Summary
본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Abstract
샤 가스 병은 주로 라틴 아메리카에서 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 무시 된 병리학입니다. 샤가스병 치료제인 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간을 포함한 여러 포유류 종을 감염시켜 심장 및 소화기 병리를 유발하는 다양한 생물학을 가진 절대 세포 내 기생충입니다. 샤가스병의 복잡한 생물학을 이해하고 치료 요법의 결과를 정확하게 평가하기 위해서는 T. cruzi in vivo 감염의 신뢰할 수 있는 검출이 오랫동안 요구되어 왔습니다. 현재 프로토콜은 3D 재구성 및 제거 된 장기에서 T. cruzi 감염 세포의 자동 정량화를위한 통합 파이프 라인을 보여줍니다. 라이트 시트 형광 현미경을 사용하면 전체 장기 또는 조직에서 활발하게 증식하고 휴면 상태인 T. cruzi 기생충과 면역 이펙터 세포를 정확하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 항체 및 핵 염색으로 제거 된 장기의 균일 한 표지를 얻기위한 CUBIC-HistoVision 파이프 라인이 성공적으로 채택되었습니다. 3D 면역염색과 결합된 조직 투명화는 약물 치료 프로토콜을 종합적으로 평가하고 T. cruzi 감염 조직의 세포 조직에 대한 이해를 향상시키는 편견 없는 접근 방식을 제공하며 샤가스병의 항-T. 크루즈 면역 반응, 조직 손상 및 복구와 관련된 발견을 발전시킬 것으로 기대됩니다.
Introduction
원생동물 기생충 T. cruzi에 의해 발생하는 샤가스병은 세계에서 가장 방치된 열대성 질병 중 하나이며 연간 약 13,000명이 사망합니다. 감염은 종종 부정맥, 심부전 및 갑작스런 사망을 포함하여 환자의 30 %에서 심장 병리를 일으키는 급성에서 만성 단계로 진행됩니다 1,2. 급성기 동안 기생충에 대해 유도 된 강력한 숙주 면역 반응에도 불구하고, 적은 수의 기생충이 심장 및 골격근과 같은 조직에서 숙주의 평생 동안 만성적으로 지속됩니다. 적응 면역 반응의 지연된 발병 및 비 복제 형태의 기생충의 존재를 포함한 몇 가지 요인은 면역계 3,4,5,6에 의한 완전한 제거를 피하기 위해 T. cruzi의 능력에 기여할 수 있습니다. 또한, 복제되지 않는 휴면 형태의 기생충은 트리파노시드 약물에 대한 낮은 감수성을 나타내며 많은 경우 7,8에서 관찰되는 치료 실패의 원인이 될 수 있습니다.
새로운 이미징 기술의 개발은 감염된 조직에서 기생충의 공간적 분포와 통제에 관여하는 면역 세포와의 관계에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 특성은 면역 체계에 의한 기생충 제어 과정을 더 잘 이해하고 만성 조직에 존재하는 희귀 휴면 기생충을 추적하는 데 중요합니다.
라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 얇은 절편 없이 큰 조직 또는 장기의 3D 이미징을 위한 가장 포괄적이고 편견 없는 방법 중 하나입니다. 라이트 시트 현미경은 얇은 빛의 시트를 사용하여 초점면의 형광단만 여기시키고, 샘플의 광퇴색 및 광독성을 줄이며, 초고속 카메라를 사용하여 수천 개의 조직층의 이미지를 기록합니다. 조직에서 레이저 광의 적절한 침투에 필요한 높은 수준의 조직 투명성은 조직 지질 화 및 탈색 후 굴절률 (RI)을 균질화하여 얻어지며, 이는 빛의 산란을 줄이고 고품질 이미지를 렌더링합니다 9,10,11.
조직 투명화 접근법은 전체 마우스12,13,14, 오가노이드15,16,17, 리포터 형광 마커를 발현하는 기관 18,19,20,21,22,23, 및 최근에는 제한된 수의 인간 조직(24)의 이미징을 위해 개발되었습니다. . 조직 청소를 위한 현재의 방법은 세 가지 제품군으로 분류됩니다: (1) DISCO 프로토콜25,26과 같은 유기 용매 기반 방법, (2) CLARITY 27과 같은 하이드로겔 기반 방법 및 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 이미징 칵테일 및 전산 분석)18,19,28,29와 같은 수성 방법 . CUBIC 프로토콜은 장기 모양과 조직 무결성을 유지하여 내인성으로 발현된 리포터 단백질의 형광을 보존합니다. 이 기술의 가장 최근의 업데이트인 CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV)은 또한 형광-표지된 항체 및 DNA 표지28을 사용하여 에피토프의 검출을 허용한다.
본 프로토콜에서, 정제된 무손상 마우스 조직에서 형광 단백질을 발현하는 T. cruzi 를 검출하기 위한 CUBIC 파이프라인을 사용하였다. 광학적으로 투명한 조직을 LSFM 이미지화하고 3D로 재구성했으며 장기 당 T. cruzi 감염 세포, 휴면 무명 및 T 세포의 정확한 총 수를 자동으로 정량화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 항체 및 핵 얼룩이 있는 투명화된 장기의 균일한 표지를 얻기 위해 성공적으로 채택되었습니다. 이러한 접근법은 감염된 숙주에서 T. cruzi 의 확장 및 제어를 이해하는 데 필수적이며 샤 가스 병에 대한 화학 및 면역 치료제를 완전히 평가하는 데 유용합니다.
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Protocol
이 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 실험실 동물 관리 인증 지침의 평가 및 인증 협회에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 동물 사용 프로토콜(마우스의 T. cruzi 감염 통제-A2021 04-011-Y1-A0)은 조지아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 나6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 및 C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 마우스(암컷,1-2개월)를 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다(재료 표 참조).
1. 감염, 관류 및 해부
- 각각 tdTomato 또는 GFP 형광 단백질을 발현하는 콜롬비아나(DTU TcI) 또는 브라질(DTU TcV) T. 크루지 균주의 조직 배양 유래 트리포마스티고테로 마우스를 복강 내 감염시킵니다. 감염 용량은 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 100μL에 희석 된 50,000에서 200,000 트리포 마스 티고 테의 범위 일 수 있습니다.
참고: 리포터 기생충 생성 및 마우스 감염 모델에 대한 구체적인 세부 정보는 Canavaci et al. 29 및 부스타만테 외.30. - 3-7 L/min의 유속으로 이산화탄소 흡입에 의해 마우스를 안락사시킨다. 동물이 페달 반사를 보이지 않 자마자 복부에서 흉골쪽으로 피부를 통해 세로 절개를하십시오. 그런 다음 복부에서 체벽을 자르고 흉골을 들어 올려 심장을 노출시킬 때까지 흉부 양쪽의 갈비뼈를 통해 계속하십시오.
