Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה תלת-ממדית כמותית של תאים נגועים בטריפנוסומה קרוזי, אמסטיגוטים רדומים ותאי T באיברים מבהירים שלמים

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63919
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור ושיטות אוטומטיות בסיוע תוכנה כדי להמחיש ולכמת במדויק טפילי טריפנוזומה קרוזי ותאי T מתרבים ורדומים באיברים ורקמות שלמים ומנוקים. טכניקות אלה מספקות דרך אמינה להעריך את תוצאות הטיפול ומציעות תובנות חדשות על אינטראקציות בין טפיל לפונדקאי.

Abstract

מחלת צ'אגאס היא פתולוגיה מוזנחת המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם, בעיקר באמריקה הלטינית. סוכן מחלת צ'אגאס, טריפנוסומה קרוזי (T. cruzi), הוא טפיל תוך תאי חובה עם ביולוגיה מגוונת שמדביקה כמה מיני יונקים, כולל בני אדם, וגורמת לפתולוגיות לב ועיכול. זיהוי אמין של זיהומים מסוג T. cruzi in vivo נחוץ זה מכבר כדי להבין את הביולוגיה המורכבת של מחלת צ'אגאס ולהעריך במדויק את התוצאות של משטרי טיפול. הפרוטוקול הנוכחי מדגים צינור משולב לכימות אוטומטי של תאים נגועים ב-T. cruzi באיברים משוחזרים ומסולקים בתלת-ממד. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מאפשרת הדמיה וכימות מדויקים של טפילי T. cruzi פעילים ורדומים ותאי השפעה חיסונית באיברים או רקמות שלמות. כמו כן, צינור CUBIC-HistoVision כדי לקבל תיוג אחיד של איברים מנוקים עם נוגדנים וכתמים גרעיניים אומץ בהצלחה. ניקוי רקמות בשילוב עם אימונוסטינינג תלת-ממדי מספק גישה בלתי משוחדת להערכה מקיפה של פרוטוקולי טיפול תרופתיים, משפר את הבנת הארגון התאי של רקמות נגועות ב-T. cruzi, וצפוי לקדם תגליות הקשורות לאנטי-T. תגובות חיסוניות של קרוזי , נזק לרקמות ותיקון במחלת צ'אגאס.

Introduction

מחלת צ'אגאס, הנגרמת על ידי הטפיל הפרוטוזואני T. cruzi, היא בין המחלות הטרופיות המוזנחות ביותר בעולם, וגורמת לכ-13,000 מקרי מוות בשנה. הזיהום מתקדם לעתים קרובות משלב אקוטי לכרוני ומייצר פתולוגיה לבבית אצל 30% מהחולים, כולל הפרעות קצב, אי ספיקת לב ומוות פתאומי 1,2. למרות התגובה החיסונית החזקה של הפונדקאי המתעוררת נגד הטפיל בשלב החריף, מספר נמוך של טפילים נמשך באופן כרוני לאורך כל חייו של הפונדקאי ברקמות כמו הלב ושרירי השלד. מספר גורמים, כולל התפרצות מאוחרת של תגובות חיסוניות נרכשות ונוכחות של צורות לא משוכפלות של הטפיל, עשויים לתרום ליכולת של T. cruzi למנוע חיסול מוחלט על ידי מערכת החיסון 3,4,5,6. יתר על כן, צורות רדומות שאינן משתכפלות של הטפיל מציגות רגישות נמוכה לתרופות טריפנוצידליות ועשויות להיות אחראיות בחלקן לכישלון הטיפול שנצפה במקרים רבים 7,8.

פיתוח טכניקות הדמיה חדשות מספק הזדמנות לקבל תובנה לגבי ההתפלגות המרחבית של הטפילים ברקמות הנגועות והקשר שלהם עם תאי החיסון המעורבים בשליטה שלהם. מאפיינים אלה חיוניים להבנה טובה יותר של תהליכי הדברת הטפילים על ידי מערכת החיסון ולמעקב אחר הטפילים הרדומים הנדירים הנמצאים ברקמות כרוניות.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM) היא אחת השיטות המקיפות והבלתי משוחדות ביותר להדמיה תלת-ממדית של רקמות או איברים גדולים ללא חתך דק. מיקרוסקופים בעלי יריעות אור מנצלים יריעה דקה של אור רק כדי לעורר את הפלואורופורים במישור המוקד, להפחית את הפוטו-לבניה והפוטוטוקסיות של דגימות, ולהקליט תמונות של אלפי שכבות רקמה באמצעות מצלמות אולטרה-מהירות. הרמה הגבוהה של שקיפות הרקמה הדרושה לחדירה נכונה של אור הלייזר לרקמות מתקבלת על ידי הומוגניזציה של מקדם השבירה (RI) לאחר דליפיזציה ודה-צביעה של הרקמות, מה שמפחית את פיזור האור ומעניק תמונות באיכות גבוהה ל-9,10,11.

גישות לניקוי רקמות פותחו להדמיה של עכברים שלמים 12,13,14, אורגנואידים 15,16,17, איברים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים מדווחים 18,19,20,21,22,23, ולאחרונה מספר מוגבל של רקמות אנושיות 24 . השיטות הנוכחיות לניקוי רקמות מסווגות לשלוש משפחות: (1) שיטות מבוססות ממסים אורגניים כגון פרוטוקולי DISCO 25,26, (2) שיטות מבוססות הידרוג'ל, כגון CLARITY27, ושיטות מימיות, כגון CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף וניתוח חישובי)18,19,28,29 . פרוטוקולים מעוקבים שומרים על צורת האיברים ושלמות הרקמות, ושומרים על הפלואורסצנטיות של חלבוני דיווח המבוטאים באופן אנדוגני. העדכון האחרון של טכניקה זו, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), מאפשר גם זיהוי של אפיטופים באמצעות נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים ותיוג DNA28.

בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בצינור CUBIC לאיתור T. cruzi המבטא חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות עכבר שלמות שהובהרו. רקמות שקופות אופטית צולמו על ידי LSFM, שוחזרו בתלת-ממד, והמספר הכולל המדויק של תאים נגועים ב-T. cruzi , אמסטיגוטים רדומים ותאי T לכל איבר כומתו באופן אוטומטי. כמו כן, פרוטוקול זה אומץ בהצלחה כדי לקבל תיוג אחיד של איברים מנוקים עם נוגדנים וכתמים גרעיניים. גישות אלה חיוניות להבנת ההתרחבות והבקרה של T. cruzi בפונדקאים נגועים והן שימושיות להערכה מלאה של טיפולים כימותרפיים ואימונו-תרפויטיים למחלת צ'אגאס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם קפדנית למדיניות שירות בריאות הציבור בנושא טיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה והאגודה להערכה והסמכה של הנחיות הסמכה לטיפול בחיות מעבדה. פרוטוקול השימוש בבעלי חיים (שליטה בזיהום T. cruzi בעכברים-A2021 04-011-Y1-A0) אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ורג'יה. ב6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J ו-C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J עכברים (נקבה,1-2 חודשים) שימשו במחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. זיהום, זלוף ונתיחה

