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Immunology and Infection

ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और बरकरार स्पष्ट अंगों में टी कोशिकाओं की मात्रात्मक 3 डी इमेजिंग

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63919
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और स्वचालित सॉफ्टवेयर सहायता प्राप्त तरीकों का वर्णन करता है ताकि बरकरार, साफ अंगों और ऊतकों में प्रसार और निष्क्रिय ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी और टी कोशिकाओं की कल्पना और सटीक मात्रा निर्धारित की जा सके। ये तकनीकें उपचार के परिणामों का मूल्यांकन करने और परजीवी-मेजबान इंटरैक्शन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करती हैं।

Abstract

चगास रोग एक उपेक्षित विकृति है जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करती है, मुख्य रूप से लैटिन अमेरिका में। चागास रोग एजेंट, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी), एक विविध जीव विज्ञान के साथ एक अनिवार्य इंट्रासेल्युलर परजीवी है जो मनुष्यों सहित कई स्तनधारी प्रजातियों को संक्रमित करता है, जिससे हृदय और पाचन विकृति होती है। विवो संक्रमण में टी क्रूज़ी का विश्वसनीय पता लगाने के लिए लंबे समय से चागास रोग के जटिल जीव विज्ञान को समझने और उपचार आहार के परिणाम का सटीक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल 3 डी-पुनर्निर्माण, साफ अंगों में टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं के स्वचालित परिमाणीकरण के लिए एक एकीकृत पाइपलाइन प्रदर्शित करता है। लाइट-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पूरे अंगों या ऊतकों में सक्रिय रूप से प्रसार और निष्क्रिय टी क्रूज़ी परजीवी और प्रतिरक्षा प्रभावकारी कोशिकाओं की सटीक कल्पना और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एंटीबॉडी और परमाणु दाग के साथ साफ किए गए अंगों की समान लेबलिंग प्राप्त करने के लिए क्यूबिक-हिस्टोविजन पाइपलाइन को सफलतापूर्वक अपनाया गया था। 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग के साथ मिलकर ऊतक समाशोधन दवा उपचार प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने, टी क्रूज़ी-संक्रमित ऊतकों के सेलुलर संगठन की समझ में सुधार करने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है, और एंटी-टी क्रूज़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, ऊतक क्षति और चागास रोग में मरम्मत से संबंधित खोजों को आगे बढ़ाने की उम्मीद है।

Introduction

प्रोटोजोआ परजीवी टी क्रूज़ी के कारण होने वाली चगास बीमारी, दुनिया की सबसे उपेक्षित उष्णकटिबंधीय बीमारियों में से एक है, जिससे लगभग 13,000 वार्षिक मौतें होती हैं। संक्रमण अक्सर अतालता, दिल की विफलता और अचानक मृत्यु 1,2 सहित 30% रोगियों में कार्डियक पैथोलॉजी का उत्पादन करने वाले एक तीव्र से पुरानी अवस्था में आगे बढ़ता है। तीव्र चरण के दौरान परजीवी के खिलाफ मजबूत मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बावजूद, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों जैसे ऊतकों में मेजबान के जीवन भर में परजीवी की कम संख्या बनी रहती है। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की देरी से शुरुआत और परजीवी के गैर-प्रतिकृति रूपों की उपस्थिति सहित कई कारक, प्रतिरक्षा प्रणाली 3,4,5,6 द्वारा पूर्ण उन्मूलन से बचने के लिए टी क्रूज़ी की क्षमता में योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, परजीवी के गैर-प्रतिकृति निष्क्रिय रूप ट्रिपैनोसिडल दवाओं के लिए कम संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं और कई मामलों में देखी गई उपचार विफलता के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं 7,8.

नई इमेजिंग तकनीकों का विकास संक्रमित ऊतकों में परजीवी के स्थानिक वितरण और उनके नियंत्रण में शामिल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनके संबंधों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। ये विशेषताएं प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा परजीवी नियंत्रण की प्रक्रियाओं की बेहतर समझ और पुराने ऊतकों में मौजूद दुर्लभ निष्क्रिय परजीवियों को ट्रैक करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) पतले-सेक्शनिंग के बिना बड़े ऊतकों या अंगों की 3 डी इमेजिंग के लिए सबसे व्यापक और निष्पक्ष तरीकों में से एक है। लाइट-शीट माइक्रोस्कोप केवल फोकल प्लेन में फ्लोरोफोरस को उत्तेजित करने, नमूनों की फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने और अल्ट्रा-फास्ट कैमरों का उपयोग करके हजारों ऊतक परतों की छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रकाश की एक पतली शीट का उपयोग करते हैं। ऊतकों में लेजर प्रकाश के उचित प्रवेश के लिए आवश्यक ऊतक पारदर्शिता का उच्च स्तर ऊतक डिलिपिडेशन और डिकोलराइजेशन के बाद अपवर्तक सूचकांक (आरआई) को समरूप करके प्राप्त किया जाता है, जो प्रकाश के बिखरने को कम करता है और उच्च गुणवत्ता वाली छवियोंको 9,10,11 प्रदान करता है।

पूरे चूहों की इमेजिंग के लिए ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं 12,13,14, ऑर्गेनोइड 15,16,17, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाले अंग 18,19,20,21,22,23, और हाल ही में मानव ऊतकों की सीमित संख्या24 . ऊतक समाशोधन के लिए वर्तमान तरीकों को तीन परिवारों में वर्गीकृत किया गया है: (1) कार्बनिक विलायक-आधारित विधियां जैसे डिस्को प्रोटोकॉल 25,26, (2) हाइड्रोगेल-आधारित विधियां, जैसे स्पष्टता 27, और जलीय विधियां, जैसे क्यूबिक (स्पष्ट, निर्बाध मस्तिष्क / . क्यूबिक प्रोटोकॉल अंग आकार और ऊतक अखंडता को बनाए रखते हैं, अंतर्जात रूप से व्यक्त रिपोर्टर प्रोटीन के प्रतिदीप्ति को संरक्षित करते हैं। इस तकनीक का सबसे हालिया अद्यतन, क्यूबिक-हिस्टोविजन (क्यूबिक-एचवी), फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए एंटीबॉडी और डीएनए लेबलिंग28 का उपयोग करके एपिटोप्स का पता लगाने की भी अनुमति देता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, स्पष्ट बरकरार माउस ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त टी क्रूजी का पता लगाने के लिए क्यूबिक पाइपलाइन का उपयोग किया गया था। ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतकों को एलएसएफएम इमेज किया गया था, 3 डी का पुनर्निर्माण किया गया था, और टी क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और टी कोशिकाओं की सटीक कुल संख्या प्रति अंग स्वचालित रूप से मात्रा निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, एंटीबॉडी और परमाणु दाग के साथ साफ अंगों की समान लेबलिंग प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अपनाया गया था। ये दृष्टिकोण संक्रमित मेजबानों में टी क्रूज़ी के विस्तार और नियंत्रण को समझने के लिए आवश्यक हैं और चगास रोग के लिए कीमो- और इम्यूनो-थेरेप्यूटिक्स के पूरी तरह से मूल्यांकन के लिए उपयोगी हैं।

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Protocol

यह अध्ययन प्रयोगशाला पशुओं की मानवीय देखभाल और उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति और प्रयोगशाला पशु देखभाल प्रत्यायन दिशानिर्देशों के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन के अनुसार सख्ती से किया गया था। पशु उपयोग प्रोटोकॉल (चूहों-ए 2021 04-011-वाई 1-ए 0 में टी क्रूज़ी संक्रमण का नियंत्रण) जॉर्जिया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। बी 6 । वर्तमान अध्ययन के लिए सी +ए 2: ए 44 जी-जीटी (आरओएसए) 26 सोरटीएम 14 (सीएजी-टीडीटीओएमए) एचजेडई / जे, B6.Cg-जीटी (आरओएसए) 26 एसओआरटीएम 14 (सीएजी-टीडीटोमैटो) एचजेडई / जे और सी 57 बीएल / 6 जे-टीजी (सीडी 8 ए *-सीआरई) बी 8 एसिन / जे चूहों (महिला, 1-2 महीने पुराना) का उपयोग किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. संक्रमण, छिड़काव, और विच्छेदन

