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Immunology and Infection

Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par Trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63919
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

Le présent protocole décrit la microscopie fluorescente à feuille de lumière et les méthodes automatisées assistées par logiciel pour visualiser et quantifier avec précision la prolifération et la dormance des parasites Trypanosoma cruzi et des lymphocytes T dans des organes et des tissus intacts et nettoyés. Ces techniques fournissent un moyen fiable d’évaluer les résultats du traitement et offrent de nouvelles perspectives sur les interactions parasite-hôte.

Abstract

La maladie de Chagas est une pathologie négligée qui touche des millions de personnes dans le monde, principalement en Amérique latine. L’agent de la maladie de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), est un parasite intracellulaire obligatoire avec une biologie diversifiée qui infecte plusieurs espèces de mammifères, y compris les humains, provoquant des pathologies cardiaques et digestives. Une détection fiable des infections in vivo à T. cruzi est nécessaire depuis longtemps pour comprendre la biologie complexe de la maladie de Chagas et évaluer avec précision les résultats des schémas thérapeutiques. Le protocole actuel démontre un pipeline intégré pour la quantification automatisée des cellules infectées par T. cruzi dans des organes reconstruits en 3D. La microscopie fluorescente à feuille de lumière permet de visualiser et de quantifier avec précision les parasites T. cruzi proliférants et dormants et les cellules effectrices immunitaires dans des organes ou des tissus entiers. En outre, le pipeline CUBIC-HistoVision pour obtenir un marquage uniforme des organes dégagés avec des anticorps et des colorations nucléaires a été adopté avec succès. Le nettoyage des tissus, associé à l’immunomarquage 3D, fournit une approche impartiale pour évaluer de manière exhaustive les protocoles de traitement médicamenteux, améliorer la compréhension de l’organisation cellulaire des tissus infectés par T. cruzi et devrait faire progresser les découvertes liées aux réponses immunitaires anti-T. cruzi , aux lésions tissulaires et à la réparation dans la maladie de Chagas.

Introduction

La maladie de Chagas, causée par le parasite protozoaire T. cruzi, est l’une des maladies tropicales les plus négligées au monde, causant environ 13 000 décès annuels. L’infection progresse souvent d’un stade aigu à un stade chronique produisant une pathologie cardiaque chez 30% des patients, y compris des arythmies, une insuffisance cardiaque et une mort subite 1,2. Malgré la forte réponse immunitaire de l’hôte provoquée contre le parasite pendant la phase aiguë, un faible nombre de parasites persiste de façon chronique tout au long de la vie de l’hôte dans des tissus tels que le cœur et les muscles squelettiques. Plusieurs facteurs, dont l’apparition tardive de réponses immunitaires adaptatives et la présence de formes non réplicatives du parasite, peuvent contribuer à la capacité de T. cruzi d’éviter une élimination complète par le système immunitaire 3,4,5,6. De plus, les formes dormantes non réplicatives du parasite présentent une faible sensibilité aux médicaments trypanocides et peuvent en partie être responsables de l’échec du traitement observé dans de nombreux cas 7,8.

Le développement de nouvelles techniques d’imagerie permet de mieux comprendre la distribution spatiale des parasites dans les tissus infectés et leur relation avec les cellules immunitaires impliquées dans leur contrôle. Ces caractéristiques sont cruciales pour une meilleure compréhension des processus de contrôle des parasites par le système immunitaire et le suivi des rares parasites dormants présents dans les tissus chroniques.

La microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) est l’une des méthodes les plus complètes et les plus impartiales pour l’imagerie 3D de grands tissus ou organes sans coupe mince. Les microscopes à feuille de lumière utilisent une fine feuille de lumière pour exciter uniquement les fluorophores dans le plan focal, réduire le photoblanchiment et la phototoxicité des échantillons et enregistrer des images de milliers de couches tissulaires à l’aide de caméras ultra-rapides. Le haut niveau de transparence tissulaire nécessaire à la bonne pénétration de la lumière laser dans les tissus est obtenu en homogénéisant l’indice de réfraction (IR) suite à la délipidation et à la décoloration des tissus, ce qui réduit la diffusion de la lumière et rend des images de haute qualité 9,10,11.

