför dem till 5 ml monteringslösning (RI = 1,520) (se materialtabell) i en cellodlingsplatta med sex brunnar och inkubera dem (ON) vid RT. Vrid ofta vävnaderna för att eliminera luftbubblor, särskilt på organens ytor.
OBS: Organ kan förvaras i mer än 6 månader i monteringslösning eller CUBIC-R+. - Fäst vävnaderna på mikroskopprovhållaren med hjälp av cyanoakrylatbaserat gellim.
- Sänk ner proverna i mikroskopets kvartskuvett fylld med 120 ml monteringslösning och avbilda dem tvärs över till deras längsgående axel. Håll fast hjärtat med toppen och aortan horisontellt inriktad.
OBS: Rensade och monterade organ kan sektioneras med vibratom och avbildas med hög förstoring med konfokalmikroskopi. Bädda in organen i 2% agaros och skär sektioner på 100-500 μm. Organ kan också delas manuellt med ett skarpt blad för att producera tjockvävnadssektioner (>1000 μm). Efter sektionering, placera skivorna i glasbotten 35 mm petriskålar, montera med samma monteringslösning, försegla med nagellack och bild med ett konfokalmikroskop.
8. Bildförvärv
- Avbilda de monterade proverna med ett ljusarkmikroskop (se Materialförteckning). Ställ in förstoring och stegstorlek mellan enskilda skivor till 3 μm och använd höger och vänster ljuslaserlaser med 5 μm tjocklekar och 100% bredd. Ställ in exponeringstiden konstant på 50-100 ms och justera lasereffekten från 10% till 80% beroende på fluorescenssignalens intensitet.
- För samdetektion av tdTomato-uttryckande parasiter och DiR-färgade vilande amastigotes (figur 2C), använd röda (Ex/Em 561/620-660 nm) respektive infraröda (Ex/Em 785/845-55 nm) kanaler. För samdetektion av T-celler och tdTomat-uttryckande parasiter i CD8-reportermus (figur 2D), använd grön (Ex/Em 488/525-50 nm) respektive röd kanal.
- För saminfektionsanalyserna (figur 2E), liksom för samdetektion av parasiter som uttrycker GFP i kärnreportermöss (figur 2F), använd de gröna respektive röda kanalerna. För detektion av tdTomato-uttryckande parasiter, kärnfärgämne och hjärtkärl (figur 3B,C), använd de röda, gröna respektive fjärrröda (Ex/Em 640/680-730 nm) kanalerna.
- Upptäck anti-RFP-antikroppar med den fjärrröda kanalen och anti-GFP-nanokroppar med hjälp av den gröna kanalen (figur 3D).
- Konvertera de förvärvade TIFF-bildstaplarna och 3D-rekonstruera organen med hjälp av Imaris v9.7.2-programvaran (se materialförteckningen).
9. Ytrekonstruktion och kvantifiering med Imaris programvara
- Välj algoritmverktyg för ytdetektering och initiera guiden i bildanalysprogramvaran.
- Utför en första analys i ett 3D-område av intresse (slumpmässigt utvalt) och applicera det sedan på hela 3D-organrekonstruktionen. När du har valt en region av intresse (ROI) väljer du kanalen som ska analyseras, avmarkerar den släta knappen och väljer bakgrundssubtraktion.
OBS: Bakgrundssubtraktion beräknar ett unikt lokalt bakgrundsvärde för varje voxel och subtraherar detta från det ursprungliga pixelvärdet. Diametern på den största sfären som passar in i objektet måste vara upp till 200 μm för T. cruzi-infekterade celler, 10 μm för T-celler och 5 μm för enskilda parasiter. - Använd histogrammet för att justera klassificeringen och filterlistrutan för att välja mått för klassificering.
OBS: Använd histogrammet för att justera klassificeringen: ellipticitet (oblatt) och sfäricitetsmätningar rekommenderas. - Slutför guiden, tryck på statistikknappen och hämta det totala antalet parasitinfekterade celler eller T-celler som antalet frånkopplade komponenter per tidpunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KUBISKA fasta vävnader tvättades med PBS för att avlägsna fixeringsmedel och inkuberades sedan med CUBIC-L-cocktails, en grundläggande buffrad lösning av aminoalkoholer som extraherar pigment och lipider från vävnaden vilket resulterar i avfärgning av vävnad samtidigt som vävnadsarkitekturen bibehålls. Rutnätslinjer i papperet kan ses genom vävnaderna som indikerar en lämplig rensning av organen (figur 2A). Efter delipidering tvättades vävnaderna och nedsänktes i CUBIC-R+ och monteringslösning för RI-homogenisering respektive avbildning (figur 2B).
