Summary
Het huidige protocol beschrijft lichtblad fluorescerende microscopie en geautomatiseerde software-ondersteunde methoden om prolifererende en slapende Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in intacte, gewiste organen en weefsels te visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze technieken bieden een betrouwbare manier om behandelingsresultaten te evalueren en bieden nieuwe inzichten in interacties tussen parasieten en gastheer.
Abstract
De ziekte van Chagas is een verwaarloosde pathologie die wereldwijd miljoenen mensen treft, voornamelijk in Latijns-Amerika. De ziekteverwekker van Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is een obligate intracellulaire parasiet met een gevarieerde biologie die verschillende zoogdiersoorten infecteert, waaronder mensen, waardoor cardiale en spijsverteringspathologieën ontstaan. Betrouwbare detectie van T. cruzi in vivo infecties is al lang nodig om de complexe biologie van de ziekte van Chagas te begrijpen en de uitkomst van behandelingsregimes nauwkeurig te evalueren. Het huidige protocol demonstreert een geïntegreerde pijplijn voor geautomatiseerde kwantificering van T. cruzi-geïnfecteerde cellen in 3D-gereconstrueerde, gewiste organen. Light-sheet fluorescerende microscopie maakt het mogelijk om actief prolifererende en slapende T. cruzi-parasieten en immuuneffectorcellen in hele organen of weefsels nauwkeurig te visualiseren en te kwantificeren. Ook werd de CUBIC-HistoVision-pijplijn voor het verkrijgen van uniforme etikettering van geruimde organen met antilichamen en nucleaire vlekken met succes aangenomen. Weefselopruiming in combinatie met 3D-immunostaining biedt een onbevooroordeelde benadering om geneesmiddelenbehandelingsprotocollen uitgebreid te evalueren, het begrip van de cellulaire organisatie van T. cruzi-geïnfecteerde weefsels te verbeteren en zal naar verwachting ontdekkingen bevorderen met betrekking tot anti-T. cruzi immuunresponsen, weefselschade en reparatie bij de ziekte van Chagas.
Introduction
De ziekte van Chagas, veroorzaakt door de protozoaire parasiet T. cruzi, is een van 's werelds meest verwaarloosde tropische ziekten en veroorzaakt ongeveer 13.000 jaarlijkse sterfgevallen. De infectie evolueert vaak van een acuut naar een chronisch stadium dat cardiale pathologie produceert bij 30% van de patiënten, waaronder aritmieën, hartfalen en plotselinge dood 1,2. Ondanks de sterke immuunrespons van de gastheer die tijdens de acute fase tegen de parasiet werd opgewekt, blijven lage aantallen parasieten chronisch bestaan gedurende het hele leven van de gastheer in weefsels zoals het hart en de skeletspieren. Verschillende factoren, waaronder het vertraagde begin van adaptieve immuunresponsen en de aanwezigheid van niet-replicerende vormen van de parasiet, kunnen bijdragen aan het vermogen van T. cruzi om een volledige eliminatie door het immuunsysteem te voorkomen 3,4,5,6. Bovendien vertonen niet-replicerende slapende vormen van de parasiet een lage gevoeligheid voor trypanocidale geneesmiddelen en kunnen ze gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor het falen van de behandeling dat in veel gevallen wordt waargenomen 7,8.
De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingstechnieken biedt de mogelijkheid om inzicht te krijgen in de ruimtelijke verdeling van de parasieten in de geïnfecteerde weefsels en hun relatie met de immuuncellen die betrokken zijn bij hun controle. Deze kenmerken zijn cruciaal voor een beter begrip van de processen van parasietbestrijding door het immuunsysteem en het volgen van de zeldzame slapende parasieten die aanwezig zijn in chronische weefsels.
Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) is een van de meest uitgebreide en onbevooroordeelde methoden voor 3D-beeldvorming van grote weefsels of organen zonder dunne secties. Light-sheet microscopen gebruiken een dun vel licht om alleen de fluoroforen in het brandpuntsvlak te prikkelen, fotobleaching en fototoxiciteit van monsters te verminderen en beelden van duizenden weefsellagen op te nemen met behulp van ultrasnelle camera's. Het hoge niveau van weefseltransparantie dat nodig is voor de juiste penetratie van het laserlicht in weefsels wordt verkregen door de brekingsindex (RI) te homogeniseren na weefseldelipidatie en ontkleuring, waardoor de verstrooiing van licht wordt verminderd en beelden van hoge kwaliteit 9,10,11 worden weergegeven.
Weefselzuiveringsbenaderingen zijn ontwikkeld voor de beeldvorming van hele muizen 12,13,14, organoïden 15,16,17, organen die reporter fluorescerende markers tot expressie brengen 18,19,20,21,22,23, en onlangs een beperkt aantal menselijke weefsels24 . De huidige methoden voor weefselzuivering zijn ingedeeld in drie families: (1) organische methoden op basis van oplosmiddelen zoals DISCO-protocollen 25,26, (2) op hydrogel gebaseerde methoden, zoals CLARITY27, en waterige methoden, zoals CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails en Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-protocollen behouden de orgaanvorm en weefselintegriteit, waardoor de fluorescentie van endogene tot expressie gebrachte reportereiwitten behouden blijft. De meest recente update van deze techniek, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), maakt ook de detectie van epitopen mogelijk met behulp van fluorescerend gelabelde antilichamen en DNA-etikettering28.
In het huidige protocol werd de CUBIC-pijplijn gebruikt voor het detecteren van T. cruzi die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt in geklaarde intacte muizenweefsels. Optisch transparante weefsels werden LSFM-beelden, 3D gereconstrueerd en het precieze totale aantal T. cruzi geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen per orgaan werden automatisch gekwantificeerd. Ook werd dit protocol met succes aangenomen om uniforme etikettering van geruimde organen met antilichamen en nucleaire vlekken te verkrijgen. Deze benaderingen zijn essentieel voor het begrijpen van de uitbreiding en controle van T. cruzi in geïnfecteerde gastheren en zijn nuttig voor het volledig evalueren van chemo- en immunotherapieën voor de ziekte van Chagas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met het volksgezondheidsbeleid voor humane zorg en gebruik van proefdieren en de accreditatierichtlijnen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Het Animal Use Protocol (controle van T. cruzi-infectie bij muizen-A2021 04-011-Y1-A0) is goedgekeurd door de University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J en C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J muizen (vrouwelijk, 1-2 maanden oud) werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).