Des approches de nettoyage tissulaire ont été développées pour l’imagerie de souris entières 12,13,14, d’organoïdes 15,16,17, d’organes exprimant des marqueurs fluorescents rapporteurs 18,19,20,21,22,23 et, récemment, d’un nombre limité de tissus humains 24 . Les méthodes actuelles de nettoyage tissulaire sont classées en trois familles : (1) les méthodes à base de solvants organiques telles que les protocoles DISCO 25,26, (2) les méthodes à base d’hydrogel, telles que CLARITY27, et les méthodes aqueuses, telles que CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Les protocoles CUBIC maintiennent la forme des organes et l’intégrité des tissus, préservant la fluorescence des protéines rapporteures exprimées de manière endogène. La mise à jour la plus récente de cette technique, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), permet également la détection d’épitopes à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence et de marquage ADN28.

Dans le présent protocole, le pipeline CUBIC pour détecter T. cruzi exprimant des protéines fluorescentes dans des tissus de souris intacts clarifiés a été utilisé. Des tissus optiquement transparents ont été imagés LSFM, reconstruits en 3D et le nombre total précis de cellules infectées par T. cruzi , d’amastigotes dormants et de cellules T par organe a été automatiquement quantifié. En outre, ce protocole a été adopté avec succès pour obtenir un marquage uniforme des organes nettoyés avec des anticorps et des colorations nucléaires. Ces approches sont essentielles pour comprendre l’expansion et le contrôle de T. cruzi chez les hôtes infectés et sont utiles pour évaluer pleinement les chimiothérapies et immunothérapeutiques pour la maladie de Chagas.

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Protocol

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les lignes directrices d’accréditation de la Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Le protocole d’utilisation des animaux (contrôle de l’infection à T. cruzi chez la souris-A2021 04-011-Y1-A0) a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J et C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (femelles, âgées de 1 à 2 mois) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Infection, perfusion et dissection