En mus av vild typ infekterades med tdTomato-uttryckande trypomastigotes förfärgade med DiR nära infrarött cyaninfärgämne. Musen avlivades 15 dagar efter infektion, och det intakta hjärtat dissekerades, fixerades och rensades. LSFM-avbildning och 3D-rekonstruktion gjorde det möjligt för oss att visualisera tdTomat-uttryckande prolifererande T. cruzi-parasiter (röd). Autofluorescensnivåer i den röda kanalen kan användas för korrekt visualisering av hjärtstruktur och kanter (figur 2C i). LSFM var också användbart för att identifiera läkemedelsresistenta vilande former 7,8. Färgning av parasiter före infektion med DiR-färgämne möjliggör spårning av vilande parasiter genom att visualisera parasiterna som inte hade spätt färgämnet genom replikation, som tidigare rapporterats för CellTrace Violet7.
Vilande parasiter (cyan) kan identifieras i hjärtat som avbildas i 3D-förstorade infällningar (gula pilar) (figur 2C ii,iii). Z-projektionsfluorescens segmenterades automatiskt för att generera en rekonstruerad 3D-ytmodell för rumslig visualisering och kvantifiering av det totala antalet T. cruzi-infekterade celler och vilande parasiter under hela 3D-rekonstruktionen (figur 2A). Analys av 3D-ytmodellen avslöjade 186 T. cruzi-infekterade celler med en högre andel infekterade celler i hjärtatriumet (123) jämfört med ventriklar (63) och 18 vilande parasiter i hela hjärtat (figur 2C i). I en tidigare rapport rapporterades en liknande pipeline för att övervaka antalet T. cruzi-infekterade celler och vilande parasiter i klarade mössvävnader efter läkemedelsbehandling31. Det är viktigt att notera att uppskattningarna för antalet vilande parasiter sannolikt är ett underantal, eftersom färgutspädningstekniken endast tillåter detektion av parasiter som inte har replikerats signifikant sedan den första infektionen, men inte upptäcker de som blev vilande senare i infektionen efter flera delningsrundor.
Ett liknande tillvägagångssätt användes för att övervaka interaktionen mellan olika T. cruzi-stammar i interferon (IFN) -gamma-bristfälliga möss. Produktionen av IFN-gamma av effektor-T-celler är avgörande för immunkontrollen av T. cruzi. I IFN-gamma bristfälliga möss sprider parasiter sig med minimal immunbegränsning, vilket ger mycket stort antal infekterade celler i organ. Dessa immunbristmodeller är användbara verktyg för att studera effekten av nya läkemedel utan den begränsning som immunigenkänning medför, och därmed möjliggöra detektering av parasitåterfall efter behandling. IFN-gamma bristfälliga möss infekterades med tdTomato-uttryckande Colombiana (röd) och GFP-uttryckande Brasilien (blå) T. cruzi-stammar. Mössen avlivades 17 dagar efter infektion, och de intakta hjärtan dissekerades, fixerades och rensades. I denna immunbristmodell kan värdceller infekterade med båda T. cruzi-stammarna observeras vid olika stadier av parasitutveckling, inklusive stora, medelstora och små infekterade celler och nyligen sprängda. Skivning genom vävnaderna visar rikligt med parasitinfekterade celler i hjärtförmaken på olika vävnadsdjup (figur 2E i-iii och film 1).
Ett kors av C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J och B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J-mallar, där alla T-celler uttrycker det gröna fluorescerande proteinet ZsGreen1, användes för att övervaka T-cellrekryteringen i T. cruzi-infekterade vävnader. Möss avlivades 14 dagar efter infektion med tdTomato-uttryckande parasiter, och skelettmuskulaturen skars ut, rensades och avbildades av LSFM. ZsGreen1 som uttrycker T-celler (blå) och T. cruzi-infekterade celler (röda) detekterades robust (figur 2D i och film 2). 3D-inzoomningar av 3D-rekonstruktionen identifierade T-celler i området för en infekterad cell (figur 2D ii). Vibratoma tjocka sektioner (200-500 μm) av samma vävnad gör att vi kan visualisera gränssnittet mellan T-celler och vara värd för infekterade celler genom konfokalmikroskopi (Figur 2D iii).