  1. इंट्रापेरिटोनियल रूप से कोलम्बियाना (डीटीयू टीसीआई) या ब्राजील (डीटीयू टीसीवी) टी क्रूज़ी तनाव के ऊतक संस्कृति-व्युत्पन्न ट्रिपोमास्टिगोट्स के साथ चूहों को संक्रमित करते हैं, क्रमशः टीडीटोमैटो या जीएफपी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। संक्रमण की खुराक 50,000 से 200,000 ट्रिपोमास्टिगोट्स तक हो सकती है जो 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 100 μL में पतला हो सकती है।
    नोट: रिपोर्टर परजीवी की पीढ़ी और संक्रमण के माउस मॉडल के बारे में विशिष्ट विवरण कैनावसी एट अल में उपलब्ध हैं। 29 और बुस्टामांटे एट अल.30.
  2. मिनट की प्रवाह दर पर कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें। जैसे ही जानवर किसी भी पेडल रिफ्लेक्स को दिखाना बंद कर देते हैं, पेट से उरोस्थि की ओर त्वचा के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं। फिर पेट से शरीर की दीवार को काट लें और वक्ष के प्रत्येक तरफ पसलियों के माध्यम से तब तक जारी रखें जब तक कि उरोस्थि को दूर नहीं उठाया जा सकता है, जिससे हृदय उजागर हो जाता है।
  3. जैसा कि चित्रा 1 में वर्णित है, हृदय के दाहिने ऑरिकल में 2.5 मिमी चीरा बनाएं और 1 एमएल माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके जल निकासी रक्त एकत्र करें।
  4. बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में एक तितली सुई (छिड़काव प्रणाली के एक छोर से जुड़ा हुआ) डालें जब तक कि यह आरोही महाधमनी तक न पहुंच जाए। सुई के चारों ओर इनलेट छेद को सील करने और छिड़काव के दौरान स्थिति में सुई को बनाए रखने के लिए जेल-आधारित गोंद ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
  5. चूहोंको 50 मिलीलीटर ठंड हेपरिन-पीबीएस (पीएच 7.4, हेपरिन के 10 यू / एमएल) के साथ या जब तक संग्रह ट्रे की ओर माउस से बाहर आने वाला तरल पदार्थ रक्त से स्पष्ट न हो।
  6. पीबीएस में 50 मिलीलीटर ठंड 4% (डब्ल्यू / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) (पीएच 7.4) के साथ परफ्यूज करें।
    नोट: पीएफए ऊतक निर्धारण प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, विशेष रूप से एपिटोप संरचनाओं और बाद में इम्यूनोडिटेक्शन को बनाए रखने के लिए। पीएफए समय के साथ कम हो जाता है, इसलिए इसे ताजा तैयार किया जाना चाहिए। समाधान का पीएच भी अति-निर्धारण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे ऊतकों की खराब समाशोधन हो सकती है।
    सावधानी: पीएफए त्वचा के संपर्क से मामूली विषाक्त है। तीव्र जोखिम नाक, आंखों और गले के लिए भी अत्यधिक परेशान है। हवा या त्वचा में निम्न स्तर के लंबे समय तक संपर्क में रहने से त्वचा में जलन हो सकती है जैसे कि जिल्द की सूजन और खुजली, और अस्थमा जैसी श्वसन समस्याएं। चेहरे और आंखों की सुरक्षा पहनें और धूल, गैस, धुंध, धुआं या वाष्प सांस न लें।
    1. पीएफए छिड़काव के बाद, चरण 1.5 में उल्लिखित स्पष्टीकरण स्तर तक पहुंचने के लिए क्यूबिक-पी बफर के 100 एमएल के साथ माउस को परफ्यूज करें।
    2. क्यूबिक-पी बफर तैयार करने के लिए, डबल-डिस्टिल्ड पानी में 10% एन-ब्यूटाइलडीथेनॉलमाइन, 5% ट्राइटन एक्स -100 और 5% 1-एन-मिथाइलिमिडाज़ोल को भंग करें या वाणिज्यिक कॉकटेल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: चरण 1.6.1.-1.6.2. केवल हृदय और गुर्दे जैसे अत्यधिक वर्णित अंगों के लिए अनुशंसित हैं क्योंकि उन्हें पारदर्शिता के बढ़े हुए स्तर को प्राप्त करने के लिए पूर्व-समाशोधन चरण की आवश्यकता होती है। क्यूबिक-पी का उपयोग करने के बाद, अंगों को विच्छेदित करें और सीधे चरण 2 पर आगे बढ़ें: ऊतक समाशोधन।
  7. अंगोंको 30 इमेज करने के लिए विच्छेदन करें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में कोमल झटकों (5 एक्स जी से अधिक नहीं) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (ऑन) पीबीएस (~ 10 एमएल / पूरे अंग) में 4% (डब्ल्यू / वी) पीएफए में उन्हें ठीक करें।
    नोट: इसके बाद से सभी ऊष्मायन प्रकाश से संरक्षित 20-30 डिग्री सेल्सियस पर क्षैतिज रूप से बिछाने ट्यूबों पर किया जाना चाहिए।
  8. पीबीएस के 10 मिलीलीटर में नमूना धो लें (कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर3 घंटे (तीन बार) के लिए 0.05% सोडियम एजाइड (एनएएन 3) के साथ पूरक)।
    नोट: ऊतकों को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ पीबीएस में 30% सुक्रोज के 10 मिलीलीटर में इनक्यूबेट करके जमे हुए किया जा सकता है। ऊतकों को ट्यूब के नीचे डूबने के बाद, उन्हें ओसीटी यौगिक में एम्बेड करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। आरटी पर पिघलना जब तक कि ओसीटी यौगिक पूरी तरह से पिघल न जाए, फिर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में कोमल झटकों (5 एक्स जी) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस (~ 10 एमएल / चरण 2 पर आगे बढ़ें।

2. ऊतक समाशोधन

नोट: इस काम में किए गए सभी ऊतक समाशोधन क्यूबिक प्रोटोकॉल मैं22 का उपयोग कर किया गया था। तीन अलग-अलग कॉकटेल का उपयोग किया गया था: छिड़काव के दौरान डिलिपिडेशन और तेजी से डिकोलराइजेशन के लिए क्यूबिक-पी, डिलिपिडेशन और डिकोलराइजेशन के लिए क्यूबिक-एल, और आरआई मिलान के लिए क्यूबिक-आर। डीएनए धुंधला और इम्यूनोस्टेनिंग क्रमशः क्यूबिक-एचवी 1 3 डी परमाणु धुंधला किट और क्यूबिक-एचवी 1 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग किट का उपयोग करके किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में आरटी (ओएन) पर कोमल झटकों (5 एक्स जी) के साथ 50% पानी पतला क्यूबिक-एल (सामग्री की तालिका देखें) के 10 मिलीलीटर में व्यक्तिगत अंगों को विसर्जित करें। मिलाते हुए प्लेट पर ट्यूबों को सपाट रखें।
    नोट: ऊतक क्षति से बचने के लिए, अंगों को एक ही ट्यूब में बनाए रखा जाता है, और समाधान एक वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके एकत्र किए जाते हैं। क्यूबिक-एल तैयार करने के लिए, वाणिज्यिक कॉकटेल का उपयोग करके डबल-डिस्टिल्ड पानी में 10% एन-ब्यूटाइलडीथेनॉलमाइन और 10% ट्राइटन एक्स -100 को भंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    सावधानी: क्यूबिक-एल गंभीर आंखों की क्षति का कारण बनता है। आंख और चेहरे की सुरक्षा पहनें। अनुमोदित अपशिष्ट निपटान संयंत्र को निपटान करें।
  2. 6 दिनों के लिए 100% क्यूबिक-एल के 10 एमएल में विसर्जित नमूना (दिन 3 पर समाधान ताज़ा करना)।
    नोट: इस इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, ऊतकों को लगभग पूरी तरह से पारदर्शी होना चाहिए।
  3. कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे (तीन बार) के लिए पीबीएस (0.05% एनएएन 3 के साथ पूरक) के साथ पारदर्शी अंगों को धो लें। ट्राइटन एक्स -100 को हटाने के लिए प्रत्येक धोने के साथ एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऊतकों को स्थानांतरित करें।
    नोट: जैसा कि चित्रा 2 बी में वर्णित है, यदि प्रयोग का लक्ष्य ट्रांसजेनिक टी क्रूज़ी परजीवी या चूहों (चित्रा 2 सी-एफ) से अंतर्जात रूप से व्यक्त रिपोर्टर प्रोटीन की कल्पना करना है, तो चरण 3, 4 और 5 को छोड़ दें और सीधे चरण 6 पर जारी रखें।