1. Infectie, perfusie en dissectie
- Intraperitoneaal infecteren muizen met van weefselkweek afgeleide trypomastigoten van Colombiana (DTU TcI) of Brazilië (DTU TcV) T. cruzi-stam die respectievelijk tdTomato- of GFP-fluorescerende eiwitten tot expressie brengt. De infectiedosis kan variëren van 50.000 tot 200.000 trypomastigoten verdund in 100 μL 1x Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Specifieke details over het genereren van reporterparasieten en muismodellen van infectie zijn beschikbaar in Canavaci et al. 29 en Bustamante et al.30. - Euthanaseer de muizen door kooldioxide-inademing met een stroomsnelheid van 3-7 L/min. Zodra de dieren geen pedaalreflex meer vertonen, maakt u een longitudinale incisie door de huid van de buik naar het borstbeen. Snijd vervolgens de lichaamswand van de buik en ga door de ribben aan elke kant van de thorax totdat het borstbeen kan worden weggetild, waardoor het hart wordt blootgesteld.
- Zoals beschreven in figuur 1, maak een incisie van 2,5 mm in de rechter oorschelp van het hart en verzamel het drainerende bloed met behulp van een micropipettepunt van 1 ml.
- Steek een vlindernaald (verbonden met het ene uiteinde van het perfusiesysteem) in de top van de linker ventrikel totdat deze de opgaande aorta bereikt. Gebruik lijm op basis van gel (zie Materiaaltabel) om het inlaatgat rond de naald af te dichten en de naald op zijn plaats te houden tijdens perfusies.
- Perfuseer de muizen30 met 50 ml koude Heparine-PBS (pH 7,4, 10 U / ml Heparine) of totdat de vloeistof die uit de muis naar de verzamelbak komt vrij is van bloed.
- Perfuseer met 50 ml koude 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) (pH 7,4) in PBS.
OPMERKING: PFA-weefselfixatie is waarschijnlijk een van de kritieke stappen van het protocol, vooral voor het behoud van epitoopstructuren en daaropvolgende immunodetectie. PFA degradeert na verloop van tijd, dus het moet vers worden bereid. De pH van de oplossing is ook belangrijk om overfixatie te voorkomen, wat kan leiden tot een slechte reiniging van weefsels.
LET OP: PFA is matig giftig bij huidcontact. Acute blootstelling is ook zeer irriterend voor de neus, ogen en keel. Langdurige blootstelling aan lage niveaus in de lucht of huid kan huidirritatie veroorzaken, zoals dermatitis en jeuk, en astma-achtige ademhalingsproblemen. Draag gezichts- en oogbescherming en adem geen stof, gas, mist, dampen of dampen in.- Na de PFA-perfusie perfuseert u de muis met 100 ml CUBIC-P-buffer om de in stap 1.5 vermelde klaringsniveaus te bereiken.
- Om CUBIC-P buffer te bereiden, lost u 10% N-butyldiethanolamine, 5% Triton X-100 en 5% 1-N-Methylimidazol op in dubbel gedestilleerd water of gebruikt u de commerciële cocktails (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Stappen 1.6.1.-1.6.2. worden alleen aanbevolen voor sterk gepigmenteerde organen zoals het hart en de nieren, omdat ze een pre-clearing stap vereisen om verhoogde niveaus van transparantie te verkrijgen. Na het gebruik van CUBIC-P, ontleedt u de organen en gaat u direct verder met stap 2: Weefsel opruimen.
- Ontleed de weefselmonsters/organen30 om in beeld te brengen en postfixeer ze in 4% (w/v) PFA in PBS (~10 ml/heel orgaan) 's nachts (ON) bij 4 °C met zacht schudden (niet meer dan 5 x g) in conische buizen van 50 ml.
OPMERKING: Alle incubaties uit het hiernamaals moeten worden uitgevoerd op buizen die horizontaal bij 20-30 °C beschermd tegen licht liggen. - Was het monster in 10 ml PBS (aangevuld met 0,05% natriumazide (NaN3) gedurende 3 uur (driemaal) bij kamertemperatuur (RT) met zacht schudden (5 x g).
OPMERKING: Weefsels kunnen worden ingevroren door te broeden in 10 ml van 30% sucrose in PBS met zacht schudden (5 x g) bij 4 ° C ON in conische buizen van 50 ml. Nadat weefsels naar de bodem van de buis zijn gezakt, plaatst u ze in de OCT-verbinding en houdt u ze op -80 °C. Ontdooi bij RT totdat de OCT-verbinding volledig smelt en was vervolgens in PBS (~ 10 ml / heel orgaan) ON op 4 ° C met zacht schudden (5 x g) in 50 ml conische buizen. Ga verder met stap 2.
2. Weefsel opruimen
OPMERKING: Alle weefselzuiveringen die in dit werk zijn uitgevoerd, zijn uitgevoerd met CUBIC-protocol I22. Drie verschillende cocktails werden gebruikt: CUBIC-P voor delipidatie en snelle ontkleuring tijdens perfusies, CUBIC-L voor delipidatie en ontkleuring en CUBIC-R voor RI-matching. DNA-kleuring en immunostainings werden uitgevoerd met respectievelijk CUBIC-HV 1 3D nucleaire kleuringskit en CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit (zie Materiaaltabel).
- Dompel individuele organen onder in 10 ml 50% met water verdunde CUBIC-L (zie materiaaltabel) met zacht schudden (5 x g) bij RT (ON) in conische buizen van 50 ml. Houd de buizen plat op de schudplaat.
OPMERKING: Om weefselschade te voorkomen, worden organen in dezelfde buis gehouden en worden oplossingen verzameld met behulp van een vacuümsysteem. Om CUBIC-L te bereiden, lost u 10% N-butyldiethanolamine en 10% Triton X-100 op in dubbel gedestilleerd water met behulp van de commerciële cocktails (zie Materiaaltabel).
LET OP: CUBIC-L veroorzaakt ernstig oogletsel. Draag oog- en gezichtsbescherming. Afvoeren naar een erkende afvalverwijderingsinstallatie. - Dompel het monster onder in 10 ml 100% CUBIC-L gedurende 6 dagen (ververs de oplossing op dag 3).
OPMERKING: Aan het einde van deze incubatieperiode moeten de weefsels bijna volledig transparant zijn. - Was de transparante organen met PBS (aangevuld met 0,05% NaN3) gedurende 2 uur (driemaal) bij 37 °C met zacht schudden (5 x g). Breng tissues over naar een nieuwe conische buis van 50 ml bij elke wasbeurt om Triton X-100 te verwijderen.
OPMERKING: Zoals beschreven in figuur 2B, als het doel van het experiment is om endogene tot expressie gebrachte reportereiwitten van transgene T. cruzi-parasieten of muizen (figuur 2C-F) te visualiseren, sla dan stap 3, 4 en 5 over en ga direct verder met stap 6.
