Summary
El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.
Abstract
La enfermedad de Chagas es una patología desatendida que afecta a millones de personas en todo el mundo, principalmente en América Latina. El agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es un parásito intracelular obligado con una biología diversa que infecta a varias especies de mamíferos, incluidos los humanos, causando patologías cardíacas y digestivas. La detección confiable de infecciones in vivo por T. cruzi ha sido necesaria durante mucho tiempo para comprender la compleja biología de la enfermedad de Chagas y evaluar con precisión el resultado de los regímenes de tratamiento. El protocolo actual demuestra una tubería integrada para la cuantificación automatizada de células infectadas por T. cruzi en órganos reconstruidos y despejados en 3D. La microscopía fluorescente de lámina de luz permite visualizar y cuantificar con precisión los parásitos T. cruzi que proliferan activamente y están latentes y las células efectoras inmunes en órganos o tejidos completos. Además, se adoptó con éxito la tubería CUBIC-HistoVision para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. La limpieza de tejidos junto con la inmunotinción 3D proporciona un enfoque imparcial para evaluar exhaustivamente los protocolos de tratamiento farmacológico, mejorar la comprensión de la organización celular de los tejidos infectados por T. cruzi y se espera que avance en los descubrimientos relacionados con las respuestas inmunes anti-T. cruzi, el daño tisular y la reparación en la enfermedad de Chagas.
Introduction
La enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario T. cruzi, es una de las enfermedades tropicales más desatendidas del mundo, causando aproximadamente 13.000 muertes anuales. La infección a menudo progresa de una etapa aguda a una crónica produciendo patología cardíaca en el 30% de los pacientes, incluyendo arritmias, insuficiencia cardíaca y muerte súbita 1,2. A pesar de la fuerte respuesta inmune del huésped provocada contra el parásito durante la fase aguda, un bajo número de parásitos persiste crónicamente durante toda la vida del huésped en tejidos como el corazón y el músculo esquelético. Varios factores, incluyendo el inicio tardío de las respuestas inmunes adaptativas y la presencia de formas no replicantes del parásito, pueden contribuir a la capacidad de T. cruzi para evitar una eliminación completa por el sistema inmune 3,4,5,6. Además, las formas latentes no replicantes del parásito muestran una baja susceptibilidad a los fármacos tripanocidas y pueden ser en parte responsables del fracaso del tratamiento observado en muchos casos 7,8.
El desarrollo de nuevas técnicas de imagen brinda la oportunidad de obtener información sobre la distribución espacial de los parásitos en los tejidos infectados y su relación con las células inmunes involucradas en su control. Estas características son cruciales para una mejor comprensión de los procesos de control de parásitos por parte del sistema inmune y el seguimiento de los raros parásitos latentes presentes en los tejidos crónicos.
La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) es uno de los métodos más completos e imparciales para obtener imágenes 3D de tejidos u órganos grandes sin sección delgada. Los microscopios de lámina de luz utilizan una fina lámina de luz para excitar solo los fluoróforos en el plano focal, reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad de las muestras, y grabar imágenes de miles de capas de tejido utilizando cámaras ultrarrápidas. El alto nivel de transparencia tisular necesario para la correcta penetración de la luz láser en los tejidos se obtiene homogeneizando el índice de refracción (IR) después de la deslipidación y decoloración tisular, lo que reduce la dispersión de la luz y produce imágenes de alta calidad 9,10,11.
Se han desarrollado enfoques de limpieza de tejidos para la obtención de imágenes de ratones enteros 12,13,14, organoides 15,16,17, órganos que expresan marcadores fluorescentes reporteros 18,19,20,21,22,23, y recientemente un número limitado de tejidos humanos 24 . Los métodos actuales para la limpieza de tejidos se clasifican en tres familias: (1) métodos basados en solventes orgánicos como los protocolos DISCO 25,26, (2) métodos basados en hidrogel, como CLARITY27, y métodos acuosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Los protocolos CUBIC mantienen la forma del órgano y la integridad del tejido, preservando la fluorescencia de las proteínas reporteras expresadas endógenamente. La actualización más reciente de esta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), también permite la detección de epítopos utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia y marcado de ADN28.
En el presente protocolo, se utilizó la tubería CUBIC para detectar T. cruzi expresando proteínas fluorescentes en tejidos de ratón intactos clarificados. Se obtuvieron imágenes de tejidos ópticamente transparentes, se reconstruyeron en 3D y se cuantificó automáticamente el número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes latentes y células T por órgano. Además, este protocolo se adoptó con éxito para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. Estos enfoques son esenciales para comprender la expansión y el control de T. cruzi en huéspedes infectados y son útiles para evaluar completamente la quimioterapia e inmunoterapéutica para la enfermedad de Chagas.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y las pautas de acreditación de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. El Protocolo de Uso de Animales (control de la infección por T. cruzi en ratones-A2021 04-011-Y1-A0) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia. B6. Para el presente estudio se utilizaron ratones C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J y C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (hembra,1-2 meses de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).
1. Infección, perfusión y disección
- Infectar intraperitonealmente ratones con tripomastigotes derivados del cultivo tisular de la cepa T . cruzi de Colombiana (DTU TcI) o Brasil (DTU TcV) que expresan proteínas fluorescentes tdTomato o GFP, respectivamente. La dosis de infección podría variar de 50.000 a 200.000 tripomastigotes diluidos en 100 μL de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: Los detalles específicos sobre la generación de parásitos reporteros y modelos de infección en ratones están disponibles en Canavaci et al. 29 y Bustamante et al.30. - Eutanasia a los ratones por inhalación de dióxido de carbono a un caudal de 3-7 L/min. Tan pronto como los animales dejen de mostrar cualquier reflejo pedal, haga una incisión longitudinal a través de la piel desde el abdomen hacia el esternón. Luego corte la pared del cuerpo desde el abdomen y continúe a través de las costillas a cada lado del tórax hasta que el esternón pueda ser levantado, exponiendo el corazón.