  1. מדביקים באופן תוך-צפקי עכברים בטריפומסטיגוטים שמקורם בתרבית רקמה של קולומביאנה (DTU TcI) או ברזיל (DTU TcV) זן T. cruzi המבטא חלבונים פלואורסצנטיים מסוג tdTomato או GFP, בהתאמה. מינון הזיהום יכול לנוע בין 50,000 ל-200,000 טריפומסטיגוטים מדוללים ב-100 μL של 1x תמיסת מלח עם פוספט (PBS).
    הערה: פרטים ספציפיים על הדור של טפילים מדווחים ומודלים עכברים של זיהום זמינים ב- Canavaci et al. 29 ובוסטמנטה ואח'.
  2. הרדמת העכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני בקצב זרימה של 3-7 ליטר לדקה. ברגע שהחיות מפסיקות להראות רפלקס דוושה, בצעו חתך אורכי דרך העור מהבטן לכיוון עצם החזה. לאחר מכן חותכים את קיר הגוף מהבטן וממשיכים דרך הצלעות בכל צד של בית החזה עד שניתן להרים את עצם החזה, לחשוף את הלב.
  3. כפי שמתואר באיור 1, בצעו חתך של 2.5 מ"מ באאוריקל הימני של הלב ואספו את הדם המתנקז באמצעות קצה מיקרופיפטה של 1 מ"ל.
  4. מחדירים מחט פרפר (המחוברת לקצה אחד של מערכת הזליפה) לתוך קצה החדר השמאלי עד שהיא מגיעה לאבי העורקים העולה. השתמשו בדבק על בסיס ג'ל (ראו טבלת חומרים) כדי לאטום את חור הכניסה סביב המחט ולשמור על המחט במקומה במהלך הזליפים.
  5. יש לפזר את העכברים 30 עם 50 מ"ל של הפרין-PBS קר (pH 7.4,10 U/mL של הפרין) או עד שהנוזל שיוצא מהעכבר לכיוון מגש האיסוף נקי מדם.
  6. עם 50 מ"ל של קור 4% (w/v) פרפורמלדהיד (PFA) (pH 7.4) ב-PBS.
    הערה: קיבוע רקמות PFA הוא ככל הנראה אחד השלבים הקריטיים של הפרוטוקול, במיוחד לשמירה על מבני אפיטופ ועל זיהוי חיסוני לאחר מכן. PFA מתכלה עם הזמן, ולכן זה חייב להיות מוכן טרי. ה- pH של התמיסה חשוב גם כדי למנוע קיבוע יתר, אשר עלול להוביל לניקוי לקוי של רקמות.
    אזהרה: PFA רעיל במידה בינונית על ידי מגע עם העור. חשיפה חריפה גם מגרה מאוד את האף, העיניים והגרון. חשיפה ארוכת טווח לרמות נמוכות באוויר או בעור עלולה לגרום לגירוי בעור כגון דרמטיטיס וגירוד, ולבעיות נשימה דמויות אסתמה. יש ללבוש הגנה על הפנים והעיניים ולא לנשום אבק, גז, ערפל, אדים או אדים.
    1. לאחר הזלפת ה-PFA, יש להשתמש בעכבר עם 100 מ"ל של חיץ CUBIC-P כדי להגיע לרמות ההבהרה שהוזכרו בשלב 1.5.
    2. כדי להכין חיץ CUBIC-P, יש להמיס 10% N-בוטילדיאתנולמין, 5% טריטון X-100 ו-5% 1-N-מתילימידאזול במים מזוקקים כפולים או להשתמש בקוקטיילים המסחריים (ראו טבלת חומרים).
      הערה: שלבים 1.6.1.-1.6.2. מומלצים רק לאיברים בעלי פיגמנטים גבוהים כמו הלב והכליות מכיוון שהם דורשים שלב ניקוי מקדים כדי להשיג רמות מוגברות של שקיפות. לאחר השימוש ב- CUBIC-P, לנתח את האיברים ולהמשיך ישירות לשלב 2: ניקוי רקמות.
  7. נתחו את דגימות הרקמה/איברים 30 להדמיה ולאחר מכן תקנו אותן ב-4% (w/v) PFA ב-PBS (~10 מ"ל/איבר שלם) למשך הלילה (ON) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (לא יותר מ-5 x גרם) בצינורות חרוטיים של50 מ"ל.
    הערה: כל הדגירה מכאן ואילך חייבת להתבצע על צינורות המונחים אופקית ב 20-30 מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור.
  8. יש לשטוף את הדגימה ב-10 מ"ל של PBS (בתוספת 0.05% נתרן אזיד (NaN 3) למשך3 שעות (שלוש פעמים) בטמפרטורת החדר (RT) עם ניעור עדין (5 x גרם).
    הערה: ניתן להקפיא רקמות על ידי דגירה ב-10 מ"ל של 30% סוכרוז ב-PBS עם ניעור עדין (5 x גרם) ב-4 מעלות צלזיוס בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. לאחר שהרקמות שוקעות לתחתית הצינור, הטמע אותן בתרכובת OCT ושמור אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הפשירו ב-RT עד שתרכובת ה-OCT נמסה לחלוטין, ואז שטפו ב-PBS (~10 מ"ל/איבר שלם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין (5 x גרם) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. המשך לשלב 2.

2. ניקוי רקמות

הערה: כל ניקוי הרקמות שבוצעו בעבודה זו נעשה באמצעות פרוטוקול CUBIC I22. שלושה קוקטיילים שונים שימשו: CUBIC-P עבור delipidation ו decolorization מהיר במהלך perfusions, CUBIC-L עבור delipidation ו decolorization, ו CUBIC-R עבור התאמת RI. צביעת דנ"א וכתמי חיסון בוצעו באמצעות ערכת צביעה גרעינית תלת-ממדית CUBIC-HV 1 וערכת אימונוסטינינג תלת-ממדית CUBIC-HV 1, בהתאמה (ראו טבלת חומרים).

  1. יש לטבול איברים בודדים ב-10 מ"ל של 50% מעוקב מדולל במים (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין (5 x גרם) ב-RT (ON) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. שמור צינורות שטוחים על הצלחת הרועדת.
    הערה: כדי למנוע נזק לרקמות, איברים נשמרים באותה צינור, ותמיסות נאספות באמצעות מערכת ואקום. להכנת CUBIC-L, יש להמיס 10% N-בוטילדיאתנולמין ו-10% טריטון X-100 במים מזוקקים פעמיים באמצעות הקוקטיילים המסחריים (ראו טבלת חומרים).
    אזהרה: CUBIC-L גורם נזק חמור לעיניים. יש ללבוש הגנה על העיניים והפנים. יש להשליך למתקן מאושר לסילוק פסולת.
  2. יש לטבול דגימה ב-10 מ"ל של 100% CUBIC-L למשך 6 ימים (לרענן את התמיסה ביום השלישי).
    הערה: בתום תקופת הדגירה הזו, הרקמות חייבות להיות שקופות כמעט לחלוטין.
  3. שטפו את האיברים השקופים עם PBS (בתוספת 0.05% NaN3) במשך שעתיים (שלוש פעמים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול עדין (5 x גרם). העבירו רקמות לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל עם כל שטיפה כדי להסיר את Triton X-100.
    הערה: כפי שמתואר באיור 2B, אם מטרת הניסוי היא לדמיין חלבוני דיווח בעלי ביטוי אנדוגני מטפילי T. cruzi מהונדסים או מעכברים (איור 2C-F), דלג על שלבים 3, 4 ו-5 והמשך ישירות לשלב 6.