3. डीएनए धुंधला

  1. 1/2,500 कमजोर पड़ने पर धुंधला बफर (किट में शामिल) के 5 मिलीलीटर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिक एसिड डाई ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें।
  2. परमाणु डाई समाधान में ऊतक विसर्जित करें और एक स्थायी स्थिति में 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग करके 5 दिनों के लिए कोमल रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ आरटी पर 2 घंटे (तीन बार) के लिए 3 डी परमाणु धुंधला धोने बफर (किट में शामिल) के 15 मिलीलीटर के साथ धो लें।
    नोट: अन्य डीएनए रंगों का उपयोग इन सांद्रता और इनक्यूबेशन समय में किया जा सकता है: डीएपीआई (किट में शामिल): 1/200, 5 दिन इनक्यूबेशन; बोबो -1: 1/400, 5 दिन इनक्यूबेशन; प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) (किट में शामिल): 1/100, 3 दिन इनक्यूबेशन; रेडडॉट 2: 1/250, 3 दिन इनक्यूबेशन। यदि प्रयोग का विशिष्ट उद्देश्य अंतर्जात रूप से व्यक्त रिपोर्टर प्रोटीन दोनों की कल्पना करना और परमाणु दाग का उपयोग करना है, तो चरण 4 और 5 को छोड़ दें और सीधे चरण 6 पर जारी रखें।

4. बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) पाचन

नोट: ईसीएम के हाइलूरोनिडेस पाचन को ऊतकों के गहरे क्षेत्रों में एंटीबॉडी के उचित प्रवेश की सुविधा के लिए किया जाना चाहिए28.

  1. प्रकाश से संरक्षित फ्लैट स्थिति में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए हाइलूरोनिडेस प्रतिक्रिया बफर के 15 मिलीलीटर में व्यक्तिगत अंगों विसर्जित।
    नोट: हाइलूरोनिडेज़ प्रतिक्रिया बफर तैयार करने के लिए, कैप्सो के 10 एमएम को भंग करें; डबल-डिस्टिल्ड पानी में सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के 150 एमएम, और एनएएन3 का 0.05% ( सामग्री की तालिका देखें) और पीएच को 10 में समायोजित करें।
  2. माइल्डे 20 मिलीग्राम / एमएल हाइलूरोनिडेज़ स्टॉक के 75 μL को हाइलूरोनिडेज़ प्रतिक्रिया बफर के 425 μL में मिलाकर एंजाइम समाधान तैयार करें। एमएल हाइलूरोनिडेस स्टॉक तैयार करने के लिए, कार्बोनेट बफर के 50 एमएम, एनएसीएल के 150 एमएम, बीएसए के 0.01% और एनएएन3 के 0.05% में हाइलूरोनिडेस को भंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। -30 डिग्री सेल्सियस पर 77 μL की मात्रा में पीएच और विभाज्य को 10 में समायोजित करें।
  3. एक पिपेट का उपयोग कर हाइलूरोनिडेज़ प्रतिक्रिया बफर त्यागें और कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्रकाश से संरक्षित एक स्थायी स्थिति में एंजाइम समाधान (15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 500 μL) में अंग विसर्जित।
  4. कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे (तीन बार) के लिए प्रकाश से संरक्षित क्षैतिज स्थिति में 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हाइलूरोनिडेस धोने बफर के 15 मिलीलीटर में नमूना धो लें।
    1. हाइलूरोनिडेज वॉश बफर तैयार करने के लिए, कार्बोनेट बफर के 50 एमएम, एनएसीएल के 150 एमएम, ट्राइटन एक्स -100 के 0.1% (वी / वी), मेथनॉल के 5% (वी / वी) और 0.05% एनएएन3 को भंग करें। पीएच को 10 में समायोजित करें। 10x कार्बोनेट बफर-एनएसीएल स्टॉक तैयार करने के लिए, 2.96 ग्राम सोडियम कार्बोनेट, 1.86 ग्राम सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट, और 8.77 ग्राम एनएसीएल को 0.05% एनएएन3 ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ डबल-डिस्टिल्ड पानी के 100 मिलीलीटर में भंग करें और पीएच को 10 में समायोजित करें।

5. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एंटी-α-एसएमए (अल्फा-छोटी मांसपेशी एक्टिन, सामग्री की तालिका देखें) एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल वास्कुलचर।
    1. प्राथमिक प्लस संयुग्मित फैब टुकड़ा माध्यमिक एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स उत्पन्न करें। धुंधला प्रक्रिया से 1.5 घंटे पहले इस प्रतिक्रिया शुरू करें।
      1. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यक मात्रा की गणना करें (वजन से 1: 0.5 अनुपात पर मिलाएं)।
        नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-α-एसएमए के लिए, पूरे दिल या समान आयामों के कंकाल की मांसपेशियों के टुकड़े को लेबल करने के लिए 3.5 μg की आवश्यकता होती है। एमएल उत्पाद के लिए, एंटीबॉडी समाधान के 3.5 /2.5 = 1.4 μL की आवश्यकता होती है। माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्साफ्लोर 647 एंटी-माउस फैब टुकड़े के लिए, पूरे दिल या समान आयामों के कंकाल की मांसपेशियों के टुकड़े को लेबल करने के लिए 1.75 μg की आवश्यकता होती है। एमएल उत्पाद के लिए, एंटीबॉडी समाधान के 1.75 /1.7 = 1 μL की आवश्यकता होती है।
      2. एक एम्बर 2 एमएल ट्यूब में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. बफर एक्सचेंज के लिए, डबल-डिस्टिल्ड पानी के 7.5 एमएल के साथ 2 एक्स एचवी 1 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग बफर (किट में शामिल, सामग्री की तालिका देखें) के 7.5 एमएल मिलाएं और क्षैतिज स्थिति में 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोमल झटकों (5 एक्स जी) के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए ऊतक के नमूने को विसर्जित करें। एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स की पीढ़ी (इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया से 1.5 घंटे पहले) के रूप में इस प्रतिक्रिया को एक साथ शुरू करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग करें।
    1. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, पूरक फ़ाइल 1 के बाद एंटीबॉडी धुंधला समाधान तैयार करें।
    2. बफर एक्सचेंज मीडिया (चरण 5.1.2) से ऊतक नमूना इकट्ठा करें और इसे एंटीबॉडी धुंधला समाधान में विसर्जित करें। प्रकाश से संरक्षित एक स्थायी स्थिति में ट्यूबों के कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए व्यक्तिगत रूप से ऊतकों सेते हैं। वाष्पीकरण से बचने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूब सील करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएँ और एक स्थायी स्थिति में पर सेते हैं।
    4. कूल 1एक्स एचवी 1 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग वॉश बफर (किट में शामिल, सामग्री की तालिका देखें) 4 डिग्री सेल्सियस तक और कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 30 मिनट के लिए 15 एमएल बफर (दो बार ) के साथ नमूना धो लें। चरण 5.2.7 तक क्षैतिज स्थिति में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रखें।
    5. 1एक्स एचवी 1 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग वॉश बफर में 1% तक फॉर्मलिन को पतला करें और कोमल झटकों (5 एक्स जी) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए समाधान के 8 एमएल में नमूना विसर्जित करें।
    6. कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ताजा 1% फॉर्मलिन समाधान में सेते हैं।
    7. कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पीबीएस के 15 मिलीलीटर में धो लें।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एंटी-रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) एंटीबॉडी का उपयोग करके टीडीटोमैटो सिग्नल को बढ़ावा दें।
    1. चरण 5.2.2 के समान इनक्यूबेशन बार और तापमान का पालन करें। प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की मात्रा की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें वजन से 1: 0.5 अनुपात में मिलाएं।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-आरएफपी के लिए, पूरे दिल या समान आयामों के कंकाल की मांसपेशियों के टुकड़े को लेबल करने के लिए 5 μg की आवश्यकता होती है। एमएल उत्पाद के लिए, समाधान के 5/1.25 = 4 μL की आवश्यकता होती है। माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 647 एंटी-खरगोश फैब टुकड़े के लिए, पूरे दिल या समान आयामों के कंकाल की मांसपेशियों के टुकड़े को लेबल करने के लिए 2.5 μg की आवश्यकता होती है। एमएल उत्पाद के लिए, समाधान के 2.5/1.5 = 1.7 μL की आवश्यकता होती है।
    2. पूरक फ़ाइल 1 में उल्लिखित एंटीबॉडी धुंधला समाधान तैयार करें।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी का उपयोग करके जीएफपी संकेतों को बढ़ावा दें।
    1. चरण 5.2.2 में उल्लिखित समय और तापमान के समान इनक्यूबेशन पालन करें।
      नोट: एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) एलेक्सा फ्लोर 647 के साथ संयुग्मित हैं, इसलिए एंटीबॉडी जटिल पीढ़ी अनावश्यक है।
    2. पूरक फ़ाइल 1 में उल्लिखित एंटीबॉडी धुंधला समाधान तैयार करें।

