Le présent protocole décrit la microscopie fluorescente à feuille de lumière et les méthodes automatisées assistées par logiciel pour visualiser et quantifier avec précision la prolifération et la dormance des parasites Trypanosoma cruzi et des lymphocytes T dans des organes et des tissus intacts et nettoyés. Ces techniques fournissent un moyen fiable d’évaluer les résultats du traitement et offrent de nouvelles perspectives sur les interactions parasite-hôte.
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Article de méthode
Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par Trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie de Chagas est une pathologie négligée qui touche des millions de personnes dans le monde, principalement en Amérique latine. L’agent de la maladie de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), est un parasite intracellulaire obligatoire avec une biologie diversifiée qui infecte plusieurs espèces de mammifères, y compris les humains, provoquant des pathologies cardiaques et digestives. Une détection fiable des infections in vivo à T. cruzi est nécessaire depuis longtemps pour comprendre la biologie complexe de la maladie de Chagas et évaluer avec précision les résultats des schémas thérapeutiques. Le protocole actuel démontre un pipeline intégré pour la quantification automatisée des cellules infectées par T. cruzi dans des organes reconstruits en 3D. La microscopie fluorescente à feuille de lumière permet de visualiser et de quantifier avec précision les parasites T. cruzi proliférants et dormants et les cellules effectrices immunitaires dans des organes ou des tissus entiers. En outre, le pipeline CUBIC-HistoVision pour obtenir un marquage uniforme des organes dégagés avec des anticorps et des colorations nucléaires a été adopté avec succès. Le nettoyage des tissus, associé à l’immunomarquage 3D, fournit une approche impartiale pour évaluer de manière exhaustive les protocoles de traitement médicamenteux, améliorer la compréhension de l’organisation cellulaire des tissus infectés par T. cruzi et devrait faire progresser les découvertes liées aux réponses immunitaires anti-T. cruzi , aux lésions tissulaires et à la réparation dans la maladie de Chagas.
Introduction
La maladie de Chagas, causée par le parasite protozoaire T. cruzi, est l’une des maladies tropicales les plus négligées au monde, causant environ 13 000 décès annuels. L’infection progresse souvent d’un stade aigu à un stade chronique produisant une pathologie cardiaque chez 30% des patients, y compris des arythmies, une insuffisance cardiaque et une mort subite 1,2. Malgré la forte réponse immunitaire de l’hôte provoquée contre le parasite pendant la phase aiguë, un faible nombre de parasites persiste de façon chronique tout au long de la vie de l’hôte dans des tissus tels que le cœur et les muscles ....
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Protocole
Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les lignes directrices d’accréditation de la Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Le protocole d’utilisation des animaux (contrôle de l’infection à T. cruzi chez la souris-A2021 04-011-Y1-A0) a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J et C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (femelles, âgées de 1 à 2 mois) ont été uti....
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Résultats
Les tissus fixes CUBIC ont été lavés avec du PBS pour éliminer les fixateurs, puis incubés avec des cocktails CUBIC-L, une solution tamponnée de base d’alcools aminés qui extrait les pigments et les lipides du tissu, ce qui entraîne une décoloration des tissus tout en maintenant l’architecture des tissus. Les lignes de la grille dans le papier peuvent être vues à travers les tissus indiquant une clairance appropriée des organes (Figure 2A). Après délipidation, les tissus ont.......
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Discussion
L’absence d’imagerie approfondie des parasites et de la réponse immunitaire limite la compréhension de la complexité des interactions hôte-parasite et entrave l’évaluation des thérapies pour la maladie de Chagas. La présente étude a adopté le pipeline CUBIC pour clarifier et colorer les organes et tissus intacts de souris infectées par T. cruzi.
Plusieurs protocoles de nettoyage tissulaire ont été testés dans cette étude (PACT32, ECi 33, FLASH.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Nous remercions le Dr Etsuo Susaki pour son aide précieuse et ses recommandations concernant les protocoles de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage. De plus, nous sommes reconnaissants à M. Kandasamy du noyau de microscopie biomédicale du CTEGD pour son soutien technique à l’aide de LSFM et de l’imagerie confocale. Nous remercions également tous les membres du Tarleton Research Group pour leurs suggestions utiles tout au long de cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1-méthylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| Plaques de culture cellulaire 6 puits | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-souris | Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-lapin Fragment Fab | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| nanocorps anti-GFP Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-&alpha ;-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6. C+A2 :A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J souris | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Nom commun : Ai14 , Ai14D ou Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J | souris The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Nom commun : Ai14 , Ai14D ou Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodure | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J souris | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Commun Nom : Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Lingettes nettoyantes Kimwipes | ; Kimberly-Clark | T8788 | |
| Microscope confocal à balayage laser | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 kit d’immunomarquage 3D | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 kit de coloration nucléaire 3D | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Superglue en gel à base de cyanoacrylate | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7) ; 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-iodure de tétraméthylindotricarbocyanine) Société : Biotium | Biotium | #60017 | |
| Éthylène diamine acide tétraacétique (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Tubes à centrifuger 15 mL | Corning | ||
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Héparine | ThermoFisher Scientific | J16920. BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 ou #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Logiciel Imaris | BitPlane | v9.3 | |
| Logiciel ImSpector | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Aiguille d’injection intraveineuse 23-G | Sartori, Minisart Filtre seringue | 16534 | |
| Kimwipes | Lingettes non pelucheuses | ||
| Microscope fluorescent à feuille de lumière | Miltenyi Biotec | Système d’imagerie ULtramicroscope II Méthanol | |
| ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | ||
| Pointes de micropipette, 10 & micro ; L, 200 et micro ; L et 1 000 & micro ; L | Axygen | T-300, T-200-Y et T-1000-B | |
| Distributeur de pipettes motorisé | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Solution de montage | TCI | M3294 | |
| N-butyldiéthanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-méthylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Tache nucléaire rouge lointain | Biotium | #40061 | |
| Système de perfusion Sacrifice | Leica | 10030-380 | |
| Ciseaux | Outils scientifiques fins | 91460-11 | |
| Pipettes sérologiques | Costar Sterile | 4488 | |
| Incubateur à agitation | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Azoture de sodium (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 Carbonate de | |
| sodium (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Teinture d’acide nucléique vert | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Références
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
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Réimpressions et autorisations