- Como se describe en la figura 1, haga una incisión de 2,5 mm en la aurícula derecha del corazón y recoja la sangre drenante con una punta de micropipeta de 1 ml.
- Inserte una aguja de mariposa (conectada a un extremo del sistema de perfusión) en el ápice del ventrículo izquierdo hasta que llegue a la aorta ascendente. Use pegamento a base de gel (consulte la Tabla de materiales) para sellar el orificio de entrada alrededor de la aguja y mantener la aguja en posición durante las perfusiones.
- Perfundir los ratones30 con 50 ml de heparina-PBS fría (pH 7.4, 10 U/ml de heparina) o hasta que el líquido que sale del ratón hacia la bandeja de recolección esté libre de sangre.
- Perfundir con 50 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v) frío (pH 7.4) en PBS.
NOTA: La fijación tisular de PFA es probablemente uno de los pasos críticos del protocolo, especialmente para mantener las estructuras de los epítopos y la posterior inmunodetección. El PFA se degrada con el tiempo, por lo que debe estar recién preparado. El pH de la solución también es importante para evitar la fijación excesiva, lo que podría conducir a una limpieza deficiente de los tejidos.
PRECAUCIÓN: El PFA es moderadamente tóxico por contacto con la piel. La exposición aguda también es altamente irritante para la nariz, los ojos y la garganta. La exposición prolongada a niveles bajos en el aire o la piel puede causar irritación de la piel, como dermatitis y picazón, y problemas respiratorios similares al asma. Use protección para la cara y los ojos y no respire polvo, gas, niebla, vapores o vapores.- Después de la perfusión de PFA, perfundir el ratón con 100 ml de tampón CUBIC-P para alcanzar los niveles de clarificación mencionados en el paso 1.5.
- Para preparar tampón CUBIC-P, disuelva 10% de N-butildietanolamina, Triton X-100 al 5% y 1-N-metilimidazol al 5% en agua de doble destilación o use los cócteles comerciales (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Pasos 1.6.1.-1.6.2. Se recomiendan solo para órganos altamente pigmentados como el corazón y el riñón, ya que requieren un paso previo de limpieza para obtener mayores niveles de transparencia. Después de usar CUBIC-P, diseccionar los órganos y proceder directamente al paso 2: Limpieza de tejidos.
- Diseccionar las muestras de tejido/órganos 30 para obtener imágenes y posfijarlas en 4% (p/v) PFA en PBS (~10 ml/órgano completo) durante la noche (ON) a 4 °C con agitación suave (no más de 5 x g) en tubos cónicos de50 ml.
NOTA: Todas las incubaciones a partir de ahora deben realizarse en tubos colocados horizontalmente a 20-30 °C protegidos de la luz. - Lavar la muestra en 10 ml de PBS (suplementado con azida sódica al 0,05% (NaN 3) durante3 h (tres veces) a temperatura ambiente (RT) con agitación suave (5 x g).
NOTA: Los tejidos se pueden congelar incubando en 10 ml de sacarosa al 30% en PBS con agitación suave (5 x g) a 4 °C ON en tubos cónicos de 50 ml. Después de que los tejidos se hundan hasta el fondo del tubo, insértelos en el compuesto OCT y manténgalos a -80 °C. Descongelar a RT hasta que el compuesto OCT se derrita completamente, luego lavar en PBS (~10 mL/órgano entero) ON a 4 °C con agitación suave (5 x g) en tubos cónicos de 50 ml. Continúe con el paso 2.
2. Limpieza de tejidos
NOTA: Todos los aclaramientos de tejidos realizados en este trabajo se realizaron utilizando el protocolo CUBICI 22. Se utilizaron tres cócteles diferentes: CUBIC-P para la delipidación y la decoloración rápida durante las perfusiones, CUBIC-L para la delipidación y decoloración, y CUBIC-R para la coincidencia de RI. La tinción de ADN y las inmunotinciones se realizaron utilizando el kit de tinción nuclear CUBIC-HV 1 3D y el kit de inmunotinción CUBIC-HV 1 3D, respectivamente (ver Tabla de materiales).
- Sumerja los órganos individuales en 10 ml de CUBIC-L diluido en agua al 50% (consulte la Tabla de materiales) con agitación suave (5 x g) a RT (ON) en tubos cónicos de 50 ml. Mantenga los tubos planos sobre la placa de agitación.
NOTA: Para evitar daños tisulares, los órganos se mantienen en el mismo tubo y las soluciones se recogen utilizando un sistema de vacío. Para preparar CUBIC-L, disuelva 10% de N-butildietanolamina y 10% de Triton X-100 en agua de doble destilación usando los cócteles comerciales (ver Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: CUBIC-L causa daño ocular grave. Use protección para los ojos y la cara. Deseche en una planta de eliminación de residuos aprobada. - Sumerja la muestra en 10 mL de 100% CUBIC-L durante 6 días (refrescando la solución el día 3).
NOTA: Al final de este período de incubación, los tejidos deben ser casi completamente transparentes. - Lavar los órganos transparentes con PBS (suplementado con NaN3 al 0,05%) durante 2 h (tres veces) a 37 °C con agitación suave (5 x g). Transfiera los tejidos a un nuevo tubo cónico de 50 ml con cada lavado para eliminar Triton X-100.
NOTA: Como se describe en la Figura 2B, si el objetivo del experimento es visualizar proteínas reporteras expresadas endógenamente de parásitos transgénicos T. cruzi o ratones (Figura 2C-F), omita los pasos 3, 4 y 5 y continúe directamente al paso 6.
3. Tinción de ADN
- Diluir el colorante de ácido nucleico disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en 5 ml de tampón de tinción (incluido en el kit) a 1/2.500 de dilución.
- Sumergir el tejido en la solución de colorante nuclear e incubar a 37 °C con una rotación suave durante 5 días utilizando tubos cónicos de 15 ml en posición de pie.
- Lavar con 15 ml de tampón de lavado de tinción nuclear 3D (incluido en el kit) durante 2 h (tres veces) a RT con agitación suave (5 x g).