6. आरआई मिलान

  1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोमल मिलाते हुए (5 एक्स जी) के साथ आरटी (ओएन) पर 50% पानी-पतला क्यूबिक-आर + समाधान (सामग्री की तालिका देखें) के 5 एमएल में पारदर्शी अंगों को विसर्जित करें। पूरे आरआई मिलान चरण के दौरान ट्यूबों को एक स्थायी स्थिति में रखें।
    नोट: पिछले प्रयोगों से पुनर्नवीनीकरण क्यूबिक आर + समाधान इस चरण में पुन: उपयोग किया जा सकता है (चार बार तक)। क्यूबिक-आर + समाधान तैयार करने के लिए, डबल-डिस्टिल्ड पानी में 2,3-डाइमिथाइल-1-फिनाइल-5-पाइराज़ोलोन (एंटीपाइरिन), निकोटिनामाइड या एन-मेथिलनिकोटिनामाइड का 30%, और एन-ब्यूटाइलडीथेनॉलमाइन का 0.5% भंग करें या वाणिज्यिक क्यूबिक-आर + बफर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    सावधानी: क्यूबिक-आर + त्वचा की जलन, गंभीर आंखों की जलन और अंगों को नुकसान पहुंचाता है। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें, और आंख और चेहरे की सुरक्षा सुनिश्चित करें। धूल, धुएं, गैस, धुंध या वाष्प में सांस न लें। अनुमोदित अपशिष्ट निपटान संयंत्र में निपटान।
  2. 100% क्यूबिक-आर + के 5 एमएल के साथ 50% क्यूबिक-आर + को बदलें और 2 दिनों के लिए आरटी पर कोमल झटकों (5 एक्स जी) के साथ सेते हैं। फिर, लिंट-मुक्त पोंछे के ढेर पर ऊतकों को स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए अंग सतहों से क्यूबिक-आर + समाधान को हटाने के लिए ऊतकों को सावधानीपूर्वक चालू करें।

7. बढ़ते

  1. ऊतकों को सुखाने के बाद, उन्हें छह अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में बढ़ते समाधान (आरआई = 1.520) ( सामग्री की तालिका देखें) के 5 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें और आरटी पर उन्हें (चालू) सेते हैं।
    नोट: बढ़ते समाधान या क्यूबिक-आर + में अंगों को 6 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. साइनोएक्रिलेट-आधारित जेल गोंद का उपयोग करके माइक्रोस्कोप नमूना धारक के ऊतकों का पालन करें।
  3. बढ़ते समाधान के 120 मिलीलीटर से भरा माइक्रोस्कोप क्वार्ट्ज क्युवेट में नमूनों विसर्जित और उन्हें अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के लिए अनुप्रस्थ रूप से छवि। शीर्ष और महाधमनी क्षैतिज रूप से संरेखित के साथ दिल का पालन करें।
    नोट: साफ़ और घुड़सवार अंगों को एक वाइब्रेटोम के साथ विभाजित किया जा सकता है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा उच्च आवर्धन पर चित्रित किया जा सकता है। 2% अगारोज़ में अंगों को एम्बेड करें और 100-500 μm के कट अनुभागों को काटें। अंगों को मोटी ऊतक वर्गों (>1000 μm) का उत्पादन करने के लिए एक तेज ब्लेड के साथ मैन्युअल रूप से विभाजित किया जा सकता है। सेक्शनिंग के बाद, स्लाइस को ग्लास-बॉटम 35 मिमी पेट्री डिश में रखें, एक ही बढ़ते समाधान का उपयोग करके माउंट करें, नेल पॉलिश के साथ सील करें, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि।

8. छवि अधिग्रहण

  1. एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप के साथ घुड़सवार नमूनों की छवि ( सामग्री की तालिका देखें)। 3 μm करने के लिए व्यक्तिगत स्लाइस के बीच आवर्धन और कदम आकार सेट करें, और 5 μm मोटाई और 100% चौड़ाई के साथ दाएं और बाएं प्रकाश शीट पराबैंगनीकिरण का उपयोग करें। एक्सपोजर समय 50-100 एमएस पर स्थिर सेट करें, और प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के आधार पर लेजर पावर को 10% से 80% तक समायोजित करें।
    1. टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग परजीवी और डीआईआर-दाग वाले निष्क्रिय अमास्टिगोट्स (चित्रा 2 सी) के सह-पता लगाने के लिए, क्रमशः लाल (पूर्व / एम 561/620-660 एनएम) और इन्फ्रा-रेड (एक्स / सीडी 8 रिपोर्टर माउस (चित्रा 2 डी) में टी कोशिकाओं और टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग परजीवी के सह-पता लगाने के लिए, क्रमशः हरे (पूर्व /
    2. सह-संक्रमण परख (चित्रा 2 ई) के लिए, साथ ही नाभिक रिपोर्टर चूहों (चित्रा 2 एफ) में जीएफपी व्यक्त करने वाले परजीवियों के सह-पता लगाने के लिए, क्रमशः हरे और लाल चैनलों का उपयोग करें। टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग परजीवी, परमाणु डाई, और हृदय वास्कुलचर (चित्रा 3 बी, सी) का पता लगाने के लिए, क्रमशः लाल, हरे और दूर-लाल (पूर्व /
    3. हरे चैनल (चित्रा 3 डी) का उपयोग करके दूर-लाल चैनल और एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी के साथ एंटी-आरएफपी एंटीबॉडी का पता लगाएं।
  2. अधिग्रहित टीआईएफएफ छवि ढेर को परिवर्तित करें और 3 डी इमारिस वी 9.7.2 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अंगों का पुनर्निर्माण करें (सामग्री की तालिका देखें)।

9. इमारिस सॉफ्टवेयर के साथ सतह पुनर्निर्माण और मात्रा का ठहराव

  1. सतहों का पता लगाने एल्गोरिथ्म उपकरण का चयन करें और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में विज़ार्ड प्रारंभ करें।
  2. ब्याज के 3 डी क्षेत्र (यादृच्छिक रूप से चयनित) में प्रारंभिक विश्लेषण करें और फिर इसे पूरे 3 डी अंग पुनर्निर्माण पर लागू करें। ब्याज का एक क्षेत्र (आरओआई) चुनने के बाद, विश्लेषण किए जाने वाले चैनल का चयन करें, चिकनी बटन को अनचेक करें, और पृष्ठभूमि घटाव का चयन करें।
    नोट:: पृष्ठभूमि घटाव प्रत्येक वोक्सल के लिए एक अद्वितीय स्थानीय पृष्ठभूमि मान की गणना करता है और मूल पिक्सेल मान से इसे घटाता है। सबसे बड़े गोले का व्यास जो वस्तु में फिट बैठता है, टी क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं के लिए 200 μm, T कोशिकाओं के लिए 10 μm और व्यक्तिगत परजीवी के लिए 5 μm तक होना चाहिए।
  3. वर्गीकरण के लिए माप का चयन करने के लिए वर्गीकरण और फ़िल्टर ड्रॉप-डाउन सूची को समायोजित करने के लिए हिस्टोग्राम का उपयोग करें।
    नोट: वर्गीकरण को समायोजित करने के लिए हिस्टोग्राम का उपयोग करें: अण्डाकारता (तिरछा) और गोलाकार माप की सिफारिश की जाती है।
  4. विज़ार्ड को अंतिम रूप दें, आँकड़े बटन दबाएं, और प्रति समय बिंदु डिस्कनेक्ट किए गए घटकों की संख्या के रूप में परजीवी-संक्रमित कोशिकाओं या टी कोशिकाओं की कुल संख्या पुनर्प्राप्त करें।