- 그림 1에 설명된 대로 심장의 오른쪽 귀에 2.5mm 절개를 하고 1mL 마이크로피펫 팁을 사용하여 배수 혈액을 수집합니다.
- 나비 바늘 (관류 시스템의 한쪽 끝에 연결됨)이 오름차순 대동맥에 도달 할 때까지 좌심실의 정점에 삽입하십시오. 젤 기반 접착제 ( 재료 표 참조)를 사용하여 바늘 주위의 입구 구멍을 밀봉하고 관류 중에 바늘을 제자리에 유지하십시오.
- 마우스30 을 차가운 헤파린-PBS 50mL(헤파린 pH 7.4, 10U/mL)로 관류하거나 마우스에서 수집 트레이를 향해 나오는 액체에 혈액이 없어질 때까지 관류합니다.
- PBS에서 50mL의 차가운 4%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)(pH 7.4)와 관류합니다.
참고: PFA 조직 고정은 특히 에피토프 구조 및 후속 면역검출을 유지하기 위한 프로토콜의 중요한 단계 중 하나일 가능성이 높습니다. PFA는 시간이 지남에 따라 분해되므로 새로 준비해야합니다. 용액의 pH는 또한 조직의 불량한 청소로 이어질 수있는 과도한 고정을 피하기 위해 중요합니다.
주의: PFA는 피부 접촉에 의해 중간 정도의 독성이 있습니다. 급성 노출은 또한 코, 눈, 목에 매우 자극적입니다. 공기 또는 피부의 낮은 수준에 장기간 노출되면 피부염 및 가려움증과 같은 피부 자극과 천식과 유사한 호흡기 문제가 발생할 수 있습니다. 얼굴과 눈 보호구를 착용하고 먼지, 가스, 미스트, 연기 또는 증기를 흡입하지 마십시오.- PFA 관류 후 100mL의 CUBIC-P 완충액으로 마우스를 관류하여 1.5단계에서 언급한 정화 수준에 도달합니다.
- CUBIC-P 완충액을 준비하려면 이중 증류수에 10 % N- 부틸 디 에탄올 아민, 5 % 트리톤 X-100 및 5 % 1-N- 메틸이 미다 졸을 용해 시키거나 상업용 칵테일을 사용하십시오 ( 재료 표 참조).
참고: 단계 1.6.1.-1.6.2. 심장 및 신장과 같이 색소가 많은 장기에만 권장되는데, 이는 투명성을 높이기 위해 사전 제거 단계가 필요하기 때문입니다. CUBIC-P를 사용한 후 장기를 해부하고 2단계: 조직 청소로 바로 진행합니다.
- 이미징할 조직 샘플/장기30 개를 해부하고 50mL 원뿔형 튜브에서 부드럽게 흔들면서(5 x g 이하) 4°C에서 밤새 PBS(~10mL/전체 장기)에서 4%(w/v) PFA로 사후 고정합니다.
알림: 이후의 모든 배양은 빛으로부터 보호되는 20-30 ° C에서 수평으로 놓인 튜브에서 수행해야합니다. - 샘플을 10mL의 PBS(0.05% 아지드화나트륨(NaN 3)가 보충됨)에서 3시간(3회) 동안 부드럽게 흔들어(5 x g)하여 세척합니다.
참고: 조직은 50mL 원뿔형 튜브에서 4°C에서 부드럽게 흔들어(5 x g) PBS의 30% 자당 10mL에 배양하여 냉동할 수 있습니다. 조직이 튜브 바닥으로 가라앉은 후 OCT 화합물에 삽입하고 -80°C에서 유지합니다. OCT 화합물이 완전히 녹을 때까지 RT에서 해동 한 다음 10mL 원추형 튜브에서 부드럽게 흔들어 (5 x g) 4 ° C에서 PBS (~ 50mL / 전체 장기)로 세척합니다. 2단계로 진행합니다.
2. 조직 청소
참고: 이 작업에서 수행된 모든 조직 청소는 CUBIC 프로토콜 I22를 사용하여 수행되었습니다. 관류 중 지질 및 신속한 탈색을 위한 CUBIC-P, 지질 및 탈색을 위한 CUBIC-L, RI 매칭을 위한 CUBIC-R의 세 가지 칵테일이 사용되었습니다. DNA 염색 및 면역염색은 각각 CUBIC-HV1 3D 핵염색 키트 및 CUBIC-HV1 3D 면역염색 키트를 사용하여 수행하였다( 재료 표 참조).
- 50mL 원뿔형 튜브의 RT(ON)에서 부드럽게 흔들어(5 x g) 하여 50% 물로 희석한 CUBIC-L(재료 표 참조) 10mL에 개별 장기를 담그십시오. 튜브를 흔들리는 판에 평평하게 유지하십시오.
알림: 조직 손상을 방지하기 위해 장기는 동일한 튜브에 유지되고 용액은 진공 시스템을 사용하여 수집됩니다. CUBIC-L을 준비하려면 상업용 칵테일을 사용하여 이중 증류수에 10 % N- 부틸 디 에탄올 아민과 10 % Triton X-100을 녹입니다 ( 재료 표 참조).
주의: CUBIC-L은 눈에 심각한 손상을 일으킵니다. 눈과 얼굴 보호구를 착용하십시오. 승인된 폐기물 처리장에 폐기하십시오. - 샘플을 100% CUBIC-L 10mL에 6일 동안 담그십시오(3일째에 용액 새로 고침).
알림: 이 잠복기가 끝나면 조직은 거의 완전히 투명해야 합니다. - 투명한 장기를 PBS(0.05%NaN3 보충)로 37°C에서 2시간(3회) 동안 부드럽게 흔들어(5 x g) 세척합니다. 세척할 때마다 조직을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮겨 Triton X-100을 제거합니다.
참고: 도 2B에 기술된 바와 같이, 실험의 목적이 형질전환 T. cruzi 기생충 또는 마우스로부터 내인성으로 발현된 리포터 단백질을 시각화하는 것이라면(도 2C-F), 단계 3, 4 및 5단계를 건너뛰고 바로 단계 6으로 계속한다.
3. DNA 염색
- 시판되는 핵산 염료( 재료 표 참조)를 5mL의 염색 완충액(키트에 포함됨)에 1/2,500 희석으로 희석합니다.