NOTA: Se pueden usar otros colorantes de ADN en estas concentraciones y tiempos de incubación: DAPI (incluido en el kit): 1/200, 5 días de incubación; BOBO-1: 1/400, 5 días de incubación; Yoduro de propidio (PI) (incluido en el kit): 1/100, 3 días de incubación; RedDot2: 1/250, 3 días de incubación. Si el objetivo específico del experimento es visualizar ambas proteínas reporteras expresadas endógenamente y usar tinciones nucleares, omita los pasos 4 y 5 y continúe directamente al paso 6.
4. Digestión de la matriz extracelular (ECM)
NOTA: La digestión de la hialuronidasa de la ECM debe realizarse para facilitar la penetración adecuada de los anticuerpos en las regiones profundas de los tejidos28.
- Sumergir órganos individuales en 15 ml de tampón de reacción de hialuronidasa durante 2 h a 37 °C en un tubo cónico de 50 ml en posición plana protegido de la luz.
NOTA: Para preparar el tampón de reacción de la hialuronidasa, disolver 10 mM de CAPSO; 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), y 0,05% de NaN3 (ver Tabla de materiales) en agua de doble destilación y ajustar el pH a 10. - Prepare la solución enzimática mezclando 75 μL de 20 mg/ml de stock de hialuronidasa en 425 μL de tampón de reacción de hialuronidasa. Para preparar 20 mg/ml de cepa de hialuronidasa, disuelva la hialuronidasa en 50 mM de tampón carbonato, 150 mM de NaCl, 0,01% de BSA y 0,05% de NaN3 (ver Tabla de materiales). Ajustar el pH a 10 y alícuota en volúmenes de 77 μL a -30 °C.
- Desechar el tampón de reacción de la hialuronidasa con una pipeta y sumergir el órgano en la solución enzimática (500 μL en un tubo cónico de 15 ml) en posición de pie protegida de la luz durante 24 h a 37 °C con agitación suave (5 x g).
- Lavar la muestra en 15 ml de tampón de lavado hialuronidasa en un tubo cónico de 50 ml en posición horizontal protegido de la luz durante 2 h (tres veces) a 37 °C con agitación suave (5 x g).
- Para preparar tampón de lavado de hialuronidasa, disuelva 50 mM de tampón de carbonato, 150 mM de NaCl, 0.1% (v / v) de Triton X-100, 5% (v / v) de metanol y 0.05% NaN3. Ajuste el pH a 10. Para preparar 10x stock tampón de carbonato-NaCl, disuelva 2,96 g de carbonato de sodio, 1,86 g de carbonato de hidrógeno de sodio y 8,77 g de NaCl en 100 ml de agua doble destilada con 0,05% de NaN3 (consulte la Tabla de materiales) y ajuste el pH a 10.
5. Inmunotinción
- Etiquete la vasculatura con anticuerpos anti-α-SMA (actina de músculo alfa-pequeño, consulte la Tabla de materiales) siguiendo los pasos a continuación.
- Generar complejo de anticuerpos secundarios de fragmentos Fab primarios más conjugados. Comience esta reacción 1,5 h antes del procedimiento de tinción.
- Calcule la cantidad requerida de anticuerpos primarios y secundarios (mezcle en una proporción de 1:0.5 por peso).
NOTA: Para el anticuerpo primario anti-α-SMA, se necesitan 3,5 μg para marcar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 2,5 mg/ml, se necesitan 3,5/2,5 = 1,4 μL de solución de anticuerpos. Para el anticuerpo secundario AlexaFluor 647 anti-ratón Fab fragmento, se necesitan 1,75 μg para etiquetar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 1,7 mg/ml, se necesitan 1,75/1,7 = 1 μL de solución de anticuerpos. - Mezclar anticuerpos primarios y secundarios en un tubo ámbar de 2 ml e incubar durante 1,5 h a 37 °C.
- Calcule la cantidad requerida de anticuerpos primarios y secundarios (mezcle en una proporción de 1:0.5 por peso).
- Para el intercambio de tampón, mezcle 7,5 ml de tampón de inmunotinción HV1 3D 2x (incluido en el kit, consulte la Tabla de materiales) con 7,5 ml de agua doble destilada y sumerja la muestra de tejido durante 1,5 h a 32 °C con agitación suave (5 x g) en un tubo cónico de 15 ml en posición horizontal. Iniciar esta reacción simultáneamente como la generación de complejo de anticuerpos (1,5 h antes del procedimiento de inmunotinción).
- Generar complejo de anticuerpos secundarios de fragmentos Fab primarios más conjugados. Comience esta reacción 1,5 h antes del procedimiento de tinción.
- Realice la inmunotinción 3D siguiendo los pasos a continuación.
- En un tubo cónico de 15 ml, preparar la solución de tinción de anticuerpos siguiendo el archivo complementario 1.
- Recoger la muestra de tejido del medio de intercambio tampón (paso 5.1.2) y sumergirla en la solución de tinción de anticuerpos. Incubar los tejidos individualmente durante 1 semana a 32 °C con una agitación suave (5 x g) de los tubos en posición de pie protegidos de la luz. Selle el tubo con película de parafina para evitar la evaporación.
- Desplazar a 4 °C e incubar ON de pie.
- Enfriar 1x tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D (incluido en el kit, ver Tabla de materiales) a 4 °C y lavar la muestra con tampón de 15 ml (dos veces) durante 30 min cada una a 4 °C con agitación suave (5 x g). Conservar los tubos cónicos de 15 ml en posición horizontal hasta el paso 5.2.7.
- Diluir la formalina al 1% en 1x tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D y sumergir la muestra en 8 ml de la solución durante 24 h a 4 °C con agitación suave (5 x g).
- Incubar en solución fresca de formalina al 1% durante 1 h a 37 °C con agitación suave (5 x g).
- Lavar en 15 mL de PBS durante 2 h a 25 °C con agitación suave (5 x g).
- Aumente la señal de tdTomato utilizando anticuerpos anti-proteína fluorescente roja (RFP) siguiendo los pasos a continuación.