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Representative Results

क्यूबिक फिक्स्ड ऊतकों को फिक्सेटिव को हटाने के लिए पीबीएस के साथ धोया गया था और फिर क्यूबिक-एल कॉकटेल के साथ ऊष्मायन किया गया था, अमीनो अल्कोहल का एक बुनियादी बफर समाधान जो ऊतक से पिगमेंट और लिपिड निकालता है जिसके परिणामस्वरूप ऊतक वास्तुकला को बनाए रखते हुए ऊतक का विघटन होता है। कागज में ग्रिड लाइनों अंगों (चित्रा 2 ए) की एक उपयुक्त समाशोधन का संकेत ऊतकों के माध्यम से देखा जा सकता है। डिलिपिडेशन के बाद, ऊतकों को क्रमशः (चित्रा 2 बी) आरआई होमोजेनाइजेशन और इमेजिंग के लिए क्यूबिक-आर + और बढ़ते समाधान में धोया और डुबोया गया था।

एक जंगली प्रकार का माउस डीआईडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग ट्रिपोमास्टिगोट्स से संक्रमित था, जो डीआईआर निकट-अवरक्त साइनाइन डाई के साथ पूर्व-दाग था। माउस को संक्रमण के 15 दिनों बाद इच्छामृत्यु दी गई थी, और बरकरार दिल को विच्छेदित, तय और साफ किया गया था। एलएसएफएम इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण ने हमें टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग प्रोलिफेरिंग टी क्रूज़ी परजीवी (लाल) की कल्पना करने की अनुमति दी। लाल चैनल में ऑटोफ्लोरेसेंस के स्तर का उपयोग हृदय संरचना और किनारों (चित्रा 2 सी आई) के सही दृश्य के लिए किया जा सकता है। एलएसएफएम दवा प्रतिरोधी निष्क्रिय रूपों 7,8 की पहचान करने के लिए भी उपयोगी था। डीआईआर डाई के साथ परजीवी के पूर्व-संक्रमण धुंधला परजीवी की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है, परजीवी की कल्पना करके जिन्होंने प्रतिकृति के माध्यम से डाई को पतला नहीं किया था, जैसा कि पहले सेलट्रेस वायलेट7 के लिए रिपोर्ट किया गया था।

निष्क्रिय परजीवी (सियान) को हृदय में पहचाना जा सकता है जैसा कि 3 डी बढ़े हुए इनसेट (पीले तीर) (चित्रा 2 सी द्वितीय, iii) में दर्शाया गया है। जेड-प्रोजेक्शन प्रतिदीप्ति को स्थानिक दृश्य और पूरे 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 2 ए) में टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं और निष्क्रिय परजीवी की कुल संख्या का ठहराव के लिए एक पुनर्निर्मित 3 डी सतह मॉडल उत्पन्न करने के लिए स्वचालित रूप से खंडित किया गया था। 3 डी सतह मॉडल के विश्लेषण से वेंट्रिकल्स (63) और पूरे दिल में 18 निष्क्रिय परजीवी (चित्रा 2 सी आई) की तुलना में हृदय आलिंद (123) में संक्रमित कोशिकाओं के उच्च अनुपात के साथ 186 टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं का पता चला। पिछली रिपोर्ट में, दवा उपचार के बाद स्पष्ट चूहों के ऊतकों में टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं और निष्क्रिय परजीवी की संख्या की निगरानी के लिए एक समान पाइपलाइन31 की सूचना दी गई थी। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि निष्क्रिय परजीवियों की संख्या के लिए अनुमान संभवतः एक अंडरकाउंट है, क्योंकि डाई कमजोर पड़ने की तकनीक केवल उन परजीवियों का पता लगाने की अनुमति देती है जो प्रारंभिक संक्रमण के बाद से काफी दोहराए नहीं गए हैं, लेकिन उन लोगों का पता नहीं लगाते हैं जो विभाजन के कई दौरों के बाद संक्रमण में बाद में निष्क्रिय हो गए।

इंटरफेरॉन (आईएफएन) -गामा की कमी वाले चूहों में विभिन्न टी क्रूज़ी उपभेदों के बीच बातचीत की निगरानी के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। प्रभावकारी टी कोशिकाओं द्वारा आईएफएन-गामा का उत्पादन टी क्रूज़ी के प्रतिरक्षा नियंत्रण के लिए आवश्यक है। आईएफएन-गामा की कमी वाले चूहों में, परजीवी न्यूनतम प्रतिरक्षा प्रतिबंध के साथ फैलते हैं, जिससे अंगों में संक्रमित कोशिकाओं की संख्या बहुत अधिक होती है। ये इम्यूनोडेफिशिएंट मॉडल प्रतिरक्षा मान्यता द्वारा लगाए गए प्रतिबंध के बिना नई दवाओं की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं, और इस प्रकार उपचार के बाद परजीवी रिलैप्स का पता लगाने की अनुमति देते हैं। आईएफएन-गामा की कमी वाले चूहों को टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग कोलंबियाना (लाल) और जीएफपी-एक्सप्रेसिंग ब्राजील (नीला) टी क्रूज़ी उपभेदों से संक्रमित किया गया था। चूहों को संक्रमण के 17 दिनों बाद इच्छामृत्यु दी गई थी, और बरकरार दिलों को विच्छेदित, तय और साफ किया गया था। इस इम्यूनोडेफिशिएंट मॉडल में, टी क्रूज़ी उपभेदों दोनों से संक्रमित मेजबान कोशिकाओं को परजीवी विकास के विभिन्न चरणों में देखा जा सकता है, जिसमें बड़े, मध्यम और छोटे संक्रमित कोशिकाएं और हाल ही में फटने वाले शामिल हैं। ऊतकों के माध्यम से टुकड़ा करने की क्रिया विभिन्न ऊतक गहराई (चित्रा 2 ई आई-तृतीय और मूवी 1) पर हृदय अटरिया में प्रचुर मात्रा में परजीवी संक्रमित कोशिकाओं को दिखाती है।

जे और B6.Cg-जीटी (आरओएसए) 26 एसओआर टीएम 14 (सीएजी-टीडीटोमैटो) एचजेडई / जे चूहों का एक क्रॉस, जिसमें सभी टी कोशिकाएं हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेडएसग्रीन 1 को व्यक्त करती हैं, का उपयोग टी क्रूज़ी संक्रमित ऊतकों में टी सेल भर्ती की निगरानी के लिए किया गया था। चूहों को टीडीटोमैटो-व्यक्त करने वाले परजीवी के संक्रमण के 14 दिन बाद इच्छामृत्यु दी गई थी, और कंकाल की मांसपेशियों को एलएसएफएम द्वारा उत्पादित, साफ और इमेज किया गया था। क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं (लाल) को व्यक्त करने वाले जेडएसग्रीन 1 को मजबूती से पता लगाया गया था (चित्रा 2 डी आई और मूवी 2)। 3 डी पुनर्निर्माण के 3 डी ज़ूम-इन ने संक्रमित सेल (चित्रा 2 डी द्वितीय) के क्षेत्र में टी कोशिकाओं की पहचान की। एक ही ऊतक के वाइब्रेटोम मोटे वर्गों (200-500 μm) हमें टी कोशिकाओं के इंटरफ़ेस की कल्पना करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 डी iii) द्वारा संक्रमित कोशिकाओं की मेजबानी करने की अनुमति देते हैं।

सूजन फोकी की निगरानी करने का एक वैकल्पिक तरीका टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं के आसपास सेल नाभिक संचय पर आधारित है। एक रिपोर्टर माउस जिसमें सभी सेल नाभिक फ्लोरोसेंट टी डीटोमैटो प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया गया था। समाशोधन प्रक्रिया के बाद ऊतकों में परमाणु टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति (लाल) का आसानी से पता लगाया गया था। क्रूज़ी परजीवी (सियान), और संक्रमण के 35 दिनों के बाद, इच्छामृत्यु की गई थी, और कंकाल की मांसपेशियों को एलएसएफएम (चित्रा 2 एफ आई-iii) द्वारा उत्पादित, साफ और चित्रित किया गया था। कंकाल की मांसपेशियों के ज़ूम किए गए ऑप्टिकल वर्गों में जीएफपी-व्यक्त परजीवी (चित्रा 2 एफ द्वितीय) के साथ लाल नाभिक जमा करके बढ़ी हुई सेलुलरता का पता चलता है। एक ही ऊतक के वाइब्रेटोम अनुभाग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 एफ iii) द्वारा जीएफपी-व्यक्त परजीवी के साथ लाल नाभिक के पहले वर्णित संचय की पुष्टि करते हैं।