3. DNA-kleuring
- Verdun de in de handel verkrijgbare nucleïnezuurkleurstof (zie materiaaltabel) in 5 ml kleuringsbuffer (inbegrepen in de kit) bij een verdunning van 1/2.500.
- Dompel weefsel onder in de nucleaire kleurstofoplossing en incubeer bij 37 °C met zachte rotatie gedurende 5 dagen met behulp van 15 ml conische buizen in een staande positie.
- Wassen met 15 ml 3D nucleaire vlekkenwasbuffer (inbegrepen in de kit) gedurende 2 uur (drie keer) op RT met zacht schudden (5 x g).
OPMERKING: Andere DNA-kleurstoffen kunnen worden gebruikt in deze concentraties en incubatietijden: DAPI (inbegrepen in de kit): 1/200, 5 dagen incubatie; BOBO-1: 1/400, 5 dagen incubatie; Propidium jodide (PI) (inbegrepen in de kit): 1/100, 3 dagen incubatie; RedDot2: 1/250, 3 dagen incubatie. Als het specifieke doel van het experiment is om zowel endogene tot expressie gebrachte reportereiwitten te visualiseren als nucleaire vlekken te gebruiken, sla dan stap 4 en 5 over en ga direct door naar stap 6.
4. Extracellulaire matrix (ECM) spijsvertering
OPMERKING: Hyaluronidase-vertering van de ECU moet worden uitgevoerd om de juiste penetratie van de antilichamen in diepe delen van de weefselste vergemakkelijken 28.
- Dompel individuele organen onder in 15 ml hyaluronidasereactiebuffer gedurende 2 uur bij 37 °C in een conische buis van 50 ml in vlakke positie beschermd tegen licht.
OPMERKING: Om hyaluronidasereactiebuffer te bereiden, lost u 10 mM CAPSO op; 150 mM natriumchloride (NaCl) en 0,05% NaN3 (zie materiaaltabel) in dubbel gedestilleerd water en stel de pH in op 10. - Bereid enzymoplossing door 75 μL van 20 mg/ml hyaluronidasebouillon te mengen in 425 μL hyaluronidasereactiebuffer. Om 20 mg/ml hyaluronidasebouillon te bereiden, lost u hyaluronidase op in 50 mM carbonaatbuffer, 150 mM NaCl, 0,01% BSA en 0,05% NaN3 (zie Materiaaltabel). Stel de pH in op 10 en aliquot in volumes van 77 μL bij -30 °C.
- Gooi de hyaluronidasereactiebuffer weg met behulp van een pipet en dompel het orgaan onder in de enzymoplossing (500 μL in een conische buis van 15 ml) in een staande positie beschermd tegen licht gedurende 24 uur bij 37 °C met zacht schudden (5 x g).
- Was het monster in 15 ml hyaluronidasewasbuffer in een conische buis van 50 ml in een horizontale positie beschermd tegen licht gedurende 2 uur (driemaal) bij 37 °C met zacht schudden (5 x g).
- Om hyaluronidasewasbuffer te bereiden, lost u 50 mM carbonaatbuffer, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 5% (v/v) Methanol en 0,05% NaN3 op. Stel de pH in op 10. Om 10x carbonaatbuffer-NaCl-bouillon te bereiden, lost u 2,96 g natriumcarbonaat, 1,86 g natriumwaterstofcarbonaat en 8,77 g NaCl op in 100 ml dubbel gedestilleerd water met 0,05% NaN3 (zie materiaaltabel) en stelt u de pH in op 10.
5. Immunostaining
- Label vasculatuur met anti-α-SMA (alfa-kleine spieractine, zie Tabel van materialen) antilichamen volgens de onderstaande stappen.
- Genereer primair plus geconjugeerd Fab fragment secundair antilichaam complex. Start deze reactie 1,5 uur voor de kleuringsprocedure.
- Bereken de vereiste hoeveelheid primaire en secundaire antilichamen (mix in een verhouding van 1:0,5 per gewicht).
OPMERKING: Voor het primaire anti-anti-α-SMA is 3,5 μg nodig om het hele hart of een fragment van de skeletspieren van vergelijkbare afmetingen te labelen. Voor 2,5 mg/ml product is 3,5/2,5 = 1,4 μl antilichaamoplossing nodig. Voor secundair antilichaam AlexaFluor 647 anti-muis Fab-fragment is 1,75 μg nodig om het hele hart of een fragment van de skeletspieren van vergelijkbare afmetingen te labelen. Voor 1,7 mg/ml product is 1,75/1,7 = 1 μL antilichaamoplossing nodig. - Meng primaire en secundaire antilichamen in een amberkleurige buis van 2 ml en incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 °C.
- Bereken de vereiste hoeveelheid primaire en secundaire antilichamen (mix in een verhouding van 1:0,5 per gewicht).
- Meng voor bufferuitwisseling 7,5 ml 2x HV1 3D immunostaining buffer (inbegrepen in de kit, zie Materiaaltabel) met 7,5 ml dubbel gedestilleerd water en dompel het weefselmonster gedurende 1,5 uur onder bij 32 °C met zacht schudden (5 x g) in een conische buis van 15 ml in een horizontale positie. Start deze reactie gelijktijdig met het genereren van antilichaamcomplex (1,5 uur voorafgaand aan de immunostainingprocedure).
- Genereer primair plus geconjugeerd Fab fragment secundair antilichaam complex. Start deze reactie 1,5 uur voor de kleuringsprocedure.
- Voer 3D-immunostaining uit volgens de onderstaande stappen.
- Bereid in een conische buis van 15 ml de antilichaamkleuringsoplossing volgens aanvullend dossier 1.
- Verzamel het weefselmonster uit de bufferuitwisselingsmedia (stap 5.1.2) en dompel het onder in de antilichaamkleuringsoplossing. Incubeer weefsels afzonderlijk gedurende 1 week bij 32 °C met zacht schudden (5 x g) van de buizen in een staande positie beschermd tegen licht. Sluit de buis af met paraffinefilm om verdamping te voorkomen.
- Ga naar 4 °C en incubeer ON in een staande positie.
- Koel 1x HV1 3D immunostaining wasbuffer (inbegrepen in de kit, zie Materiaaltabel) tot 4 °C en was het monster met 15 ml buffer (twee keer) gedurende 30 minuten bij 4 °C met zacht schudden (5 x g). Houd conische buizen van 15 ml in horizontale positie tot stap 5.2.7.
- Verdun formaline tot 1% in 1x HV1 3D immunostaining wasbuffer en dompel het monster onder in 8 ml van de oplossing gedurende 24 uur bij 4 °C met zacht schudden (5 x g).