- 조직을 핵 염료 용액에 담그고 서 있는 위치에서 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 5일 동안 부드럽게 회전하면서 37°C에서 배양합니다.
- RT에서 15mL의 3D 핵 염색 세척 완충액(키트에 포함됨)으로 2시간(3회) 동안 부드럽게 흔들어줍니다(5 x g).
참고: 다른 DNA 염료는 이러한 농도 및 배양 시간에 사용될 수 있습니다: DAPI (키트에 포함): 1/200, 5일 배양; BOBO-1 : 1/400, 5 일 배양; 요오드화프로피듐(PI)(키트에 포함): 1/100, 3일 배양; RedDot2: 1/250, 3일 배양. 실험의 특정 목적이 내인성으로 발현된 리포터 단백질을 모두 시각화하고 핵 염색을 사용하는 것이라면 4단계와 5단계를 건너뛰고 6단계로 바로 진행합니다.
4. 세포외 기질(ECM) 소화
참고: ECM의 히알루로니다제 소화는 항체가 조직28의 깊은 영역으로 적절하게 침투하는 것을 촉진하기 위해 수행되어야 합니다.
- 빛으로부터 보호되는 평평한 위치의 50mL 원뿔형 튜브에 37°C에서 2시간 동안 히알루로니다제 반응 완충액 15mL에 개별 장기를 담급니다.
참고: 히알루로니다제 반응 완충액을 준비하려면 10mM의 CAPSO를 용해하십시오. 이중 증류수에서 150mM의 염화나트륨 (NaCl) 및 0.05 %의 NaN3 ( 재료 표 참조)를 넣고 pH를 10으로 조정하십시오. - 히알루로니다제 반응 완충액 425μL에 히알루로니다아제 스톡 20mg/mL 75μL를 혼합하여 효소 용액을 준비합니다. 20mg/mL의 히알루로니다아제 스톡을 준비하려면 50mM의 탄산염 완충액, 150mM의 NaCl, 0.01%의 BSA 및 0.05%의NaN3 에 히알루로니다아제를 용해시킵니다( 재료 표 참조). pH를 10으로 조정하고 -30 °C에서 77 μL의 부피로 분취량을 조정합니다.
- 피펫을 사용하여 히알루로니다제 반응 완충액을 버리고 37°C에서 24시간 동안 빛으로부터 보호되는 서 있는 위치에서 효소 용액(15mL 원뿔형 튜브에 500μL)에 장기를 담그고 부드럽게 흔들어줍니다(5 x g).
- 50mL 원뿔형 튜브에 있는 히알루로니다제 세척 완충액 15mL에 샘플을 37°C에서 2시간(3회) 동안 빛으로부터 보호되는 수평 위치에서 부드럽게 흔들면서(5 x g) 세척합니다.
- 히알루로니다제 세척 완충액을 준비하려면 50mM의 탄산염 완충액, 150mM의 NaCl, 0.1%(v/v)의 트리톤 X-100, 5%(v/v)의 메탄올 및 0.05%의NaN3을 용해합니다. pH를 10으로 조정합니다. 10x 탄산염 완충액-NaCl 스톡을 제조하기 위해 2.96g의 탄산나트륨, 1.86g의 탄산수소나트륨 및 8.77g의 NaCl을 0.05%NaN3 ( 재료 표 참조)과 함께 이중 증류수 100mL에 용해시키고 pH를 10으로 조정합니다.
5. 면역 염색
- 아래 단계에 따라 항-α-SMA(알파-소근육 액틴, 재료 표 참조) 항체를 사용하여 혈관구조에 라벨을 붙입니다.
- 1차 및 접합된 Fab 단편 2차 항체 복합체를 생성한다. 염색 절차 1.5 시간 전에이 반응을 시작하십시오.
- 1 차 및 2 차 항체의 필요한 양을 계산하십시오 (1 : 0.5 중량 비율로 혼합).
참고: 1차 항체 항-α-SMA의 경우 심장 전체 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하려면 3.5μg이 필요합니다. 2.5 mg/mL 제품의 경우 3.5/2.5 = 1.4 μL의 항체 용액이 필요합니다. 2차 항체 AlexaFluor 647 항-마우스 Fab 단편의 경우, 전체 심장 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하기 위해 1.75μg이 필요하다. 1.7 mg/mL 제품의 경우 1.75/1.7 = 1 μL의 항체 용액이 필요합니다. - 호박색 2mL 튜브에 1차 항체와 2차 항체를 혼합하고 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.
- 1 차 및 2 차 항체의 필요한 양을 계산하십시오 (1 : 0.5 중량 비율로 혼합).
- 완충액 교환을 위해 7.5mL의 2x HV1 3D 면역염색 완충액(키트에 포함, 재료 표 참조)을 7.5mL의 이중 증류수와 혼합하고 조직 샘플을 수평 위치의 15mL 원뿔형 튜브에 부드럽게 흔들어(5 x g) 32°C에서 1.5시간 동안 담근다. 항체 복합체의 생성과 동시에 이 반응을 시작한다(면역염색 절차 1.5시간 전).
- 1차 및 접합된 Fab 단편 2차 항체 복합체를 생성한다. 염색 절차 1.5 시간 전에이 반응을 시작하십시오.
- 아래 단계에 따라 3D 면역염색을 수행합니다.
- 15mL 원뿔형 튜브에서 보충 파일 1에 따라 항체 염색 용액을 준비합니다.
- 완충액 교환 배지로부터 조직 샘플을 수집하고(단계 5.1.2) 항체 염색 용액에 침지시킨다. 빛으로부터 보호되는 서 있는 위치에서 튜브를 부드럽게 흔들면서(5 x g) 32°C에서 1주일 동안 개별적으로 조직을 배양합니다. 증발을 피하기 위해 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하십시오.
- 4°C로 이동하고 서 있는 자세에서 ON을 배양합니다.
- 1x HV1 3D 면역염색 세척 완충액(키트에 포함, 재료 표 참조)을 4°C로 냉각하고 샘플을 15mL 완충액(2회)으로 4°C에서 각각 30분 동안 부드럽게 흔들어(5 x g)하여 세척합니다. 15 단계까지 5.2.7mL 원추형 튜브를 수평 위치에 유지하십시오.
- 포르말린을 1x HV1 3D 면역염색 세척 완충액 중 1%로 희석하고, 샘플을 용액 8mL에 4°C에서 24시간 동안 부드럽게 흔들면서 침지시킨다(5 x g).
