Summary
本プロトコルは、無傷で除去された臓器および組織における増殖および休眠中の トリパノソーマクルジ 寄生虫およびT細胞を視覚化および正確に定量するためのライトシート蛍光顕微鏡法および自動化されたソフトウェア支援方法について説明しています。これらの手法は、治療結果を評価するための信頼できる方法を提供し、寄生虫と宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供します。
Abstract
シャーガス病は、ラテンアメリカを中心に世界中の何百万人もの人々に影響を与える無視された病理です。シャーガス病剤である トリパノソーマ クルジ(T.クルジ)は、ヒトを含むいくつかの哺乳類種に感染し、心臓および消化器系の病状を引き起こす多様な生物学を持つ絶対性細胞内寄生虫です。 T. cruziのin vivo 感染の信頼性の高い検出は、シャーガス病の複雑な生物学を理解し、治療レジメンの結果を正確に評価するために長い間必要とされてきました。現在のプロトコルは、3D再構築されたクリアされた臓器における T.cruzi感染細胞の自動定量のための統合パイプラインを示しています。ライトシート蛍光顕微鏡法は、臓器または組織全体において活発に増殖および休眠している T. cruzi 寄生虫および免疫エフェクター細胞を正確に視覚化および定量することを可能にする。また、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るためのCUBIC-HistoVisionパイプラインも採用されました。組織クリアリングと3D免疫染色を組み合わせることで、薬物治療プロトコルを包括的に評価し、 T. cruzi感染組織の細胞組織の理解を深めるための公平なアプローチを提供し、シャーガス病における抗T.クルジ 免疫応答、組織損傷、および修復に関連する発見を進めることが期待されます。
Introduction
原虫寄生虫T. cruziによって引き起こされるシャーガス病は、世界で最も無視されている熱帯病の1つであり、年間約13,000人が死亡しています。感染症はしばしば急性期から慢性期に進行し、不整脈、心不全、突然死などの患者の30%に心臓病を引き起こします1,2。急性期に寄生虫に対して強い宿主免疫応答が誘発されるにもかかわらず、少数の寄生虫は、心臓や骨格筋などの組織で宿主の生涯を通じて慢性的に存続します。適応免疫応答の開始遅延および寄生虫の非複製型の存在を含むいくつかの要因は、免疫系による完全な排除を回避するT. cruziの能力に寄与する可能性がある3,4,5,6。さらに、寄生虫の非複製休眠型は、トリパノシド薬に対する低い感受性を示し、多くの場合に観察される治療の失敗に部分的に関与している可能性があります7,8。
新しいイメージング技術の開発は、感染した組織における寄生虫の空間分布と、それらの制御に関与する免疫細胞との関係についての洞察を得る機会を提供します。これらの特性は、免疫系による寄生虫制御のプロセスをよりよく理解し、慢性組織に存在するまれな休眠中の寄生虫を追跡するために重要です。
ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、薄切片なしで大きな組織や臓器を3Dイメージングするための最も包括的で偏りのない方法の1つです。ライトシート顕微鏡は、薄い光シートを利用して、焦点面内の蛍光色素のみを励起し、サンプルの光退色と光毒性を低減し、超高速カメラを使用して数千の組織層の画像を記録します。組織へのレーザー光の適切な浸透に必要な高レベルの組織透明性は、組織の脱脂質化および脱色に続く屈折率(RI)を均質化することによって得られ、光の散乱を低減し、高品質の画像をレンダリングする9,10,11。
組織クリアリングアプローチは、マウス全体12、13、14、オルガノイド15、16、17、レポーター蛍光マーカー18、19、20、21、22、23、および最近では限られた数のヒト組織のイメージングのために開発されています24.現在の組織透明化の方法は、(1)DISCOプロトコル25,26などの有機溶媒ベースの方法、(2)CLARITY27などのヒドロゲルベースの方法、およびCUBICなどの水性方法(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)18,19,28,29の3つのファミリーに分類されます。.CUBICプロトコルは、臓器の形状と組織の完全性を維持し、内因的に発現したレポータータンパク質の蛍光を維持します。この技術の最新のアップデートであるCUBIC-HistoVision(CUBIC-HV)では、蛍光タグ付き抗体とDNA標識を使用したエピトープの検出も可能です28。
本プロトコルでは、清澄化された無傷のマウス組織において蛍光タンパク質を発現 するT. cruzi を検出するためのCUBICパイプラインを使用した。光学的に透明な組織をLSFM画像化し、3D再構成し、 臓器あたりのT. cruzi 感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の正確な総数を自動的に定量化しました。また、このプロトコルは、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るために首尾よく採用された。これらのアプローチは、感染した宿主における T. cruzi の増殖と制御を理解するために不可欠であり、シャーガス病の化学療法および免疫治療薬を完全に評価するのに役立ちます。
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Protocol