- Incubeer in verse 1% formalineoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C met zacht schudden (5 x g).
- Wassen in 15 ml PBS gedurende 2 uur bij 25 °C met zacht schudden (5 x g).
- Boost tdTomato-signaal met behulp van anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antilichamen volgens de onderstaande stappen.
- Volg dezelfde incubatietijden en temperaturen als in stap 5.2.2. Bereken de hoeveelheid primaire en secundaire antilichamen (zie Materiaaltabel) en meng ze in een gewichtsverhouding van 1:0,5.
OPMERKING: Voor primaire anti-antilichaam anti-RFP is 5 μg nodig om het hele hart of een fragment van de skeletspieren van vergelijkbare afmetingen te labelen. Voor 1,25 mg/ml product is 5/1,25 = 4 μL van de oplossing vereist. Voor secundair antilichaam Alexa Fluor 647 anti-konijn Fab-fragment is 2,5 μg nodig om het hele hart of een fragment van de skeletspieren van vergelijkbare afmetingen te labelen. Voor 1,5 mg/ml product is 2,5/1,5 = 1,7 μl van de oplossing nodig. - Bereid de antilichaamkleuringsoplossing zoals vermeld in aanvullend dossier 1.
- Volg dezelfde incubatietijden en temperaturen als in stap 5.2.2. Bereken de hoeveelheid primaire en secundaire antilichamen (zie Materiaaltabel) en meng ze in een gewichtsverhouding van 1:0,5.
- Boost GFP-signalen met behulp van anti-GFP-nanobodies volgens de onderstaande stappen.
- Volg dezelfde incubatietijden en temperaturen als vermeld in stap 5.2.2.
OPMERKING: Anti-GFP nanobodies (zie Tabel van materialen) zijn geconjugeerd met Alexa Fluor 647, dus de antilichaamcomplexgeneratie is onnodig. - Bereid de antilichaamkleuringsoplossing zoals vermeld in aanvullend dossier 1.
- Volg dezelfde incubatietijden en temperaturen als vermeld in stap 5.2.2.
6. RI-matching
- Dompel transparante organen onder in 5 ml 50% met water verdunde CUBIC-R + oplossing (zie materiaaltabel) bij RT (ON) met zacht schudden (5 x g) in een conische buis van 50 ml. Houd buizen in een staande positie tijdens de gehele RI-matchingstap.
OPMERKING: Gerecyclede CUBIC R+ oplossingen uit eerdere experimenten kunnen in deze stap (tot vier keer) worden hergebruikt. Om CUBIC-R+ oplossing te bereiden, lost u 45% van 2,3-Dimethyl-1-fenyl-5-pyrazolon (Antipyrine), 30% van Nicotinamide of N-Methylnicotinamide en 0,5% van N-butyldiethanolamine op in dubbel gedestilleerd water of gebruikt u de commerciële CUBIC-R+ buffer (zie Materiaaltabel).
LET OP: CUBIC-R+ veroorzaakt huidirritatie, ernstige oogirritatie en schade aan organen. Draag beschermende handschoenen en zorg voor oog- en gezichtsbescherming. Adem geen stof, dampen, gas, nevel of dampen in. Afvoeren naar een erkende afvalverwijderingsinstallatie. - Vervang 50% CUBIC-R+ door 5 ml 100% CUBIC-R+ en incubeer met zacht schudden (5 x g) bij RT gedurende 2 dagen. Breng vervolgens de weefsels over op een stapel pluisvrije doekjes en draai de weefsels voorzichtig om CUBIC-R + -oplossing gedurende 5 minuten van de orgaanoppervlakken te verwijderen.
7. Montage
- Breng ze na het drogen van de weefsels over op 5 ml montageoplossing (RI = 1.520) (zie materiaaltabel) in een celkweekplaat met zes putten en incubeer ze (ON) bij RT. Draai de weefsels vaak om luchtbellen te elimineren, vooral op de oppervlakken van de organen.
OPMERKING: Organen kunnen meer dan 6 maanden worden bewaard in Mounting Solution of CUBIC-R +. - Hecht de weefsels aan de microscoopmonsterhouder met behulp van gellijm op basis van cyanoacrylaat.
- Dompel de monsters onder in het microscoopkwartscuvet gevuld met 120 ml montageoplossing en beeld ze dwars af op hun lengteas. Hecht het hart met de top en de aorta horizontaal uitgelijnd.
OPMERKING: Gewiste en gemonteerde organen kunnen worden doorsneden met een vibratoom en bij hoge vergroting worden afgebeeld door confocale microscopie. Inbedden van de organen in 2% agarose en gesneden secties van 100-500 μm. Organen kunnen ook handmatig worden doorsneden met een scherp mes om dikke weefselsecties te produceren (> 1000 μm). Plaats na het snijden de plakjes in petrischalen met glazen bodem van 35 mm, monteer ze met dezelfde montageoplossing, sluit ze af met nagellak en beeldt u af met een confocale microscoop.
8. Beeldacquisitie
- Breng de gemonteerde monsters in beeld met een lichtplaatmicroscoop (zie Materiaaltabel). Stel de vergroting en stapgrootte tussen afzonderlijke segmenten in op 3 μm en gebruik lasers met rechts en links licht met een dikte van 5 μm en een breedte van 100%. Stel de belichtingstijd constant in op 50-100 ms en pas het laservermogen aan van 10% tot 80%, afhankelijk van de intensiteit van het fluorescentiesignaal.
- Gebruik voor de co-detectie van tdTomato-tot expressie brengende parasieten en DiR-gekleurde slapende amastigoten (figuur 2C) respectievelijk rode (Ex/Em 561/620-660 nm) en infrarood (Ex/Em 785/845-55 nm) kanalen. Gebruik voor de co-detectie van T-cellen en tdTomato-tot expressie brengende parasieten in CD8 reporter mouse (Figuur 2D) respectievelijk groen (Ex/Em 488/525-50 nm) en rood kanaal.
- Gebruik voor de co-infecties (figuur 2E) en voor de co-detectie van parasieten die GFP tot expressie brengen in kernen reportermuizen (figuur 2F), respectievelijk de groene en rode kanalen. Gebruik voor de detectie van tdTomato-tot expressie brengende parasieten, nucleaire kleurstof en hartvaculatuur (figuur 3B, C) respectievelijk de rode, groene en verrode (Ex / Em 640 / 680-730 nm) kanalen.
- Detecteer anti-RFP-antilichamen met het verrode kanaal en anti-GFP-nanobodies met behulp van het groene kanaal (figuur 3D).
- Converteer de verkregen TIFF-beeldstapels en 3D reconstrueer de organen met behulp van Imaris v9.7.2-software (zie Materiaaltabel).