- 신선한 1% 포르말린 용액에서 37°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다(5 x g).
- 15mL의 PBS에서 25°C에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다(5 x g).
- 아래 단계에 따라 항 적색 형광 단백질 (RFP) 항체를 사용하여 tdTomato 신호를 증폭하십시오.
- 5.2.2단계와 동일한 배양 시간과 온도를 따릅니다. 1차 및 2차 항체의 양을 계산하고( 재료 표 참조) 1:0.5 중량비로 혼합합니다.
참고: 1차 항체 항-RFP의 경우 심장 전체 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하려면 5μg이 필요합니다. 1.25 mg/mL 제품의 경우 5/1.25 = 4 μL의 용액이 필요합니다. 2차 항체 Alexa Fluor 647 항-토끼 Fab 단편의 경우, 전체 심장 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하기 위해 2.5μg이 필요하다. 1.5 mg/mL 제품의 경우 2.5/1.5 = 1.7 μL의 용액이 필요합니다. - 보충 파일 1에 언급된 대로 항체 염색 용액을 준비합니다.
- 5.2.2단계와 동일한 배양 시간과 온도를 따릅니다. 1차 및 2차 항체의 양을 계산하고( 재료 표 참조) 1:0.5 중량비로 혼합합니다.
- 아래 단계에 따라 항 GFP 나노바디를 사용하여 GFP 신호를 증폭합니다.
- 5.2.2단계에서 언급한 것과 동일한 배양 시간과 온도를 따릅니다.
참고: 항-GFP 나노바디( 재료 표 참조)는 Alexa Fluor 647과 접합되므로 항체 복합체 생성이 필요하지 않습니다. - 보충 파일 1에 언급된 대로 항체 염색 용액을 준비합니다.
- 5.2.2단계에서 언급한 것과 동일한 배양 시간과 온도를 따릅니다.
6. RI 매칭
- 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 RT(ON)에서 50% 물로 희석한 CUBIC-R+ 용액( 재료 표 참조) 5mL에 투명 장기를 담그고 부드럽게 흔들어줍니다(5 x g). 전체 RI 매칭 단계 동안 튜브를 서 있는 위치에 두십시오.
알림: 이전 실험의 재활용 CUBIC R+ 용액은 이 단계에서 재사용할 수 있습니다(최대 4회). CUBIC-R+ 용액을 준비하려면 이중 증류수에 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론(안티피린) 45%, 니코틴아미드 또는 N-메틸니코틴아미드 30%, N-부틸디에탄올아민 0.5%를 용해하거나 상용 CUBIC-R+ 완충액을 사용합니다( 재료 표 참조).
주의: CUBIC-R+는 피부 자극, 심한 눈 자극 및 장기 손상을 유발합니다. 보호 장갑을 착용하고 눈과 얼굴을 보호하십시오. 먼지, 연기, 가스, 미스트 또는 증기를 흡입하지 마십시오. 승인된 폐기물 처리장에 폐기하십시오. - 50% CUBIC-R+를 100% CUBIC-R+ 5mL로 교체하고 RT에서 2일 동안 부드럽게 흔들어(5 x g) 배양합니다. 그런 다음 보풀이 없는 물티슈 더미에 티슈를 옮기고 조심스럽게 티슈를 돌려 장기 표면에서 CUBIC-R+ 용액을 5분 동안 제거합니다.
7. 장착
- 조직을 건조시킨 후 6웰 세포 배양 플레이트에 5mL의 장착 용액(RI = 1.520)( 재료 표 참조)으로 옮기고 RT에서 배양(ON)합니다. 특히 장기 표면의 기포를 제거하기 위해 조직을 자주 돌립니다.
알림: 장기는 장착 용액 또는 CUBIC-R+에 6개월 이상 보관할 수 있습니다. - 시아노아크릴레이트계 겔 접착제를 사용하여 조직을 현미경 샘플 홀더에 부착합니다.
- 120mL의 마운팅 용액으로 채워진 현미경 석영 큐벳에 샘플을 담그고 세로 축에 가로로 이미지를 만듭니다. 정점과 대동맥이 수평으로 정렬 된 상태에서 심장을 부착하십시오.
참고: 투명하고 장착된 장기는 비브라톰으로 절단하고 컨포칼 현미경으로 고배율로 이미지화할 수 있습니다. 장기를 2 % 아가 로스에 넣고 100-500 μm의 절편을 자릅니다. 날카로운 칼날로 장기를 수동으로 절단하여 두꺼운 조직 절편(>1000μm)을 생성할 수도 있습니다. 절단 후 슬라이스를 유리 바닥 35mm 페트리 접시에 넣고 동일한 장착 용액을 사용하여 장착하고 매니큐어로 밀봉하고 컨포칼 현미경으로 이미지를 만듭니다.
8. 이미지 획득
- 라이트 시트 현미경으로 장착된 샘플을 이미지화합니다( 재료 표 참조). 개별 슬라이스 사이의 배율 및 스텝 크기를 3μm로 설정하고 두께가 5μm이고 너비가 100%인 좌우 라이트 시트 레이저를 사용합니다. 노출 시간 상수를 50-100ms로 설정하고 형광 신호 강도에 따라 레이저 출력을 10%에서 80%까지 조정합니다.
- td토마토 발현 기생충과 DiR 염색 휴면 무식증(그림 2C)의 공동 검출을 위해 각각 빨간색(Ex/Em 561/620-660nm) 및 적외선(Ex/Em 785/845-55nm) 채널을 사용합니다. CD8 리포터 마우스에서 T 세포 및 td토마토 발현 기생충의 공동 검출을 위해(그림 2D), 각각 녹색(Ex/Em 488/525-50 nm) 및 적색 채널을 사용하십시오.
- 공동 감염 분석(그림 2E)과 핵 리포터 마우스(그림 2F)에서 GFP를 발현하는 기생충의 공동 검출을 위해 각각 녹색 및 빨간색 채널을 사용합니다. td토마토 발현 기생충, 핵염료 및 심장 혈관구조(그림 3B,C)를 검출하려면 각각 적색, 녹색 및 원적색(Ex/Em 640/680-730nm) 채널을 사용하십시오.
- 원적색 채널이 있는 항-RFP 항체와 녹색 채널을 사용하여 항-GFP 나노바디를 검출합니다(그림 3D).
- 획득한 TIFF 이미지 스택을 변환하고 Imaris v9.7.2 소프트웨어를 사용하여 장기를 3D 재구성합니다( 재료 표 참조).