3. מכתים דנ"א

  1. דלל את צבע חומצות הגרעין הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של חיץ צביעה (כלול בערכה) בדילול של 1/2,500.
  2. לטבול רקמות בתמיסת הצבע הגרעינית ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 5 ימים באמצעות צינורות חרוטיים של 15 מ"ל במצב עמידה.
  3. יש לכבס עם 15 מ"ל של חיץ כביסה מכתים גרעיני תלת-ממדי (כלול בערכה) למשך שעתיים (שלוש פעמים) ב-RT עם ניעור עדין (5 x גרם).
    הערה: ניתן להשתמש בצבעי DNA אחרים בריכוזים ובזמני הדגירה הבאים: DAPI (כלול בערכה): 1/200, דגירה של 5 ימים; BOBO-1: 1/400, 5 ימי דגירה; Propidium Iodide (PI) (כלול בערכה): 1/100, דגירה של 3 ימים; RedDot2: 1/250, דגירה של 3 ימים. אם המטרה הספציפית של הניסוי היא לדמיין את שני חלבוני הכתב המבוטאים באופן אנדוגני ולהשתמש בכתמים גרעיניים, דלג על שלבים 4 ו-5 והמשך ישירות לשלב 6.

4. עיכול מטריצה חוץ-תאית (ECM)

הערה: יש לבצע עיכול היאלורונידאז של ה- ECM כדי להקל על חדירה נכונה של הנוגדנים לאזורים עמוקים של הרקמות28.

  1. לטבול איברים בודדים ב-15 מ"ל של חיץ תגובה היאלורונידאז למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי של 50 מ"ל במצב שטוח המוגן מפני אור.
    הערה: כדי להכין חיץ תגובה hyaluronidase, להמיס 10 mM של CAPSO; 150 mM של נתרן כלורי (NaCl), ו-0.05% של NaN3 (ראו טבלת חומרים) במים מזוקקים כפולים והתאמת ה-pH ל-10.
  2. הכן תמיסת אנזימים על-ידי ערבוב של 75 μL של 20 מ"ג/מ"ל של מלאי היאלורונידאז לתוך 425 μL של מאגר התגובה hyaluronidase. כדי להכין 20 מ"ג/מ"ל של ציר היאלורונידאז, יש להמיס היאלורונידז ב-50 מ"מ של חיץ קרבונט, 150 מ"מ של NaCl, 0.01% של BSA ו-0.05% של NaN3 (ראו טבלת חומרים). כוונן את ה- pH ל- 10 ואת ה- aliquot בנפחים של 77 μL ב- -30 °C.
  3. יש להשליך את מאגר התגובה hyaluronidase באמצעות פיפטה ולטבול את האיבר בתמיסת האנזים (500 μL בצינור חרוטי של 15 מ"ל) במצב עמידה מוגן מפני אור למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (5 x גרם).
  4. שטפו את הדגימה ב-15 מ"ל של חיץ כביסה היאלורונידאז בצינור חרוטי של 50 מ"ל במצב אופקי מוגן מפני אור למשך שעתיים (שלוש פעמים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (5 x גרם).
    1. כדי להכין מאגר שטיפה היאלורונידאז, יש להמיס 50 מ"מ של חיץ קרבונט, 150 מ"מ של NaCl, 0.1% (v/v) של טריטון X-100, 5% (v/v) של מתנול ו-0.05% NaN3. התאם את ה-pH ל-10. כדי להכין מלאי של 10x Carbonate buffer-NaCl, יש להמיס 2.96 גרם נתרן פחמתי, 1.86 גרם נתרן מימן פחמתי ו-8.77 גרם של NaCl ב-100 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים עם 0.05% NaN3 (ראו טבלת חומרים) ולהתאים את ה-pH ל-10.

5. אימונוסטינינג

  1. תייג כלי דם באמצעות נוגדנים נגד α-SMA (אקטין שריר אלפא-קטן, ראה טבלת חומרים) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. צור קומפלקס נוגדנים משני של מקטע Fab ראשוני פלוס. התחל תגובה זו 1.5 שעות לפני הליך ההכתמה.
      1. חישוב הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים ומשניים (לערבב ביחס של 1:0.5 לפי משקל).
        הערה: עבור הנוגדן העיקרי anti-α-SMA, יש צורך ב-3.5 מיקרוגרם כדי לסמן את הלב כולו או שבר של שרירי שלד בממדים דומים. עבור מוצר של 2.5 מ"ג/מ"ל, יש צורך בתמיסת נוגדנים של 3.5/2.5 = 1.4 מיקרון. עבור נוגדן משני AlexaFluor 647 נגד העכבר שבר Fab, 1.75 מיקרוגרם נדרש כדי לתייג את כל הלב או שבר של שריר השלד של ממדים דומים. עבור מוצר של 1.7 מ"ג/מ"ל, יש צורך בתמיסת נוגדנים של 1.75/1.7 = 1 μL.
      2. מערבבים נוגדנים ראשוניים ומשניים בצינור ענבר 2 מ"ל ודוגרים במשך 1.5 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. להחלפת חיץ, יש לערבב 7.5 מ"ל של חיץ חיסוני תלת-ממדי 2x HV1 (כלול בערכה, ראו טבלת חומרים) עם 7.5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים ולטבול את דגימת הרקמה למשך שעה וחצי ב-32 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (5 x גרם) בצינור חרוטי של 15 מ"ל במצב אופקי. התחל תגובה זו בו זמנית כמו הדור של קומפלקס נוגדנים (1.5 שעות לפני הליך immunostaining).
  2. בצע אימונוסטיינינג בתלת-ממד לפי השלבים הבאים.
    1. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, הכינו את תמיסת צביעת הנוגדנים בעקבות קובץ משלים 1.
    2. אסוף את דגימת הרקמה ממדיית חילופי החיץ (שלב 5.1.2) וטבל אותה בתמיסת צביעת הנוגדנים. לדגור רקמות בנפרד במשך שבוע אחד בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין (5 x גרם) של הצינורות במצב עמידה מוגן מפני אור. אטמו את הצינור עם סרט פרפין כדי למנוע אידוי.
    3. מעבר ל-4 מעלות צלזיוס ודגירת ON במצב עמידה.
    4. יש לקרר את מאגר הכביסה החיסוני 1x HV1 3D (הכלול בערכה, ראו טבלת חומרים) ל-4°C ולשטוף את הדגימה עם חיץ של 15 מ"ל (פעמיים) למשך 30 דקות כל אחד ב-4°C עם רעידות עדינות (5 x גרם). שמור על צינורות חרוטיים של 15 מ"ל במצב אופקי עד לשלב 5.2.7.
    5. יש לדלל את הפורמלין ל-1% במאגר הכביסה התלת-ממדי HV1 3D ולטבול את הדגימה ב-8 מ"ל של התמיסה למשך 24 שעות ב-4°C עם רעידות עדינות (5 x גרם).
    6. יש לדגום בתמיסת פורמלין טרייה של 1% למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C עם רעידות עדינות (5 x גרם).
    7. יש לשטוף ב-15 מ"ל PBS למשך שעתיים ב-25°C עם רעידות עדינות (5 x גרם).
  3. הגבירו את אות tdTomato באמצעות נוגדנים נגד חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. עקוב אחר אותם זמני דגירה וטמפרטורות כמו בשלב 5.2.2. חשב את כמות הנוגדנים הראשוניים והמשניים (ראה טבלת חומרים) וערבב אותם ביחס של 1:0.5 לפי משקל.
      הערה: עבור נוגדנים ראשוניים נגד RFP, יש צורך ב-5 מיקרוגרם כדי לסמן את כל הלב או שבר של שריר השלד בממדים דומים. עבור מוצר של 1.25 מ"ג/מ"ל, נדרש 5/1.25 = 4 מיקרון של התמיסה. עבור נוגדן משני Alexa Fluor 647 אנטי ארנב שבר Fab, 2.5 מיקרוגרם יש צורך לתייג את כל הלב או שבר של שריר השלד של ממדים דומים. עבור מוצר של 1.5 מ"ג/מ"ל, יש צורך ב-2.5/1.5 = 1.7 מיקרון לתמיסה.
    2. הכן את תמיסת צביעת הנוגדנים כאמור בתיק משלים 1.
  4. הגבר את אותות ה-GFP באמצעות ננו-גופים אנטי-GFP בהתאם לשלבים הבאים.
    1. עקוב אחר אותם זמני דגירה וטמפרטורות כאמור בשלב 5.2.2.
      הערה: ננו-גופים נגד GFP (ראו טבלת חומרים) מצומדים ל-Alexa Fluor 647, כך שיצירת קומפלקס הנוגדנים אינה נחוצה.
    2. הכן את תמיסת צביעת הנוגדנים כאמור בתיק משלים 1.