9. Oppervlaktereconstructie en kwantificering met Imaris-software
- Selecteer het algoritme voor oppervlaktedetectie en start de wizard in de beeldanalysesoftware.
- Voer een eerste analyse uit in een 3D-interessegebied (willekeurig geselecteerd) en pas deze vervolgens toe op de gehele 3D-orgaanreconstructie. Nadat u een interessante regio (ROI) hebt gekozen, selecteert u het kanaal dat u wilt analyseren, schakelt u de vloeiende knop uit en selecteert u aftrekken op de achtergrond.
OPMERKING: Achtergrondaftrek berekent een unieke lokale achtergrondwaarde voor elke voxel en trekt deze af van de oorspronkelijke pixelwaarde. De diameter van de grootste bol die in het object past, moet maximaal 200 μm zijn voor T. cruzi-geïnfecteerde cellen, 10 μm voor T-cellen en 5 μm voor individuele parasieten. - Gebruik het histogram om de classificatie aan te passen en de vervolgkeuzelijst filter om de metingen voor classificatie te selecteren.
OPMERKING: Gebruik het histogram om de classificatie aan te passen: ellipticiteit (oblaat) en sfericiteitsmetingen worden aanbevolen. - Voltooi de wizard, druk op de statistiekknop en haal het totale aantal met parasieten geïnfecteerde cellen of T-cellen op als het aantal losgekoppelde componenten per tijdspunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CUBIC vaste weefsels werden gewassen met PBS om fixatieven te verwijderen en vervolgens geïncubeerd met CUBIC-L cocktails, een basis gebufferde oplossing van aminoalcoholen die pigmenten en lipiden uit het weefsel extraheren, wat resulteert in verkleuring van weefsel met behoud van weefselarchitectuur. Rasterlijnen in het papier zijn te zien door de weefsels die wijzen op een geschikte opruiming van de organen (figuur 2A). Na delipidatie werden weefsels gewassen en ondergedompeld in CUBIC-R+ en montageoplossing voor ri-homogenisatie en beeldvorming (figuur 2B).
Een wild-type muis werd geïnfecteerd met tdTomato-expresserende trypomastigoten vooraf gekleurd met de DiR nabij-infrarode cyaninekleurstof. De muis werd 15 dagen na de infectie geëuthanaseerd en het intacte hart werd ontleed, gefixeerd en gewist. LSFM-beeldvorming en 3D-reconstructie stelden ons in staat om tdTomato-expresserende prolifererende T. cruzi-parasieten (rood) te visualiseren. Autofluorescentieniveaus in het rode kanaal kunnen worden gebruikt voor de juiste visualisatie van de hartstructuur en -randen (figuur 2C i). LSFM was ook nuttig voor het identificeren van resistente slapende vormen 7,8. Pre-infectiekleuring van parasieten met DiR-kleurstof maakt het mogelijk om slapende parasieten te volgen door de parasieten te visualiseren die de kleurstof niet hadden verdund door replicatie, zoals eerder gemeld voor CellTrace Violet7.
Slapende parasieten (cyaan) kunnen in het hart worden geïdentificeerd zoals afgebeeld in de 3D-vergrote inzetstukken (gele pijlen) (figuur 2C ii,iii). Z-projectiefluorescentie werd automatisch gesegmenteerd om een gereconstrueerd 3D-oppervlaktemodel te genereren voor ruimtelijke visualisatie en kwantificering van het totale aantal T. cruzi-geïnfecteerde cellen en slapende parasieten gedurende de gehele 3D-reconstructie (figuur 2A). Analyse van het 3D-oppervlaktemodel onthulde 186 T. cruzi-geïnfecteerde cellen met een hoger aandeel geïnfecteerde cellen in het hartatrium (123) in vergelijking met ventrikels (63) en 18 slapende parasieten in het hele hart (figuur 2C i). In een eerder rapport werd een vergelijkbare pijplijn gemeld om het aantal T. cruzi-geïnfecteerde cellen en slapende parasieten in geklaarde muizenweefsels na medicamenteuze behandeling te controleren31. Het is belangrijk op te merken dat de schattingen voor het aantal slapende parasieten waarschijnlijk een ondertelling zijn, omdat de kleurstofverdunningstechniek alleen detectie mogelijk maakt van parasieten die zich sinds de eerste infectie niet significant hebben gerepliceerd, maar niet die detecteren die later in de infectie slapend werden na meerdere delingsrondes.
Een vergelijkbare benadering werd gebruikt om de interactie tussen verschillende T. cruzi-stammen in interferon (IFN)-gamma-deficiënte muizen te monitoren. De productie van IFN-gamma door effector T-cellen is essentieel voor de immuuncontrole van T. cruzi. Bij IFN-gamma-deficiënte muizen prolifereren parasieten met minimale immuunbeperking, wat zeer hoge aantallen geïnfecteerde cellen in organen oplevert. Deze immunodeficiënte modellen zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van de werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen zonder de beperking opgelegd door immuunherkenning, en maken dus de detectie van parasietrecidieven na behandeling mogelijk. IFN-gamma deficiënte muizen werden gecomponfecteerd met tdTomato-expresserende Colombiana (rood) en GFP-expresserende Brazilië (blauwe) T. cruzi stammen. De muizen werden 17 dagen na de infectie geëuthanaseerd en de intacte harten werden ontleed, gefixeerd en opgeruimd. In dit immunodeficiënte model kunnen gastheercellen die zijn geïnfecteerd met beide T. cruzi-stammen worden waargenomen in verschillende stadia van parasietontwikkeling, waaronder grote, middelgrote en kleine geïnfecteerde cellen en recent gebarsten cellen. Het snijden door de weefsels toont overvloedige met parasieten geïnfecteerde cellen in de hartboezems op verschillende weefseldiepten (figuur 2E i-iii en film 1).
Een kruising van C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J en B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J muizen, waarbij alle T-cellen het groene fluorescerende eiwit ZsGreen1 tot expressie brengen, werden gebruikt om de rekrutering van T-cellen in T. cruzi geïnfecteerde weefsels te controleren. Muizen werden 14 dagen na infectie met tdTomato-tot expressie brengende parasieten geëuthanaseerd en skeletspieren werden weggesneden, gewist en afgebeeld door LSFM. ZsGreen1 tot expressie brengende T-cellen (blauw) en T. cruzi-geïnfecteerde cellen (rood) werden robuust gedetecteerd (figuur 2D i en film 2). 3D-zoom-ins van de 3D-reconstructie identificeerden T-cellen in het gebied van een geïnfecteerde cel (figuur 2D ii). Vibratome dikke delen (200-500 μm) van hetzelfde weefsel stellen ons in staat om de interface van T-cellen te visualiseren en geïnfecteerde cellen te hosten door confocale microscopie (figuur 2D iii).