9. Imaris 소프트웨어를 사용한 표면 재구성 및 정량화
- 표면 감지 알고리즘 도구를 선택하고 이미지 분석 소프트웨어에서 마법사를 시작합니다.
- 관심 있는 3D 영역(무작위로 선택)에서 초기 분석을 수행한 다음 전체 3D 장기 재구성에 적용합니다. 관심 영역(ROI)을 선택한 후 분석할 채널을 선택하고 부드럽게 버튼을 선택 취소한 다음 배경 빼기를 선택합니다.
참고: 배경 빼기는 모든 복셀에 대해 고유한 로컬 배경 값을 계산하고 원래 픽셀 값에서 뺍니다. 물체에 맞는 가장 큰 구의 직경은 T. cruzi 감염 세포의 경우 최대 200μm, T 세포의 경우 10μm, 개별 기생충의 경우 5μm여야 합니다. - 히스토그램을 사용하여 분류를 조정하고 필터 드롭다운 목록을 사용하여 분류할 측정값을 선택합니다.
참고: 히스토그램을 사용하여 분류를 조정합니다: 타원도(편평한) 및 구형도 측정이 권장됩니다. - 마법사를 완료하고 통계 버튼을 누른 다음 기생충에 감염된 세포 또는 T 세포의 총 수를 시점 당 분리 된 구성 요소 수로 검색합니다.
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Representative Results
CUBIC 고정 조직을 PBS로 세척하여 고정액을 제거한 다음 조직에서 색소와 지질을 추출하는 아미노 알코올의 기본 완충 용액인 CUBIC-L 칵테일과 함께 배양하여 조직 구조를 유지하면서 조직을 탈색시켰습니다. 종이의 격자 선은 장기의 적절한 청소를 나타내는 조직을 통해 볼 수 있습니다 (그림 2A). 탈지화 후, 조직을 세척하고, RI 균질화 및 이미징을 위한 CUBIC-R+ 및 장착 용액에 각각 침지시켰다(도 2B).
야생형 마우스를 DiR 근적외선 시아닌 염료로 미리 염색된 td토마토 발현 트리포마스티고테에 감염시켰다. 마우스는 감염 후 15일 후에 안락사되었고, 온전한 심장은 해부, 고정 및 제거되었습니다. LSFM 이미징 및 3D 재구성을 통해 td토마토 발현 증식 T. cruzi 기생충 (빨간색)을 시각화 할 수있었습니다. 적색 채널의 자가형광 수준은 심장 구조와 가장자리의 정확한 시각화에 사용될 수 있습니다(그림 2C i). LSFM은 약물 내성 휴면 형태 7,8을 확인하는 데에도 유용했습니다. DiR 염료를 사용한 기생충의 감염 전 염색은 이전에 CellTrace Violet7에 대해 보고된 바와 같이 복제를 통해 염료를 희석하지 않은 기생충을 시각화하여 휴면 기생충을 추적할 수 있습니다.
휴면 기생충 (청록색)은 3D 확대 삽입 (노란색 화살표) (그림 2C ii, iii)에 묘사 된 바와 같이 심장에서 식별 할 수 있습니다. Z-프로젝션 형광을 자동으로 분할하여 전체 3D 재구성에 걸쳐 T. cruzi 감염 세포 및 휴면 기생충의 총 수의 공간 시각화 및 정량화를 위해 재구성된 3D 표면 모델을 생성했습니다(그림 2A). 3D 표면 모델을 분석한 결과, 심실(63)과 심장 전체에 18개의 휴면 기생충이 있는 것에 비해 심방(123)에서 감염된 세포의 비율이 더 높은 186개의 T. cruzi 감염 세포가 밝혀졌습니다(그림 2C i). 이전 보고서에서, 약물 치료 후 정화 된 마우스 조직에서 T. cruzi 감염 세포 및 휴면 기생충의 수를 모니터링하는 유사한 파이프 라인이보고되었다31. 염료 희석 기술은 초기 감염 이후 크게 복제되지 않은 기생충만 검출할 수 있지만 여러 차례의 분열 후 감염 후반에 휴면 상태가 된 기생충은 검출하지 않기 때문에 휴면 기생충의 수에 대한 추정치는 과소 계산될 가능성이 높다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
인터페론 (IFN)-감마 결핍 마우스에서 상이한 T. cruzi 균주 간의 상호 작용을 모니터링하기 위해 유사한 접근법이 사용되었다. 이펙터 T 세포에 의한 IFN- 감마의 생산은 T. cruzi의 면역 조절에 필수적입니다. IFN- 감마 결핍 마우스에서 기생충은 최소한의 면역 제한으로 증식하여 장기에서 매우 많은 수의 감염된 세포를 생성합니다. 이러한 면역 결핍 모델은 면역 인식에 의해 부과 된 제한없이 신약의 효능을 연구하는 데 유용한 도구이며, 따라서 치료 후 기생충 재발의 검출을 허용합니다. IFN-감마 결핍 마우스를 td토마토 발현 콜롬비아나(빨간색) 및 GFP 발현 브라질(파란색) T. 크루즈 균주와 동시 감염시켰다. 마우스는 감염 후 17일 후에 안락사되었고, 온전한 심장은 해부, 고정 및 제거되었습니다. 이 면역 결핍 모델에서 T. cruzi 균주에 감염된 숙주 세포는 대형, 중형 및 소형 감염 세포 및 최근 파열 된 세포를 포함하여 기생충 발달의 다양한 단계에서 관찰 될 수 있습니다. 조직을 통해 슬라이스하면 다양한 조직 깊이의 심장 심방에 풍부한 기생충 감염 세포가 있음을 알 수 있습니다 (그림 2E i-iii 및 영화 1).
모든 T 세포가 녹색 형광 단백질 ZsGreen1을 발현하는 C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 및 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-td토마토)Hze/J 마우스의 교배를 사용하여 T. cruzi 감염 조직에서 T 세포 모집을 모니터링했습니다. 마우스는 td토마토 발현 기생충에 감염된 지 14일 후에 안락사되었고, 골격근을 절제하고, 제거하고, LSFM에 의해 영상화하였다. T 세포(파란색)와 T. cruzi-감염된 세포(적색)를 발현하는 ZsGreen1이 강력하게 검출되었다(그림 2D i 및 도 2). 3D 재구성의 3D 확대는 감염된 세포의 영역에서 T 세포를 식별했습니다 (그림 2D ii). 동일한 조직의 Vibratome 두꺼운 부분 (200-500 μm)을 통해 공 초점 현미경으로 T 세포와 숙주 감염 세포의 인터페이스를 시각화 할 수 있습니다 (그림 2D iii).