- Siga los mismos tiempos de incubación y temperaturas que en el paso 5.2.2. Calcule la cantidad de anticuerpos primarios y secundarios (consulte la Tabla de materiales) y mézclelos en una proporción de 1:0.5 en peso.
NOTA: Para el anticuerpo primario anti-RFP, se necesitan 5 μg para etiquetar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 1,25 mg/ml, se requieren 5/1,25 = 4 μL de la solución. Para el anticuerpo secundario Alexa Fluor 647 anti-conejo Fab fragmento, se necesitan 2,5 μg para etiquetar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 1,5 mg/ml, se necesitan 2,5/1,5 = 1,7 μL de la solución. - Prepare la solución de tinción de anticuerpos como se menciona en el Archivo complementario 1.
- Siga los mismos tiempos de incubación y temperaturas que en el paso 5.2.2. Calcule la cantidad de anticuerpos primarios y secundarios (consulte la Tabla de materiales) y mézclelos en una proporción de 1:0.5 en peso.
- Aumente las señales de GFP utilizando nanocuerpos anti-GFP siguiendo los pasos a continuación.
- Siga los mismos tiempos de incubación y temperaturas que se mencionan en el paso 5.2.2.
NOTA: Los nanocuerpos anti-GFP (consulte la Tabla de materiales) se conjugan con Alexa Fluor 647, por lo que la generación de complejos de anticuerpos es innecesaria. - Prepare la solución de tinción de anticuerpos como se menciona en el Archivo complementario 1.
- Siga los mismos tiempos de incubación y temperaturas que se mencionan en el paso 5.2.2.
6. Coincidencia de RI
- Sumerja los órganos transparentes en 5 ml de solución CUBIC-R+ diluida en agua al 50% (consulte la Tabla de materiales) en RT (ON) con agitación suave (5 x g) en un tubo cónico de 50 ml. Mantenga los tubos de pie durante todo el paso de emparejamiento de RI.
NOTA: Las soluciones CUBIC R+ recicladas de experimentos anteriores podrían reutilizarse (hasta cuatro veces) en este paso. Para preparar la solución CUBIC-R+, disuelva el 45% de 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolona (Antipirina), el 30% de nicotinamida o N-metilnicotinamida y el 0,5% de N-butildietanolamina en agua de doble destilación o use el tampón CUBIC-R+ comercial (ver Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: CUBIC-R+ causa irritación de la piel, irritación ocular grave y daño a los órganos. Use guantes protectores y asegúrese de proteger los ojos y la cara. No respire polvo, humos, gases, niebla o vapores. Desechar en una planta de eliminación de residuos aprobada. - Reemplace 50% CUBIC-R+ con 5 mL de 100% CUBIC-R+ e incubar con agitación suave (5 x g) a RT durante 2 días. Luego, transfiera los tejidos a una pila de toallitas sin pelusa y gire cuidadosamente los tejidos para eliminar la solución CUBIC-R + de las superficies de los órganos durante 5 minutos.
7. Montaje
- Después de secar los tejidos, transfiéralos a 5 ml de solución de montaje (RI = 1.520) (ver Tabla de materiales) en una placa de cultivo celular de seis pocillos e incubarlos (ON) en RT. Gire con frecuencia los tejidos para eliminar las burbujas de aire, especialmente en las superficies de los órganos.
NOTA: Los órganos se pueden almacenar durante más de 6 meses en solución de montaje o CUBIC-R +. - Adhiera los tejidos al soporte de la muestra del microscopio usando pegamento de gel a base de cianoacrilato.
- Sumerja las muestras en la cubeta de cuarzo del microscopio llena de 120 ml de solución de montaje y obtenga imágenes transversales a su eje longitudinal. Adhiera el corazón con el ápice y la aorta alineados horizontalmente.
NOTA: Los órganos despejados y montados se pueden seccionar con un vibratomo y obtener imágenes a gran aumento mediante microscopía confocal. Incrustar los órganos en agarosa al 2% y cortar secciones de 100-500 μm. Los órganos también se pueden seccionar manualmente con una cuchilla afilada para producir secciones de tejido grueso (>1000 μm). Después de seccionar, coloque las rodajas en placas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio, monte con la misma solución de montaje, selle con esmalte de uñas e imagine con un microscopio confocal.
8. Adquisición de imágenes
- Imagen de las muestras montadas con un microscopio de hoja de luz (consulte la Tabla de materiales). Establezca la ampliación y el tamaño de paso entre cortes individuales a 3 μm, y use láseres de lámina de luz derecha e izquierda con espesores de 5 μm y 100% de ancho. Ajuste la constante de tiempo de exposición a 50-100 ms y ajuste la potencia del láser del 10% al 80% dependiendo de la intensidad de la señal de fluorescencia.
- Para la codetección de parásitos que expresan tdTomate y amastigotes latentes teñidos con DiR (Figura 2C), utilice canales rojo (Ex/Em 561/620-660 nm) e infrarrojo (Ex/Em 785/845-55 nm), respectivamente. Para la co-detección de linfocitos T y parásitos que expresan tdTomato-en ratón reportero CD8 (Figura 2D), use verde (Ex/Em 488/525-50 nm) y canal rojo, respectivamente.
- Para los ensayos de coinfecciones (Figura 2E), así como para la co-detección de parásitos que expresan GFP en núcleos ratones reporteros (Figura 2F), utilice los canales verde y rojo, respectivamente. Para la detección de parásitos que expresan tdTomato, colorante nuclear y vasculatura cardíaca (Figura 3B, C), use los canales rojo, verde y rojo lejano (Ex / Em 640 / 680-730 nm), respectivamente.
- Detectar anticuerpos anti-RFP con el canal rojo lejano y nanocuerpos anti-GFP utilizando el canal verde (Figura 3D).
- Convierta las pilas de imágenes TIFF adquiridas y reconstruya en 3D los órganos utilizando el software Imaris v9.7.2 (consulte la Tabla de materiales).
9. Reconstrucción y cuantificación de superficies con el software Imaris
- Seleccione la herramienta de algoritmo de detección de superficies e inicie el asistente en el software de análisis de imágenes.
- Realice un análisis inicial en una región 3D de interés (seleccionada al azar) y luego aplíquelo a toda la reconstrucción del órgano 3D. Después de elegir una región de interés (ROI), seleccione el canal a analizar, desmarque el botón suave y seleccione la resta de fondo.
NOTA: La sustracción de fondo calcula un valor de fondo local único para cada vóxel y lo resta del valor de píxel original. El diámetro de la esfera más grande que cabe en el objeto debe ser de hasta 200 μm para las células infectadas por T. cruzi, 10 μm para las células T y 5 μm para los parásitos individuales. - Utilice el histograma para ajustar la clasificación y la lista desplegable de filtros para seleccionar las medidas para la clasificación.
NOTA: Utilice el histograma para ajustar la clasificación: se recomiendan mediciones de elipticidad (achatación) y esfericidad. - Finalice el asistente, presione el botón de estadísticas y recupere el número total de células infectadas por parásitos o células T como el número de componentes desconectados por punto de tiempo.
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Representative Results
Los tejidos fijos CUBIC se lavaron con PBS para eliminar los fijadores y luego se incubaron con cócteles CUBIC-L, una solución tamponada básica de aminoácidos alcoholes que extraen pigmentos y lípidos del tejido, lo que resulta en la decoloración del tejido mientras se mantiene la arquitectura del tejido. Las líneas de cuadrícula en el papel se pueden ver a través de los tejidos que indican una limpieza adecuada de los órganos (Figura 2A). Después de la deslipidación, los tejidos se lavaron y se sumergieron en CUBIC-R+ y solución de montaje para homogeneización de RI e imagen, respectivamente (Figura 2B).
Un ratón de tipo salvaje fue infectado con tripomastigotes que expresan tdTomato pre-teñidos con el colorante de cianina del infrarrojo cercano DiR. El ratón fue sacrificado 15 días después de la infección, y el corazón intacto fue disecado, reparado y despejado. Las imágenes de LSFM y la reconstrucción 3D nos permitieron visualizar los parásitos T. cruzi que expresan tdTomato (rojo). Los niveles de autofluorescencia en el canal rojo se pueden utilizar para la correcta visualización de la estructura y los bordes del corazón (Figura 2C i). El LSFM también fue útil para identificar formas latentes resistentes a los fármacos 7,8. La tinción previa a la infección de parásitos con colorante DiR permite el seguimiento de parásitos latentes mediante la visualización de los parásitos que no habían diluido el tinte a través de la replicación, como se informó anteriormente para CellTrace Violet7.
Los parásitos latentes (cian) se pueden identificar en el corazón como se muestra en los recuadros agrandados en 3D (flechas amarillas) (Figura 2C ii, iii). La fluorescencia de proyección Z se segmentó automáticamente para generar un modelo de superficie 3D reconstruido para la visualización espacial y la cuantificación del número total de células infectadas por T. cruzi y parásitos latentes a lo largo de toda la reconstrucción 3D (Figura 2A). El análisis del modelo de superficie 3D reveló 186 células infectadas por T. cruzi con una mayor proporción de células infectadas en la aurícula cardíaca (123) en comparación con los ventrículos (63) y 18 parásitos latentes en todo el corazón (Figura 2C i). En un informe anterior, se informó de una tubería similar para monitorear el número de células infectadas por T. cruzi y parásitos latentes en tejidos de ratones clarificados después del tratamiento farmacológico31. Es importante tener en cuenta que las estimaciones del número de parásitos latentes son probablemente un recuento insuficiente, ya que la técnica de dilución de colorante permite la detección solo de parásitos que no se han replicado significativamente desde la infección inicial, pero no detecta aquellos que se volvieron latentes más adelante en la infección después de múltiples rondas de división.
Se utilizó un enfoque similar para monitorear la interacción entre diferentes cepas de T. cruzi en ratones deficientes en interferón (IFN)-gamma. La producción de IFN-gamma por las células T efectoras es esencial para el control inmune de T. cruzi. En ratones deficientes en IFN-gamma, los parásitos proliferan con una restricción inmune mínima, produciendo un número muy alto de células infectadas en los órganos. Estos modelos inmunodeficientes son herramientas útiles para estudiar la eficacia de nuevos fármacos sin la restricción impuesta por el reconocimiento inmune, y así permiten la detección de la recaída del parásito después del tratamiento. Los ratones deficientes en IFN-gamma fueron coinfectados con cepas de T. cruzi que expresan tdTomato colombiana (rojo) y Brasil (azul) que expresan GFP. Los ratones fueron sacrificados 17 días después de la infección, y los corazones intactos fueron disecados, reparados y despejados. En este modelo inmunodeficiente, las células huésped infectadas con ambas cepas de T. cruzi se pueden observar en varias etapas del desarrollo del parásito, incluidas las células infectadas grandes, medianas y pequeñas y las recientemente explotadas. El corte a través de los tejidos muestra abundantes células infectadas por parásitos en las aurículas del corazón a varias profundidades de tejido (Figura 2E i-iii y Película 1).
Se utilizó un cruce de ratones C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J y B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, en los que todas las células T expresan la proteína fluorescente verde ZsGreen1, para monitorizar el reclutamiento de células T en tejidos infectados por T. cruzi. Los ratones fueron sacrificados 14 días después de la infección con parásitos que expresan tdTomato, y el músculo esquelético fue extirpado, eliminado e imaginado por LSFM. ZsGreen1 que expresaba células T (azul) y células infectadas por T. cruzi (rojo) se detectaron de forma robusta (Figura 2D i y Película 2). Los zoom-ins 3D de la reconstrucción 3D identificaron células T en la región de una célula infectada (Figura 2D ii). Las secciones gruesas de vibratomo (200-500 μm) del mismo tejido nos permiten visualizar la interfaz de las células T y las células infectadas del huésped mediante microscopía confocal (Figura 2D iii).
Una forma alternativa de monitorear los focos de inflamación se basa en la acumulación de núcleos celulares alrededor de las células infectadas por T. cruzi. Para este propósito se utilizó un ratón reportero en el que todos los núcleos celulares expresan la proteína fluorescente tdTomato. La expresión nuclear de tdTomate (rojo) se detectó fácilmente en los tejidos después del proceso de limpieza. Un ratón reportero nuclear fue infectado con parásitos T. cruzi que expresan GFP (cian), y 35 días después de la infección, fue sacrificado, y los músculos esqueléticos fueron extirpados, eliminados y fotografiados por LSFM (Figura 2F i-iii). Las secciones ópticas ampliadas del músculo esquelético revelan un aumento de la celularidad al acumular núcleos rojos a lo largo de los parásitos que expresan GFP (Figura 2F ii). Las secciones de vibrantomo del mismo tejido confirman la acumulación previamente descrita de núcleos rojos a lo largo de parásitos que expresan GFP mediante microscopía confocal (Figura 2F iii).
El protocolo CUBIC también se adaptó para la inmunotinción y el marcado de ADN de órganos y tejidos intactos y despejados infectados con T. cruzi (Figura 3A). Los ratones fueron sacrificados 40 días después de la infección con parásitos que expresan tdTomato, y los corazones fueron disecados, reparados y despejados. El corazón intacto despejado se lavó y se tiñó durante 5 días con un marcador de ADN verde, luego se lavó nuevamente y se inmunotiñó durante 7 días con anticuerpos contra α-SMA. Las muestras fueron fijadas posteriormente, lavadas, emparejadas con RI y fotografiadas con LSFM. La detección simultánea de múltiples señales fluorescentes, incluidos núcleos, vasculatura y células infectadas por T. cruzi, fue posible siguiendo este protocolo. La inmunotinción α-SMA (blanca) presentó altos niveles de señal que revelan la intrincada vasculatura del corazón (Figura 3B ii y Película 3). Una sección óptica de regiones cardíacas más profundas representa la penetración tisular de anticuerpos α-SMA en las condiciones establecidas (Figura 3B v). La tinción de ADN (azul) también mostró buena penetración tisular, niveles de fluorescencia y tinción volumétrica estable. Se identificaron algunas áreas con marcado intenso de ADN en diferentes ubicaciones del corazón (Figura 3B i) y alrededor de las fibras musculares esqueléticas (Figura 3C i y Película 4). Una imagen ampliada del músculo esquelético mostró una acumulación de núcleos azules en áreas con pocos o indetectables parásitos tdTomato, lo que sugiere el reclutamiento de células inmunes en sitios de infección actual o previa por T. cruzi (Figura 3C ii). En otros casos, las células huésped infectadas tenían poca o ninguna evidencia de infiltrados celulares cercanos (flechas blancas) (Figura 3C i). Las secciones de vibranatomo del mismo tejido que en la Figura 3C ii muestran tinción de ADN de células y parásitos que expresan tdTomate por microscopía confocal (Figura 3C iii).
Experimentos previos han demostrado que los parásitos latentes exhibían una expresión baja o insignificante de las proteínas reporteras tdTomato o GFP (Figura 2C ii y iii). Para mejorar la detección de estas proteínas fluorescentes, los tejidos despejados se inmunotiñeron con anticuerpos anti-RFP o -GFP. Los tejidos musculares esqueléticos intactos de ratones infectados con parásitos que expresan tdTomato o GFP se fijaron, aclararon e inmunotiñeron con anticuerpos contra RFP (RFP Booster) (Figura 3D) o nanocuerpos contra GFP conjugados con Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Figura 3E), respectivamente. Las muestras fueron fijadas posteriormente, lavadas, emparejadas con RI y fotografiadas con LSFM. En ambos casos, el aumento de las señales GFP y tdTomato por los anticuerpos dio lugar a una fuerte fluorescencia (Figura 3D ii y 3E ii). Las inmunotinciones que utilizan anticuerpos estimulantes representan una herramienta versátil que se utilizará para detectar T. cruzi latentes en órganos y tejidos completos clarificados y detectar cualquier señal subrepresentada de RFP o proteínas reporteras de miembros de la familia GFP.
Figura 1: Inserción de la aguja durante la perfusión transcardíaca. (A) Una representación esquemática que muestra los pasos realizados antes de perfundir el ratón a través del corazón y la posición y dirección correctas de la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo. Se realizó una pequeña incisión en la aurícula derecha y se recolectó sangre drenante (1); Se insertó una aguja de mariposa en el ápice del corazón. Mantenga la dirección para que la aguja no perfore el tabique (2). El orificio de entrada alrededor de la aguja se selló con pegamento a base de gel (3). El hígado está lleno de sangre y aparece rojo antes de la perfusión; Sin embargo, después de la perfusión, pierde pigmentación y se vuelve pálido. AR: aurícula derecha; LA: aurícula izquierda; RV: ventrículo derecho; VI: ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización de células infectadas por T. cruzi, amastigotes latentes y focos de inflamación en órganos despejados. (A) Esquema de órgano completo T. cruzi-detección de células infectadas mediante limpieza de tejidos, imágenes LSFM y cuantificación asistida por software en modelos de superficie 3D. (Yo) Imágenes de campo brillante del corazón y el músculo esquelético antes (izquierda) y después (derecha) de la limpieza (barra de escala: 1000 μm). (Ii) Microscopio de fluorescencia de lámina de luz. (Iii) Ratón deficiente en IFN-gamma fue infectado con 2 x 105 tdTripomastigotes que expresan tomate. A los 17 días después de la infección, se diseccionó el corazón, se eliminó CUBIC y se tomaron imágenes de LSFM (barra de escala: 500 μm). (Iv) La fluorescencia de proyección Z se segmentó automáticamente para generar un modelo de superficie 3D reconstruido para la visualización espacial y la cuantificación del número de T. cruzi-células infectadas. Un total de 736 T. cruzi-Se detectaron células infectadas en todo el corazón (barra de escala: 500 μm). (v) muestra los aumentos del volumen indicado en (Iv), donde los objetos cian representan T. cruzi-células infectadas (barra de escala: 50 μm). (B) Protocolo de depuración de órganos enteros CUBIC. (C) Visualización de proliferantes y latentes T. cruzi Parásitos en corazón de ratón transparente. (Yo) Un ratón de tipo salvaje fue infectado con 2 x 105 tripomastigotes que expresan tdTomate teñidos con un colorante de cianina infrarroja cercana DiR. El corazón fue diseccionado, despejado y LSFM fotografiado. tdProliferación que expresa tomate (rojo) y latente (cian) T. cruzi Los parásitos pueden ser identificados. Los niveles de autofluorescencia se mantuvieron para permitir la visualización correcta de la estructura del corazón. Un ratón fue asesinado 15 días después de la infección basado en el pico de células infectadas por parásitos y amastigotes latentes encontrados en trabajos anteriores (barra de escala: 400 μm). (Ii) y iii) mostrar aumentos del volumen indicado en (Yo), donde las flechas amarillas indican parásitos latentes (cian) (barra de escala: 200 μm). (D) Detección del reclutamiento de linfocitos T en ratón reportero CD8 infectado. (Yo) El ratón reportero fue infectado con 2 x 105 Los tripomastigotes que expresan tdTomato, y el músculo esquelético se diseccionaron, eliminaron y se tomaron imágenes de LSFM 14 días después de la infección, un punto de tiempo en el que se detectan respuestas celulares sustanciales. ZsGreen1 que expresa células T (azul) así como T. cruzi-Se visualizaron células infectadas (rojo) (barra de escala: 400 μm) (ver también Película 2). (Ii) muestra los aumentos del volumen indicado en (Yo) (barra de escala: 50 μm). (Iii) representa la acumulación de células T que rodean un T. cruzi-célula infectada en una sección tisular (200 μm) del mismo órgano (barra de escala: 8 μm). (E) Interacción entre diferentes T. cruzi Cepas. (Yo) Los ratones deficientes en IFN-gamma fueron coinfectados con 2 x 105 tdColombiana que expresa tomate (rojo) y Brasil que expresa GFP (azul) T. cruzi Cepas. Los ratones fueron sacrificados, y los corazones intactos fueron diseccionados, fijados y despejados a los 17 días posteriores a la infección (barra de escala: 400 μm). (Ii) muestra los aumentos del volumen indicado en (Yo) (barra de escala: 250 μm). (Iii) muestra una sección óptica ampliada que revela células infectadas con Colombiana (rojo) y Brasil (azul) T. cruzi deformaciones (barra de escala: 150 μm). (F) Visualización de la celularidad a lo largo de las células infectadas utilizando núcleos de ratón reportero. (Yo) Un ratón reportero nuclear fue infectado con 2 x 105 Los tripomastigotes que expresan GFP y el músculo esquelético se diseccionaron, eliminaron y se obtuvieron imágenes de LSFM a los 35 días posteriores a la infección. Se detectó la expresión nuclear de tdTomato de las células huésped (rojo), así como la expresión del parásito GFP (cian) (barra de escala: 400 μm). (Ii) muestra una sección óptica ampliada que revela la acumulación de núcleos rojos a lo largo de parásitos que expresan GFP (barra de escala: 90 μm). (Iii) confirma el aumento de la celularidad mediante imágenes confocales de secciones de tejido del mismo órgano (barra de escala: 8 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Etiquetado de órganos infectados por T. cruzi con anticuerpos y tinciones nucleares. (A) Protocolo CUBIC para la limpieza de tejidos, inmunotinción 3D y etiquetado de ADN de órganos completos. (B) Etiquetado del corazón del ratón para la vasculatura y la detección del ADN (véase también la película 3). (i-iii) Un ratón de tipo salvaje fue infectado con 2 x 105 tdparásitos que expresan tomates. El ratón fue sacrificado 40 días después de la infección, y el corazón fue diseccionado, reparado y despejado. El corazón despejado fue marcado con un marcador de ADN e inmunoteñido con anticuerpos contra α-SMA. La detección simultánea de núcleos celulares (azules), vasculatura (blanco) y células infectadas por T. cruzi (rojo) fueron posibles. El ratón murió en este momento después de la infección cuando se puede evaluar la remodelación del tejido y la vasculatura especial (barra de escala: 400 μm). (iv) muestra un volumen magnificado de las regiones profundas del corazón de (iii) que representa núcleos celulares, vasculatura y células infectadas (barra de escala: 90 μm). (v) representa una sección óptica obtenida de (iii) (barra de escala: 90 μm). (C) Aumento de la celularidad visualizada por el etiquetado de ADN de todo el músculo esquelético aclarado. (i) El tejido muscular esquelético del experimento anterior se tiñó de ADN, revelando áreas con marcado nuclear intenso (azul), así como células infectadas por T. cruzi (rojo) (barra de escala: 200 μm) (ver también Película 4). (ii) revela una intensa acumulación de núcleos azules en áreas con menor o nula detección del parásito tdTomato (barra de escala: 100 μm). (iii) imágenes confocales de gran aumento (60x) identifican el marcado de ADN de células y parásitos en secciones de tejido (barra de escala: 10 μm). (D) Aumento de los marcadores reporteros del parásito tdTomato en todo el músculo esquelético despejado. (i-iii) Los tejidos musculares esqueléticos intactos de ratones infectados con 2 x 105 parásitos que expresan tdTomato se fijaron, aclararon e inmunotiñeron con anticuerpos contra RFP (RFP Booster). Se obtuvo una señal fluorescente intensa y uniforme en el canal rojo lejano después del aumento de RFP (verde) de la señal tdTomato (rojo) (barra de escala: 100 μm). (E) Refuerzo de los marcadores de reporteros de parásitos GFP utilizando nanocuerpos anti-GFP. (i-iii) Los tejidos del músculo esquelético de ratones infectados con 2 x 105 parásitos que expresan GFP se fijaron, aclararon e inmunotiñeron con nanocuerpos conjugados con Alexa Fluor 647 contra GFP (GFP Booster). Se obtuvo una fuerte señal fluorescente en el canal rojo lejano después del aumento de GFP (magenta) de la fluorescencia de GFP (cian). Los ratones de (D) y (E) murieron 30 días después de la infección porque las cargas de parásitos alcanzan un pico en este punto de tiempo, y las células infectadas por parásitos se pueden detectar fácilmente en el músculo esquelético (barra de escala: 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Infección por T. cruzi del corazón y el músculo esquelético en ratones deficientes en IFN-gamma. Reconstrucciones 3D de tejidos clarificados por CUBIC de ratones deficientes en IFN-gamma coinfectados con 2 x 10cepas de 5 tdTomato-expresando Colombiana (rojo) y Brasil (azul) que expresan GFP (azul) en el día 17 post-infección. Un total de 1151 cortes individuales del corazón y 559 del músculo esquelético fueron adquiridos a través de LSFM. Se lograron resultados de imagen comparables en tres animales independientes. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 2: Detección del reclutamiento de células T en ratón reportero CD8 infectado con T. cruzi. Visualización 3D de un músculo esquelético clarificado por CUBIC de un ratón reportero CD8 infectado con 2 x 10 cepa de T. cruzi colombiana que expresa5 Tdtomato (rojo) y muerto a los 14 días después de la infección. Un total de 668 cortes individuales del músculo esquelético fueron fotografiados por LSFM. Se visualizaron células T que expresan ZsGreen1 (azul) y células infectadas con T. cruzi (rojo). Se lograron resultados de imagen comparables en dos animales. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 3: Inmunodetección de vasculatura en corazón infectado y aclarado por T. cruzi. Reconstrucción 3D de un corazón clarificado por CUBIC de ratones de tipo salvaje infectados con 2 x 105 tdTomato-expresando Colombiana T. cruzi e inmunoteñidos con anticuerpos contra α-SMA (azul) a los 40 días después de la infección. El corte a través del corazón revela la intrincada vasculatura del corazón y la penetración tisular de los anticuerpos α-SMA. Las células infectadas con parásitos se podían observar como manchas rojas brillantes en las aurículas del corazón (rojo, derecha). Se lograron resultados de imagen comparables en dos animales. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 4: La tinción de ADN de todo el órganorevela áreas con mayor celularidad. Reconstrucción 3D del músculo esquelético clarificado por CUBIC de ratón de tipo salvaje a los 40 días después de la infección infectado con 2 x 105 tdColombiana T. cruzi que expresa tomato. Toda el área muscular del cuádriceps se tiñó con un tinte nuclear verde. Se visualizaron las células infectadas por T. cruzi (rojo) y los núcleos de cada célula en el tejido (azul). Los zoom-ins de la reconstrucción 3D revelan la acumulación de núcleos azules a lo largo de áreas con poca o ninguna detección de parásitos tdTomato. Se lograron resultados de imagen comparables en dos animales. Haga clic aquí para descargar esta película.
Archivo complementario 1: Composición de las soluciones de tinción de anticuerpos utilizadas en el estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La ausencia de imágenes extensas de los parásitos y la respuesta inmune en todo el órgano limita la comprensión de la complejidad de las interacciones huésped-parásito e impide la evaluación de las terapias para la enfermedad de Chagas. El presente estudio adoptó la tubería CUBIC para aclarar y teñir órganos y tejidos intactos de ratones infectados con T. cruzi.
En este estudio se probaron múltiples protocolos de limpieza de tejidos (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 y fDISCO13); sin embargo, solo CUBIC conservó altos niveles de fluorescencia del parásito tdTomato o GFP. Del mismo modo, informes anteriores mostraron la preservación cúbica de marcadores expresados endógenamente en comparación con otros enfoques de limpieza de tejidos35.
La capacidad de resolución limitada es una de las advertencias actuales de la microscopía de lámina de luz convencional. Esto es evidente en las dificultades para resolver parásitos individuales en células muy infectadas (Figura 2C). Los microscopios de lámina de luz de mosaico recientemente desarrollados con una capacidad de resolución mejorada y la adaptación de técnicas de expansión tisular podrían resolver este problema36.
Las impurezas de los tampones de lavado, soluciones de limpieza u otros órganos pueden precipitarse en el tejido, produciendo señales no específicas que pueden confundirse con células infectadas por parásitos, parásitos individuales u otras estructuras. Sin embargo, estos artefactos generalmente fluorescen intensamente en múltiples canales, por lo que después del análisis de imágenes, pueden descartarse fácilmente del conteo automatizado mediante imágenes de tejidos en un canal alternativo (generalmente el canal verde). Los objetos de doble color se consideraron artefactos y se excluyeron para la cuantificación automatizada.
Las tinciones nucleares DAPI, PI, RedDot2 y SYTOX-G, presentan buenos niveles de penetración tisular e intensidades de señal en la mayoría de los órganos eliminados por CUBIC; sin embargo, el colorante de ADN verde mostró el mejor rendimiento (Figura 3B, C y Película 4).
Estos resultados mostraron que las células infectadas con T. cruzi podrían detectarse fácilmente y cuantificarse con precisión al mismo tiempo que identificaban señales de ratones reporteros de células T o núcleos. Lo más importante es que LSFM detectó eventos biológicos raros, como amastigotes latentes DiR-positivos, dentro de un entorno de tejido complejo con la capacidad potencial de expandirlo a la inmunotinción de epítopos y el etiquetado de ADN. Los estudios actuales también están explorando la utilidad de estos enfoques para monitorear la activación de las células efectoras inmunes, las interacciones entre múltiples cepas de parásitos en el mismo huésped y la inducción de daño tisular y reparación en la enfermedad de Chagas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Etsuo Susaki por su valiosa ayuda y recomendaciones con respecto a los protocolos de limpieza de tejidos e inmunotinción. Además, agradecemos a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core por el apoyo técnico que utiliza LSFM e imágenes confocales. También agradecemos a todos los miembros del Grupo de Investigación Tarleton por sus útiles sugerencias a lo largo de este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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