Een alternatieve manier om ontstekingshaarden te monitoren is gebaseerd op celkernen accumulatie rond T. cruzi-geïnfecteerde cellen. Hiervoor werd een reportermuis gebruikt waarbij alle celkernen het fluorescerende tdTomato-eiwit tot expressie brengen. De nucleaire tdTomato-expressie (rood) werd na het opruimingsproces gemakkelijk gedetecteerd in de weefsels. Een nucleaire reportermuis werd geïnfecteerd met GFP-tot expressie brengende T. cruzi-parasieten (cyaan) en werd 35 dagen na infectie geëuthanaseerd en skeletspieren werden weggesneden, gewist en in beeld gebracht door LSFM (figuur 2F i-iii). Ingezoomde optische delen van de skeletspieren onthullen een verhoogde cellulariteit door rode kernen te accumuleren langs GFP-tot expressie brengende parasieten (figuur 2F ii). Vibratomesecties van hetzelfde weefsel bevestigen de eerder beschreven accumulatie van rode kernen langs GFP-tot expressie brengende parasieten door confocale microscopie (figuur 2F iii).
Het CUBIC-protocol werd ook aangepast voor immunostaining en DNA-etikettering van intacte, gewiste organen en weefsels die geïnfecteerd zijn met T. cruzi (figuur 3A). Muizen werden 40 dagen na infectie met tdTomato-tot expressie brengende parasieten geëuthanaseerd en de harten werden ontleed, gefixeerd en opgeruimd. Het intacte geklaarde hart werd gedurende 5 dagen gewassen en gekleurd met een groene DNA-marker, vervolgens opnieuw gewassen en gedurende 7 dagen immunostained met antilichamen tegen α-SMA. De monsters werden postfixeerd, gewassen, RI-gematcht en in beeld gebracht met LSFM. Gelijktijdige detectie van meerdere fluorescerende signalen, waaronder kernen, vasculatuur en T. cruzi-geïnfecteerde cellen, was mogelijk volgens dit protocol. α-SMA immunostaining (wit) presenteerde hoge signaalniveaus die de ingewikkelde vasculatuur van het hart onthulden (figuur 3B ii en film 3). Een optische sectie uit diepere hartgebieden toont de weefselpenetratie van α-SMA-antilichamen in de vastgestelde omstandigheden (figuur 3B v). DNA-kleuring (blauw) vertoonde ook een goede weefselpenetratie, fluorescentieniveaus en stabiele volumetrische kleuring. Sommige gebieden met intense DNA-labeling werden geïdentificeerd op verschillende hartlocaties (figuur 3B i) en rond skeletspiervezels (figuur 3C i en film 4). Een ingezoomde afbeelding van skeletspieren toonde een opeenhoping van blauwe kernen in gebieden met weinig of niet-detecteerbare tdTomato-parasieten, wat de rekrutering van immuuncellen suggereert op plaatsen van huidige of eerdere T. cruzi-infectie (figuur 3C ii). In andere gevallen hadden geïnfecteerde gastheercellen weinig tot geen bewijs van nabijgelegen cellulaire infiltraten (witte pijlen) (figuur 3C i). Vibratomesecties van hetzelfde weefsel als in figuur 3C ii tonen DNA-kleuring van cellen en tdTomato-tot expressie brengende parasieten door confocale microscopie (figuur 3C iii).
Eerdere experimenten hebben aangetoond dat slapende parasieten een lage of verwaarloosbare expressie van tdTomato- of GFP-reportereiwitten vertoonden (figuur 2C ii en iii). Om de detectie van deze fluorescerende eiwitten te verbeteren, werden geklaarde weefsels immunostained met anti-RFP- of -GFP-antilichamen. Intacte skeletspierweefsels van muizen die geïnfecteerd waren met parasieten die tdTomato of GFP tot expressie brachten, werden gefixeerd, geklaard en immunostained met antilichamen tegen RFP (RFP Booster ) (Figuur 3D) of nanobodies tegen GFP geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Figuur 3E), respectievelijk. De monsters werden postfixeerd, gewassen, RI-gematcht en in beeld gebracht met LSFM. In beide gevallen resulteerde de versterking van de GFP- en tdTomato-signalen door de antilichamen in sterke fluorescentie (figuur 3D ii en 3E ii). De immunostainings met behulp van stimulerende antilichamen vertegenwoordigen een veelzijdig hulpmiddel dat zal worden gebruikt om T. cruzi-slapende stoffen in geklaarde hele organen en weefsels te detecteren en elk ondervertegenwoordigd signaal van RFP- of GFP-rapportlideiwitten te detecteren.