염증 병소를 모니터링하는 또 다른 방법은 T. cruzi에 감염된 세포 주변의 세포핵 축적을 기반으로합니다. 이를 위해 모든 세포핵이 형광 tdTomato 단백질을 발현하는 리포터 마우스를 사용하였다. 핵 tdTomato 발현 (빨간색)은 제거 과정 후 조직에서 쉽게 검출되었습니다. 핵 리포터 마우스를 GFP-발현 T. cruzi 기생충(시안)에 감염시키고, 감염 35일 후, 안락사시키고, 골격근을 절제하고, 제거하고, LSFM에 의해 영상화하였다(도 2F i-iii). 골격근의 확대된 광학 섹션은 GFP 발현 기생충을 따라 적색 핵을 축적하여 세포성이 증가했음을 보여줍니다(그림 2F ii). 동일한 조직의 비브라톰 절편은 공초점 현미경으로 GFP 발현 기생충을 따라 앞서 설명한 적색 핵의 축적을 확인합니다(그림 2F iii).
CUBIC 프로토콜은 또한 T. cruzi에 감염된 온전하고 깨끗한 장기 및 조직의 면역 염색 및 DNA 표지에 적합했습니다 (그림 3A). 마우스는 td토마토 발현 기생충에 감염된 지 40일 후에 안락사되었고, 심장은 해부, 고정 및 제거되었습니다. 온전한 투명화된 심장을 녹색 DNA 마커로 5일 동안 세척하고 염색한 다음, 다시 세척하고 α-SMA에 대한 항체로 7일 동안 면역염색하였다. 샘플은 사후 고정, 세척, RI 일치 및 LSFM으로 이미징되었습니다. 이 프로토콜에 따라 핵, 혈관 구조 및 T. cruzi 감염 세포를 포함한 여러 형광 신호의 동시 검출이 가능했습니다. α-SMA 면역 염색 (흰색)은 심장의 복잡한 혈관 구조를 드러내는 높은 신호 수준을 나타 냈습니다 (그림 3B ii 및 영화 3). 더 깊은 심장 영역으로부터의 광학 섹션은 확립 된 조건에서 α-SMA 항체의 조직 침투를 묘사한다 (도 3B v). DNA 염색(파란색)은 또한 양호한 조직 침투, 형광 수준 및 안정적인 체적 염색을 나타냈다. 강렬한 DNA 표지가있는 일부 영역은 다른 심장 위치 (그림 3B i)와 골격근 섬유 주변 (그림 3C i 및 영화 4)에서 확인되었습니다. 골격근의 확대 된 이미지는 td토마토 기생충이 거의 없거나 감지 할 수없는 부위에 청색 핵이 축적되어 현재 또는 이전의 T. cruzi 감염 부위에서 면역 세포의 모집을 시사합니다 (그림 3C ii). 다른 경우에, 감염된 숙주 세포는 근처의 세포 침윤물 (백색 화살표)의 증거가 거의 또는 전혀 없었다 (도 3Ci). 도 3C ii에서와 같은 조직의 비브라톰 절편은 공초점 현미경에 의한 세포 및 td토마토 발현 기생충의 DNA 염색을 나타낸다(도 3C iii).
이전 실험은 휴면 기생충이 tdTomato 또는 GFP 리포터 단백질의 발현이 낮거나 무시할 수 있음을 보여주었습니다(그림 2C ii 및 iii). 이들 형광 단백질의 검출을 개선하기 위해, 투명화된 조직을 항-RFP 또는 -GFP 항체로 면역염색하였다. tdTomato 또는 GFP를 발현하는 기생충에 감염된 마우스의 온전한 골격근 조직을 각각 RFP(RFP 부스터)(그림 3D) 또는 Alexa Fluor 647(GFP 부스터)(그림 3E)과 접합된 GFP에 대한 나노바디로 고정, 정화 및 면역염색했습니다. 샘플은 사후 고정, 세척, RI 일치 및 LSFM으로 이미징되었습니다. 두 경우 모두, 항체에 의한 GFP 및 tdTomato 신호의 증폭은 강한 형광을 초래하였다(그림 3D ii 및 3E ii ). 부스팅 항체를 사용한 면역염색은 정화된 전체 장기 및 조직에서 T. cruzi 휴면을 검출하고 RFP 또는 GFP 패밀리 구성원의 리포터 단백질에서 과소 대표되는 신호를 검출하는 데 사용되는 다목적 도구입니다.
그림 1: 경심장 관류 중 바늘 삽입. (A) 심장을 통해 마우스를 관류하기 전에 수행 된 단계와 좌심실에서 관류 바늘의 올바른 위치와 방향을 보여주는 개략적 표현. 우심방에 작은 절개를 수행하고 배액하는 혈액을 수집했습니다 (1). 나비 바늘이 심장 정점에 삽입되었습니다. 바늘이 중격을 관통하지 않도록 방향을 유지하십시오 (2). 바늘 주위의 입구 구멍은 겔계 접착제(3)를 사용하여 밀봉하였다. 간은 혈액으로 채워져 관류 전에 붉게 보입니다. 그러나 관류 후에는 색소 침착을 잃고 창백 해집니다. RA, 오른쪽 귀; LA, 왼쪽 귀의; RV, 우심실; LV, 좌심실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: T. cruzi에 감염된 세포, 휴면 무식증, 제거 된 장기의 염증 병소를 시각화합니다. (ᅡ) 전체 기관의 계획 T. cruzi-조직 투명화, LSFM 이미징 및 3D 표면 모델에서 소프트웨어 지원 정량화를 사용한 감염된 세포 검출. (나는) 지우기 전(왼쪽)과 후(오른쪽) 심장 및 골격근의 명시야 이미지(스케일 바: 1000μm). (ᅲᅲ) 라이트 시트 형광 현미경. (세 번째) IFN-감마-결핍 마우스를 2 x 10으로 감염시켰다.5 td토마토 발현 트리포마스티고테스. 감염 후 17일에 심장을 해부하고 CUBIC 투명화하고 LSFM을 영상화했습니다(스케일 바: 500μm). (ᅲᅲ) Z 투영 형광을 자동으로 분할하여 공간 시각화 및 정량화를 위한 재구성된 3D 표면 모델을 생성했습니다. T. cruzi-감염된 세포. 총 736 T. cruzi-감염된 세포는 심장 전체에서 검출되었다 (스케일 바 : 500 μm). (v)는 표시된 부피의 배율을 (ᅲᅲ), 여기서 청록색 객체는 T. cruzi-감염된 세포 (스케일 바 : 50 μm). (B) CUBIC 전체 장기 청산 프로토콜. (C) 증식 및 휴면의 시각화 T. cruzi 투명한 마우스 심장의 기생충. (나는) 야생형 마우스를 2 x 10으로 감염시켰다.5 tdDiR 근적외선 시아닌 염료로 염색된 토마토 발현 트리포마스티고테. 