6. התאמת RI

  1. לטבול איברים שקופים ב-5 מ"ל של תמיסת CUBIC-R+ מדוללת מים (ראו טבלת חומרים) ב-RT (ON) עם ניעור עדין (5 x גרם) בצינור חרוטי של 50 מ"ל. שמור על צינורות במצב עמידה במהלך כל שלב התאמת ה- RI.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסות CUBIC R+ ממוחזרות מניסויים קודמים (עד ארבע פעמים) בשלב זה. כדי להכין תמיסת CUBIC-R+, יש להמיס 45% מ-2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון (אנטיפירין), 30% מניקוטינמיד או N-מתילניקוטין-אמיד, ו-0.5% מ-N-בוטילדיאתנולמין במים מזוקקים כפולים או להשתמש בחיץ CUBIC-R+ המסחרי (ראו טבלת חומרים).
    אזהרה: CUBIC-R+ גורם לגירוי בעור, לגירוי חמור בעיניים ולנזק לאיברים. יש ללבוש כפפות מגן ולהבטיח הגנה על העיניים והפנים. אין לנשום אבק, אדים, גז, ערפל או אדים. יש להשליך למפעל מאושר לסילוק פסולת.
  2. יש להחליף 50% CUBIC-R+ ב-5 מ"ל של 100% CUBIC-R+ ולדגור ברעידות עדינות (5 x גרם) ב-RT למשך יומיים. לאחר מכן, העבירו את הרקמות לערימה של מגבונים נטולי מוך וסובבו בזהירות את הרקמות כדי להסיר תמיסת CUBIC-R+ ממשטחי האיברים למשך 5 דקות.

7. הרכבה

  1. לאחר ייבוש הרקמות, העבירו אותן ל-5 מ"ל של תמיסת הרכבה (RI = 1.520) (ראו טבלת חומרים) בצלחת תרבית תאים בת שש בארות ודגרו אותן (ON) ב-RT. לעתים קרובות סובבו את הרקמות כדי לחסל בועות אוויר, במיוחד על פני השטח של האיברים.
    הערה: ניתן לאחסן איברים במשך יותר מ-6 חודשים בתמיסת הרכבה או ב-CUBIC-R+.
  2. הדביקו את הרקמות למחזיק דגימת המיקרוסקופ באמצעות דבק ג'ל על בסיס ציאנואקרילט.
  3. לטבול את הדגימות במיקרוסקופ קוורץ cuvette מלא 120 מ"ל של תמיסת הרכבה ולדמיין אותם באופן רוחבי לציר האורך שלהם. הדבק את הלב עם apex ואת אבי העורקים מיושר אופקית.
    הערה: איברים מנוקים ומותקנים ניתנים לחיתוך עם ויברטום והדמיה בהגדלה גבוהה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. להטמיע את האיברים ב 2% agarose ולחתוך חלקים של 100-500 מיקרומטר. איברים ניתן גם לחתוך באופן ידני עם להב חד כדי לייצר חלקים רקמה עבה (>1000 מיקרומטר). לאחר החיתוך, מניחים את הפרוסות בצלחות פטרי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית, מרכיבים באמצעות אותה תמיסת הרכבה, אוטמים עם לק, ומצלמים עם מיקרוסקופ קונפוקלי.

8. רכישת תמונה

  1. דמיינו את הדוגמאות המותקנות באמצעות מיקרוסקופ בעל יריעת אור (ראו טבלת חומרים). הגדר הגדלה וגודל צעד בין פרוסות בודדות ל- 3 מיקרומטר, והשתמש במדפסות לייזר בהירות מימין ומשמאל בעוביים של 5 מיקרומטר וברוחב של 100%. הגדר את קבוע זמן החשיפה ל-50-100 אלפיות השנייה, וכוונן את עוצמת הלייזר מ-10% ל-80% בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי.
    1. לזיהוי משותף של טפילים מבטאי tdTomato ואמסטיגוטים רדומים מוכתמים ב-DiR (איור 2C), השתמשו בערוצים אדומים (Ex/Em 561/620-660 ננומטר) ובתת-אדום (Ex/Em 785/845-55 ננומטר), בהתאמה. לזיהוי משותף של תאי T וטפילים המבטאים tdTomato בעכבר מדווח CD8 (איור 2D), השתמש בירוק (Ex/Em 488/525-50 ננומטר) ובערוץ אדום, בהתאמה.
    2. עבור מבחני coinfections (איור 2E), כמו גם עבור זיהוי משותף של טפילים המבטאים GFP בעכברים מדווחים של גרעינים (איור 2F), השתמשו בערוצים הירוקים והאדומים, בהתאמה. לזיהוי טפילים המבטאים tdTomato, צבע גרעיני וכלי דם בלב (איור 3B,C), השתמשו בערוצים האדומים, הירוקים והאדומים הרחוקים (Ex/Em 640/680-730 ננומטר), בהתאמה.
    3. זהה נוגדנים נגד RFP עם הערוץ האדום הרחוק וננו-גופים נגד GFP באמצעות הערוץ הירוק (איור 3D).
  2. המירו את ערימות התמונות TIFF שנרכשו ושחזרו בתלת-ממד את האיברים באמצעות תוכנת Imaris v9.7.2 (ראו טבלת חומרים).