Figuur 1: Naaldinbrenging tijdens transcardiale perfusie. (A) Een schematische weergave van de stappen die zijn uitgevoerd voordat de muis door het hart wordt toegediend en de juiste positie en richting van de perfusienaald in de linker ventrikel. Een kleine incisie in het rechter atrium werd uitgevoerd en er werd bloed afgenomen (1); een vlindernaald werd in de harttop ingebracht. Houd de richting zo aan dat de naald niet door het septum prikt (2). Het inlaatgat rond de naald werd afgedicht met lijm op basis van gel (3). De lever is gevuld met bloed en lijkt rood voor perfusie; na perfusie verliest het echter pigmentatie en wordt het bleek. RA, rechter oorschelp; LA, linker oorschelp; RV, rechter ventrikel; LV, linker ventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie van T. cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en ontstekingshaarden in gewiste organen. A) Schema van het hele orgaan T. cruzi-detectie van geïnfecteerde cellen met behulp van weefselzuivering, LSFM-beeldvorming en softwareondersteunde kwantificering in 3D-oppervlaktemodellen. (Ik) Bright-field beelden van het hart en de skeletspieren voor (links) en na (rechts) clearing (schaalbalk: 1000 μm). (Ii) Light-sheet fluorescentiemicroscoop. (Iii) IFN-gamma-deficiënte muis werd geïnfecteerd met 2 x 105 tdTomato-expresserende trypomastigoten. 17 dagen na de infectie werd het hart ontleed, CUBIC geklaard en LSFM in beeld gebracht (schaalbalk: 500 μm). (IvZ-projectie fluorescentie werd automatisch gesegmenteerd om een gereconstrueerd 3D-oppervlaktemodel te genereren voor ruimtelijke visualisatie en kwantificering van het aantal T. cruzi-geïnfecteerde cellen. Een totaal van 736 T. cruzi-geïnfecteerde cellen werden gedetecteerd in het hele hart (schaalbalk: 500 μm). (v) toont vergrotingen van het aangegeven volume in (Iv), waarbij cyaanobjecten worden voorgesteld T. cruzi-geïnfecteerde cellen (schaalbalk: 50 μm). (B) Protocol van CUBIC whole-organ clearing. (C) Visualisatie van woekerende en slapende T. cruzi parasieten in transparant muizenhart. (Ik) Een wild-type muis is geïnfecteerd met 2 x 105 tdTomato-expresserende trypomastigoten gekleurd met een DiR nabij-infrarode cyaninekleurstof. Het hart werd ontleed, opgeruimd en LSFM in beeld gebracht. tdTomato-expresserend prolifererend (rood) en slapend (cyaan) T. cruzi parasieten kunnen worden geïdentificeerd. Autofluorescentieniveaus werden gehandhaafd om een correcte visualisatie van de hartstructuur mogelijk te maken. Een muis werd 15 dagen na de infectie gedood op basis van de piek van met parasieten geïnfecteerde cellen en slapende amastigoten die in eerdere werken werden aangetroffen (schaalbalk: 400 μm). (Ii) en iii) vergrotingen van het aangegeven volume weergeven in (Ik), waarbij gele pijlen slapende parasieten (cyaan) aangeven (schaalbalk: 200 μm). (D) Detectie van T-cel rekrutering in geïnfecteerde CD8 reporter muis. (Ik) Reporter muis was geïnfecteerd met 2 x 105 tdTomato-expresserende trypomastigoten en skeletspieren werden ontleed, gewist en LSFM in beeld gebracht 14 dagen na infectie, een tijdstip waarop substantiële celreacties worden gedetecteerd. ZsGreen1 drukt T-cellen (blauw) en T. cruzi-geïnfecteerde cellen (rood) werden gevisualiseerd (schaalbalk: 400 μm) (zie ook Film 2). (Ii) toont vergrotingen van het aangegeven volume in (Ik) (schaalbalk: 50 μm). (Iii) toont de accumulatie van T-cellen rond een T. cruzi-geïnfecteerde cel in een weefselsectie (200 μm) van hetzelfde orgaan (schaalbalk: 8 μm). (E) Interactie tussen verschillende T. cruzi Stammen. (Ik) IFN-gamma deficiënte muizen werden gecocomponeerd met 2 x 105 tdTomato-expressing Colombiana (rood) en GFP-expressing Brazilië (blauw) T. cruzi Stammen. De muizen werden geëuthanaseerd en de intacte harten werden 17 dagen na de infectie ontleed, gefixeerd en opgeruimd (schaalbalk: 400 μm). (Ii) toont vergrotingen van het aangegeven volume in (Ik) (schaalbalk: 250 μm). (Iii) toont een vergrote optische sectie die cellen onthult die zijn geïnfecteerd met Colombiana (rood) en Brazilië (blauw) T. cruzi stammen (schaalbalk: 150 μm). (FVisualisatie van cellulariteit langs geïnfecteerde cellen met behulp van kernen reporter muis. (Ik) Een nucleaire reportermuis was geïnfecteerd met 2 x 105 GFP-expresserende trypomastigoten en skeletspieren werden ontleed, gewist en LSFM afgebeeld 35 dagen na infectie. Nucleaire tdTomato-expressie van de gastheercellen (rood), evenals GFP-parasietexpressie (cyaan), werden gedetecteerd (schaalbalk: 400 μm). (Ii) toont een vergrote optische sectie die accumulatie van rode kernen langs GFP-tot expressie brengende parasieten onthult (schaalbalk: 90 μm). (Iii) bevestigt verhoogde cellulariteit door confocale beeldvorming van weefselsecties van hetzelfde orgaan (schaalbalk: 8 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Labeling van gewiste T. cruzi-geïnfecteerde organen met antilichamen en nuclearstains. (A) CUBIC-protocol voor weefselzuivering, 3D-immunostaining en DNA-etikettering van hele organen. (B) Etikettering van muizenhart voor vasculatuur en DNA-detectie (zie ook Film 3). (i-iii) Een wild-type muis werd geïnfecteerd met 2 x 105 tdTomato-tot expressie brengende parasieten. De muis werd 40 dagen na infectie geëuthanaseerd en het hart werd ontleed, gefixeerd en gewist. Het geklaarde hart werd gelabeld met een DNA-marker en immunoskleurd met antilichamen tegen α-SMA. Gelijktijdige detectie van celkernen (blauw), vasculatuur (wit) en T. cruzi-geïnfecteerde cellen (rood) waren mogelijk. De muis werd gedood op dit moment na de infectie wanneer weefsel en speciale vasculatuurremodellering kunnen worden beoordeeld (schaalbalk: 400 μm). (iv) toont een vergroot volume van diepe hartgebieden van (iii) met celkernen, vasculatuur en geïnfecteerde cellen (schaalbalk: 90 μm). v) een optische sectie van (iii) weergeeft (schaalbalk: 90 μm). (C) Verhoogde cellulariteit gevisualiseerd door DNA-labeling van de hele geklaarde skeletspieren. (i) Skeletspierweefsel van het vorige experiment was DNA-gekleurd, onthullende gebieden met intense nucleaire etikettering (blauw) en T. cruzi-geïnfecteerde cellen (rood) (schaalbalk: 200 μm) (zie ook film 4). (ii) onthult een intense accumulatie van blauwe kernen in gebieden met een lagere tot geen detectie van tdTomato-parasiet (schaalbalk: 100 μm). (iii) hoge vergroting (60x) confocale beeldvorming identificeert DNA-etikettering van cellen en parasieten in weefselsecties (schaalbalk: 10 μm). (D) Het stimuleren van tdTomato parasiet reporter markers in het geheel gewiste skeletspieren. (i-iii) Intacte skeletspierweefsels van muizen die geïnfecteerd waren met 2 x 105 parasieten die tdTomato tot expressie brachten, werden gefixeerd, geklaard en immunoskleurd met antilichamen tegen RFP (RFP Booster). Een intens en uniform fluorescerend signaal werd verkregen in het verrode kanaal na RFP-versterking (groen) van het tdTomato-signaal (rood) (schaalbalk: 100 μm). (E) Stimuleren van GFP parasiet reporter markers met behulp van anti-GFP nanobodies. (i-iii) Skeletspierweefsels van muizen die geïnfecteerd waren met 2 x 105 parasieten die GFP tot expressie brachten, werden gefixeerd, geklaard en immunostained met Alexa Fluor 647-geconjugeerde nanobodies tegen GFP (GFP Booster). Een sterk fluorescerend signaal werd verkregen in het verrode kanaal na GFP-boosting (magenta) van de GFP-fluorescentie (cyaan). Muizen van (D) en (E) werden 30 dagen na infectie gedood omdat parasietbelastingen op dit tijdstip een piek bereiken en met parasieten geïnfecteerde cellen gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd in skeletspieren (schaalbalk: 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: T. cruzi infectie van het hart en de skeletspieren bij IFN-gamma deficiënte muizen. 3D-reconstructies van CUBIC-geklaarde weefsels van IFN-gamma-deficiënte muizen gecollofecteerd met 2 x 105 tdTomato-expresserende Colombiana (rood) en GFP-expresserende Brazilië (blauw) T. cruzi stammen op dag 17 na infectie. In totaal werden 1151 afzonderlijke plakjes van het hart en 559 van de skeletspier verkregen via LSFM. Vergelijkbare beeldvormingsresultaten werden bereikt bij drie onafhankelijke dieren. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 2: Detectie van T-cel rekrutering in T. cruzi-geïnfecteerde CD8 reporter muis. 3D-visualisatie van een CUBIC-geklaarde skeletspier van een CD8-reportermuis geïnfecteerd met 2 x 105 Tdtomato-expresserende Colombiana T. cruzi-stam (rood) en gedood op 14 dagen na infectie. Een totaal van 668 individuele plakjes van de skeletspieren werden in beeld gebracht door LSFM. ZsGreen1 tot expressie brengende T-cellen (blauw) en T. cruzi-geïnfecteerde cellen (rood) werden gevisualiseerd. Vergelijkbare beeldvormingsresultaten werden bereikt bij twee dieren. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 3: Immunodetectie van vasculatuur in T. cruzi-geïnfecteerd en geklaard hart. 3D-reconstructie van een CUBIC-geklaard hart van wild-type muizen geïnfecteerd met 2 x 105 tdTomato-expresserende Colombiana T. cruzi en immunoskleurd met antilichamen tegen α-SMA (blauw) 40 dagen na infectie. Snijden door het hart onthult de ingewikkelde vasculatuur van het hart en de weefselpenetratie van de α-SMA-antilichamen. Met parasieten geïnfecteerde cellen kunnen worden waargenomen als felrode vlekken in de hartboezems (rood, rechts). Vergelijkbare beeldvormingsresultaten werden bereikt bij twee dieren. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 4: Dna-kleuring vanhele organen onthult gebieden met een verhoogde cellulariteit. 3D-reconstructie van de CUBIC-geklaarde skeletspier van wild-type muis 40 dagen na infectie geïnfecteerd met 2 x 105 tTomato-expresserende Colombiana T. cruzi stam. Het hele quadriceps spiergebied was gekleurd met een groene nucleaire kleurstof. T. cruzi-geïnfecteerde cellen (rood) en de kernen van elke cel in het weefsel (blauw) werden gevisualiseerd. Zoom-ins van de 3D-reconstructie onthult accumulatie van blauwe kernen langs gebieden met weinig of geen detectie van tdTomato-parasieten. Vergelijkbare beeldvormingsresultaten werden bereikt bij twee dieren. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Samenstelling van de antilichaamkleuringsoplossingen die in het onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De afwezigheid van uitgebreide beeldvorming van het hele orgaan van parasieten en de immuunrespons beperkt het begrip van de complexiteit van de gastheer-parasietinteracties en belemmert de evaluatie van therapieën voor de ziekte van Chagas. De huidige studie heeft de CUBIC-pijplijn aangenomen om intacte organen en weefsels van T. cruzi-geïnfecteerde muizen te verduidelijken en te kleuren.
In deze studie werden meerdere weefselzuiveringsprotocollen getest (PACT32, ECi33, FLASH34, iDISCO11,26 en fDISCO13); alleen CUBIC bewaarde echter hoge niveaus van tdTomato- of GFP-parasietfluorescentie. Evenzo toonden eerdere rapporten het CUBIC-behoud van endogene expressie markers in vergelijking met andere weefselzuiveringsbenaderingen35.
Beperkte resolutiecapaciteit is een van de huidige kanttekeningen bij conventionele lichtplaatmicroscopie. Dit is duidelijk in de moeilijkheden bij het oplossen van individuele parasieten in zwaar geïnfecteerde cellen (figuur 2C). De nieuw ontwikkelde tegellichtplaatmicroscopen met een verbeterd resolutievermogen en de aanpassing van weefselexpansietechnieken zouden dit probleem kunnen oplossen36.
Onzuiverheden uit de wasbuffers, opruimoplossingen of andere organen kunnen neerslaan in het weefsel en niet-specifieke signalen produceren die kunnen worden aangezien voor met parasieten geïnfecteerde cellen, individuele parasieten of andere structuren. Deze artefacten fluoresceren echter meestal helder in meerdere kanalen, dus na beeldanalyse kunnen ze gemakkelijk worden weggegooid uit geautomatiseerde telling door weefsels in een alternatief kanaal (meestal het groene kanaal) af te beelden. Objecten met dubbele kleuren werden beschouwd als artefacten en uitgesloten voor geautomatiseerde kwantificering.
Nucleaire vlekken DAPI, PI, RedDot2 en SYTOX-G, vertonen goede niveaus van weefselpenetratie en signaalintensiteiten in de meeste CUBIC-geklaarde organen; de groene DNA-kleurstof liet echter de beste prestaties zien (figuur 3B, C en film 4)."
Deze resultaten toonden aan dat T. cruzi-geïnfecteerde cellen gemakkelijk konden worden gedetecteerd en nauwkeurig gekwantificeerd, terwijl tegelijkertijd T-cel- of kernenrapportagemuizensignalen werden geïdentificeerd. Het belangrijkste is dat LSFM zeldzame biologische gebeurtenissen detecteerde, zoals DiR-positieve slapende amastigoten, binnen een complexe weefselomgeving met het potentiële vermogen om het uit te breiden naar epitoop immunostaining en DNA-etikettering. Huidige studies onderzoeken ook het nut van deze benaderingen voor het monitoren van de activering van immuuneffectorcellen, de interacties tussen meerdere parasietstammen in dezelfde gastheer en de inductie van weefselschade en -herstel bij de ziekte van Chagas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
We danken Dr. Etsuo Susaki voor hun waardevolle hulp en aanbevelingen met betrekking tot weefselzuivering en immunostaining protocollen. Ook zijn we M. Kandasamy van de CTEGD Biomedical Microscopy Core dankbaar voor technische ondersteuning met behulp van LSFM en confocale beeldvorming. We bedanken ook alle leden van Tarleton Research Group voor nuttige suggesties tijdens dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