この研究は、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび実験動物ケア認定ガイドラインの評価と認定のための協会に厳密に従って実施されました。動物使用プロトコル(マウスにおける T.クルジ 感染の制御-A2021 04-011-Y1-A0)は、ジョージア大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdトマト)Hze/J、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdトマト)Hze/JおよびC57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/Jマウス(雌、生後1-2ヶ月)を本試験に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1.感染、灌流、解剖
- コロンビアーナ(DTU TcI)またはブラジル(DTU TcV) T.cruzi 株の組織培養由来トリポマスティゴテスをそれぞれtdTomatoまたはGFP蛍光タンパク質を発現するマウスを腹腔内感染させる。感染量は、100 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈された50,000〜200,000のトリポマスティゴテの範囲である可能性があります。
注:レポーター寄生虫の生成と感染のマウスモデルに関する具体的な詳細は、Canavaciらで入手できます。29 およびブスタマンテら30。 - 3〜7 L / minの流速で二酸化炭素吸入によってマウスを安楽死させます。動物がペダル反射を示さなくなったらすぐに、腹部から胸骨に向かって皮膚を通して縦方向の切開を行います。次に、腹部から体壁を切り取り、胸骨が持ち上げられて心臓が露出するまで、胸郭の両側の肋骨を通り続けます。
- 図1に示すように、心臓の右耳介を2.5 mm切開し、 1 mLのマイクロピペットチップを使用して排血血液を採取します。
- 蝶の針(灌流システムの一端に接続)を上行大動脈に達するまで左心室の頂点に挿入します。ゲルベースの接着剤( 材料表を参照)を使用して、針の周りの入口穴を密閉し、灌流中に針を所定の位置に維持します。
- マウス30に50 mLの冷たいヘパリン-PBS(pH 7.4、10 U / mLのヘパリン)を灌流するか、マウスから収集トレイに向かって出てくる液体が血液がなくなるまで灌流します。
- PBS中の50 mLの冷4%(w / v)パラホルムアルデヒド(PFA)(pH 7.4)で灌流します。
注:PFA組織固定は、特にエピトープ構造の維持とその後の免疫検出にとって、プロトコルの重要なステップの1つである可能性があります。PFAは時間の経過とともに劣化するため、新たに準備する必要があります。溶液のpHは、組織の透明化不良につながる可能性のある過剰固定を避けるためにも重要です。
注意: PFAは皮膚接触によって中程度の毒性があります。急性曝露はまた、鼻、目、喉を非常に刺激します。空気や皮膚の低レベルに長期間さらされると、皮膚炎やかゆみなどの皮膚の炎症、および喘息のような呼吸器系の問題を引き起こす可能性があります。顔と目の保護具を着用し、ほこり、ガス、ミスト、煙、または蒸気を吸い込まないでください。- PFA灌流後、マウスに100 mLのCUBIC-Pバッファーを灌流し、ステップ1.5で述べた清澄化レベルに到達します。
- CUBIC-Pバッファーを調製するには、10%N-ブチルジエタノールアミン、5%Triton X-100、および5%1-N-メチルイミダゾールを二重蒸留水に溶解するか、市販のカクテルを使用します(材料表を参照)。
メモ: ステップ 1.6.1.-1.6.2.心臓や腎臓などの高度に色素沈着した臓器は、透明度を高めるために事前のクリアステップが必要なため、のみ推奨されます。CUBIC-Pを使用した後、臓器を解剖し、ステップ2:組織の透明化に直接進みます。
- 画像化する組織サンプル/臓器30 を解剖し、50 mLコニカルチューブで穏やかに振とう(5 x g以下)しながら、PBS(~10 mL /臓器全体)中の4%(w / v)PFAに4°Cで一晩(ON)後固定します。
注:それ以降のすべてのインキュベーションは、光から保護された20〜30°Cで水平に置かれたチューブで実行する必要があります。 - サンプルを10 mLのPBS(0.05%アジ化ナトリウム(NaN 3)を添加した)で、室温(RT)で穏やかに振とう(5 x g)しながら3時間(3回)洗浄します。
注:組織は、50 mLコニカルチューブで4°Cで穏やかに振とう(5 x g)しながら、PBS中の10 mLの30%スクロースでインキュベートすることにより凍結できます。組織がチューブの底に沈んだ後、それらをOCTコンパウンドに埋め込み、-80°Cに保ちます。 OCTコンパウンドが完全に溶けるまでRTで解凍し、50 mLコニカルチューブで穏やかに振とう(5 x g)しながら、4°CでPBS(~10 mL/臓器全体)で洗浄します。手順 2 に進みます。
2.組織のクリアリング
注:この作業で行われたすべての組織クリアリングは、CUBICプロトコルI22を使用して行われました。3種類のカクテルを使用しました:灌流中の脱脂と急速な脱色のためのCUBIC-P、脱脂と脱色のためのCUBIC-L、RIマッチングのためのCUBIC-R。DNA染色および免疫染色は、それぞれCUBIC-HV 1 3D核染色キットおよびCUBIC-HV 1 3D免疫染色キットを用いて行った( 材料表参照)。
- 個々の臓器を10 mLの50%水で希釈したCUBIC-L( 材料の表を参照)に浸し、50 mLのコニカルチューブのRT(ON)で穏やかに振とう(5 x g)します。.チューブを振とうプレート上で平らに保ちます。
注:組織の損傷を避けるために、臓器は同じチューブ内に維持され、溶液は真空システムを使用して収集されます。CUBIC-Lを調製するには、市販のカクテルを使用して、10%N-ブチルジエタノールアミンと10%Triton X-100を二重蒸留水に溶解します( 材料の表を参照)。