9. שחזור וכימות פני השטח באמצעות תוכנת Imaris

  1. בחר בכלי אלגוריתם לזיהוי משטחים והפעל את האשף בתוכנת ניתוח התמונות.
  2. בצע ניתוח ראשוני באזור עניין תלת-ממדי (שנבחר באקראי) ולאחר מכן החל אותו על כל שחזור האיברים התלת-ממדיים. לאחר בחירת אזור עניין (ROI), בחר את הערוץ לניתוח, בטל את הסימון של הלחצן החלק ובחר חיסור רקע.
    הערה: חיסור רקע מחשב ערך רקע מקומי ייחודי עבור כל ווקסל ומפחית אותו מערך הפיקסלים המקורי. קוטר הכדור הגדול ביותר שמתאים לאובייקט חייב להיות עד 200 מיקרומטר עבור תאים נגועים ב-T. cruzi, 10 מיקרומטר עבור תאי T ו-5 מיקרומטר עבור טפילים בודדים.
  3. השתמש בהיסטוגרמה כדי להתאים את הסיווג וברשימה הנפתחת של המסנן כדי לבחור את המדידות לסיווג.
    הערה: השתמש בהיסטוגרמה כדי להתאים את הסיווג: מדידות אליפטיות (oblate) וכדוריות מומלצות.
  4. סיים את האשף, לחץ על לחצן הסטטיסטיקה ואחזר את המספר הכולל של תאים נגועים בטפיל או תאי T כמספר הרכיבים המנותקים לכל נקודת זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רקמות קבועות מעוקבות נשטפו עם PBS להסרת קיבועים ולאחר מכן דוגרו עם קוקטיילים CUBIC-L, תמיסה בסיסית של אלכוהולים אמינו המוציאים פיגמנטים ושומנים מהרקמה וכתוצאה מכך דה-צביעה של רקמות תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמות. ניתן לראות קווי רשת בנייר דרך הרקמות המעידים על ניקוי מתאים של האיברים (איור 2A). לאחר ההטלה, הרקמות נשטפו והוטמעו בתמיסת CUBIC-R+ ותמיסת הרכבה עבור הומוגניזציה והדמיית RI, בהתאמה (איור 2B).

עכבר מסוג פרא היה נגוע בטריפומסטיגוטים המבטאים tdTomato שהוכתמו מראש בצבע DiR כמעט אינפרה-אדום ציאנין. העכבר הומת 15 יום לאחר ההדבקה, והלב השלם נותח, תוקן ונוקה. הדמיית LSFM ושחזור תלת-ממדי אפשרו לנו לדמיין טפילי T. cruzi מתרבים המבטאים tdTomato (אדום). ניתן להשתמש ברמות אוטופלואורסצנציה בתעלה האדומה להדמיה נכונה של מבנה הלב וקצוותיו (איור 2C i). LSFM היה שימושי גם לזיהוי צורות רדומותעמידות לתרופות 7,8. הכתמה לפני ההדבקה של טפילים עם צבע DiR מאפשרת מעקב אחר טפילים רדומים על ידי הדמיה של הטפילים שלא דיללו את הצבע באמצעות שכפול, כפי שדווח בעבר עבור CellTrace Violet7.

ניתן לזהות טפילים רדומים (ציאן) בלב כפי שהם מתוארים בכניסות המוגדלות בתלת-ממד (חיצים צהובים) (איור 2C ii,iii). פלואורסצנציה של היטל Z פולחה באופן אוטומטי כדי ליצור מודל משטח תלת-ממדי משוחזר להדמיה מרחבית ולכימות של המספר הכולל של תאים נגועים ב-T. cruzi וטפילים רדומים לאורך כל השחזור התלת-ממדי (איור 2A). ניתוח של מודל פני השטח התלת-ממדי גילה 186 תאים נגועים ב-T. cruzi עם שיעור גבוה יותר של תאים נגועים באטריום הלב (123) בהשוואה לחדרים (63) ו-18 טפילים רדומים בלב כולו (איור 2C i)). בדו"ח קודם, צינור דומה לניטור מספר התאים הנגועים ב - T. cruzi וטפילים רדומים ברקמות עכברים שהובהרו לאחר טיפול תרופתי דווחעל 31. חשוב לציין כי האומדנים למספרים של טפילים רדומים הם ככל הנראה מספר חסר, שכן טכניקת דילול הצבע מאפשרת זיהוי רק של טפילים שלא שוכפלו באופן משמעותי מאז ההדבקה הראשונית, אך אינה מזהה את אלה שהפכו רדומים בהמשך ההדבקה לאחר סבבים מרובים של חלוקה.

גישה דומה שימשה לניטור האינטראקציה בין זני T. cruzi שונים בעכברים עם מחסור באינטרפרון (IFN)-גמא. הייצור של IFN-גמא על ידי תאי T משפיעים חיוני לשליטה החיסונית של T. cruzi. בעכברים עם מחסור ב-IFN-גמא, טפילים מתרבים עם הגבלה חיסונית מינימלית, ומניבים מספר גבוה מאוד של תאים נגועים באיברים. מודלים חיסוניים אלה הם כלים שימושיים לחקר היעילות של תרופות חדשות ללא ההגבלה המוטלת על ידי זיהוי החיסון, ובכך מאפשרים זיהוי של הישנות טפיל לאחר הטיפול. עכברים עם מחסור ב-IFN-גמא נדבקו בזני T. cruzi ברזילאים המבטאים tdTomato (אדום) וברזיל (כחול) המבטאים GFP. העכברים הומתו 17 יום לאחר ההדבקה, והלבבות השלמים נותחו, תוקנו ונוקו. במודל חיסוני זה, ניתן לראות תאים מארחים הנגועים בשני זני T. cruzi בשלבים שונים של התפתחות טפילים, כולל תאים נגועים גדולים, בינוניים וקטנים ותאים שהתפוצצו לאחרונה. חיתוך דרך הרקמות מראה שפע של תאים נגועים בטפילים באטריה של הלב בעומקי רקמות שונים (איור 2E i-iii וסרט 1).