심장을 해부하고 제거하고 LSFM을 이미지화했습니다. td토마토 발현 증식 (빨간색) 및 휴면 (청록색) T. cruzi 기생충을 확인할 수 있습니다. 자가형광 수준은 심장 구조의 정확한 시각화를 허용하기 위해 유지되었습니다. 마우스는 이전 연구에서 발견된 기생충 감염 세포 및 휴면 무식증의 피크를 기반으로 감염 후 15일 후에 사망했습니다(스케일 바: 400μm). (ᅲᅲ) 및 (iii) 표시된 볼륨의 배율을 (나는), 여기서 노란색 화살표는 휴면 기생충(청록색)을 나타냅니다(스케일 바: 200μm). (D) 감염된 CD8 리포터 마우스에서 T 세포 모집의 검출. (나는) 리포터 마우스는 2 x 10으로 감염되었습니다.5 td토마토-발현 트리포마스티고테스 및 골격근을 해부하고, 제거하고, LSFM을 감염 후 14일째에 영상화했으며, 이는 실질적인 세포 반응이 검출되는 시점이다. ZsGreen1은 T 세포 (파란색)뿐만 아니라 T. cruzi-감염된 세포(적색)를 가시화하였다(스케일 바: 400 μm)(또한 참조 영화 2). (ᅲᅲ)는 표시된 부피의 배율을 (나는) (스케일 바: 50 μm). (세 번째)는 T 세포 축적을 둘러싸고 있음을 나타냅니다. T. cruzi-동일한 장기의 조직 절편 (200 μm)에 감염된 세포 (스케일 바 : 8 μm). (E) 서로 다른 상호 작용 T. cruzi 변종. (나는) IFN-감마 결핍 마우스를 2 x 10으로 동시 감염시켰다.5 td토마토 발현 콜롬비아나(빨간색) 및 GFP 발현 브라질(파란색) T. cruzi 변종. 마우스를 안락사시키고, 온전한 심장을 해부하고, 고정시키고, 감염 후 17일에 투명화시켰다(스케일 바: 400μm). (ᅲᅲ)는 표시된 부피의 배율을 (나는) (스케일 바: 250 μm). (세 번째)는 콜롬비아나 (빨간색) 및 브라질 (파란색)에 감염된 세포를 드러내는 확대 된 광학 섹션을 보여줍니다. T. cruzi 균주 (스케일 바 : 150 μm). (F) 핵 리포터 마우스를 사용하여 감염된 세포를 따라 세포성의 시각화. (나는) 핵 리포터 마우스를 2 x 10으로 감염시켰다.5 GFP-발현 트리포마스티고테스 및 골격근을 해부하고, 제거하고, 감염 후 35일에 LSFM을 영상화하였다. 숙주 세포의 핵 td토마토 발현(빨간색)과 GFP 기생충 발현(청록색)이 검출되었습니다(스케일 바: 400μm). (ᅲᅲ)는 GFP 발현 기생충을 따라 적색 핵의 축적을 드러내는 확대된 광학 단면을 나타낸다(스케일 바: 90μm). (세 번째)는 동일한 장기의 조직 절편의 컨포칼 이미징을 통해 증가된 세포성을 확인합니다(스케일 바: 8μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 투명해진 T. cruzi에 감염된 장기를 항체와 핵염색으로 표지하는 모습. (A) 조직 투명화, 3D 면역염색 및 전체 장기의 DNA 표지를 위한 CUBIC 프로토콜. (B) 혈관 구조 및 DNA 검출을 위한 마우스 심장의 라벨링(영화 3 참조). (i-iii) 야생형 마우스를 2 x 105 td토마토 발현 기생충에 감염시켰다. 마우스는 감염 후 40일 후에 안락사되었고, 심장은 해부, 고정 및 제거되었다. 깨끗해진 심장을 DNA 마커로 표지하고 α-SMA에 대한 항체로 면역염색하였다. 세포핵(파란색), 혈관구조(흰색) 및 T. cruzi 감염 세포(빨간색)의 동시 검출이 가능했습니다. 마우스는 감염 후 조직 및 특수 혈관 리모델링을 평가할 수 있을 때 사망했습니다(스케일 바: 400μm). (iv)는 세포핵, 혈관구조, 및 감염된 세포를 묘사하는 (iii)의 심부 심장 영역으로부터의 확대된 부피를 나타낸다(scale bar: 90 μm). (v)는 (iii)의 얻어진 광학부를 나타낸다(스케일 바: 90 μm). (C) 전체 투명 골격근의 DNA 표지로 시각화 된 증가 된 세포성. (i) 이전 실험의 골격근 조직을 DNA로 염색하여 강렬한 핵 표지 (파란색)와 T. cruzi 감염 세포 (빨간색) (스케일 바 : 200 μm) 영역을 나타 냈습니다 (영화 4 참조). (ii) tdTomato 기생충의 검출이 낮거나 전혀없는 영역에서 청색 핵의 강렬한 축적을 나타냅니다 (스케일 바 : 100 μm). (iii) 고배율 (60x) 컨포칼 이미징은 조직 절편에서 세포 및 기생충의 DNA 표지를 식별합니다(스케일 바: 10μm). (D) 전체 제거 된 골격근에서 tdTomato 기생충 리포터 마커의 부스팅. (i-iii) tdTomato를 발현하는 2 x 105 기생충에 감염된 마우스의 손상되지 않은 골격근 조직을 고정, 정화 및 RFP (RFP 부스터)에 대한 항체로 면역 염색했습니다. tdTomato 신호(빨간색)의 RFP 부스팅(녹색) 후 원적색 채널에서 강렬하고 균일한 형광 신호가 얻어졌다(스케일 바: 100μm). (E) 항 GFP 나노바디를 사용한 GFP 기생충 리포터 마커의 부스팅. (i-iii) GFP를 발현하는 2 x 105 기생충에 감염된 마우스의 골격근 조직을 고정, 정화 및 GFP(GFP 부스터)에 대해 Alexa Fluor 647 접합 나노바디로 면역 염색했습니다. GFP 형광(시안)의 GFP 부스팅 (마젠타) 후 원적색 채널에서 강한 형광 신호가 얻어졌다. (D) 및 (E)로부터의 마우스는 기생충 부하가 이 시점에서 피크에 도달하고 기생충 감염 세포가 골격근에서 쉽게 검출될 수 있기 때문에 감염 후 30일 후에 사망하였다(scale bar: 100 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1: IFN-감마 결핍 마우스에서 심장 및 골격근의 T. cruzi 감염. 감염 후 17일째에 2 x 105 td토마토 발현 콜롬비아나(빨간색) 및 GFP 발현 브라질(파란색) T. cruzi 균주와 동시 감염된 IFN-감마 결핍 마우스의 CUBIC 정화 조직의 3D 재구성. 