क्यूबिक प्रोटोकॉल को बरकरार, साफ अंगों और टी क्रूज़ी (चित्रा 3 ए) से संक्रमित ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग और डीएनए लेबलिंग के लिए भी अनुकूलित किया गया था। चूहों को टीडीटोमैटो-व्यक्त करने वाले परजीवी के संक्रमण के 40 दिनों बाद इच्छामृत्यु दी गई थी, और दिलों को विच्छेदित, तय और साफ किया गया था। बरकरार साफ दिल को हरे रंग के डीएनए मार्कर के साथ 5 दिनों के लिए धोया और दाग दिया गया था, फिर फिर से धोया गया और α-एसएमए के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 7 दिनों के लिए इम्यूनोस्टेन किया गया। नमूनों को पोस्ट-फिक्स, धोया गया, आरआई मिलान किया गया, और एलएसएफएम के साथ चित्रित किया गया। नाभिक, वास्कुलचर और टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं सहित कई फ्लोरोसेंट संकेतों का एक साथ पता लगाना, इस प्रोटोकॉल के बाद संभव था। α-एसएमए इम्यूनोस्टेनिंग (सफेद) ने हृदय के जटिल वास्कुलचर (चित्रा 3 बी द्वितीय और मूवी 3) का खुलासा करते हुए उच्च सिग्नल स्तर प्रस्तुत किए। गहरे हृदय क्षेत्रों से एक ऑप्टिकल अनुभाग स्थापित स्थितियों (चित्रा 3 बी वी) में α-एसएमए एंटीबॉडी के ऊतक प्रवेश को दर्शाता है। डीएनए धुंधला (नीला) ने भी अच्छे ऊतक प्रवेश, प्रतिदीप्ति के स्तर और स्थिर वॉल्यूमेट्रिक धुंधला प्रदर्शन किया। तीव्र डीएनए लेबलिंग वाले कुछ क्षेत्रों को विभिन्न हृदय स्थानों (चित्रा 3 बी आई) और कंकाल की मांसपेशी फाइबर (चित्रा 3 सी आई और मूवी 4) के आसपास पहचाना गया था। कंकाल की मांसपेशियों की एक ज़ूम की गई छवि ने कुछ या अज्ञात टीडीटोमैटो परजीवी वाले क्षेत्रों में नीले नाभिक का संचय दिखाया, जो वर्तमान या पूर्व टी क्रूज़ी संक्रमण (चित्रा 3 सी द्वितीय) की साइटों पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती का सुझाव देता है। अन्य मामलों में, संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के पास पास के सेलुलर घुसपैठ (सफेद तीर) (चित्रा 3 सी मैं) का कोई सबूत नहीं था। चित्रा 3 सी द्वितीय में के रूप में एक ही ऊतक के वाइब्रेटोम वर्गों कंफोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 सी iii) द्वारा कोशिकाओं और टीडीटोमैटो-व्यक्त परजीवी के डीएनए धुंधला दिखाते हैं। 