Ett alternativt sätt att övervaka inflammationsfoci är baserat på cellkärnor ackumulering runt T. cruzi-infekterade celler. En reportermus där alla cellkärnor uttrycker det fluorescerande tdToto-proteinet användes för detta ändamål. Det nukleära tdTomato-uttrycket (rött) upptäcktes lätt i vävnaderna efter rensningsprocessen. En kärnreportermus infekterades med GFP-uttryckande T. cruzi-parasiter (cyan), och 35 dagar efter infektion, avlivades och skelettmusklerna skärs ut, rensades och avbildades av LSFM (Figur 2F i-iii). Zoomade optiska delar av skelettmuskulaturen avslöjar ökad cellularitet genom att ackumulera röda kärnor längs GFP-uttryckande parasiter (figur 2F ii). Vibratomsektioner av samma vävnad bekräftar den tidigare beskrivna ackumuleringen av röda kärnor längs GFP-uttryckande parasiter genom konfokalmikroskopi (figur 2F iii).
CUBIC-protokollet anpassades också för immunfärgning och DNA-märkning av intakta, rensade organ och vävnader infekterade med T. cruzi (Figur 3A). Möss avlivades 40 dagar efter infektion med tdTomat-uttryckande parasiter, och hjärtan dissekerades, fixerades och rensades. Det intakta rensade hjärtat tvättades och färgades i 5 dagar med en grön DNA-markör, tvättades sedan igen och immunfärgades i 7 dagar med antikroppar mot α-SMA. Proverna postfixerades, tvättades, RI matchades och avbildades med LSFM. Samtidig detektion av flera fluorescerande signaler, inklusive kärnor, vaskulatur och T. cruzi-infekterade celler, var möjlig efter detta protokoll. α-SMA-immunfärgning (vit) presenterade höga signalnivåer som avslöjade hjärtats invecklade kärl (figur 3B ii och film 3). En optisk sektion från djupare hjärtregioner visar vävnadspenetrationen av α-SMA-antikroppar under de etablerade förhållandena (figur 3B v). DNA-färgning (blå) uppvisade också god vävnadspenetration, fluorescensnivåer och stabil volymetrisk färgning. Vissa områden med intensiv DNA-märkning identifierades på olika hjärtplatser (figur 3B i) och runt skelettmuskelfibrer (figur 3C i och film 4). En zoomad bild av skelettmuskulaturen visade en ansamling av blå kärnor i områden med få eller omätbara tdTomato-parasiter, vilket tyder på rekrytering av immunceller på platser med nuvarande eller tidigare T. cruzi-infektion (figur 3C ii). I andra fall hade infekterade värdceller få eller inga tecken på närliggande cellulära infiltrat (vita pilar) (figur 3C i). Vibratomsektioner av samma vävnad som i figur 3C ii visar DNA-färgning av celler och tdTomatuttryckande parasiter med konfokalmikroskopi (figur 3C iii).
Tidigare experiment har visat att vilande parasiter uppvisade lågt eller försumbart uttryck av tdToto- eller GFP-reporterproteiner (figur 2C ii och iii). För att förbättra detektionen av dessa fluorescerande proteiner immunbehandlades rensade vävnader med anti-RFP- eller -GFP-antikroppar. Intakta skelettmuskelvävnader från möss infekterade med parasiter som uttrycker tdTomato eller GFP fixerades, klargjordes och immunbesudlades med antikroppar mot RFP (RFP Booster) (figur 3D) eller nanokroppar mot GFP konjugerade med Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (figur 3E). Proverna postfixerades, tvättades, RI matchades och avbildades med LSFM. I båda fallen resulterade förstärkningen av GFP- och tdTomato-signalerna av antikropparna i stark fluorescens (figur 3D ii och 3E ii). Immunfärgningarna med hjälp av förstärkande antikroppar representerar ett mångsidigt verktyg som kommer att användas för att detektera T. cruzi-vilande i klarat hela organ och vävnader och upptäcka underrepresenterade signaler från RFP- eller GFP-familjemedlemmens reporterproteiner.