총 1151 개의 개별 심장 조각과 559 개의 골격근이 LSFM을 통해 획득되었습니다. 3마리의 독립적인 동물에서 비교 가능한 영상 결과가 달성되었습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2: T. cruzi-감염된 CD8 리포터 마우스 에서의 T 세포 모집의 검출. 감염 후 14일에 2 x 105 Tdtomato 발현 Colombiana T. cruzi 균주(빨간색)에 감염되어 사망한 CD8 리포터 마우스의 CUBIC 정화 골격근의 3D 시각화. 골격근의 총 668 개의 개별 슬라이스가 LSFM에 의해 이미지화되었습니다. T 세포 (파란색)를 발현하는 ZsGreen1 및 T. cruzi 감염 세포 (빨간색)를 시각화 하였다. 비교 가능한 이미징 결과는 두 동물에서 달성되었습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3 : T. cruzi에 감염되고 맑은 심장 에서 혈관계의 면역 검출. 감염 후 40일에 2 x 105 td토마토 발현 Colombiana T. cruzi에 감염되고 α-SMA(파란색)에 대한 항체로 면역염색된 야생형 마우스의 CUBIC 정화 심장의 3D 재구성. 심장을 절단하면 심장의 복잡한 혈관구조와 α-SMA 항체의 조직 침투가 드러납니다. 기생충에 감염된 세포는 심장 심방 (빨간색, 오른쪽)에서 밝은 빨간색 반점으로 관찰 될 수 있습니다. 비교 가능한 이미징 결과는 두 동물에서 달성되었습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 4: 전체 장기DNA 염색은 세포성이 증가한 영역을 나타냅니다. 감염 후 40일째에 야생형 마우스의 CUBIC 정화 골격근의 3D 재구성을 2 x 105 td토마토 발현 콜롬비아나 T. 크루지 균주에 감염시켰다. 전체 대퇴사 두근 영역을 녹색 핵 염료로 염색했습니다. T. cruzi에 감염된 세포 (빨간색)와 조직 내 모든 세포의 핵 (파란색)을 시각화했습니다. 3D 재구성을 확대하면 tdTomato 기생충이 거의 또는 전혀 감지되지 않은 영역을 따라 파란색 핵이 축적되는 것을 알 수 있습니다. 비교 가능한 이미징 결과는 두 동물에서 달성되었습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 연구에 사용된 항체 염색 용액의 조성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기생충과 면역 반응에 대한 광범위한 전체 장기 영상의 부재는 숙주-기생충 상호 작용의 복잡성에 대한 이해를 제한하고 샤가스병에 대한 치료법의 평가를 방해합니다. 본 연구는 T. cruzi에 감염된 마우스의 손상되지 않은 장기와 조직을 명확히하고 염색하기 위해 CUBIC 파이프 라인을 채택했습니다.
이 연구에서 여러 조직 투명화 프로토콜이 테스트되었습니다 (PACT32,ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 및 fDISCO13). 그러나 CUBIC 만이 높은 수준의 tdTomato 또는 GFP 기생충 형광을 보존했습니다. 유사하게, 이전의 보고는 다른 조직-투명화 접근법과 비교하여 내인성적으로 발현된 마커의 CUBIC 보존을 보여주었다35.
제한된 분해능은 기존 라이트 시트 현미경의 현재 주의 사항 중 하나입니다. 이것은 심하게 감염된 세포에서 개별 기생충을 해결하는 어려움에서 분명합니다 (그림 2C). 향상된 해상도 용량과 조직 확장 기술의 적응을 가진 새로 개발된 타일링 라이트 시트 현미경은 이러한 문제를 해결할 수 있습니다(36).
세척 완충액, 투명액 또는 기타 기관의 불순물이 조직에 침전되어 기생충에 감염된 세포, 개별 기생충 또는 기타 구조로 오인될 수 있는 비특이적 신호를 생성할 수 있습니다. 그러나 이러한 인공물은 일반적으로 여러 채널에서 밝게 형광을 발하므로 이미지 분석 후 대체 채널(일반적으로 녹색 채널)의 이미징 조직에 의해 자동 계수에서 쉽게 폐기될 수 있습니다. 이중 색상 물체는 인공물로 간주되어 자동 정량화를 위해 제외되었습니다.
핵 염색 DAPI, PI, RedDot2 및 SYTOX-G는 대부분의 CUBIC 제거 기관에서 좋은 수준의 조직 침투 및 신호 강도를 나타냅니다. 그러나 녹색 DNA 염료가 가장 우수한 성능을 보였습니다 (그림 3B, C 및 영화 4).
이러한 결과는 T. cruzi에 감염된 세포를 쉽게 검출하고 정확하게 정량화하는 동시에 T 세포 또는 핵 리포터 마우스 신호를 식별할 수 있음을 보여주었습니다. 가장 중요한 것은 LSFM이 복잡한 조직 환경 내에서 DiR 양성 휴면 무식증과 같은 희귀 생물학적 이벤트를 검출하여 에피토프 면역 염색 및 DNA 표지로 확장 할 수있는 잠재적 인 능력을 가지고 있다는 것입니다. 현재의 연구는 또한 면역 이펙터 세포의 활성화, 동일한 숙주에서 여러 기생충 균주 간의 상호 작용, 샤 가스 병에서 조직 손상 및 복구 유도를 모니터링하기위한 이러한 접근법의 유용성을 탐구하고 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
조직 투명화 및 면역염색 프로토콜에 관한 귀중한 도움과 권장 사항에 대해 Etsuo Susaki 박사에게 감사드립니다. 또한 LSFM 및 컨포칼 이미징을 사용한 기술 지원에 대해 CTEGD Biomedical Microscopy Core의 M. Kandasamy에게 감사드립니다. 또한이 연구 전반에 걸쳐 유용한 제안을 해주신 Tarleton Research Group의 모든 구성원에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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