צלב של C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J ועכברי B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, שבו כל תאי ה-T מבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק ZsGreen1, שימשו לניטור גיוס תאי T ברקמות נגועות ב-T. cruzi. עכברים הומתו 14 יום לאחר ההדבקה בטפילים המבטאים tdTomato, ושרירי השלד נכרתו, נוקו וצולמו על ידי LSFM. ZsGreen1 המבטאים תאי T (בכחול) ותאי T. קרוזי נגועים (אדום) זוהו בחוזקה (איור 2D i וסרט 2). זום-אין תלת-ממדי של השחזור התלת-ממדי זיהה תאי T באזור של תא נגוע (איור 2D ii). מקטעים עבים של ויברטום (200-500 מיקרומטר) של אותה רקמה מאפשרים לנו לדמיין את הממשק של תאי T ותאים נגועים מארחים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2D iii).

דרך חלופית לניטור מוקדי דלקת מבוססת על הצטברות גרעיני תאים סביב תאים נגועים ב-T. cruzi. לשם כך נעשה שימוש בעכבר מדווח שבו כל גרעיני התאים מבטאים את החלבון הפלואורסצנטי tdTomato. ביטוי ה-tdTomato הגרעיני (אדום) זוהה בקלות ברקמות לאחר תהליך הסליקה. עכבר כתב גרעין הודבק בטפילי T. cruzi (ציאן) המבטאים GFP, ו-35 יום לאחר ההדבקה, הומת, ושרירי השלד נכרתו, נוקו וצולמו על ידי LSFM (איור 2F i-iii). מקטעים אופטיים מוגדלים של שרירי השלד חושפים תאים מוגברים על-ידי צבירת גרעינים אדומים לאורך טפילים המבטאים GFP (איור 2F ii). מקטעי ויברטום של אותה רקמה מאשרים את ההצטברות שתוארה קודם לכן של גרעינים אדומים לאורך טפילים המבטאים GFP על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2F iii).

פרוטוקול CUBIC הותאם גם לסימון אימונוסטינינג ותיוג דנ"א של איברים ורקמות שלמים ומסולקים הנגועים ב-T. cruzi (איור 3A). עכברים הומתו 40 יום לאחר ההדבקה בטפילים המבטאים tdTomato, והלבבות נותחו, תוקנו ונוקו. הלב שפונה בשלמותו נשטף והוכתם במשך 5 ימים עם סמן DNA ירוק, לאחר מכן נשטף שוב והוכתם חיסונית במשך 7 ימים עם נוגדנים נגד α-SMA. הדגימות תוקנו, נשטפו, הותאמו ל-RI וצולמו עם LSFM. זיהוי סימולטני של אותות פלואורסצנטיים מרובים, כולל גרעינים, כלי דם ותאים נגועים ב-T. cruzi, היה אפשרי בעקבות פרוטוקול זה. α-SMA immunostaining (לבן) הציג רמות אות גבוהות שחשפו את כלי הדם המורכבים של הלב (איור 3B ii וסרט 3). חתך אופטי מאזורי לב עמוקים יותר מתאר את החדירה לרקמות של נוגדני α-SMA בתנאים שנקבעו (איור 3B v). צביעת דנ"א (כחול) הפגינה גם חדירה טובה לרקמות, רמות פלואורסצנטיות וכתמים נפחיים יציבים. אזורים מסוימים עם תיוג דנ"א אינטנסיבי זוהו במיקומי לב שונים (איור 3B i) וסביב סיבי שרירי השלד (איור 3C i וסרט 4). תמונה מוגדלת של שרירי השלד הראתה הצטברות של גרעינים כחולים באזורים עם מעט או טפילי tdTomato שאינם ניתנים לזיהוי, מה שמרמז על גיוס של תאי חיסון באתרים של זיהום T. cruzi נוכחי או קודם (איור 3C ii). במקרים אחרים, לתאים מארחים נגועים לא הייתה כמעט עדות לחדירות תאיות סמוכות (חיצים לבנים) (איור 3C i). מקטעי ויברטום של אותה רקמה כמו באיור 3C ii מראים צביעת דנ"א של תאים וטפילים המבטאים tdTomato על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 3C iii). 

ניסויים קודמים הראו שטפילים רדומים הפגינו ביטוי נמוך או זניח של חלבוני tdTomato או GFP (איור 2C ii ו-iii). כדי לשפר את הזיהוי של חלבונים פלואורסצנטיים אלה, רקמות מנוקות הוכתמו בנוגדנים נגד RFP או -GFP. רקמות שרירי שלד שלמות מעכברים שנדבקו בטפילים המבטאים tdTomato או GFP תוקנו, הובהרו והוכתמו בנוגדנים נגד RFP (RFP Booster) (איור 3D) או ננו-גופים נגד GFP המצומדים ל-Alexa Fluor 647 (מאיץ GFP) (איור 3E), בהתאמה. הדגימות תוקנו, נשטפו, הותאמו ל-RI וצולמו עם LSFM. בשני המקרים, ההאצה של אותות GFP ו-tdTomato על-ידי הנוגדנים גרמה לפלואורסצנציה חזקה (איור 3D ii ו-3E ii ). החיסוניות המשתמשות בנוגדנים מגבירים מייצגות כלי רב-תכליתי שישמש לזיהוי רדומים של T. cruzi באיברים ורקמות שלמים ומבהירים ולזהות כל אות שאינו מיוצג כראוי מחלבוני הדיווח של RFP או GFP.