Figur 1: Nålinsättning under transkardiell perfusion. (A) En schematisk representation som visar de steg som utförts innan musen genomborras genom hjärtat och den korrekta positionen och riktningen för perfusionsnålen i vänster kammare. Ett litet snitt i det högra atriumet utfördes och dränerande blod samlades in (1); En fjärilsnål sattes in i hjärttoppen. Håll riktningen så att nålen inte tränger igenom septum (2). Inloppshålet runt nålen förseglades med gelbaserat lim (3). Levern är fylld med blod och verkar röd före perfusion; Men efter perfusion förlorar den pigmentering och blir blek. RA, höger aurikel; LA, vänster aurikel; Husbil, höger kammare; LV, vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visualisering av T. cruzi-infekterade celler, vilande amastigotes och inflammationsfokus i rensade organ. a) Schema för helorgan T. cruzi-upptäckt av infekterade celler med hjälp av vävnadsrensning, LSFM-avbildning och mjukvaruassisterad kvantifiering i 3D-ytmodeller. (jag) Ljusfältsbilder av hjärtat och skelettmuskulaturen före (vänster) och efter (höger) rensning (skalstreck: 1000 μm). (Ii) Ljus-ark fluorescensmikroskop. (Iii) IFN-gamma- bristfällig mus infekterades med 2 x 105 tdTomatuttryckande trypomastigotes. Vid 17 dagar efter infektion dissekerades hjärtat, CUBIC rensades och LSFM avbildades (skalfält: 500 μm). (dropp) Z-projektionsfluorescens segmenterades automatiskt för att generera en rekonstruerad 3D-ytmodell för rumslig visualisering och kvantifiering av antalet T. cruzi-infekterade celler. Totalt 736 T. cruzi-infekterade celler påvisades i hela hjärtat (skalstreck: 500 μm). (v) visar förstoringar av den angivna volymen i (dropp), där cyanobjekt representerar T. cruzi-infekterade celler (skalstreck: 50 μm). (B) Protokoll om CUBIC clearing av hela organ. (C) Visualisering av spridning och vilande T. cruzi parasiter i transparent mushjärta. (jag) En vild mus infekterades med 2 x 105 tdTomatuttryckande trypomastigotes färgade med ett DiR nära infrarött cyaninfärgämne. Hjärtat dissekerades, rensades och LSFM avbildades. tdTomatuttryckande prolifererande (röd) och vilande (cyan) T. cruzi parasiter kan identifieras. Autofluorescensnivåer upprätthölls för att möjliggöra korrekt visualisering av hjärtstrukturen. En mus dödades 15 dagar efter infektion baserat på toppen av parasitinfekterade celler och vilande amastigotes som hittades i tidigare verk (skalfält: 400 μm). (Ii) och iii) visa förstoringar av den angivna volymen i (jag), där gula pilar indikerar vilande parasiter (cyan) (skalstreck: 200 μm). (D) Detektion av T-cellrekrytering hos infekterad CD8-reportermus. (jag) Reportermusen smittades med 2 x 105 tdTomatuttryckande trypomastigotes och skelettmuskulaturen dissekerades, rensades och LSFM avbildades 14 dagar efter infektion, en tidpunkt då betydande cellsvar detekteras. ZsGreen1 uttrycker T-celler (blå) samt T. cruzi-infekterade celler (röda) visualiserades (skalstreck: 400 μm) (se även Film 2). (Ii) visar förstoringar av den angivna volymen i (jag) (skalstreck: 50 μm). (Iii) visar T-cellackumulering som omger en T. cruzi-infekterad cell i en vävnadssektion (200 μm) i samma organ (skalstreck: 8 μm). (E) Samspel mellan olika T. cruzi Stammar. (jag) IFN-gamma bristfälliga möss saminfekterades med 2 x 105 tdTomatuttryckande Colombiana (röd) och GFP-uttryckande Brasilien (blå) T. cruzi Stammar. Mössen avlivades och de intakta hjärtana dissekerades, fixerades och rensades vid 17 dagar efter infektion (skalstreck: 400 μm). (Ii) visar förstoringar av den angivna volymen i (jag) (skalstreck: 250 μm). (Iii) visar en förstorad optisk sektion som avslöjar celler infekterade med Colombiana (röd) och Brasilien (blå) T. cruzi Stammar (skalstreck: 150 μm). (F) Visualisering av cellularitet längs infekterade celler med hjälp av kärnreportermus. (jag) En kärnreportermus infekterades med 2 x 105 GFP-uttryckande trypomastigotes och skelettmuskulaturen dissekerades, rensades och LSFM avbildades vid 35 dagar efter infektion. Kärn-tdToto-uttryck av värdcellerna (rött), liksom GFP-parasituttryck (cyan), detekterades (skalfält: 400 μm). (Ii) visar en förstorad optisk sektion som avslöjar ansamling av röda kärnor längs GFP-uttryckande parasiter (skalstreck: 90 μm). (Iii) bekräftar ökad cellularitet genom konfokal avbildning av vävnadssektioner från samma organ (skalstreck: 8 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Märkning av rensade T. cruzi-infekterade organ med antikroppar och kärnfläckar . (A) KUBIK-protokoll för vävnadsrensning, 3D-immunfärgning och DNA-märkning av hela organ. (B) Märkning av mushjärta för kärl och DNA-detektion (se även film 3). i–iii) En vild mus infekterades med 2 x 105 tdTomat-uttryckande parasiter. Musen avlivades 40 dagar efter infektion, och hjärtat dissekerades, fixerades och rensades. Det rensade hjärtat var märkt med en DNA-markör och immunbesudlat med antikroppar mot α-SMA. Samtidig detektion av cellkärnor (blå), vaskulatur (vit) och T. cruzi-infekterade celler (röd) var möjliga. Musen dödades vid denna tidpunkt efter infektion när vävnad och speciell vaskulaturombyggnad kan bedömas (skalstreck: 400 μm). (iv) visar en förstorad volym från djupa hjärtregioner av (iii) som visar cellkärnor, kärl och infekterade celler (skalstreck: 90 μm). v) visar en optisk sektion erhållen av (iii) (skalstreck: 90 μm). (C) Ökad cellularitet visualiserad genom DNA-märkning av hela rensade skelettmuskulaturen. (i) Skelettmuskelvävnad från det tidigare experimentet var DNA-färgad och avslöjade områden med intensiv kärnmärkning (blå) samt T. cruzi-infekterade celler (röd) (skalfält: 200 μm) (se även film 4). ii) avslöjar en intensiv ansamling av blå kärnor i områden med lägre eller ingen detektion av tdToto-parasit (skalstreck: 100 μm). (iii) konfokal avbildning med hög förstoring (60x) identifierar DNA-märkning av celler och parasiter i vävnadssektioner (skalfält: 10 μm). (D) Förstärkning av tdTomato parasitreportermarkörer i hela rensade skelettmuskulaturen. i–iii) Intakta skelettmuskelvävnader från möss infekterade med 2 x 105 parasiter som uttrycker tdTomato fixerades, klargjordes och immunfärgades med antikroppar mot RFP (RFP Booster). En intensiv och enhetlig fluorescerande signal erhölls i den fjärrröda kanalen efter RFP-förstärkning (grön) av tdTomato-signalen (röd) (skalstreck: 100 μm). (E) Förstärkning av GFP-parasitreportermarkörer med hjälp av anti-GFP-nanokroppar. i–iii) Skelettmuskelvävnader från möss infekterade med 2 x 105 parasiter som uttrycker GFP fixerades, klargjordes och immunbesudlades med Alexa Fluor 647-konjugerade nanokroppar mot GFP (GFP Booster). En stark fluorescerande signal erhölls i den fjärrröda kanalen efter GFP-förstärkning (magenta) av GFP-fluorescensen (cyan). Mus från (D) och (E) dödades 30 dagar efter infektion eftersom parasitbelastningen når en topp vid denna tidpunkt, och parasitinfekterade celler kan lätt detekteras i skelettmuskulaturen (skalstång: 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: T. cruzi-infektion i hjärtat och skelettmuskulaturen hos IFN-gamma-bristfälliga möss. 3D-rekonstruktioner av KUBIK-klargjorda vävnader av IFN-gamma-bristfälliga möss som saminfekterats med 2 x 105 tdTomatuttryckande Colombiana (röd) och GFP-uttryckande Brasilien (blå) T. cruzi-stammar vid dag 17 efter infektion. Totalt 1151 enskilda skivor av hjärtat och 559 av skelettmuskeln förvärvades via LSFM. Jämförbara avbildningsresultat uppnåddes hos tre oberoende djur. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Detektion av T-cellrekrytering i T. cruzi-infekterad CD8-reportermus. 3D-visualisering av en KUBIK-klarad skelettmuskel från en CD8-reportermus infekterad med 2 x 105 Tdtomato-uttryckande Colombiana T. cruzi-stam (röd) och dödad vid 14 dagar efter infektion. Totalt 668 enskilda skivor av skelettmuskeln avbildades av LSFM. ZsGreen1 som uttrycker T-celler (blå) samt T. cruzi-infekterade celler (röd) visualiserades. Jämförbara avbildningsresultat uppnåddes hos två djur. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: Immunodetektion av kärl i T. cruzi-infekterat och rensat hjärta. 