注意: CUBIC-Lは深刻な眼の損傷を引き起こします。目と顔の保護具を着用してください。承認された廃棄物処理プラントに廃棄してください。 - サンプルを100%CUBIC-Lの10mLに6日間浸します(3日目に溶液をリフレッシュします)。
注:この潜伏期間の終わりには、組織はほぼ完全に透明でなければなりません。 - 透明な臓器をPBS(0.05%NaN 3を添加したもの)で、穏やかに振とうしながら37°Cで2時間(3回)洗浄します(5 x g)。洗浄するたびに組織を新しい50 mLコニカルチューブに移し、Triton X-100を除去します。
注:図2Bに記載されているように、実験の目的がトランスジェニックT. cruzi寄生虫またはマウスからの内因性発現レポータータンパク質を視覚化することである場合(図2C-F)、手順3、4、および5をスキップして、手順6に直接進みます。
3. DNA染色
- 市販の核酸色素( 材料表参照)を5 mLの染色バッファー(キットに含まれています)で1/2,500希釈で希釈します。
- 組織を核色素溶液に浸し、静置姿勢で15 mLのコニカルチューブを使用して、37°Cで穏やかに回転させて5日間インキュベートします。
- 15 mLの3D核染色洗浄バッファー(キットに含まれています)で、穏やかに振とうしながらRTで2時間(3回)洗浄します(5 x g)。
注:他のDNA色素は、これらの濃度とインキュベーション時間で使用できます:DAPI(キットに含まれています):1/200、5日間のインキュベーション。BOBO-1:1/400、5日間のインキュベーション;ヨウ化プロピジウム(PI)(キットに含まれています):1/100、3日間のインキュベーション;RedDot2:1/250、3日間のインキュベーション。実験の具体的な目的が内因性発現レポータータンパク質の両方を視覚化し、核染色を使用することである場合は、手順4と5をスキップして、手順6に直接進んでください。
4.細胞外マトリックス(ECM)消化
注:ECMのヒアルロニダーゼ消化は、組織の深部領域への抗体の適切な浸透を促進するために行わなければならない28。
- 個々の臓器を15 mLのヒアルロニダーゼ反応バッファーに37°Cで2時間浸し、光から保護された平らな位置にある50 mLコニカルチューブに入れます。
注:ヒアルロニダーゼ反応バッファーを調製するには、10 mMのCAPSOを溶解します。150 mMの塩化ナトリウム(NaCl)、および0.05%のNaN3 ( 材料の表を参照)を二重蒸留水中に入れ、pHを10に調整します。 - 75 μLの20 mg/mLのヒアルロニダーゼストックを425 μLのヒアルロニダーゼ反応バッファーに混合して酵素溶液を調製します。20 mg/mLのヒアルロニダーゼストックを調製するには、ヒアルロニダーゼを50 mMの炭酸塩バッファー、150 mMのNaCl、0.01%のBSA、および0.05%のNaN3 に溶解します( 材料の表を参照)。pHを10に調整し、-30°Cで77 μLの容量で分注します。
- ピペットを使用してヒアルロニダーゼ反応バッファーを捨て、酵素溶液(15 mLコニカルチューブに500 μL)に臓器を浸し、光から保護された静置姿勢で37°Cで24時間穏やかに振とうします(5 x g)。
- 50 mLコニカルチューブ内の15 mLのヒアルロニダーゼ洗浄バッファーでサンプルを、光から保護された水平位置で37°Cで穏やかに振とう(5 x g)しながら2時間(3回)洗浄します。
- ヒアルロニダーゼ洗浄バッファーを調製するには、50 mMの炭酸塩バッファー、150 mMのNaCl、0.1%(v / v)のトリトンX-100、5%(v / v)のメタノール、および0.05%NaN3を溶解します。pHを10に調整します。10x炭酸塩バッファー-NaClストックを調製するには、2.96 gの炭酸ナトリウム、1.86 gの炭酸水素ナトリウム、および8.77 gのNaClを0.05%NaN3 を含む100 mLの二重蒸留水に溶解し( 材料の表を参照)、pHを10に調整します。
5.免疫染色
- 以下の手順に従って抗α-SMA(α-小筋アクチン、 材料の表を参照)抗体を使用して血管系を標識します。
- 一次プラスコンジュゲートFabフラグメント二次抗体複合体を生成する。染色手順の1.5時間前にこの反応を開始します。
- 一次抗体と二次抗体の必要量を計算します(重量比で1:0.5で混合します)。
注:一次抗体抗α-SMAの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋の断片を標識するには3.5μgが必要です。2.5 mg/mL 製品の場合、3.5/2.5 = 1.4 μL の抗体溶液が必要です。二次抗体AlexaFluor 647抗マウスFabフラグメントの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋フラグメントを標識するために1.75 μgが必要です。1.7 mg/mL 製品の場合、1.75/1.7 = 1 μL の抗体溶液が必要です。 - 一次抗体と二次抗体をアンバー色の 2 mL チューブで混合し、37 °C で 1.5 時間インキュベートします。
- 一次抗体と二次抗体の必要量を計算します(重量比で1:0.5で混合します)。
- バッファー交換のために、7.5 mLの2x HV1 3D免疫染色バッファー(キットに含まれています、 材料表を参照)を7.5 mLの二重蒸留水と混合し、組織サンプルを15 mLのコニカルチューブに水平位置で穏やかに振とう(5 x g)しながら32°Cで1.5時間浸します。抗体複合体の生成と同時にこの反応を開始します(免疫染色手順の1.5時間前)。
- 一次プラスコンジュゲートFabフラグメント二次抗体複合体を生成する。染色手順の1.5時間前にこの反応を開始します。