Figure 1
איור 1: החדרת מחט במהלך זליפה טרנס-לבבית. (A) ייצוג סכמטי המציג את השלבים שבוצעו לפני החדרת העכבר דרך הלב ואת המיקום והכיוון הנכונים של מחט הזליפה בחדר השמאלי. בוצע חתך קטן באטריום הימני, ונאסף ניקוז דם (1); מחט פרפר הוכנסה לפסגת הלב. שמור על הכיוון כך שהמחט לא תחדור דרך המחיצה (2). חור הכניסה סביב המחט נאטם באמצעות דבק על בסיס ג'ל (3). הכבד מלא בדם ונראה אדום לפני הזליפה; עם זאת, לאחר זלוף, הוא מאבד פיגמנטציה והופך חיוור. RA, ימין auricle; לוס אנג'לס, שמאלית; RV, חדר ימין; LV, חדר שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
תרשים 2הדמיה של תאים נגועים ב-T. cruzi, אמסטיגוטים רדומים ומוקדי דלקת באיברים מנוקים.: (א) סכימה של איבר שלם T. cruzi-זיהוי תאים נגועים באמצעות ניקוי רקמות, הדמיית LSFM וכימות בעזרת תוכנה במודלים תלת-ממדיים של פני שטח. (אני) תמונות שדה בהיר של הלב ושרירי השלד לפני (משמאל) ואחרי (מימין) (סרגל קנה מידה: 1000 מיקרומטר). (השני) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור. (השלישי) IFN-גמא- עכבר חסר נדבק ב 2 x 105 tdTomato-מבטא טריפומסטיגוטים. ב-17 ימים לאחר ההדבקה, הלב נותח, CUBIC נוקה, ו-LSFM צולם (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). (הרביעי) פלואורסצנציה של היטל Z פולחה באופן אוטומטי כדי ליצור מודל משטח תלת-ממדי משוחזר להדמיה מרחבית וכימות של מספר T. cruzi-תאים נגועים. סה"כ 736 T. cruzi-תאים נגועים זוהו בכל הלב (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). (v) מציג הגדלה של אמצעי האחסון המצוין ב- (הרביעי), כאשר אובייקטים ציאניים מייצגים T. cruzi-תאים נגועים (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). (B) פרוטוקול של ניקוי איברים שלמים מעוקבים. (C) הדמיה של מתרבים ורדומים T. cruzi טפילים בלב עכבר שקוף. (אני) עכבר מסוג פרא נדבק ב-2 x 105 טריפומסטיגוטים המבטאים tdTomato מוכתמים בצבע ציאנין כמעט אינפרא אדום DiR. הלב נותח, נוקה, ו-LSFM צולם. tdTomato-מבטא התפשטות (אדום) ורדום (ציאן) T. cruzi ניתן לזהות טפילים. רמות אוטופלואורסצנציה נשמרו כדי לאפשר הדמיה נכונה של מבנה הלב. עכבר נהרג 15 יום לאחר ההדבקה על סמך שיא התאים הנגועים בטפילים ואמסטיגוטים רדומים שנמצאו בעבודות קודמות (סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר). (השני) ו (3) להציג הגדלה של אמצעי האחסון המצוין ב- (אני), כאשר חצים צהובים מציינים טפילים רדומים (ציאן) (סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר). (D) איתור גיוס תאי T בעכבר מדווח CD8 נגוע. (אני) עכבר הכתב היה נגוע ב 2 x 105 טריפומסטיגוטים המבטאים tdTomato ושרירי השלד נותחו, נוקו, ו-LSFM צולם 14 יום לאחר ההדבקה, נקודת זמן שבה מתגלות תגובות תאים משמעותיות. ZsGreen1 המבטא תאי T (כחול) וכן T. cruzi-תאים נגועים (אדום) הודגמו (סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר) (ראו גם סרט 2). (השני) מציג הגדלה של אמצעי האחסון המצוין ב- (אני) (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). (השלישי) מתאר הצטברות תאי T סביב T. cruzi-תא נגוע בקטע רקמה (200 מיקרומטר) של אותו איבר (סרגל קנה מידה: 8 מיקרומטר). (E) אינטראקציה בין שונים T. cruzi זנים. (אני) עכברים עם מחסור ב-IFN-גמא הודבקו ב-2 x 105 tdTomato-מבטא קולומביאנה (אדום) וברזיל המבטאת GFP (כחול) T. cruzi זנים. העכברים הומתו, והלבבות השלמים נותחו, תוקנו ופונו 17 יום לאחר ההדבקה (סרגל אבנית: 400 מיקרומטר). (השני) מציג הגדלה של אמצעי האחסון המצוין ב- (אני) (סרגל קנה מידה: 250 מיקרומטר). (השלישי) מציג מקטע אופטי מוגדל החושף תאים נגועים בקולומביאנה (אדום) וברזיל (כחול) T. cruzi זנים (סרגל קנה מידה: 150 מיקרומטר). (F) הדמיה של תאים לאורך תאים נגועים באמצעות עכבר מדווח גרעינים. (אני) עכבר כתב גרעיני הודבק ב 2 x 105 טריפומסטיגוטים המבטאים GFP, ושרירי השלד נותחו, נוקו, ו-LSFM צולם ב-35 יום לאחר ההדבקה. זוהו ביטוי tdTomato גרעיני של התאים המארחים (אדום), כמו גם ביטוי טפיל GFP (ציאן), (סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר). (השני) מראה חתך אופטי מוגדל החושף הצטברות של גרעינים אדומים לאורך טפילים המבטאים GFP (סרגל קנה מידה: 90 מיקרומטר). (השלישי) מאשר את התאיות המוגברת על ידי הדמיה קונפוקלית של מקטעי רקמה מאותו איבר (סרגל קנה מידה: 8 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תיוג של איברים נגועים ב-T. cruzi עם נוגדנים וכתמים גרעיניים. (A) פרוטוקול CUBIC לניקוי רקמות, אימונוסטינינג תלת-ממדי ותיוג DNA של איברים שלמים. (B) תיוג לב עכבר לזיהוי כלי דם ודנ"א (ראו גם סרט 3). (i-iii) עכבר מסוג בר היה נגוע ב 2 x 105 tdTomato טפילים המבטאים. העכבר הומת 40 יום לאחר ההדבקה, והלב נותח, תוקן ונוקה. הלב המסולק סומן בסמן דנ"א והוכתם בנוגדנים נגד α-SMA. זיהוי סימולטני של גרעיני תאים (כחול), כלי דם (לבן) ותאי T. קרוזי נגועים (אדום) היה אפשרי. העכבר נהרג בשלב זה לאחר ההדבקה כאשר ניתן להעריך רקמות ושיפוץ כלי דם מיוחד (סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר). (iv) מראה נפח מוגדל מאזורי לב עמוקים של (iii) המתאר גרעיני תאים, כלי דם ותאים נגועים (סרגל קנה מידה: 90 מיקרומטר). (v) מתאר קטע אופטי המתקבל מ-(iii) (סרגל קנה מידה: 90 מיקרומטר). (C) תאיות מוגברת המתוארת על ידי תיוג דנ"א של שרירי שלד שלמים מנוקים. (i) רקמת שריר השלד מהניסוי הקודם הייתה מוכתמת בדנ"א, וחשפה אזורים עם תיוג גרעיני אינטנסיבי (כחול) וכן תאים נגועים ב-T. cruzi (אדום) (סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר) (ראו גם סרט 4). (ii) חושף הצטברות אינטנסיבית של גרעינים כחולים באזורים עם זיהוי נמוך עד אפסי של טפיל tdTomato (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). (iii) הדמיה קונפוקלית בהגדלה גבוהה (פי 60) מזהה תיוג DNA של תאים וטפילים במקטעי רקמות (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). (D) חיזוק של סמני כתב טפיל tdTomato בשרירי שלד שלמים מנוקים. (i-iii) רקמות שרירי שלד שלמות מעכברים שנדבקו ב-2 x 105 טפילים המבטאים tdTomato תוקנו, הובהרו והוכתמו בנוגדנים נגד RFP (RFP Booster). אות פלואורסצנטי עז ואחיד התקבל בערוץ האדום-רחוק לאחר הגברת RFP (ירוק) של אות tdTomato (אדום) (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). (E) חיזוק סמני דיווח טפילי GFP באמצעות ננו-גופים אנטי-GFP. (i-iii) רקמות שרירי שלד מעכברים שנדבקו ב-2 x 105 טפילים המבטאים GFP תוקנו, הובהרו והוכתמו חיסונית באמצעות ננו-גופים מצומדים של Alexa Fluor 647 כנגד GFP (GFP Booster). אות פלואורסצנטי חזק התקבל בערוץ האדום הרחוק לאחר הגברת GFP (מגנטה) של פלואורסצנציה GFP (ציאן). עכברים מ-(D) ו-(E) הומתו 30 יום לאחר ההדבקה משום שעומסי הטפילים מגיעים לשיא בנקודת זמן זו, וניתן לזהות בקלות תאים נגועים בטפילים בשרירי השלד (סרגל אבנית: 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט 1: זיהום T. cruzi של הלב ושרירי השלד בעכברים עם מחסור ב-IFN-גמא. שחזורים תלת-ממדיים של רקמות בהבהרת CUBIC של עכברים עם מחסור ב-IFN-גמא נגועים ב-2 x 105 tdהבטא-טומסטומי קולומביאנה (אדום) וברזיל (כחולה) המבטאת GFP זני T. cruzi ביום ה-17 לאחר ההדבקה. בסך הכל נרכשו 1151 פרוסות בודדות של הלב ו-559 של שרירי השלד באמצעות LSFM. תוצאות הדמיה דומות הושגו בשלושה בעלי חיים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט 2: זיהוי גיוס תאי T בעכבר כתב CD8 נגוע ב- T. cruzi. הדמיה תלת-ממדית של שריר שלד שהובהר על ידי CUBIC מעכבר כתב CD8 הנגוע ב-2 x 105 Tdtomato-מבטא זן T. cruzi קולומביאני (אדום) ונהרג ב-14 יום לאחר ההדבקה. בסך הכל 668 פרוסות בודדות של שרירי השלד צולמו על ידי LSFM. ZsGreen1 המבטאים תאי T (כחולים) וכן תאי T. נגועים בקרוזי (אדום) הודגמו. תוצאות הדמיה דומות הושגו בשני בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט 3: זיהוי חיסוני של כלי דם ב T. קרוזי נגוע לב מנוקה. שחזור תלת-ממדי של לב מובהר מעוקב של עכברים מסוג בר שנדבקו ב-2 x 105 tdTomato-expressian T. cruzi קולומביאני המבטא חיסון ומוכתמים בנוגדנים נגד α-SMA (כחול) ב-40 יום לאחר ההדבקה. חיתוך דרך הלב חושף את כלי הדם המורכבים של הלב ואת החדירה לרקמות של נוגדני α-SMA. ניתן היה לראות תאים נגועים בטפילים ככתמים אדומים בוהקים באטריה של הלב (אדום, מימין). תוצאות הדמיה דומות הושגו בשני בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט 4:צביעת דנ"א של איברים שלמים חושפת אזורים עם תאים מוגברים. שחזור תלת מימדי של שריר השלד הבהיר CUBIC של עכבר מסוג בר ב 40 יום לאחר ההדבקה נגוע 2 x 105 tdTomato מבטא קולומביאנה T. קרוזי. כל אזור השרירים של הארבע ראשי הוכתם בצבע גרעיני ירוק. T. תאים נגועים בקרוזי (אדום) והגרעינים של כל תא ברקמה (כחול) הודגמו. זום-אין של השחזור התלת-ממדי חושף הצטברות של גרעינים כחולים לאורך אזורים עם זיהוי מועט או ללא זיהוי של טפילי tdTomato. תוצאות הדמיה דומות הושגו בשני בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