पिछले प्रयोगों से पता चला है कि निष्क्रिय परजीवी ने टीडीटोमैटो या जीएफपी रिपोर्टर प्रोटीन (चित्रा 2 सी द्वितीय और तृतीय) की कम या नगण्य अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया है। इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने में सुधार करने के लिए, साफ ऊतकों को एंटी-आरएफपी या -जीएफपी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन किया गया था। टीडीटोमैटो या जीएफपी व्यक्त करने वाले परजीवी से संक्रमित चूहों से बरकरार कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को क्रमशः एलेक्सा फ्लोर 647 (जीएफपी बूस्टर) (चित्रा 3 ई) के साथ संयुग्मित जीएफपी के खिलाफ आरएफपी (आरएफपी बूस्टर) (चित्रा 3 डी) या नैनोबॉडी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ तय, स्पष्ट और इम्यूनोस्टेन किया गया था। नमूनों को पोस्ट-फिक्स, धोया गया, आरआई मिलान किया गया, और एलएसएफएम के साथ चित्रित किया गया। दोनों मामलों में, एंटीबॉडी द्वारा जीएफपी और टीडीटोमैटो संकेतों को बढ़ावा देने के परिणामस्वरूप मजबूत प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 डी द्वितीय और 3 ई द्वितीय) हुई। बूस्टिंग एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग एक बहुमुखी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसका उपयोग स्पष्ट पूरे अंग और ऊतकों में टी क्रूज़ी डॉर्मेंट्स का पता लगाने और आरएफपी या जीएफपी परिवार के सदस्य के रिपोर्टर प्रोटीन से किसी भी कम प्रतिनिधित्व वाले संकेत का पता लगाने के लिए किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसकार्डियक छिड़काव के दौरान सुई सम्मिलन। (ए) दिल के माध्यम से माउस को छिड़काव करने से पहले किए गए चरणों और बाएं वेंट्रिकल में छिड़काव सुई की सही स्थिति और दिशा दिखाने वाला एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। दाहिने आलिंद में एक छोटा चीरा लगाया गया था, और रक्त को निकालने के लिए एकत्र किया गया था (1); एक तितली सुई दिल के शीर्ष में डाला गया था। दिशा बनाए रखें ताकि सुई सेप्टम (2) के माध्यम से छेद न करे। सुई के चारों ओर इनलेट छेद को जेल-आधारित गोंद (3) का उपयोग करके सील कर दिया गया था। यकृत रक्त से भरा होता है और छिड़काव से पहले लाल दिखाई देता है; हालाँकि, छिड़काव के बाद, यह रंजकता खो देता है और पीला हो जाता है। आरए, सही ऑरिकल; ला, बाएं ऑरिकल; आरवी, दाएं वेंट्रिकल; एलवी, बाएं वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2क्रूजी संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और साफ किए गए अंगों में सूजन फोसी का दृश्य। (अ) संपूर्ण अंग की योजना T. cruzi-3 डी सतह मॉडल में ऊतक समाशोधन, एलएसएफएम इमेजिंग और सॉफ्टवेयर-सहायता प्राप्त मात्रा का ठहराव का उपयोग करके संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाना। (मैं) (बाएं) से पहले और बाद में (दाएं) समाशोधन (स्केल बार: 1000 μm) हृदय और कंकाल की मांसपेशियों की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (द्वितीय) लाइट शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप। (3.) आईएफएन-गामा की कमी वाले माउस को 2 x 10 से संक्रमित किया गया था5 टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग ट्रिपोमास्टिगोट्स। संक्रमण के बाद 17 दिनों में, हृदय को विच्छेदित किया गया था, क्यूबिक को साफ किया गया था, और एलएसएफएम इमेज किया गया था (स्केल बार: 500 μm)। (4.) जेड-प्रोजेक्शन प्रतिदीप्ति को स्थानिक दृश्य और संख्या का ठहराव के लिए एक पुनर्निर्मित 3 डी सतह मॉडल उत्पन्न करने के लिए स्वचालित रूप से खंडित किया गया था T. cruzi-संक्रमित कोशिकाएं। कुल 736 T. cruzi-संक्रमित कोशिकाओं को पूरे दिल में पाया गया (स्केल बार: 500 μm)। (v) में संकेतित मात्रा के आवर्धन से पता चलता है (4.), जहां सियान ऑब्जेक्ट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं T. cruzi-संक्रमित कोशिकाओं (स्केल बार: 50 μm)। (B) क्यूबिक पूरे अंग समाशोधन का प्रोटोकॉल। (C) प्रसार और निष्क्रिय का दृश्य T. cruzi पारदर्शी माउस दिल में परजीवी। (मैं) एक जंगली प्रकार का माउस 2 x 10 से संक्रमित था5 टीडीटोमैटो-व्यक्त करने वाले ट्रिपोमास्टिगोट्स एक डीआईआर निकट-अवरक्त साइनिन डाई के साथ दाग दिए गए। दिल को विच्छेदित, साफ किया गया था, और एलएसएफएम इमेज किया गया था। टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग प्रोलिफेरिंग (लाल) और निष्क्रिय (सियान) T. cruzi परजीवी की पहचान की जा सकती है। हृदय संरचना के सही दृश्य की अनुमति देने के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस के स्तर को बनाए रखा गया था। परजीवी संक्रमित कोशिकाओं के शिखर के आधार पर एक माउस को संक्रमण के 15 दिनों के बाद मार दिया गया था और पिछले कार्यों (स्केल बार: 400 μm) में पाए गए निष्क्रिय अमास्टिगोट्स। (द्वितीय) और (प) में इंगित मात्रा के आवर्धन दिखाएँ (मैं), जहां पीले तीर निष्क्रिय परजीवी (सियान) (स्केल बार: 200 μm) का संकेत देते हैं। (D) संक्रमित सीडी 8 रिपोर्टर माउस में टी सेल भर्ती का पता लगाना। (मैं) रिपोर्टर माउस 2 x 10 से संक्रमित था5 टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग ट्रिपोमास्टिगोट्स, और कंकाल की मांसपेशियों को विच्छेदित, साफ़ किया गया था, और एलएसएफएम को संक्रमण के 14 दिनों के बाद इमेज किया गया था, एक समय बिंदु जिस पर पर्याप्त सेल प्रतिक्रियाओं का पता लगाया जाता है। जेडएसग्रीन 1 टी कोशिकाओं (नीले) के साथ-साथ व्यक्त करता है T. cruzi-संक्रमित कोशिकाओं (लाल) कल्पना की गई थी (स्केल बार: 400 μm) (यह भी देखें) फिल्म 2). (द्वितीय) में संकेतित मात्रा के आवर्धन से पता चलता है (मैं) (स्केल बार: 50 μm)। (3.) एक के आसपास टी सेल संचय को दर्शाता है T. cruziएक ही अंग (स्केल बार: 8 μm) के एक ऊतक अनुभाग (200 μm) में संक्रमित सेल। (E) विभिन्न के बीच बातचीत T. cruzi उपभेदों। (मैं) आईएफएन-गामा की कमी वाले चूहों को 2 x 10 के साथ सहसंक्रमित किया गया था5 टीडीटोमैटो-व्यक्त कोलंबियाना (लाल) और जीएफपी-व्यक्त ब्राजील (नीला) T. cruzi उपभेदों। चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी, और बरकरार दिलों को विच्छेदित, तय किया गया था, और संक्रमण के बाद 17 दिनों (स्केल बार: 400 μm) पर साफ किया गया था। (द्वितीय) में संकेतित मात्रा के आवर्धन से पता चलता है (मैं) (स्केल बार: 250 μm)। (3.) कोलंबिया (लाल) और ब्राजील (नीले) से संक्रमित कोशिकाओं का खुलासा करने वाला एक आवर्धित ऑप्टिकल अनुभाग दिखाता है T. cruzi उपभेदों (स्केल बार: 150 μm)। (F) नाभिक रिपोर्टर माउस का उपयोग कर संक्रमित कोशिकाओं के साथ सेलुलरिटी का दृश्य। (मैं) एक परमाणु रिपोर्टर माउस 2 x 10 से संक्रमित था5 जीएफपी-व्यक्त करने वाले ट्रिपोमास्टिगोट्स, और कंकाल की मांसपेशियों को विच्छेदित, साफ किया गया था, और एलएसएफएम को संक्रमण के बाद 35 दिनों में चित्रित किया गया था। मेजबान कोशिकाओं (लाल), साथ ही जीएफपी परजीवी अभिव्यक्ति (सियान) की परमाणु टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था (स्केल बार: 400 μm)। (द्वितीय) जीएफपी-व्यक्त परजीवी (स्केल बार: 90 μm) के साथ लाल नाभिक के संचय का खुलासा करने वाला एक आवर्धित ऑप्टिकल अनुभाग दिखाता है। (3.) एक ही अंग (स्केल बार: 8 μm) से ऊतक वर्गों के कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा बढ़ी हुई कोशिकीयता की पुष्टि करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एंटीबॉडी और न्यूक्लियरस्टेन के साथ साफ टी क्रूज़ी-संक्रमित अंगों की लेबलिंग( ए) ऊतक समाशोधन, 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग और पूरे अंगों के डीएनए लेबलिंग के लिए क्यूबिक प्रोटोकॉल। (बी) वास्कुलचर और डीएनए का पता लगाने के लिए माउस दिल की लेबलिंग (मूवी 3 भी देखें)। (i-iii) एक जंगली प्रकार का माउस 2 x 105 टीडीटोमैटो-व्यक्त परजीवी से संक्रमित था। माउस को संक्रमण के 40 दिनों बाद इच्छामृत्यु दी गई थी, और हृदय को विच्छेदित, तय और साफ किया गया था। साफ किए गए दिल को डीएनए मार्कर के साथ लेबल किया गया था और α-एसएमए के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन किया गया था। सेल नाभिक (नीला), वास्कुलचर (सफेद), और टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं (लाल) का एक साथ पता लगाना संभव था। माउस इस समय संक्रमण के बाद मारा गया था जब ऊतक और विशेष वास्कुलचर रीमॉडेलिंग का आकलन किया जा सकता है (स्केल बार: 400 μm)। (iv) कोशिका नाभिक, वास्कुलचर और संक्रमित कोशिकाओं (स्केल बार: 90 μm) को दर्शाते हुए (iii) के गहरे हृदय क्षेत्रों से एक आवर्धित आयतन दिखाता है। (v) (iii) (स्केल बार: 90 μm) के प्राप्त एक ऑप्टिकल अनुभाग को दर्शाता है। (सी) पूरे साफ कंकाल की मांसपेशियों के डीएनए लेबलिंग द्वारा कल्पना की गई सेलुलरता में वृद्धि। (i) पिछले प्रयोग से कंकाल की मांसपेशी ऊतक डीएनए दाग था, तीव्र परमाणु लेबलिंग (नीले) के साथ-साथ टी क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं (लाल) (स्केल बार: 200 μm) (मूवी 4 भी देखें) के साथ क्षेत्रों का खुलासा। (ii) टीडीटोमैटो परजीवी (स्केल बार: 100 μm) का पता लगाने के लिए कम से कम क्षेत्रों में नीले नाभिक के एक तीव्र संचय को प्रकट करता है। (iii) उच्च आवर्धन (60x) कॉन्फोकल इमेजिंग ऊतक वर्गों (स्केल बार: 10 μm) में कोशिकाओं और परजीवियों के डीएनए लेबलिंग की पहचान करता है। (डी) पूरे साफ कंकाल की मांसपेशियों में टीडीटोमैटो परजीवी रिपोर्टर मार्करों को बढ़ावा देना। (i-iii) टीडीटोमैटो व्यक्त करने वाले 2 x 105 परजीवी से संक्रमित चूहों से बरकरार कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को आरएफपी (आरएफपी बूस्टर) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ तय, स्पष्ट और इम्यूनोस्टेन किया गया था। टीडीटोमैटो सिग्नल (लाल) (स्केल बार: 100 μm) के आरएफपी बूस्टिंग (हरा) के बाद दूर-लाल चैनल में एक तीव्र और समान फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त किया गया था। (ई) एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी का उपयोग करके जीएफपी परजीवी रिपोर्टर मार्करों को बढ़ावा देना। (i-iii) जीएफपी व्यक्त करने वाले 2 x 105 परजीवी से संक्रमित चूहों से कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को जीएफपी (जीएफपी बूस्टर) के खिलाफ एलेक्सा फ्लोर 647-संयुग्मित नैनोबॉडी के साथ तय, स्पष्ट और इम्यूनोस्टेन किया गया था। जीएफपी प्रतिदीप्ति (सियान) के जीएफपी बूस्टिंग (मैजेंटा) के बाद दूर-लाल चैनल में एक मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त किया गया था। (डी) और (ई) से माउस को संक्रमण के 30 दिनों बाद मार दिया गया था क्योंकि परजीवी भार इस समय बिंदु पर एक शिखर पर पहुंच जाता है, और परजीवी संक्रमित कोशिकाओं को कंकाल की मांसपेशियों (स्केल बार: 100 μm) में आसानी से पता लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1: आईएफएन-गामा की कमी वाले चूहों में हृदय और कंकाल की मांसपेशियों का टी क्रूज़ी संक्रमण। "आईएफएन-गामा की कमी वाले चूहों के क्यूबिक-स्पष्ट ऊतकों के 3 डी पुनर्निर्माण 2 एक्स 105 टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग कोलंबियाना (लाल) और जीएफपी-एक्सप्रेसिंग ब्राजील (नीला) टी क्रूज़ी उपभेदों के साथ संक्रमित 17 दिन के बाद संक्रमण"। एलएसएफएम के माध्यम से हृदय के कुल 1151 व्यक्तिगत स्लाइस और कंकाल की मांसपेशियों के 559 का अधिग्रहण किया गया था। तुलनीय इमेजिंग परिणाम तीन स्वतंत्र जानवरों में प्राप्त किए गए थे। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: टी क्रूज़ी-संक्रमित सीडी 8 रिपोर्टर माउस में टी सेल भर्ती का पता लगाना। सीडी 8 रिपोर्टर माउस से क्यूबिक-स्पष्ट कंकाल की मांसपेशियों का 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन 2 x 105 टीडीटोमैटो-व्यक्त कोलंबियाई टी क्रूज़ी तनाव (लाल) से संक्रमित है और संक्रमण के बाद 14 दिनों में मारा गया। कंकाल की मांसपेशियों के कुल 668 व्यक्तिगत स्लाइस एलएसएफएम द्वारा चित्रित किए गए थे। टी कोशिकाओं (नीले) के साथ-साथ टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं (लाल) को व्यक्त करने वाले जेडएसग्रीन 1 की कल्पना की गई थी। तुलनीय इमेजिंग परिणाम दो जानवरों में प्राप्त किए गए थे। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 3: टी क्रूज़ी-संक्रमित और साफ दिल में वास्कुलचर का इम्यूनोडिटेक्शन। 2 x 105 टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग कोलंबियाना टी क्रूज़ी से संक्रमित जंगली प्रकार के चूहों के क्यूबिक-स्पष्ट हृदय का 3 डी पुनर्निर्माण और संक्रमण के बाद 40 दिनों में α-एसएमए (ब्लू) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन किया गया। दिल के माध्यम से टुकड़ा करने से हृदय के जटिल वास्कुलचर और α-एसएमए एंटीबॉडी के ऊतक प्रवेश का पता चलता है। परजीवी संक्रमित कोशिकाओं को हृदय अटरिया (लाल, दाएं) में उज्ज्वल लाल धब्बे के रूप में देखा जा सकता है। तुलनीय इमेजिंग परिणाम दो जानवरों में प्राप्त किए गए थे। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 4: पूरे अंगडीएनए धुंधला बढ़ी हुई सेलुलरता वाले क्षेत्रों को प्रकट करता है। 2 x 105 टीडीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग कोलंबियाना टी क्रूज़ी स्ट्रेन से संक्रमित 40 दिनों के बाद संक्रमण पर जंगली प्रकार के माउस की क्यूबिक-स्पष्ट कंकाल की मांसपेशियों का 3 डी पुनर्निर्माण। पूरे क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी क्षेत्र को हरे रंग की परमाणु डाई के साथ दाग दिया गया था। टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं (लाल) और ऊतक (नीले) में प्रत्येक कोशिका के नाभिक की कल्पना की गई थी। 3 डी पुनर्निर्माण के ज़ूम-इन से टीडीटोमैटो परजीवी के कुछ या कोई पता नहीं लगाने वाले क्षेत्रों के साथ नीले नाभिक के संचय का पता चलता है। तुलनीय इमेजिंग परिणाम दो जानवरों में प्राप्त किए गए थे। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी धुंधला समाधान की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