- 以下の手順に従って3D免疫染色を行います。
- 15 mLコニカルチューブで、 以下の補足ファイル1の抗体染色液を調製します。
- バッファー交換培地から組織サンプルを採取し(ステップ5.1.2)、抗体染色液に浸します。組織を個別に32°Cで1週間インキュベートし、チューブを軽く振とう(5 x g)し、光から保護された静置位置でインキュベートします。蒸発を避けるために、チューブをパラフィンフィルムで密封します。
- 4°Cに移動し、静置姿勢でONをインキュベートします。
- 1x HV1 3D免疫染色洗浄バッファー(キットに含まれています、 材料表を参照)を4°Cに冷却し、サンプルを15 mLバッファー(2回)で4°Cで30分間、穏やかに振とう(5 x g)します。ステップ5.2.7まで、15mLのコニカルチューブを水平位置に保ちます。
- ホルマリンを1x HV1 3D免疫染色洗浄バッファーで1%に希釈し、サンプルを8 mLの溶液に穏やかに振とうしながら4°Cで24時間浸漬します(5 x g)。
- 新鮮な1%ホルマリン溶液中で、穏やかに振とうしながら37°Cで1時間インキュベートします(5 x g)。
- 15 mLのPBSで25°Cで2時間、穏やかに振とう(5 x g)洗浄します。
- 以下の手順に従って、抗赤色蛍光タンパク質(RFP)抗体を使用してtdTomatoシグナルをブーストします。
- ステップ5.2.2と同じインキュベーション時間と温度に従ってください。一次抗体と二次抗体の量を計算し( 材料表を参照)、重量比で1:0.5で混合します。
注:一次抗体抗RFPの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋の断片を標識するために5μgが必要です。1.25 mg/mL の製品の場合、5/1.25 = 4 μL の溶液が必要です。二次抗体Alexa Fluor 647抗ウサギFabフラグメントの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋フラグメントを標識するには2.5 μgが必要です。1.5 mg/mL 製品の場合、2.5/1.5 = 1.7 μL の溶液が必要です。 - 補足ファイル1に記載されているように抗体染色液を調製します。
- ステップ5.2.2と同じインキュベーション時間と温度に従ってください。一次抗体と二次抗体の量を計算し( 材料表を参照)、重量比で1:0.5で混合します。
- 以下の手順に従って、抗GFPナノボディを使用してGFPシグナルをブーストします。
- ステップ5.2.2で説明したのと同じインキュベーション時間と温度に従ってください。
注:抗GFPナノボディ( 材料の表を参照)はAlexa Fluor 647と結合しているため、抗体複合体の生成は不要です。 - 補足ファイル1に記載されているように抗体染色液を調製します。
- ステップ5.2.2で説明したのと同じインキュベーション時間と温度に従ってください。
6. RIマッチング
- 透明な臓器を5 mLの50%水で希釈したCUBIC-R +溶液( 材料の表を参照)にRT(ON)に浸し、50 mLのコニカルチューブに軽く振とう(5 x g)します。RIマッチングステップ全体を通して、チューブを立位に保ちます。
注:以前の実験からのリサイクルCUBIC R +溶液は、このステップで再利用できます(最大4回)。CUBIC-R+溶液を調製するには、45%の2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン(アンチピリン)、30%のニコチンアミドまたはN-メチルニコチンアミド、および0.5%のN-ブチルジエタノールアミンを二重蒸留水に溶解するか、市販のCUBIC-R+バッファーを使用します( 材料の表を参照)。
注意: CUBIC-R +は、皮膚の炎症、深刻な目の炎症、および臓器の損傷を引き起こします。保護手袋を着用し、目と顔の保護を確保してください。ほこり、煙、ガス、ミスト、または蒸気を吸い込まないでください。承認された廃棄物処理プラントに処分してください。 - 50%キュービックR+を5 mLの100%キュービックR+に置き換え、RTで2日間穏やかに振とう(5 x g)しながらインキュベートします。次に、組織を糸くずの出ないワイプのスタックに移し、組織を注意深く回転させて、臓器表面からCUBIC-R +溶液を5分間除去します。
7.取り付け
- 組織を乾燥させた後、6ウェル細胞培養プレート中の5 mLのマウント溶液(RI = 1.520)( 材料の表を参照)に移し、RTでインキュベートします(ON)。 特に臓器の表面の気泡を除去するために、組織を頻繁に回転させます。
注意: 臓器は、マウントソリューションまたはCUBIC-R +で6か月以上保存できます。 - シアノアクリレートベースのゲル接着剤を使用して、組織を顕微鏡サンプルホルダーに接着します。
- 120 mLのマウント溶液で満たされた顕微鏡石英キュベットにサンプルを浸し、縦軸に対して横方向に画像化します。頂点と大動脈を水平に揃えて心臓を接着します。
注:透明化およびマウントされた臓器は、ビブラトームで切片化し、共焦点顕微鏡によって高倍率で画像化することができます。臓器を2%アガロースに埋め込み、100〜500μmの切片を切断します。臓器は、鋭利な刃で手動で切片化して、厚い組織切片(>1000μm)を作成することもできます。切片化後、スライスをガラス底の35 mmペトリ皿に入れ、同じ取り付け液を使用してマウントし、マニキュアで密封し、共焦点顕微鏡で画像化します。
8. 画像取得
- マウントされたサンプルをライトシート顕微鏡で画像化します( 材料表を参照)。個々のスライス間の倍率とステップサイズを3μmに設定し、厚さ5μm、幅100%の左右のライトシートレーザーを使用します。露光時間を50〜100ミリ秒に設定し、蛍光信号強度に応じてレーザー出力を10%から80%に調整します。
- tdトマト発現寄生虫とDiR染色休眠アマスティゴテス(図2C)の共検出には、それぞれ赤(Ex/Em 561/620-660 nm)と赤外線(Ex/Em 785/845-55 nm)チャネルを使用します。CD8レポーターマウスにおけるT細胞とtdTomato発現寄生虫の共検出には(図2D)、それぞれ緑(Ex/Em 488/525-50 nm)と赤チャネルを使用します。
- 重感染アッセイ(図2E)、および核レポーターマウスにおけるGFPを発現する寄生虫の共検出(図2F)には、それぞれ緑と赤のチャネルを使用します。tdトマト発現寄生虫、核色素、および心臓血管系の検出(図3B、C)には、それぞれ赤、緑、遠赤(Ex/Em 640/680-730 nm)チャネルを使用します。
- 遠赤色チャネルで抗RFP抗体を検出し、緑チャネルを使用して抗GFPナノボディを検出します(図3D)。
- 取得したTIFF画像スタックを変換し、Imaris v9.7.2ソフトウェアを使用して臓器を3D再構築します( 材料表を参照)。
9. Imarisソフトウェアによる表面再構成と定量化
- 表面検出アルゴリズムツールを選択し、画像解析ソフトウェアでウィザードを開始します。
- 3D関心領域(ランダムに選択)で初期分析を実行し、それを3D臓器再建全体に適用します。 関心領域(ROI)を選択したら、分析する チャネル を選択し、 スムーズボタンのチェックを外して、 バックグラウンド減算を選択します。
注: バックグラウンド サブトラクションは、ボクセルごとに一意のローカル バックグラウンド値を計算し、元のピクセル値からこれを減算します。対象物に収まる最大の球体の直径は、 T. cruzi感染細胞では最大200μm、T細胞では10μm、個々の寄生虫では5μmまででなければなりません。 - ヒストグラムを使用して分類を調整し、フィルター ドロップダウン リストを使用して分類する測定値を選択します。
注:ヒストグラムを使用して分類を調整します:楕円率(扁平)と真球度の測定をお勧めします。 - ウィザードを終了し、 統計 ボタンを押して、寄生虫感染細胞またはT細胞の総数を、時点ごとの切断されたコンポーネントの数として取得します。
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Representative Results
CUBIC固定組織をPBSで洗浄して固定液を除去した後、組織から色素と脂質を抽出するアミノアルコールの基本的な緩衝溶液であるCUBIC-Lカクテルと一緒にインキュベートし、組織構造を維持しながら組織の脱色を行いました。紙のグリッド線は、臓器の適切な透明化を示す組織を通して見ることができます(図2A)。脱脂質化後、組織を洗浄し、それぞれCUBIC-R+およびRIホモジナイゼーションおよびイメージング用のマウント溶液に浸漬した(図2B)。
野生型マウスに、DiR近赤外シアニン色素で予め染色したtdTomato発現トリポマスティゴテスを感染させた。マウスは感染の15日後に安楽死させ、無傷の心臓を解剖し、固定し、クリアしました。LSFMイメージングと3D再構成により、tdトマトを発現する増殖するT. cruzi寄生虫(赤)を可視化することができました。赤チャンネルの自己蛍光レベルは、心臓の構造とエッジの正しい視覚化に使用できます(図2C i)。LSFMは、薬剤耐性休眠形態の同定にも有用であった7,8。DiR色素による寄生虫の感染前染色は、CellTrace Violet7で以前に報告されているように、複製によって色素を希釈しなかった寄生虫を視覚化することにより、休眠中の寄生虫の追跡を可能にします。
休眠中の寄生虫(シアン)は、3D拡大挿入図(黄色の矢印)に示されているように心臓で識別できます (図2C ii、iii)。Z投影蛍光を自動的にセグメント化して、3D再構成全体を通して T. cruzi感染細胞と休眠寄生虫の総数を空間的に視覚化および定量化するための再構築された3D表面モデルを生成しました (図2A)。 3D表面モデルの解析により、心臓心房の感染細胞の割合が高い186個の T. cruzi感染細胞(123個)と、心室(63個)と比較して心臓全体の休眠中の寄生虫が18個ある ことが明らかになりました(図2C i)。以前の報告では、薬物処理後の清澄化されたマウス組織における T.cruzi感染細胞および休眠中の寄生虫の数を監視するための同様のパイプラインが報告されました31。色素希釈技術では、最初の感染以来有意に複製されていない寄生虫のみを検出できますが、複数回の分割後に感染の後半に休眠状態になった寄生虫は検出されないため、休眠中の寄生虫の数の推定値は過小評価されている可能性が高いことに注意することが重要です。
同様のアプローチを使用して、インターフェロン(IFN)-ガンマ欠損マウスにおける異なるT.cruzi株間の相互作用を監視しました。エフェクターT細胞によるIFN-γの産生は、T. cruziの免疫制御に不可欠です。IFN-γ欠損マウスでは、寄生虫は最小限の免疫制限で増殖し、臓器に非常に多くの感染細胞をもたらします。これらの免疫不全モデルは、免疫認識による制約を受けることなく新薬の有効性を研究するための有用なツールであり、したがって、治療後の寄生虫の再発の検出を可能にします。IFN-γ欠損マウスは、tdトマト発現コロンビアーナ(赤)およびGFP発現ブラジル(青)T.クルジ株に同時感染させた。マウスは感染の17日後に安楽死させ、無傷の心臓を解剖し、固定し、そして除去した。この免疫不全モデルでは、両方のT. cruzi株に感染した宿主細胞は、大、中、小の感染細胞や最近破裂した感染細胞など、寄生虫の発生のさまざまな段階で観察できます。組織をスライスすると、さまざまな組織の深さで心臓心房に豊富な寄生虫感染細胞が見られます(図2EI-iiiおよび動画1)。
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/Jおよび B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウスの交配種で、すべてのT細胞が緑色蛍光タンパク質ZsGreen1を発現し、T . cruzi 感染組織におけるT細胞動員をモニターした。マウスをtdTomato発現寄生虫の感染から14日後に安楽死させ、骨格筋を切除し、クリアし、LSFMで画像化した。ZsGreen1発現T細胞(青)およびT.cruzi感染細胞(赤)が頑健に検出された (図2D i および 動画2 )。 3D再構成の3Dズームインにより、感染細胞の領域内のT細胞が同定されました (図2D ii)。 同じ組織のビブラトームの厚さの切片(200〜500 μm)により、共焦点顕微鏡でT細胞と宿主感染細胞の界面を視覚化できます (図2D iii)。
炎症病巣を監視する別の方法は、T. cruzi感染細胞の周りの細胞核蓄積に基づいています。すべての細胞核が蛍光tdTomatoタンパク質を発現するレポーターマウスをこの目的のために使用した。核tdTomatoの発現(赤)は、透明化プロセス後の組織で容易に検出されました。核レポーターマウスにGFP発現T. cruzi寄生虫(シアン)を感染させ、感染後35日目に安楽死させ、骨格筋を切除し、除去し、LSFMで画像化した(図2F i-iii)。 骨格筋のズーム光学切片は、GFP発現寄生虫に沿って赤い核を蓄積することによって細胞性の増加を明らかにします(図2F ii)。同じ組織のビブラトーム切片は、共焦点顕微鏡によってGFP発現寄生虫に沿った前述の赤色核の蓄積を確認します(図2F iii)。
CUBICプロトコルは、T. cruziに感染した無傷で除去された臓器および組織の免疫染色およびDNA標識にも適合しました(図3A)。マウスをtdTomato発現寄生虫感染の40日後に安楽死させ、心臓を解剖し、固定し、クリアした。無傷の透明化した心臓を洗浄し、緑色のDNAマーカーで5日間染色し、次いで再度洗浄し、α-SMAに対する抗体で7日間免疫染色した。サンプルは、ポストフィックス、洗浄、RIマッチング、およびLSFMによる画像化されました。このプロトコルに従って、核、血管系、およびT.cruzi感染細胞を含む複数の蛍光シグナルの同時検出が可能でした。α-SMA免疫染色(白色)は、心臓の複雑な血管系を明らかにする高いシグナルレベルを示しました(図3B iiおよび動画3)。 より深い心臓領域からの光学切片は、確立された条件におけるα-SMA抗体の組織浸透を示しています(図3B v)。 DNA染色(青色)も良好な組織浸透性、蛍光レベル、および安定した体積染色を示しました。DNA標識が強い領域は、異なる心臓位置(図3B i)および骨格筋線維周辺(図3C iおよび動画4)で同定されました。骨格筋のズーム画像は、tdTomato寄生虫がほとんどまたは検出できない領域に青い核の蓄積を示し、現在または以前のT. cruzi感染部位での免疫細胞の動員を示唆しています(図3C ii)。他のケースでは、感染した宿主細胞は、近くの細胞浸潤の証拠をほとんどまたはまったく持っていませんでした(白い矢印)(図3C i)。図3Cと同じ組織のビブラトーム切片iiは、共焦点顕微鏡による細胞およびtdTomato発現寄生虫のDNA染色を示す(図3C iii)。
以前の実験では、休眠中の寄生虫がtdTomatoまたはGFPレポータータンパク質の発現が低いか無視できることが示されています(図2C iiおよびiii)。これらの蛍光タンパク質の検出を改善するために、透明化した組織を抗RFPまたは-GFP抗体で免疫染色した。tdTomatoまたはGFPを発現する寄生虫に感染したマウスの無傷の骨格筋組織を固定し、清澄化し、RFPに対する抗体(RFPブースター)(図3D)またはAlexa Fluor 647(GFPブースター)と結合させたGFPに対するナノボディ(図3E)で免疫染色しました。 サンプルは、ポストフィックス、洗浄、RIマッチング、およびLSFMによる画像化されました。どちらの場合も、抗体によるGFPおよびtdTomatoシグナルのブーストは強い蛍光をもたらしました(図3D iiおよび3E ii)。ブースティング抗体を使用した免疫染色は、清澄化された全臓器および組織中のT. cruzi休眠を検出し、RFPまたはGFPファミリーメンバーのレポータータンパク質からの過小評価されたシグナルを検出するために使用される汎用性の高いツールです。
図1:経心臓灌流時の針挿入。(A) マウスを心臓に灌流する前に実行されるステップと、左心室における灌流針の正しい位置と方向を示す概略図。右心房を小切開し,採血した(1)。蝶の針が心臓の頂点に挿入されました。針がセプタム(2)を貫通しないように方向を維持します。針の周りの入口孔は、ゲルベースの接着剤(3)を用いて密封した。肝臓は血液で満たされ、灌流前に赤く見えます。しかし、灌流後、色素沈着を失い、青白くなります。RA、右耳介;LA、左耳介;RV、右心室;LV、左心室。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: T. cruzi感染細胞、休眠中のアマスティゴート、および除去された臓器の炎症病巣の可視化。(ア) 全臓器のスキーム T. cruzi-3D表面モデルでの組織透明化、LSFMイメージング、およびソフトウェア支援定量を使用した感染細胞検出。(私)クリアリング前(左)とクリア後(右)の心臓と骨格筋の明視野画像(スケールバー:1000μm)。(2)ライトシート蛍光顕微鏡。(三)IFN-γ欠損マウスを2 x 10に感染させた5 tdトマト発現トリポマチゴテス。感染後17日目に、心臓を解剖し、CUBICをクリアし、LSFMを画像化しました(スケールバー:500 μm)。(四)Z投影蛍光を自動的にセグメント化して、空間的な視覚化と数の定量化のために再構築された3D表面モデルを生成しました。 T. cruzi-感染細胞。の合計 736 T. cruzi・心臓全体で感染細胞が検出された(スケールバー:500μm)。(v)は、(四)、シアンのオブジェクトは T. cruzi-感染細胞(スケールバー:50μm)。(B)CUBIC全臓器クリアリングのプロトコル。(C) 増殖・休眠の可視化 T. cruzi 透明なマウスの心臓の寄生虫。(私)野生型マウスを2×10に感染させた5 tdトマト発現トリポマスティゴテスをDiR近赤外シアニン色素で染色。心臓を解剖し、クリアし、LSFMを画像化しました。tdトマト発現増殖(赤)および休眠(シアン) T. cruzi 寄生虫を特定することができます。心臓構造の正しい視覚化を可能にするために、自己蛍光レベルが維持されました。マウスは、以前の研究で見つかった寄生虫感染細胞と休眠中のアマスティゴテスのピークに基づいて、感染後15日目に殺されました(スケールバー:400μm)。(2) および (ウ) 示された体積の倍率を(私)、黄色の矢印は休眠中の寄生虫(シアン)を示します(スケールバー:200μm)。(D)感染したCD8レポーターマウスにおけるT細胞動員の検出。(私)レポーターマウスは2 x 10に感染しました5 tdトマトを発現するトリポマスティゴート、および骨格筋を解剖し、除去し、LSFMを感染後14日、つまり実質的な細胞応答が検出された時点に画像化した。T細胞を発現するZsGreen1(青色)および T. cruzi-感染細胞(赤)を可視化(スケールバー:400μm)(参照) 動画2).(2)は、(私(スケールバー:50μm)。(三)は、周囲のT細胞の蓄積を示しています。 T. cruzi-同じ臓器の組織切片(200μm)の感染細胞(スケールバー:8μm)。(E) 異種間の相互作用 T. cruzi 株。(私)IFN-γ欠損マウスを2 x 10に同時感染させた5 tdトマトを表現したコロンビアーナ(赤)とGFPを表現したブラジル(青) T. cruzi 株。マウスを安楽死させ、感染後17日目に無傷の心臓を解剖し、固定し、透明化した(スケールバー:400μm)。(2)は、(私(スケールバー:250μm)。(三)は、コロンビアーナ(赤)とブラジル(青)に感染した細胞を明らかにする拡大光学切片を示しています。 T. cruzi ひずみ(スケールバー:150μm)。(F)核レポーターマウスを用いた感染細胞に沿った細胞性の可視化。(私)核レポーターマウスが2 x 10に感染しました5 GFP発現トリポマスティゴート、および骨格筋を解剖し、除去し、感染後35日目にLSFMを画像化した。宿主細胞の核tdTomato発現(赤色)およびGFP寄生虫発現(シアン)が検出された(スケールバー:400μm)。(2)は、GFP発現寄生虫(スケールバー:90μm)に沿った赤色核の蓄積を明らかにする拡大光学切片を示す。(三)は、同じ臓器からの組織切片の共焦点イメージング(スケールバー:8μm)によって細胞性の増加を確認します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:透明化されたT. cruzi感染臓器の抗体と核染色による標識。 (A)組織透明化、3D免疫染色、および臓器全体のDNA標識のためのCUBICプロトコル。(B)血管系およびDNA検出のためのマウス心臓の標識(動画3も参照)。(I-III)野生型マウスを2 x 105 tdトマト発現寄生虫に感染させた。マウスは感染後40日目に安楽死させ、心臓を解剖し、固定し、クリアしました。透明化した心臓をDNAマーカーで標識し、α-SMAに対する抗体で免疫染色した。細胞核(青)、血管系(白)、T.cruzi感染細胞(赤)の同時検出が可能であった。マウスは、組織および特別な血管系のリモデリングを評価できる感染後のこの時点で殺されました(スケールバー:400μm)。(iv)は、細胞核、血管系、および感染細胞を描いた(スケールバー:90μm)の(iii)の心臓深部領域からの拡大体積を示す。(v)は、(iii)で得られた光学切片(スケールバー:90μm)を描いたものである。(C)クリアされた骨格筋全体のDNA標識によって視覚化された細胞性の増加。(i)前回の実験の骨格筋組織をDNA染色し、核標識の強い領域(青)とT.cruzi感染細胞(赤)(スケールバー:200μm)を明らかにしました(動画4も参照)。(ii)は、tdTomato寄生虫の検出が低いかまったくない領域に青色核の強い蓄積を明らかにします(スケールバー:100μm)。(iii)高倍率(60倍)共焦点イメージングは、組織切片の細胞および寄生虫のDNA標識を識別します(スケールバー:10μm)。(D)クリアされた骨格筋全体におけるtdTomato寄生虫レポーターマーカーのブースト。(I-III)tdTomatoを発現する2 x 105寄生虫に感染したマウスからの無傷の骨格筋組織を固定し、清澄化し、RFPに対する抗体(RFPブースター)で免疫染色した。tdTomatoシグナル(赤)のRFPブースト(緑)後、遠赤色チャネルで強烈で均一な蛍光シグナルが得られました(スケールバー:100 μm)。(E)抗GFPナノボディを用いたGFP寄生虫レポーターマーカーのブースト。(I-III)GFPを発現する2 x 105寄生虫に感染したマウスの骨格筋組織を固定し、清澄化し、GFPに対するAlexa Fluor 647結合ナノボディ(GFPブースター)で免疫染色しました。GFP蛍光(シアン)のGFPブースティング(マゼンタ)後の遠赤色チャネルで強い蛍光シグナルが得られた。(D)および(E)のマウスは、この時点で寄生虫負荷がピークに達し、骨格筋(スケールバー:100μm)で寄生虫感染細胞が容易に検出できるため、感染後30日目に殺傷した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
動画1: IFN-γ欠損マウスにおける心臓と骨格筋のT. cruzi感染。感染後17日目に、2 x 105 tdトマト発現コロンビアーナ(赤)およびGFP発現ブラジル(青)T.クルジ株に同時感染したIFN-γ欠損マウスのCUBIC清澄化組織の3D再構成。心臓の合計1151の個々のスライスと骨格筋の559がLSFMを介して取得されました。同等の画像化結果が3匹の独立した動物で達成された。この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:T. cruzi感染CD8レポーターマウス におけるT細胞動員の検出。2 x 105 Tdトマト発現コロンビアナT.クルジ株(赤)に感染し、感染後14日目に死亡したCD8レポーターマウスのCUBIC清澄化骨格筋の3D視覚化。骨格筋の合計668個の個々のスライスがLSFMによって画像化された。T細胞(青)およびT.クルジ感染細胞(赤)を発現するZsGreen1を可視化した。同等の画像化結果が2匹の動物で達成された。この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画3:T. cruzi感染およびクリアド心臓 における血管系の免疫検出。感染後40日目に2 x 105 tdトマト発現コロンビアナT. cruziに感染し、α-SMA(青)に対する抗体で免疫染色された野生型マウスのCUBIC清澄化心臓の3D再構成。心臓をスライスすると、心臓の複雑な血管系とα-SMA抗体の組織浸透が明らかになります。寄生虫に感染した細胞は、心房の真っ赤な斑点として観察できました(赤、右)。同等の画像化結果が2匹の動物で達成された。この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画4:全臓器DNA染色により、細胞性が増加した領域が明らかになります。 2 x 105 tdトマト発現コロンビアーナ T.クルジ 株に感染した野生型マウスの感染後40日目のCUBIC清澄化骨格筋の3D再構成。大腿四頭筋領域全体を緑色の核染料で染色した。 T. cruzi感染細胞(赤)と組織中のすべての細胞の核(青)を可視化した。3D再構成のズームインは、tdTomato寄生虫の検出がほとんどまたはまったくない領域に沿って青い核の蓄積を明らかにします。同等の画像化結果が2匹の動物で達成された。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:研究に使用した抗体染色液の組成。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
寄生虫と免疫応答の広範な全臓器イメージングの欠如は、宿主と寄生虫の相互作用の複雑さの理解を制限し、シャーガス病の治療法の評価を妨げます。本研究では、 C. cruzi感染マウスの無傷の臓器および組織を清澄化および染色するためにCUBICパイプラインを採用しました。
この研究では、複数の組織クリアリングプロトコルがテストされました(PACT32、ECi 33、FLASH34、iDISCO11、26、およびfDISCO13)。しかし、CUBICのみが高レベルのtdTomatoまたはGFP寄生虫蛍光を維持しました。同様に、以前の報告では、他の組織透明化アプローチと比較して、内因的に発現されたマーカーのCUBIC保存が示されました35。
限られた分解能容量は、従来のライトシート顕微鏡の現在の注意点の1つです。これは、重度に感染した細胞における個々の寄生虫を分解することの難しさにおいて明らかである(図2C)。分解能を向上させ、組織拡張技術を適応させた新開発のタイリングライトシート顕微鏡は、この問題を解決する可能性があります36。
洗浄バッファー、透明化溶液、または他の臓器からの不純物が組織内に沈殿し、寄生虫感染細胞、個々の寄生虫、または他の構造と間違われる可能性のある非特異的シグナルを生成する可能性があります。ただし、これらのアーティファクトは通常、複数のチャネルで明るく蛍光を発するため、画像分析後、代替チャネル(通常は緑色チャネル)で組織をイメージングすることにより、自動カウントから簡単に破棄できます。ダブルカラーオブジェクトはアーティファクトと見なされ、自動定量化から除外されました。
核染色DAPI、PI、RedDot2、およびSYTOX-Gは、ほとんどのCUBICクリアされた臓器で良好なレベルの組織浸透と信号強度を示します。ただし、緑色のDNA色素が最高の性能を示しました(図3B、C、および動画4)。
これらの結果は、 T. cruzi感染細胞が容易に検出され、正確に定量されると同時に、T細胞または核レポーターマウスのシグナルを同定できることを示した。最も重要なことは、LSFMは、複雑な組織環境内でDiR陽性休眠中無鞭毛虫などのまれな生物学的事象を検出し、それをエピトープ免疫染色およびDNA標識に拡大する可能性があることです。現在の研究では、免疫エフェクター細胞の活性化、同じ宿主内の複数の寄生虫株間の相互作用、およびシャーガス病における組織損傷と修復の誘導を監視するためのこれらのアプローチの有用性も調査されています。
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Disclosures
著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
須崎悦夫博士の組織透明化および免疫染色プロトコルに関する貴重な支援と推奨事項に感謝します。また、LSFMと共焦点イメージングを使用した技術サポートを提供してくれたCTEGD生物医学顕微鏡コアのM.カンダサミーに感謝しています。また、この研究を通して有益な提案をしてくれたタールトン研究グループのすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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