קובץ משלים 1: הרכב תמיסות צביעת הנוגדנים ששימשו במחקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היעדר הדמיה נרחבת של איברים שלמים של טפילים והתגובה החיסונית מגביל את הבנת המורכבות של יחסי הגומלין בין פונדקאי לטפיל ומעכב את הערכת הטיפולים למחלת צ'אגאס. המחקר הנוכחי אימץ את צינור ה-CUBIC כדי להבהיר ולהכתים איברים ורקמות שלמים של עכברים נגועים ב-T. cruzi.

מספר פרוטוקולים לניקוי רקמות נבדקו במחקר זה (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 ו-fDISCO13); עם זאת, רק CUBIC שימר רמות גבוהות של פלואורסצנציה של טפיל tdTomato או GFP. באופן דומה, דוחות קודמים הראו שימור CUBIC של סמנים המבוטאים באופן אנדוגני בהשוואה לגישות אחרות לניקוי רקמות35.

קיבולת רזולוציה מוגבלת היא אחת האזהרות הנוכחיות של מיקרוסקופיית יריעות אור קונבנציונלית. זה ברור בקשיים של פתרון טפילים בודדים בתאים נגועים בכבדות (איור 2C). מיקרוסקופי הריצוף החדשים שפותחו עם יכולת רזולוציה משופרת והתאמת טכניקות הרחבת רקמות יכולים לפתור בעיה זו36.

זיהומים ממאגרי הכביסה, תמיסות הניקוי או איברים אחרים עלולים לזרז ברקמה, ולייצר אותות לא ספציפיים שעלולים להיות מוטעים עבור תאים נגועים בטפילים, טפילים בודדים או מבנים אחרים. עם זאת, ממצאים אלה בדרך כלל פלואורסצנטיים בבהירות בערוצים מרובים, כך שלאחר ניתוח תמונה, ניתן להשליך אותם בקלות מספירה אוטומטית על ידי רקמות הדמיה בערוץ חלופי (בדרך כלל הערוץ הירוק). אובייקטים בצבע כפול נחשבו לממצאים ולא נכללו לכימות אוטומטי.

כתמים גרעיניים DAPI, PI, RedDot2 ו- SYTOX-G, מציגים רמות טובות של חדירת רקמות ועוצמות אות ברוב האיברים המנוקים על ידי CUBIC; עם זאת, צבע הדנ"א הירוק הראה את הביצועים הטובים ביותר (איור 3B,C וסרט 4)).

תוצאות אלה הראו כי ניתן לזהות בקלות תאים נגועים ב-T. cruzi ולכמת אותם במדויק, תוך זיהוי בו-זמני של אותות עכברים מדווחים של תאי T או גרעינים. והכי חשוב, LSFM זיהה אירועים ביולוגיים נדירים, כגון אמסטיגוטים רדומים חיוביים ל-DiR, בתוך סביבת רקמה מורכבת עם יכולת פוטנציאלית להרחיב אותה לאפיטופ של אימונוסטינזינג ותיוג DNA. מחקרים עדכניים בוחנים גם את התועלת של גישות אלה לניטור ההפעלה של תאים בעלי השפעה חיסונית, האינטראקציות בין זני טפילים מרובים באותו פונדקאי, והשראת נזק לרקמות ותיקון במחלת צ'אגאס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אטסואו סוסאקי על עזרתם החשובה והמלצותיהם בנוגע לפרוטוקולים לניקוי רקמות ובדיקות חיסון. כמו כן, אנו מודים ל- M. Kandasamy מליבת המיקרוסקופיה הביו-רפואית CTEGD על התמיכה הטכנית באמצעות LSFM והדמיה קונפוקלית. אנו גם מודים לכל חברי קבוצת המחקר של טרלטון על ההצעות המועילות במהלך מחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 184 טריפנוזומה קרוזי צ'אגאס ניקוי אימונוסטינינג CUBIC מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור
הדמיה תלת-ממדית כמותית של תאים נגועים <em>בטריפנוסומה קרוזי</em>, אמסטיגוטים רדומים ותאי T באיברים מבהירים שלמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M.,… More

Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter