Summary
Mevcut protokol, bozulmamış, temizlenmiş organ ve dokulardaki çoğalan ve uykuda olan Trypanosoma cruzi parazitlerini ve T hücrelerini görselleştirmek ve hassas bir şekilde ölçmek için ışık tabakası floresan mikroskopisi ve otomatik yazılım destekli yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknikler, tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güvenilir bir yol sağlar ve parazit-konakçı etkileşimlerine yeni bakış açıları sunar.
Abstract
Chagas hastalığı, başta Latin Amerika olmak üzere dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen ihmal edilmiş bir patolojidir. Chagas hastalığı ajanı Trypanosoma cruzi (T. cruzi), insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli türünü enfekte eden, kalp ve sindirim patolojilerine neden olan çeşitli biyolojiye sahip zorunlu bir hücre içi parazittir. Chagas hastalığının karmaşık biyolojisini anlamak ve tedavi rejimlerinin sonucunu doğru bir şekilde değerlendirmek için T. cruzi in vivo enfeksiyonlarının güvenilir bir şekilde tespit edilmesi uzun zamandır gereklidir. Mevcut protokol, 3D yeniden yapılandırılmış, temizlenmiş organlarda T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin otomatik olarak ölçülmesi için entegre bir boru hattı göstermektedir. Işık tabakası floresan mikroskopisi, tüm organ veya dokularda aktif olarak çoğalan ve uykuda olan T. cruzi parazitlerinin ve bağışıklık efektör hücrelerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Ayrıca, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle düzgün bir şekilde etiketlenmesini sağlamak için CUBIC-HistoVision boru hattı başarıyla kabul edildi. 3D immün boyama ile birlikte doku temizleme, ilaç tedavi protokollerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek, T. cruzi ile enfekte olmuş dokuların hücresel organizasyonunun anlaşılmasını geliştirmek için tarafsız bir yaklaşım sağlar ve Chagas hastalığında anti-T. cruzi immün yanıtları, doku hasarı ve onarımı ile ilgili keşifleri ilerletmesi beklenmektedir.
Introduction
Protozoan parazit T. cruzi'nin neden olduğu Chagas hastalığı, dünyanın en çok ihmal edilen tropikal hastalıkları arasındadır ve yılda yaklaşık 13.000 ölüme neden olmaktadır. Enfeksiyon sıklıkla akuttan kronik bir aşamaya ilerleyerek hastaların %30'unda kardiyak patoloji oluşturur ve buna aritmiler, kalp yetmezliği ve ani ölüm 1,2. Akut fazda parazite karşı ortaya çıkan güçlü konakçı bağışıklık tepkisine rağmen, konakçının yaşamı boyunca kalp ve iskelet kası gibi dokularda kronik olarak düşük sayıda parazit devam eder. Adaptif immün yanıtların gecikmiş başlangıcı ve parazitin replikasyon yapmayan formlarının varlığı da dahil olmak üzere çeşitli faktörler, T. cruzi'nin bağışıklık sistemi tarafından tamamen ortadan kaldırılmasını önleme kapasitesine katkıda bulunabilir 3,4,5,6. Ayrıca, parazitin replikasyon yapmayan uykudaki formları, tripanosidal ilaçlara karşı düşük bir duyarlılık gösterir ve kısmen birçok durumda gözlenen tedavi başarısızlığından sorumlu olabilir 7,8.
Yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi, enfekte dokulardaki parazitlerin mekansal dağılımı ve kontrollerinde yer alan bağışıklık hücreleri ile ilişkileri hakkında fikir edinme fırsatı sunmaktadır. Bu özellikler, bağışıklık sistemi tarafından parazit kontrol süreçlerinin daha iyi anlaşılması ve kronik dokularda bulunan nadir uyuyan parazitlerin izlenmesi için çok önemlidir.
Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), büyük doku veya organların ince kesitleme olmadan 3D görüntülenmesi için en kapsamlı ve tarafsız yöntemlerden biridir. Işık tabakası mikroskopları, yalnızca odak düzlemindeki floroforları uyarmak, örneklerin fotobeyazlatmasını ve fototoksisitesini azaltmak ve ultra hızlı kameralar kullanarak binlerce doku katmanının görüntülerini kaydetmek için ince bir ışık tabakası kullanır. Lazer ışığının dokulara uygun şekilde nüfuz etmesi için gerekli olan yüksek doku saydamlık seviyesi, doku delipidasyonu ve renk dejenerasyonunu takiben kırılma indisinin (RI) homojenize edilmesiyle elde edilir, bu da ışığın saçılmasını azaltır ve yüksek kaliteli görüntüler oluşturur 9,10,11.
Bütün farelerin12,13,14, organoidlerin15,16,17, muhabir floresan belirteçleri eksprese eden organların18,19,20,21,22,23 ve son zamanlarda sınırlı sayıda insan dokusunun görüntülenmesi için doku temizleme yaklaşımları geliştirilmiştir 24 . Doku temizleme için mevcut yöntemler üç aileye ayrılmıştır: (1) DISCO protokolleri 25,26 gibi organik çözücü bazlı yöntemler, (2) CLARITY27 gibi hidrojel bazlı yöntemler ve CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) gibi sulu yöntemler18,19,28,29 . CUBIC protokolleri, endojen olarak eksprese edilen muhabir proteinlerinin floresansını koruyarak organ şeklini ve doku bütünlüğünü korur. Bu tekniğin en son güncellemesi olan CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), floresan etiketli antikorlar ve DNA etiketleme28 kullanılarak epitopların tespit edilmesine de izin verir.
Bu protokolde, berraklaştırılmış bozulmamış fare dokularında floresan proteinleri eksprese eden T. cruzi'yi tespit etmek için CUBIC boru hattı kullanılmıştır. Optik olarak şeffaf dokular LSFM ile görüntülendi, 3D rekonstrükte edildi ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin, uykudaki amastigotların ve organ başına T hücrelerinin kesin toplam sayısı otomatik olarak ölçüldü. Ayrıca, bu protokol, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle tek tip etiketlenmesini sağlamak için başarıyla kabul edildi. Bu yaklaşımlar, enfekte konakçılarda T. cruzi'nin genişlemesini ve kontrolünü anlamak için gereklidir ve Chagas hastalığı için kemo- ve immüno-terapötiklerin tam olarak değerlendirilmesinde yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası ve Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği akreditasyon kılavuzlarına sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan Kullanım Protokolü (farelerde T. cruzi enfeksiyonunun kontrolü-A2021 04-011-Y1-A0) Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. B6. Bu çalışmada C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J ve C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J fareleri (dişi,1-2 aylık) kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Enfeksiyon, perfüzyon ve diseksiyon
- İntraperitoneal olarak fareleri, sırasıyla tdDomates veya GFP floresan proteinlerini ifade eden Colombiana (DTU TcI) veya Brezilya (DTU TcV) T. cruzi suşu doku kültürü kaynaklı tripomastigotlarla enfekte eder. Enfeksiyon dozu, 100 μL 1x Fosfat-Tamponlu Tuzlu (PBS) içinde seyreltilmiş 50.000 ila 200.000 tripomastigot arasında değişebilir.
NOT: Muhabir parazitlerin oluşumu ve fare enfeksiyon modelleri hakkında özel ayrıntılar Canavaci ve ark. 29 ve Bustamante ve ark.30. - Fareleri karbondioksit inhalasyonu ile 3-7 L / dak akış hızında ötenazileştirin. Hayvanlar herhangi bir pedal refleksi göstermeyi bırakır bırakmaz, deriden karından sternuma doğru uzunlamasına bir kesi yapın. Daha sonra vücut duvarını karından kesin ve sternum kaldırılana kadar göğüs kafesinin her iki tarafındaki kaburgalardan devam ederek kalbi açığa çıkarın.
- Şekil 1'de açıklandığı gibi, kalbin sağ kulak kepçesinde 2,5 mm'lik bir kesi yapın ve 1 mL'lik bir mikropipet ucu kullanarak boşalan kanı toplayın.
- Yükselen aort seviyesine ulaşana kadar sol ventrikülün tepesine bir kelebek iğnesi (perfüzyon sisteminin bir ucuna bağlı) yerleştirin. İğnenin etrafındaki giriş deliğini kapatmak ve perfüzyonlar sırasında iğneyi yerinde tutmak için jel bazlı yapıştırıcı kullanın (bkz.
- 30 fareyi 50 mL soğuk Heparin-PBS (pH 7.4,10 U / mL Heparin) ile veya fareden toplama tepsisine doğru çıkan sıvı kandan arındırıncaya kadar perfüze edin.
- PBS'de 50 mL soğuk% 4 (w / v) paraformaldehit (PFA) (pH 7.4) ile perfüze edin.
NOT: PFA doku fiksasyonu, özellikle epitop yapılarını korumak ve ardından immünostiyosifik etmek için protokolün kritik adımlarından biridir. PFA zamanla bozulur, bu nedenle taze olarak hazırlanmalıdır. Çözeltinin pH'ı, dokuların zayıf bir şekilde temizlenmesine yol açabilecek aşırı fiksasyonu önlemek için de önemlidir.
DİKKAT: PFA cilt teması nedeniyle orta derecede toksiktir. Akut maruziyet ayrıca burun, göz ve boğaz için oldukça tahriş edicidir. Havadaki veya derideki düşük seviyelere uzun süre maruz kalmak, dermatit ve kaşıntı gibi cilt tahrişine ve astım benzeri solunum problemlerine neden olabilir. Yüz ve göz koruması kullanın ve toz, gaz, sis, duman veya buhar solumayın.- PFA perfüzyonunu takiben, adım 1.5'te belirtilen netleştirme seviyelerine ulaşmak için fareyi 100 mL CUBIC-P tamponu ile perfüze edin.
- CUBIC-P tamponu hazırlamak için,% 10 N-bütildietanolamin,% 5 Triton X-100 ve% 5 1-N-Metimidazolü çift damıtılmış suda çözün veya ticari kokteylleri kullanın (bkz.
NOT: Adım 1.6.1.-1.6.2. Sadece kalp ve böbrek gibi yüksek pigmentli organlar için önerilir, çünkü artan şeffaflık seviyelerini elde etmek için ön temizleme adımı gerektirirler. CUBIC-P'yi kullandıktan sonra, organları diseke edin ve doğrudan adım 2: Doku temizlemeye geçin.
- Görüntülenecek doku örneklerini / organları 30 diseke edin ve 50 mL konik tüplerde hafif sallama (en fazla 5 x g) ile 4 ° C'de bir gecede (ON) PBS'de (~10 mL / tüm organ) % 4 (w / v) PFA'da sabitleyin.
NOT: Bundan sonraki tüm inkübasyonlar, ışıktan korunan 20-30 °C'de yatay olarak döşenen tüpler üzerinde yapılmalıdır. - Numuneyi 10 mL PBS içinde yıkayın (% 0.05 sodyum azid (NaN 3) ile desteklenmiş3 saat (üç kez) oda sıcaklığında (RT) hafifçe çalkalayarak (5 x g).
NOT: PBS'de %30 sakarozun 10 mL'sinde inkübe edilerek 50 mL konik tüplerde 4 °C AÇIK'ta hafif sallama (5 x g) ile dokular dondurulabilir. Dokular tüpün dibine battıktan sonra, OCT bileşiğine gömün ve -80 ° C'de tutun. OCT bileşiği tamamen eriyene kadar RT'de çözün, ardından 50 mL konik tüplerde hafif sallama (5 x g) ile 4 ° C'de PBS (~ 10 mL / tüm organ) AÇIK olarak yıkayın. 2. adıma geçin.
2. Doku temizleme
NOT: Bu çalışmada yapılan tüm doku temizlikleri CUBIC protokolü I22 kullanılarak yapılmıştır. Üç farklı kokteyl kullanıldı: perfüzyonlar sırasında delipidasyon ve hızlı renk giderme için CUBIC-P, delipidasyon ve renk giderme için CUBIC-L ve RI eşleştirme için CUBIC-R. DNA boyama ve immün boyamalar sırasıyla CUBIC-HV 1 3D nükleer boyama kiti ve CUBIC-HV 1 3D immün boyama kiti kullanılarak gerçekleştirildi (bakınız Malzeme Tablosu).
- Tek tek organları, 50 mL konik tüplerde RT'de (ON) hafifçe sallayarak (5 x g) 10 mL'lik %50 su ile seyreltilmiş CUBIC-L'ye (Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın. Tüpleri sallanan plaka üzerinde düz tutun.
NOT: Doku hasarını önlemek için, organlar aynı tüpte tutulur ve çözeltiler bir vakum sistemi kullanılarak toplanır. CUBIC-L'yi hazırlamak için,% 10 N-bütildietanolamin ve% 10 Triton X-100'ü ticari kokteylleri kullanarak çift damıtılmış suda çözün (bkz.
DİKKAT: CUBIC-L ciddi göz hasarına neden olur. Göz ve yüz koruyucu kullanın. Onaylı bir atık bertaraf tesisine atın. - Numuneyi 6 gün boyunca 10 mL% 100 CUBIC-L'ye daldırın (çözeltiyi 3. günde yenileyin).
NOT: Bu kuluçka süresinin sonunda, dokular neredeyse tamamen şeffaf olmalıdır. - Şeffaf organları PBS ile (% 0.05 NaN 3 ile desteklenmiş)37 ° C'de 2 saat (üç kez) hafifçe sallayarak (5 x g) yıkayın. Triton X-100'ü çıkarmak için her yıkamada dokuları yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
NOT: Şekil 2B'de açıklandığı gibi, deneyin amacı transgenik T. cruzi parazitlerinden veya farelerinden endojen olarak eksprese edilen muhabir proteinleri görselleştirmekse (Şekil 2C-F), adım 3, 4 ve 5'i atlayın ve doğrudan adım 6'ya devam edin.
3. DNA boyama
- Ticari olarak temin edilebilen nükleik asit boyasını ( bakınız Malzeme Tablosu) 5 mL boyama tamponunda (kit içinde dahil) 1/2.500 seyreltmede seyreltin.
- Dokuyu nükleer boya çözeltisine daldırın ve ayakta dururken 15 mL konik tüpler kullanarak 5 gün boyunca nazik bir dönüşle 37 ° C'de inkübe edin.
- RT'de 15 mL 3D nükleer boyama yıkama tamponu (kit içinde dahil) ile RT'de 2 saat (üç kez) boyunca hafifçe sallayarak (5 x g) yıkayın.
NOT: Diğer DNA boyaları bu konsantrasyonlarda ve inkübasyon sürelerinde kullanılabilir: DAPI (kite dahildir): 1/200, 5 günlük inkübasyon; BOBO-1: 1/400, 5 günlük inkübasyon; Propidium İyodür (PI) (kite dahil): 1/100, 3 günlük inkübasyon; RedDot2: 1/250, 3 günlük inkübasyon. Deneyin özel amacı hem endojen olarak ifade edilen muhabir proteinlerini görselleştirmek hem de nükleer lekeler kullanmaksa, adım 4 ve 5'i atlayın ve doğrudan adım 6'ya devam edin.
4. Hücre dışı matriks (ECM) sindirimi
NOT: ECM'nin hyaluronidaz sindirimi, antikorların dokuların derin bölgelerine uygun şekilde nüfuz etmesini kolaylaştırmak için yapılmalıdır28.
- Tek tek organları, ışıktan korunan düz pozisyonda 50 mL'lik bir konik tüp içinde 37 °C'de 2 saat boyunca 15 mL hyaluronidaz reaksiyon tamponuna batırın.
NOT: Hyaluronidaz reaksiyon tamponu hazırlamak için, 10 mM CAPSO'yu çözün; Çift damıtılmış suda 150 mM Sodyum Klorür (NaCl) veNaN3'ün % 0.05'i ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve pH'ı 10'a ayarlayın. - 75 μL 20 mg/mL hyaluronidaz stoğunu 425 μL hyaluronidaz reaksiyon tamponuna karıştırarak Enzim Çözeltisi hazırlayın. 20 mg/mL hyaluronidaz stoğu hazırlamak için, hyaluronidazi 50 mM Karbonat tamponunda, 150 mM NaCl'de, BSA'nın% 0.01'inde veNaN3'ün % 0.05'inde çözün (bkz. pH değerini 10 ve aliquot'u -30 ° C'de 77 μL hacimlerde ayarlayın.
- Bir pipet kullanarak hyaluronidaz reaksiyon tamponunu atın ve organı Enzim Çözeltisine (15 mL'lik bir konik tüp içinde 500 μL) 37 ° C'de 24 saat boyunca ışıktan korunan bir konumda hafifçe sallayarak (5 x g) batırın.
- Numuneyi 15 mL hyaluronidaz yıkama tamponunda, 50 mL'lik bir konik tüp içinde, 37 ° C'de 2 saat (üç kez) ışıktan korunan yatay bir konumda, hafif sallama (5 x g) ile yıkayın.
- Hyaluronidaz yıkama tamponu hazırlamak için 50 mM Karbonat tamponu, 150 mM NaCl, %0,1 (v/v) Triton X-100, %5 (v/v) Metanol ve %0,05 NaN3 çözün. PH'ı 10'a ayarlayın. 10x Karbonat tampon-NaCl stoğu hazırlamak için, 2.96 g Sodyum Karbonat, 1.86 g Sodyum Hidrojen Karbonat ve 8.77 g NaCl'yi 100 mL çift damıtılmış sudamıtılmış suda% 0.05 NaN3 ile çözün ( bkz.
5. İmmün boyama
- Aşağıdaki adımları izleyerek anti-α-SMA (alfa-küçük kas aktini, Malzeme Tablosuna bakınız) antikorlarını kullanarak vaskülatürü etiketleyin.
- Primer artı konjuge Fab fragmanı sekonder antikor kompleksi oluşturur. Boyama prosedüründen 1,5 saat önce bu reaksiyona başlayın.
- Gerekli birincil ve ikincil antikor miktarını hesaplayın (ağırlıkça 1: 0.5 oranında karıştırın).
NOT: Birincil antikor anti-α-SMA için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 3.5 μg gereklidir. 2.5 mg/mL ürün için 3.5/2.5 = 1.4 μL antikor çözeltisi gereklidir. İkincil antikor AlexaFluor 647 anti-fare Fab fragmanı için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 1.75 μg gereklidir. 1.7 mg/mL ürün için 1.75/1.7 = 1 μL antikor çözeltisi gereklidir. - Birincil ve ikincil antikorları amber 2 mL'lik bir tüpte karıştırın ve 37 ° C'de 1.5 saat boyunca inkübe edin.
- Gerekli birincil ve ikincil antikor miktarını hesaplayın (ağırlıkça 1: 0.5 oranında karıştırın).
- Tampon değişimi için, 7,5 mL 2x HV1 3D immün boyama tamponunu (kit içinde bulunur, Malzeme Tablosuna bakınız) 7,5 mL çift damıtılmış su ile karıştırın ve doku örneğini yatay konumda 15 mL konik bir tüp içinde 32 °C'de 1,5 saat boyunca 1,5 saat boyunca daldırın. Bu reaksiyonu aynı anda antikor kompleksi oluşumu olarak başlatın (immün boyama prosedüründen 1.5 saat önce).
- Primer artı konjuge Fab fragmanı sekonder antikor kompleksi oluşturur. Boyama prosedüründen 1,5 saat önce bu reaksiyona başlayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek 3D immün boyama gerçekleştirin.
- 15 mL'lik bir konik tüpte, Ek Dosya 1'i takiben antikor boyama solüsyonunu hazırlayın.
- Doku örneğini tampon değişim ortamından toplayın (adım 5.1.2) ve antikor boyama çözeltisine batırın. Dokuları 32 ° C'de 1 hafta boyunca ayrı ayrı inkübe edin ve tüplerin ışıktan korunan ayakta durma pozisyonunda hafifçe sallanmasıyla (5 x g) inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek için tüpü parafin film ile kapatın.
- 4 ° C'ye ilerleyin ve ayakta durma pozisyonunda AÇIK olarak inkübe edin.
- 1x HV1 3D immün boyama yıkama tamponunu (kit dahil, Malzeme Tablosuna bakınız) 4 °C'ye kadar soğutun ve numuneyi 15 mL tamponla (iki kez) her biri 4 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak (5 x g) yıkayın. 15 mL konik tüpleri adım 5.2.7'ye kadar yatay konumda tutun.
- Formalini 1x HV1 3D immün boyama yıkama tamponunda %1'e kadar seyreltin ve numuneyi 4 °C'de 24 saat boyunca çözeltinin 8 mL'sine hafifçe sallayarak (5 x g) batırın.
- Taze% 1 formalin çözeltisinde 37 ° C'de 1 saat boyunca hafifçe sallama (5 x g) ile inkübe edin.
- 15 mL PBS'de 25 °C'de 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak (5 x g) yıkayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek anti-Kırmızı Floresan Protein (RFP) antikorlarını kullanarak tdDomates sinyalini artırın.
- Adım 5.2.2'deki ile aynı inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını izleyin. Birincil ve ikincil antikorların miktarını hesaplayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve bunları ağırlıkça 1:0,5 oranında karıştırın.
NOT: Birincil antikor anti-RFP için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 5 μg gereklidir. 1.25 mg/mL ürün için, çözeltinin 5/1.25 = 4 μL'si gereklidir. İkincil antikor Alexa Fluor 647 anti-tavşan Fab fragmanı için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 2.5 μg gereklidir. 1.5 mg / mL ürün için, çözeltinin 2.5 / 1.5 = 1.7 μL'si gereklidir. - Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi antikor boyama solüsyonunu hazırlayın.
- Adım 5.2.2'deki ile aynı inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını izleyin. Birincil ve ikincil antikorların miktarını hesaplayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve bunları ağırlıkça 1:0,5 oranında karıştırın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek anti-GFP nanocisimcikleri kullanarak GFP sinyallerini artırın.
- Adım 5.2.2'de belirtildiği gibi aynı inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını izleyin.
NOT: Anti-GFP nanocisimleri ( bakınız Malzeme Tablosu) Alexa Fluor 647 ile konjuge edilir, bu nedenle antikor kompleksi üretimi gereksizdir. - Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi antikor boyama solüsyonunu hazırlayın.
- Adım 5.2.2'de belirtildiği gibi aynı inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını izleyin.
6. RI eşleştirme
- Şeffaf organları, RT'de (ON) 50 mL'lik bir konik tüp içinde hafifçe sallayarak (5 x g) 5 mL'lik %50 su ile seyreltilmiş CUBIC-R+ çözeltisine (bkz. Malzeme Tablosu) daldırın. Tüm RI eşleştirme adımı boyunca tüpleri ayakta tutun.
NOT: Önceki deneylerden geri dönüştürülmüş KÜBİK R+ çözümleri bu adımda (dört kata kadar) yeniden kullanılabilir. CUBIC-R + çözeltisini hazırlamak için, 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolonun (Antipirin),% 30'unun Nikotinamid veya N-Metilnikotinamid'in% 30'unu ve N-bütildietanolaminin% 0,5'ini çift damıtılmış suda çözün veya ticari CUBIC-R + tamponunu kullanın (bkz.
DİKKAT: CUBIC-R+ cilt tahrişine, ciddi göz tahrişine ve organlarda hasara neden olur. Koruyucu eldiven giyin, göz ve yüz koruması sağlayın. Toz, duman, gaz, sis veya buhar solumayın. Onaylı bir atık bertaraf tesisine atın. - %50 CUBIC-R+'ı 5 mL'lik %100 CUBIC-R+ ile değiştirin ve 2 gün boyunca RT'de hafif sallama (5 x g) ile inkübe edin. Daha sonra, dokuları tüy bırakmayan mendil yığınına aktarın ve CUBIC-R + çözeltisini organ yüzeylerinden 5 dakika boyunca çıkarmak için dokuları dikkatlice çevirin.
7. Montaj
- Dokuları kuruttuktan sonra, altı delikli bir hücre kültürü plakasında 5 mL Montaj Çözeltisine (RI = 1.520) aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de inkübe edin (AÇIK).
NOT: Organlar Montaj Çözeltisinde veya CUBIC-R+'da 6 aydan fazla saklanabilir. - Siyanoakrilat bazlı jel yapıştırıcı kullanarak dokuları mikroskop numune tutucusuna yapıştırın.
- Numuneleri 120 mL Montaj Çözeltisi ile doldurulmuş mikroskop kuvars küvete batırın ve enine olarak uzunlamasına eksenlerine kadar görüntüleyin. Kalbi tepe noktası ve aort yatay olarak hizalanmış olarak yapıştırın.
NOT: Temizlenmiş ve monte edilmiş organlar bir vibratom ile kesitlenebilir ve konfokal mikroskopi ile yüksek büyütmede görüntülenebilir. Organları% 2 agaroza gömün ve 100-500 μm'lik kesitleri kesin. Organlar ayrıca kalın doku kesitleri (>1000 μm) üretmek için keskin bir bıçakla manuel olarak kesitlenebilir. Kesitlemeden sonra, dilimleri cam tabanlı 35 mm Petri tabaklara yerleştirin, aynı montaj solüsyonunu kullanarak monte edin, oje ile kapatın ve konfokal mikroskopla görüntüleyin.
8. Görüntü toplama
- Monte edilmiş numuneleri bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntüleyin (bkz. Tek tek dilimler arasındaki büyütme ve adım boyutunu 3 μm'ye ayarlayın ve 5 μm kalınlıkta ve% 100 genişliğe sahip sağ ve sol ışık tabakası lazerlerini kullanın. Pozlama süresini 50-100 ms'de sabit tutun ve floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak lazer gücünü% 10 ila% 80 arasında ayarlayın.
- TdTomato-eksprese eden parazitlerin ve DiR-boyalı uykudaki amastigotların (Şekil 2C) birlikte tespiti için sırasıyla kırmızı (Ex/Em 561/620-660 nm) ve kızıl ötesi (Ex/Em 785/845-55 nm) kanalları kullanın. CD8 muhabir faresinde (Şekil 2D) T hücrelerinin ve tdDomates eksprese eden parazitlerin birlikte tespiti için sırasıyla yeşil (Ex / Em 488/525-50 nm) ve kırmızı kanal kullanın.
- Koenfeksiyon tahlilleri (Şekil 2E) ve ayrıca çekirdek muhabir farelerde GFP'yi eksprese eden parazitlerin birlikte tespiti için (Şekil 2F), sırasıyla yeşil ve kırmızı kanalları kullanın. TdTomato-eksprese eden parazitlerin, nükleer boyanın ve kalp vaskülatürünün (Şekil 3B,C) tespiti için sırasıyla kırmızı, yeşil ve uzak kırmızı (Ex/Em 640/680-730 nm) kanalları kullanın.
- Anti-RFP antikorlarını uzak kırmızı kanal ve anti-GFP nanocisimcikleri yeşil kanal kullanarak tespit edin (Şekil 3D).
- Elde edilen TIFF görüntü yığınlarını dönüştürün ve Imaris v9.7.2 yazılımını kullanarak organları 3B olarak yeniden yapılandırın (bkz.
9. Imaris yazılımı ile yüzey rekonstrüksiyonu ve nicelleştirme
- Yüzey algılama algoritması aracını seçin ve sihirbazı görüntü analiz yazılımında başlatın.
- İlgilenilen bir 3B bölgede (rastgele seçilmiş) bir ilk analiz yapın ve ardından tüm 3B organ rekonstrüksiyonuna uygulayın. Bir ilgi alanı (YG) seçtikten sonra, analiz edilecek kanalı seçin, pürüzsüz düğmenin işaretini kaldırın ve arka plan çıkarma işlemini seçin.
NOT: Arka plan çıkarma, her voksel için benzersiz bir yerel arka plan değeri hesaplar ve bunu orijinal piksel değerinden çıkarır. Nesneye uyan en büyük kürenin çapı, T. cruzi ile enfekte olmuş hücreler için 200 μm, T hücreleri için 10 μm ve bireysel parazitler için 5 μm'ye kadar olmalıdır. - Sınıflandırmayı ayarlamak için histogramı ve sınıflandırma ölçülerini seçmek için filtre açılır listesini kullanın.
NOT: Sınıflandırmayı ayarlamak için histogramı kullanın: eliptiklik (oblate) ve sferisite ölçümleri önerilir. - Sihirbazı sonlandırın, istatistik düğmesine basın ve parazit bulaşmış hücrelerin veya T hücrelerinin toplam sayısını, zaman noktası başına bağlantısı kesilmiş bileşen sayısı olarak alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KÜBİK sabit dokular, fiksatifleri çıkarmak için PBS ile yıkandı ve daha sonra doku mimarisini korurken dokunun renginin bozulmasına neden olan pigmentleri ve lipitleri dokudan çıkaran temel tamponlu bir amino alkol çözeltisi olan CUBIC-L kokteylleri ile inkübe edildi. Kağıttaki ızgara çizgileri, organların uygun şekilde temizlendiğini gösteren dokulardan görülebilir (Şekil 2A). Delipidasyondan sonra, dokular yıkandı ve sırasıyla RI homojenizasyonu ve görüntüleme için CUBIC-R + ve montaj çözeltisine daldırıldı (Şekil 2B).
Vahşi tip bir fareye, DiR yakın kızılötesi siyanin boyası ile önceden boyanmış tdDomates eksprese eden tripomastigotlar bulaştı. Fare, enfeksiyondan 15 gün sonra ötenazi yapıldı ve sağlam kalp disseke edildi, sabitlendi ve temizlendi. LSFM görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyon, tdDomates eksprese eden çoğalan T. cruzi parazitlerini (kırmızı) görselleştirmemizi sağladı. Kırmızı kanaldaki otofloresan seviyeleri, kalp yapısının ve kenarlarının doğru görselleştirilmesi için kullanılabilir (Şekil 2C i). LSFM ayrıca ilaca dirençli uyuyan formlar 7,8'i tanımlamak için de yararlı olmuştur. Parazitlerin DiR boyası ile enfeksiyon öncesi boyanması, daha önce CellTrace Violet7 için bildirildiği gibi, boyayı replikasyon yoluyla seyreltmemiş parazitleri görselleştirerek uykudaki parazitlerin izlenmesine izin verir.
Uyuyan parazitler (camgöbeği), 3B genişlemiş iç kısımlarda (sarı oklar) gösterildiği gibi kalpte tanımlanabilir (Şekil 2C ii,iii). Z-projeksiyon floresansı, tüm 3D rekonstrüksiyon boyunca T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin ve uykudaki parazitlerin toplam sayısının mekansal görselleştirmesi ve nicelleştirilmesi için yeniden yapılandırılmış bir 3D yüzey modeli oluşturmak üzere otomatik olarak bölümlere ayrılmıştır (Şekil 2A). 3D yüzey modelinin analizi, kalp atriyumunda (123) ventriküllere (63) ve tüm kalpte 18 uyuyan parazite kıyasla daha yüksek oranda enfekte olmuş hücrelere (123) sahip 186 T. cruzi ile enfekte olmuş hücreyi ortaya çıkardı (Şekil 2C i). Önceki bir raporda, ilaç tedavisinden sonra berraklaştırılmış fare dokularında T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin ve uyuyan parazitlerin sayısını izlemek için benzer bir boru hattı31 bildirilmiştir. Uyuyan parazitlerin sayısına ilişkin tahminlerin muhtemelen eksik sayıldığına dikkat etmek önemlidir, çünkü boya seyreltme tekniği yalnızca ilk enfeksiyondan bu yana önemli ölçüde çoğalmamış parazitlerin tespit edilmesine izin verir, ancak birden fazla bölünme turunu takiben enfeksiyonda daha sonra uykuda olanları tespit etmez.
Benzer bir yaklaşım, interferon (IFN)-gama eksikliği olan farelerde farklı T. cruzi suşları arasındaki etkileşimi izlemek için kullanıldı. Efektör T hücreleri tarafından IFN-gama üretimi, T. cruzi'nin bağışıklık kontrolü için gereklidir. IFN-gama eksikliği olan farelerde, parazitler minimum bağışıklık kısıtlaması ile çoğalır ve organlarda çok yüksek sayıda enfekte hücre verir. Bu immün yetmezlikli modeller, immün tanıma ile getirilen kısıtlama olmaksızın yeni ilaçların etkinliğini incelemek için yararlı araçlardır ve böylece tedaviden sonra parazit nüksünün tespit edilmesine izin verir. IFN-gama eksikliği olan fareler, tdDomates eksprese eden Colombiana (kırmızı) ve GFP eksprese eden Brezilya (mavi) T. cruzi suşları ile birlikte enfekte oldu. Fareler enfeksiyondan 17 gün sonra ötenazi yapıldı ve sağlam kalpler disseke edildi, sabitlendi ve temizlendi. Bu immün yetmezlikli modelde, her iki T. cruzi suşu ile enfekte olmuş konakçı hücreler, büyük, orta ve küçük enfekte olmuş hücreler ve yakın zamanda patlamış olanlar da dahil olmak üzere parazit gelişiminin çeşitli aşamalarında gözlemlenebilir. Dokulardan dilimleme, kalp atriyumunda çeşitli doku derinliklerinde bol miktarda parazitle enfekte olmuş hücre gösterir (Şekil 2E i-iii ve Film 1).
Tüm T hücrelerinin yeşil floresan proteini ZsGreen1'i eksprese ettiği C57BL / 6J-Tg (Cd8a * -cre) B8Asin / J ve B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm14 (CAG-tdTomato) Hze / J farelerinin bir haçı, T. cruzi ile enfekte dokularda T hücresi alımını izlemek için kullanılmıştır. Fareler, tdTomato-eksprese eden parazitlerle enfeksiyondan 14 gün sonra ötenazi yapıldı ve iskelet kası LSFM tarafından eksize edildi, temizlendi ve görüntülendi. T hücrelerini (mavi) eksprese eden ZsGreen1 ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücreler (kırmızı) sağlam bir şekilde tespit edildi (Şekil 2D i ve Film 2). 3D rekonstrüksiyonun 3D zoominleri, enfekte bir hücrenin bölgesindeki T hücrelerini tanımladı (Şekil 2D ii). Aynı dokunun vibratom kalınlığındaki kesitleri (200-500 μm), konfokal mikroskopi ile T hücrelerinin ve konakçı enfekte hücrelerin arayüzünü görselleştirmemizi sağlar (Şekil 2D iii).
Enflamasyon odaklarını izlemenin alternatif bir yolu, T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin etrafındaki hücre çekirdeği birikimine dayanmaktadır. Tüm hücre çekirdeklerinin floresan tdDomates proteinini eksprese ettiği bir muhabir faresi bu amaçla kullanılmıştır. Nükleer tdDomates ekspresyonu (kırmızı), temizleme işleminden sonra dokularda kolayca tespit edildi. Bir nükleer muhabir fareye GFP eksprese eden T. cruzi parazitleri (camgöbeği) bulaştı ve enfeksiyondan 35 gün sonra ötenazi yapıldı ve iskelet kasları LSFM tarafından eksize edildi, temizlendi ve görüntülendi (Şekil 2F i-iii). İskelet kasının yakınlaştırılmış optik bölümleri, GFP eksprese eden parazitler boyunca kırmızı çekirdekler biriktirerek artmış hücreselliği ortaya koymaktadır (Şekil 2F ii). Aynı dokunun vibratom kesitleri, konfokal mikroskopi ile GFP eksprese eden parazitler boyunca kırmızı çekirdeklerin daha önce tarif edilen birikimini doğrulamaktadır (Şekil 2F iii).
CUBIC protokolü ayrıca T. cruzi ile enfekte olmuş sağlam, temizlenmiş organ ve dokuların immün boyama ve DNA etiketlemesi için uyarlanmıştır (Şekil 3A). Fareler, tdTomato-eksprese eden parazitlerle enfeksiyondan 40 gün sonra ötenazi yapıldı ve kalpler disseke edildi, sabitlendi ve temizlendi. Bozulmamış temizlenmiş kalp, yeşil bir DNA belirteci ile 5 gün boyunca yıkandı ve boyandı, daha sonra tekrar yıkandı ve 7 gün boyunca α-SMA'ya karşı antikorlarla immünoboyalandı. Örnekler sonradan sabitlendi, yıkandı, RI eşleştirildi ve LSFM ile görüntülendi. Bu protokolü takiben, çekirdekler, vaskülatür ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücreler de dahil olmak üzere çoklu floresan sinyallerinin eşzamanlı tespiti mümkün olmuştur. α-SMA immün boyama (beyaz), kalbin karmaşık vaskülatürünü ortaya koyan yüksek sinyal seviyeleri sundu (Şekil 3B ii ve Film 3). Daha derin kalp bölgelerinden optik bir bölüm, belirlenmiş koşullarda α-SMA antikorlarının doku penetrasyonunu göstermektedir (Şekil 3B v). DNA boyama (mavi) ayrıca iyi doku penetrasyonu, floresan seviyeleri ve stabil volümetrik boyama sergiledi. Yoğun DNA etiketlemesine sahip bazı alanlar farklı kalp bölgelerinde (Şekil 3B i) ve iskelet kası liflerinin çevresinde (Şekil 3C i ve Film 4) tanımlanmıştır. İskelet kasının yakınlaştırılmış bir görüntüsü, az sayıda veya tespit edilemeyen tdDomates paraziti olan bölgelerde mavi çekirdek birikimini gösterdi ve bu da mevcut veya önceki T. cruzi enfeksiyonu bölgelerinde bağışıklık hücrelerinin işe alınmasını düşündürdü (Şekil 3C ii). Diğer durumlarda, enfekte konakçı hücrelerin yakındaki hücresel infiltrasyonlara (beyaz oklar) dair çok az veya hiç kanıtı yoktu (Şekil 3C i). Şekil 3C ii'de olduğu gibi aynı dokunun vibratom kesitleri, konfokal mikroskopi ile hücrelerin ve tdDomates eksprese eden parazitlerin DNA boyamasını göstermektedir (Şekil 3C iii).
Önceki deneyler, uykudaki parazitlerin tdDomates veya GFP muhabir proteinlerinin düşük veya ihmal edilebilir ekspresyonunu sergilediğini göstermiştir (Şekil 2C ii ve iii). Bu floresan proteinlerin tespitini iyileştirmek için, temizlenmiş dokular anti-RFP veya -GFP antikorları ile immünoboyalandı. TdDomates veya GFP'yi eksprese eden parazitlerle enfekte olmuş farelerden elde edilen bozulmamış iskelet kası dokuları, sırasıyla RFP'ye (RFP Booster) (Şekil 3D) karşı antikorlarla veya Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Şekil 3E) ile konjuge edilmiş GFP'ye karşı nanocisimlerle sabitlendi, açıklığa kavuşturuldu ve immünoboyalandı. Örnekler sonradan sabitlendi, yıkandı, RI eşleştirildi ve LSFM ile görüntülendi. Her iki durumda da, GFP ve tdDomates sinyallerinin antikorlar tarafından arttırılması güçlü floresan ile sonuçlandı (Şekil 3D ii ve 3E ii). Güçlendirici antikorlar kullanan immün boyamalar, açıklığa kavuşturulmuş tüm organ ve dokulardaki T. cruzi uykularını tespit etmek ve RFP veya GFP aile üyesinin muhabir proteinlerinden az temsil edilen herhangi bir sinyali tespit etmek için kullanılacak çok yönlü bir aracı temsil eder.
Şekil 1: Transkardiyak perfüzyon sırasında iğne takılması. (A) Fareyi kalpten geçirmeden önce gerçekleştirilen adımları ve sol ventriküldeki perfüzyon iğnesinin doğru konumunu ve yönünü gösteren şematik bir gösterim. Sağ atriyumda küçük bir kesi yapıldı ve drenaj kanı toplandı (1); kalp tepesine bir kelebek iğnesi yerleştirildi. İğnenin septumdan delinmemesi için yönü koruyun (2). İğnenin etrafındaki giriş deliği jel bazlı tutkal kullanılarak kapatıldı (3). Karaciğer kanla doldurulur ve perfüzyondan önce kırmızı görünür; Bununla birlikte, perfüzyondan sonra pigmentasyonunu kaybeder ve soluklaşır. RA, sağ kulak kepçesi; LA, sol kulak kepçesi; RV, sağ ventrikül; LV, sol ventrikül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin, uykuda olan amastigotların ve temizlenmiş organlarda inflamasyon odaklarının görselleştirilmesi. (A) Tüm organın şeması T. cruzi-3D yüzey modellerinde doku temizleme, LSFM görüntüleme ve yazılım destekli niceleme kullanılarak enfekte olmuş hücrelerin tespiti. (ben) Kalp ve iskelet kasının temizlenmeden önce (solda) ve sonra (sağda) parlak alan görüntüleri (ölçek çubuğu: 1000 μm). (ıı) Işık tabakası floresan mikroskop. (ııı) IFN-gama eksikliği olan fareye 2 x 10 bulaşmış5 tdDomates eksprese eden tripomastigotlar. Enfeksiyondan 17 gün sonra, kalp diseke edildi, KÜBİK temizlendi ve LSFM görüntülendi (ölçek çubuğu: 500 μm). (ıv) Z-projeksiyon floresansı, uzamsal görselleştirme ve sayıların nicelleştirilmesi için yeniden yapılandırılmış bir 3D yüzey modeli oluşturmak üzere otomatik olarak bölümlere ayrılmıştır. T. cruzi-enfekte hücreler. Toplam 736 T. cruziTüm kalpte enfekte hücreler tespit edildi (ölçek çubuğu: 500 μm). (v), belirtilen hacmin büyütmelerini gösterir (ıv), camgöbeği nesnelerinin temsil ettiği yer T. cruzi-enfekte hücreler (ölçek çubuğu: 50 μm). (B) KÜBİK tüm organ temizleme protokolü. (C) Çoğalan ve uykuda olanın görselleştirilmesi T. cruzi şeffaf fare kalbindeki parazitler. (ben) Vahşi tip bir fareye 2 x 10 bulaşmıştır5 tdDomates eksprese eden tripomastigotlar, DiR yakın kızılötesi siyanin boyası ile boyanmıştır. Kalp diseke edildi, temizlendi ve LSFM görüntülendi. tdDomates eksprese eden çoğalan (kırmızı) ve uykuda (camgöbeği) T. cruzi parazitler tanımlanabilir. Kalp yapısının doğru görüntülenmesini sağlamak için otofloresan seviyeleri korundu. Bir fare, önceki çalışmalarda bulunan parazitle enfekte olmuş hücrelerin ve uykudaki amastigotların zirvesine dayanarak enfeksiyondan 15 gün sonra öldürüldü (ölçek çubuğu: 400 μm). (ıı) ve (iii) belirtilen hacmin büyütmelerini (ben), sarı okların uykudaki parazitleri (camgöbeği) gösterdiği yerde (ölçek çubuğu: 200 μm). (D) Enfekte CD8 muhabir faresinde T hücresi alımının tespiti. (ben) Muhabir faresine 2 x 10 virüs bulaştı5 tdDomates eksprese eden tripomastigotlar ve iskelet kası diseke edildi, temizlendi ve LSFM, enfeksiyondan 14 gün sonra, önemli hücre yanıtlarının tespit edildiği bir zaman noktası olarak görüntülendi. ZsGreen1 eksprese eden T hücreleri (mavi) ve T. cruzi-enfekte hücreler (kırmızı) görselleştirildi (ölçek çubuğu: 400 μm) (ayrıca bakınız) Film 2). (ıı), belirtilen hacmin büyütmelerini gösterir (ben) (ölçek çubuğu: 50 μm). (ııı) bir T hücresini çevreleyen T hücresi birikimini tasvir eder T. cruziAynı organın bir doku bölümünde (200 μm) enfekte hücre (ölçek çubuğu: 8 μm). (E) Farklı etkileşimler T. cruzi Suş. (ben) IFN-gama eksikliği olan fareler 2 x 10 ile birlikte enfekte edildi5 tdDomates eksprese eden Colombiana (kırmızı) ve GFP eksprese eden Brezilya (mavi) T. cruzi Suş. Fareler ötenazi yapıldı ve sağlam kalpler enfeksiyondan 17 gün sonra disseke edildi, sabitlendi ve temizlendi (ölçek çubuğu: 400 μm). (ıı), belirtilen hacmin büyütmelerini gösterir (ben) (ölçek çubuğu: 250 μm). (ııı), Colombiana (kırmızı) ve Brezilya (mavi) ile enfekte olmuş hücreleri ortaya çıkaran büyütülmüş bir optik bölüm gösterir. T. cruzi suşlar (ölçek çubuğu: 150 μm). (F) Çekirdek muhabir faresi kullanılarak enfekte hücreler boyunca hücreselliğin görselleştirilmesi. (ben) Bir nükleer muhabir faresine 2 x 10 bulaşmış5 GFP eksprese eden tripomastigotlar ve iskelet kası diseke edildi, temizlendi ve enfeksiyondan 35 gün sonra LSFM görüntülendi. Konakçı hücrelerin nükleer tdTomato ekspresyonu (kırmızı) ve GFP parazit ekspresyonu (camgöbeği) tespit edildi (ölçek çubuğu: 400 μm). (ıı), GFP eksprese eden parazitler boyunca kırmızı çekirdek birikimini ortaya çıkaran büyütülmüş bir optik kesit gösterir (ölçek çubuğu: 90 μm). (ııı) aynı organdan doku kesitlerinin konfokal görüntülenmesiyle artan hücreselliği doğrular (ölçek çubuğu: 8 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temizlenmiş T. cruzi ile enfekte olmuş organların antikorlar ve nükleer lekelerle etiketlenmesi. (A) Doku temizleme, 3D immün boyama ve tüm organların DNA etiketlemesi için KÜBİK protokol. (B) Vaskülatür ve DNA tespiti için fare kalbinin etiketlenmesi (ayrıca bakınız Film 3). (i-iii) Vahşi tip bir fareye 2 x 105 tdDomates eksprese eden parazitler bulaştı. Fare enfeksiyondan 40 gün sonra ötenazi yapıldı ve kalp diseke edildi, sabitlendi ve temizlendi. Temizlenen kalp bir DNA belirteci ile etiketlendi ve α-SMA'ya karşı antikorlarla immünoboyalandı. Hücre çekirdeklerinin (mavi), vaskülatür (beyaz) ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin (kırmızı) eşzamanlı tespiti mümkündü. Fare, enfeksiyon sonrası doku ve özel vaskülatür yeniden şekillenmesinin değerlendirilebildiği zamanlarda öldürüldü (ölçek çubuğu: 400 μm). (iv) hücre çekirdeklerini, vaskülatürü ve enfekte olmuş hücreleri gösteren (iii) derin kalp bölgelerinden büyütülmüş bir hacim gösterir (ölçek çubuğu: 90 μm). (v) (iii) (ölçek çubuğu: 90 μm) elde edilen optik bir bölümü tasvir eder. (C) Tüm temizlenmiş iskelet kasının DNA etiketlemesi ile görselleştirilen artmış hücresellik. (i) Önceki deneydeki iskelet kası dokusu DNA ile boyanmış ve yoğun nükleer etiketlemeye sahip alanları (mavi) ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücreleri (kırmızı) (ölçek çubuğu: 200 μm) ortaya çıkarmıştır (ayrıca bakınız Film 4). (ii) tdDomates parazitinin daha düşük veya hiç tespit edilmediği bölgelerde yoğun bir mavi çekirdek birikimi ortaya çıkarır (ölçek çubuğu: 100 μm). (iii) yüksek büyütmeli (60x) konfokal görüntüleme, doku kesitlerindeki hücrelerin ve parazitlerin DNA etiketlemesini tanımlar (ölçek çubuğu: 10 μm). (D) Tomato parazit muhabiri belirteçlerinin tamamen temizlenmiş iskelet kasında güçlendirilmesi. (i-iii) TdDomates eksprese eden 2 x 105 parazit ile enfekte olmuş farelerden elde edilen sağlam iskelet kası dokuları sabitlendi, açıklığa kavuşturuldu ve RFP'ye (RFP Booster) karşı antikorlarla immünoboyalandı. TdDomates sinyalinin (kırmızı) RFP artırımından (yeşil) sonra uzak kırmızı kanalda yoğun ve düzgün bir floresan sinyali elde edildi (ölçek çubuğu: 100 μm). (E) GFP parazit muhabir belirteçlerinin anti-GFP nanocisimleri kullanılarak güçlendirilmesi. (i-iii) GFP'yi eksprese eden 2 x 105 parazit ile enfekte olmuş farelerin iskelet kas dokuları, GFP'ye (GFP Booster) karşı Alexa Fluor 647-konjuge nanocisimler ile sabitlendi, açıklığa kavuşturuldu ve immünoboyalandı. GFP floresansının (camgöbeği) GFP takviyesinden (macenta) sonra uzak kırmızı kanalda güçlü bir floresan sinyali elde edildi. (D) ve (E)'den gelen fareler enfeksiyondan 30 gün sonra öldürüldü, çünkü parazit yükleri bu zaman noktasında zirveye ulaştı ve parazitle enfekte olmuş hücreler iskelet kasında kolayca tespit edilebilir (ölçek çubuğu: 100 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: IFN-gama eksikliği olan farelerde kalp ve iskelet kasının T. cruzi enfeksiyonu. Enfeksiyon sonrası 17. günde 2 x 105 tdDomates eksprese eden Colombiana (kırmızı) ve GFP eksprese eden Brezilya (mavi) T. cruzi suşları ile birlikte enfekte olmuş IFN-gama eksikliği olan farelerin CUBIC ile açıklığa kavuşturulmuş dokularının 3D rekonstrüksiyonları. LSFM yoluyla toplam 1151 ayrı kalp dilimi ve 559 iskelet kası elde edildi. Üç bağımsız hayvanda karşılaştırılabilir görüntüleme sonuçları elde edildi. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 2: T. cruzi ile enfekte CD8 muhabir faresinde T hücresi alımının tespiti. 2 x 105 Tddomato-eksprese Colombiana T. cruzi suşu (kırmızı) ile enfekte olmuş ve enfeksiyondan 14 gün sonra öldürülen CD8 muhabir faresinden CUBIC ile açıklığa kavuşturulmuş bir iskelet kasının 3D görselleştirilmesi. İskelet kasının toplam 668 ayrı dilimi LSFM tarafından görüntülendi. ZsGreen1 eksprese eden T hücreleri (mavi) ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücreler (kırmızı) görselleştirildi. İki hayvanda karşılaştırılabilir görüntüleme sonuçları elde edildi. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 3: T. cruzi-enfekte olmuş ve temizlenmiş kalpte vaskülatürün immün tespiti. 2 x 105 tdDomates eksprese eden Colombiana T. cruzi ile enfekte olmuş ve enfeksiyondan 40 gün sonra α-SMA'ya (mavi) karşı antikorlarla immünoboyalı vahşi tip farelerin CUBIC ile açıklığa kavuşturulmuş bir kalbinin 3D rekonstrüksiyonu. Kalbin içinden dilimleme, kalbin karmaşık vaskülatürünü ve α-SMA antikorlarının doku penetrasyonunu ortaya çıkarır. Parazit ile enfekte olmuş hücreler kalp atriyumunda parlak kırmızı lekeler olarak gözlenebilir (kırmızı, sağ). İki hayvanda karşılaştırılabilir görüntüleme sonuçları elde edildi. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 4: Tüm organDNA boyaması, hücreselliğin arttığı alanları ortaya çıkarır. Enfeksiyondan 40 gün sonra vahşi tip farenin CUBIC ile açıklığa kavuşturulmuş iskelet kasının 3D rekonstrüksiyonu, 2 x 105 tdDomates eksprese eden Colombiana T. cruzi suşu ile enfekte oldu. Tüm kuadriseps kas bölgesi yeşil bir nükleer boya ile boyandı. T. cruzi ile enfekte olmuş hücreler (kırmızı) ve dokudaki her hücrenin çekirdeği (mavi) görselleştirildi. 3D rekonstrüksiyonun yakınlaştırmaları, tdDomates parazitlerinin az sayıda tespit edildiği veya hiç tespit edilmediği alanlarla birlikte mavi çekirdeklerin biriktiğini ortaya koymaktadır. İki hayvanda karşılaştırılabilir görüntüleme sonuçları elde edildi. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: Çalışmada kullanılan antikor boyama solüsyonlarının bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parazitlerin ve immün yanıtın yaygın, tüm organ görüntülemesinin olmaması, konakçı-parazit etkileşimlerinin karmaşıklığının anlaşılmasını sınırlar ve Chagas hastalığı için tedavilerin değerlendirilmesini engeller. Bu çalışma, T. cruzi ile enfekte olmuş farelerin bozulmamış organlarını ve dokularını açıklığa kavuşturmak ve boyamak için CUBIC boru hattını benimsemiştir.
Bu çalışmada çoklu doku temizleme protokolleri test edilmiştir (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 ve fDISCO 13); Bununla birlikte, sadece KÜBİK yüksek seviyelerde tdDomates veya GFP parazit floresansını korumuştur. Benzer şekilde, önceki raporlar, endojen olarak eksprese edilen belirteçlerin diğer doku temizleme yaklaşımlarına kıyasla KÜBİK korunmasını göstermiştir35.
Sınırlı çözünürlük kapasitesi, geleneksel ışık tabakası mikroskopisinin mevcut uyarılarından biridir. Bu, ağır enfekte olmuş hücrelerde bireysel parazitleri çözmenin zorluklarında açıktır (Şekil 2C). Yeni geliştirilen karo ışık tabakası mikroskopları geliştirilmiş çözünürlük kapasitesi ve doku genişletme tekniklerinin uyarlanması bu sorunu çözebilir36.
Yıkama tamponlarından, temizleme solüsyonlarından veya diğer organlardan gelen safsızlıklar, dokuda çökelebilir ve parazitle enfekte olmuş hücreler, bireysel parazitler veya diğer yapılarla karıştırılabilecek spesifik olmayan sinyaller üretebilir. Bununla birlikte, bu eserler genellikle birden fazla kanalda parlak bir şekilde flüoresan olur, bu nedenle görüntü analizinden sonra, alternatif bir kanaldaki (genellikle yeşil kanal) dokuları görüntüleyerek otomatik sayımdan kolayca atılabilir. Çift renkli nesneler eser olarak kabul edildi ve otomatik niceleme için hariç tutuldu.
Nükleer lekeler DAPI, PI, RedDot2 ve SYTOX-G, CUBIC tarafından temizlenen organların çoğunda iyi düzeyde doku penetrasyonu ve sinyal yoğunlukları sunar; Bununla birlikte, yeşil DNA boyası en iyi performansı gösterdi (Şekil 3B, C ve Film 4).
Bu sonuçlar, T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin kolayca tespit edilebileceğini ve doğru bir şekilde ölçülebildiğini ve aynı zamanda T hücresi veya çekirdek muhabir farelerin sinyallerini tanımlayabildiğini göstermiştir. En önemlisi, LSFM, DiR-pozitif uykuda olan amastigotlar gibi nadir biyolojik olayları, epitop immünoboyaması ve DNA etiketlemesine genişletme potansiyeline sahip karmaşık bir doku ortamında tespit etti. Mevcut çalışmalar ayrıca, immün efektör hücrelerin aktivasyonunu, aynı konakçıdaki çoklu parazit suşları arasındaki etkileşimleri ve Chagas hastalığında doku hasarı ve onarımının indüksiyonunu izlemek için bu yaklaşımların yararını araştırmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Dr. Etsuo Susaki'ye doku temizleme ve immün boyama protokolleri ile ilgili değerli yardımları ve önerileri için teşekkür ederiz. Ayrıca, LSFM ve konfokal görüntüleme kullanarak teknik destek için CTEGD Biyomedikal Mikroskopi Çekirdeğinden M. Kandasamy'ye minnettarız. Ayrıca Tarleton Araştırma Grubu'nun tüm üyelerine bu çalışma boyunca yararlı öneriler için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