परजीवी के व्यापक, पूरे अंग इमेजिंग की अनुपस्थिति और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मेजबान-परजीवी इंटरैक्शन की जटिलता की समझ को सीमित करती है और चगास रोग के लिए उपचार के मूल्यांकन में बाधा डालती है। वर्तमान अध्ययन ने टी क्रूज़ी संक्रमित चूहों के बरकरार अंगों और ऊतकों को स्पष्ट करने और दागने के लिए क्यूबिक पाइपलाइन को अपनाया।

इस अध्ययन में कई ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था (पीएसीटी32, ईसीआई33, फ्लैश34, आईडीआईएससीओ11,26, और एफडीआईएससीओ13); हालांकि, केवल क्यूबिक ने टीडीटोमैटो या जीएफपी परजीवी प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर को संरक्षित किया। इसी तरह, पिछली रिपोर्टों ने अन्य ऊतक-समाशोधन दृष्टिकोण 35 की तुलना में अंतर्जात रूप से व्यक्त मार्करों के क्यूबिक संरक्षण कोदिखाया।

सीमित रिज़ॉल्यूशन क्षमता पारंपरिक लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी की वर्तमान चेतावनियों में से एक है। यह भारी संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 2 सी) में व्यक्तिगत परजीवी को हल करने की कठिनाइयों में स्पष्ट है। एक बेहतर संकल्प क्षमता और ऊतक विस्तार तकनीकों के अनुकूलन के साथ नव विकसित टाइलिंग प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप इस समस्या को हल कर सकतेहैं 36.

धोने के बफर, समाशोधन समाधान, या अन्य अंगों से अशुद्धियां ऊतक में अवक्षेपित हो सकती हैं, जो निरर्थक संकेतों का उत्पादन करती हैं जो परजीवी-संक्रमित कोशिकाओं, व्यक्तिगत परजीवी या अन्य संरचनाओं के लिए गलत हो सकती हैं। हालांकि, ये कलाकृतियां आमतौर पर कई चैनलों में उज्ज्वल रूप से फ्लोरोसिस करती हैं, इसलिए छवि विश्लेषण के बाद, उन्हें वैकल्पिक चैनल (आमतौर पर हरे चैनल) में इमेजिंग ऊतकों द्वारा स्वचालित गिनती से आसानी से त्याग दिया जा सकता है। डबल रंग वस्तुओं को कलाकृतियों पर विचार किया गया था और स्वचालित मात्रा का ठहराव के लिए बाहर रखा गया था।

परमाणु दाग डीएपीआई, पीआई, रेडडॉट 2, और एसवाईटीओएक्स-जी, अधिकांश क्यूबिक-क्लियर अंगों में ऊतक प्रवेश और सिग्नल तीव्रता के अच्छे स्तर प्रस्तुत करते हैं; हालांकि, हरे रंग के डीएनए डाई ने सबसे अच्छा प्रदर्शन दिखाया (चित्रा 3 बी, सी और मूवी 4)।

इन परिणामों से पता चला है कि टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं को आसानी से पता लगाया जा सकता है और सटीक रूप से मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जबकि एक साथ टी सेल या नाभिक रिपोर्टर चूहों के संकेतों की पहचान की जा सकती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, एलएसएफएम ने दुर्लभ जैविक घटनाओं का पता लगाया, जैसे कि डीआईआर-पॉजिटिव निष्क्रिय अमास्टिगोट्स, एक जटिल ऊतक वातावरण के भीतर, इसे एपिटोप इम्यूनोस्टेनिंग और डीएनए लेबलिंग में विस्तारित करने की क्षमता के साथ। वर्तमान अध्ययन प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं की सक्रियता की निगरानी के लिए इन दृष्टिकोणों की उपयोगिता की भी खोज कर रहे हैं, एक ही मेजबान में कई परजीवी उपभेदों के बीच बातचीत, और चगास रोग में ऊतक क्षति और मरम्मत के प्रेरण।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

हम ऊतक-समाशोधन और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल के बारे में उनकी मूल्यवान सहायता और सिफारिशों के लिए डॉ एत्सुओ सुसाकी को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम एलएसएफएम और कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके तकनीकी सहायता के लिए सीटीईजीडी बायोमेडिकल माइक्रोस्कोपी कोर से एम कंडासामी के आभारी हैं। हम इस अध्ययन के दौरान उपयोगी सुझावों के लिए टारलटन रिसर्च ग्रुप के सभी सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 184 ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी चगास समाशोधन इम्यूनोस्टेनिंग क्यूबिक लाइट-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी
<em>ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-संक्रमित</em> कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और बरकरार स्पष्ट अंगों में टी कोशिकाओं की मात्रात्मक 3 डी इमेजिंग
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Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M.,… More

Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

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