3D-rekonstruktion av ett CUBIC-klarat hjärta av vildtypsmöss infekterade med 2 x 105 tdTomatuttryckande Colombiana T. cruzi och immunbesudlade med antikroppar mot α-SMA (blå) vid 40 dagar efter infektion. Skivning genom hjärtat avslöjar hjärtats invecklade kärl och vävnadspenetrationen av α-SMA-antikropparna. Parasitinfekterade celler kan observeras som ljusröda fläckar i hjärtförmaken (röd, höger). Jämförbara avbildningsresultat uppnåddes hos två djur. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 4: DNA-färgning av hela organavslöjar områden med ökad cellularitet. 3D-rekonstruktion av den CUBIC-klarade skelettmuskeln hos vildmusen vid 40 dagar efter infektion infekterad med 2 x 105 tdTomatuttryckande Colombiana T. cruzi-stam. Hela quadriceps muskelområde färgades med ett grönt kärnfärgämne. T. cruzi-infekterade celler (röda) och kärnorna i varje cell i vävnaden (blå) visualiserades. Inzoomningar av 3D-rekonstruktionen avslöjar ackumulering av blå kärnor längs områden med få eller ingen upptäckt av tdToto-parasiter. Jämförbara avbildningsresultat uppnåddes hos två djur. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Tilläggsfil 1: Sammansättning av de antikroppsfärgningslösningar som används i studien. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frånvaron av omfattande helorgansavbildning av parasiter och immunsvaret begränsar förståelsen av komplexiteten i värd-parasitinteraktionerna och hindrar utvärderingen av terapier för Chagas sjukdom. Den aktuella studien antog CUBIC-rörledningen för att klargöra och fläcka intakta organ och vävnader hos T. cruzi-infekterade möss.
Flera vävnadsrensningsprotokoll testades i denna studie (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 och fDISCO13); emellertid bevarade endast CUBIC höga nivåer av tdToto- eller GFP-parasitfluorescens. På samma sätt visade tidigare rapporter kubisk bevarande av endogent uttryckta markörer jämfört med andra vävnadsrensningsmetoder35.
Begränsad upplösningskapacitet är en av de nuvarande försiktighetsåtgärderna för konventionell ljusarkmikroskopi. Detta är tydligt i svårigheterna att lösa enskilda parasiter i kraftigt infekterade celler (Figur 2C). De nyutvecklade kakelljusmikroskopen med förbättrad upplösningskapacitet och anpassning av vävnadsutvidgningstekniker kan lösa detta problem36.
Föroreningar från tvättbuffertarna, clearinglösningarna eller andra organ kan fällas ut i vävnaden och producera ospecifika signaler som kan misstas för parasitinfekterade celler, enskilda parasiter eller andra strukturer. Dessa artefakter fluorescerar emellertid vanligtvis starkt i flera kanaler, så efter bildanalys kan de enkelt kasseras från automatiserad räkning genom att avbilda vävnader i en alternativ kanal (vanligtvis den gröna kanalen). Dubbelfärgsobjekt betraktades som artefakter och uteslöts för automatiserad kvantifiering.
Kärnfläckar DAPI, PI, RedDot2 och SYTOX-G, presenterar goda nivåer av vävnadspenetration och signalintensiteter i de flesta av de KUBIK-rensade organen; det gröna DNA-färgämnet visade dock bästa prestanda (figur 3B, C och film 4).
Dessa resultat visade att T. cruzi-infekterade celler lätt kunde detekteras och kvantifieras exakt samtidigt som T-cell- eller kärnreportermösssignaler identifierades. Viktigast av allt, LSFM upptäckte sällsynta biologiska händelser, såsom DiR-positiva vilande amastigotes, i en komplex vävnadsmiljö med potential att expandera den till epitopimmunfärgning och DNA-märkning. Aktuella studier undersöker också nyttan av dessa metoder för att övervaka aktiveringen av immuneffektorceller, interaktionerna mellan flera parasitstammar i samma värd och induktion av vävnadsskada och reparation vid Chagas sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Etsuo Susaki för deras värdefulla hjälp och rekommendationer angående vävnadsrensning och immunfärgningsprotokoll. Vi är också tacksamma mot M. Kandasamy från CTEGD Biomedical Microscopy Core för teknisk support med LSFM och konfokal avbildning. Vi tackar också alla medlemmar i Tarleton Research Group för användbara förslag under hela denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