  1. Infecter par voie intrapéritonéale des souris avec des trypomastigotes dérivés de cultures tissulaires de Colombiana (DTU TcI) ou du Brésil (DTU TcV) souche T. cruzi exprimant des protéines fluorescentes tdTomato ou GFP, respectivement. La dose d’infection pourrait varier de 50 000 à 200 000 trypomastigotes dilués dans 100 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    REMARQUE : Des détails précis sur la génération de parasites rapporteurs et des modèles murins d’infection sont disponibles dans Canavaci et al. 29 et Bustamante et coll.30.
  2. Euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone à un débit de 3-7 L/min. Dès que les animaux cessent de montrer un réflexe de pédale, faites une incision longitudinale à travers la peau de l’abdomen vers le sternum. Ensuite, coupez la paroi du corps de l’abdomen et continuez à travers les côtes de chaque côté du thorax jusqu’à ce que le sternum puisse être soulevé, exposant le cœur.
  3. Comme décrit à la figure 1, faites une incision de 2,5 mm dans l’oreillette droite du cœur et recueillez le sang drainant à l’aide d’un embout de micropipette de 1 mL.
  4. Insérez une aiguille papillon (reliée à une extrémité du système de perfusion) dans l’apex du ventricule gauche jusqu’à ce qu’il atteigne l’aorte ascendante. Utilisez de la colle à base de gel (voir le tableau des matériaux) pour sceller le trou d’entrée autour de l’aiguille et maintenir l’aiguille en position pendant les perfusions.
  5. Perfuser les souris 30 avec 50 mL d’héparine-PBS froid (pH 7,4,10 U/mL d’héparine) ou jusqu’à ce que le liquide qui sort de la souris vers le plateau de collecte soit exempt de sang.
  6. Perfuser avec 50 mL de paraformaldéhyde (PFA) froid à 4 % (p/v) (pH 7,4) dans du PBS.
    REMARQUE: La fixation tissulaire PFA est probablement l’une des étapes critiques du protocole, en particulier pour le maintien des structures épitopiques et la détection immunologique ultérieure. Le PFA se dégrade avec le temps, il doit donc être fraîchement préparé. Le pH de la solution est également important pour éviter une fixation excessive, qui pourrait entraîner une mauvaise élimination des tissus.
    ATTENTION : Le PFA est modérément toxique par contact cutané. L’exposition aiguë est également très irritante pour le nez, les yeux et la gorge. L’exposition à long terme à de faibles concentrations dans l’air ou la peau peut causer une irritation de la peau comme une dermatite et des démangeaisons, ainsi que des problèmes respiratoires semblables à ceux de l’asthme. Portez une protection faciale et oculaire et ne respirez pas de poussière, de gaz, de brouillard, de fumées ou de vapeurs.
    1. Après la perfusion PFA, perfuser la souris avec 100 mL de tampon CUBIC-P pour atteindre les niveaux de clarification mentionnés à l’étape 1.5.
    2. Pour préparer le tampon CUBIC-P, dissoudre 10 % de N-butyldiéthanolamine, 5 % de Triton X-100 et 5 % de 1-N-méthylimidazole dans de l’eau bidistillée ou utiliser les cocktails commerciaux (voir le tableau des matières).
      NOTA : Étapes 1.6.1.-1.6.2. ne sont recommandés que pour les organes très pigmentés tels que le cœur et les reins, car ils nécessitent une étape de pré-nettoyage pour obtenir des niveaux accrus de transparence. Après avoir utilisé CUBIC-P, disséquez les organes et passez directement à l’étape 2 : Nettoyage des tissus.
  7. Disséquer les échantillons de tissus/organes 30 à imager et les post-fixer dans 4 % (p/v) PFA dans PBS (~10 mL/organe entier) pendant la nuit (ON) à 4 °C en secouant doucement (pas plus de 5 x g) dans des tubes coniques de50 mL.
    NOTE: Toutes les incubations ci-après doivent être effectuées sur des tubes posés horizontalement à 20-30 °C à l’abri de la lumière.
  8. Laver l’échantillon dans 10 mL de PBS (complété par de l’azoture de sodium à 0,05 % (NaN3) pendant 3 h (trois fois) à température ambiante (TR) en agitant doucement (5 x g).
    REMARQUE : Les tissus peuvent être congelés en incubant dans 10 mL de saccharose à 30 % dans du PBS en agitant doucement (5 x g) à 4 °C ON dans des tubes coniques de 50 mL. Une fois les tissus coulés au fond du tube, incorporez-les dans le composé OCT et maintenez-les à -80 °C. Décongeler à TA jusqu’à ce que le composé OCT fonde complètement, puis laver au PBS (~10 mL/organe entier) ON à 4 °C en agitant doucement (5 x g) dans des tubes coniques de 50 mL. Passez à l’étape 2.

2. Nettoyage des tissus

NOTE: Tous les nettoyages tissulaires effectués dans ce travail ont été effectués en utilisant le protocole CUBIC I22. Trois cocktails différents ont été utilisés : CUBIC-P pour la délipidation et la décoloration rapide pendant les perfusions, CUBIC-L pour la délipidation et la décoloration, et CUBIC-R pour l’appariement RI. La coloration de l’ADN et les immunocolorations ont été effectuées à l’aide du kit de coloration nucléaire 3D CUBIC-HV 1 et du kit d’immunomarquage 3D CUBIC-HV 1, respectivement (voir le tableau des matériaux).

  1. Tremper les organes individuels dans 10 mL de CUBIC-L dilué à 50 % dans l’eau (voir le tableau des matières) en agitant doucement (5 x g) à TA (ON) dans des tubes coniques de 50 mL. Gardez les tubes à plat sur la plaque agitée.
    REMARQUE: Pour éviter des dommages tissulaires, les organes sont maintenus dans le même tube et les solutions sont collectées à l’aide d’un système de vide. Pour préparer CUBIC-L, dissoudre 10 % de N-butyldiéthanolamine et 10 % de Triton X-100 dans de l’eau bidistillée en utilisant les cocktails commerciaux (voir le tableau des matières).
    ATTENTION : CUBIC-L provoque de graves lésions oculaires. Portez une protection des yeux et du visage. Procéder à l’élimination dans une usine d’élimination des déchets agréée.
  2. Tremper l’échantillon dans 10 ml de 100 % CUBIC-L pendant 6 jours (rafraîchir la solution le jour 3).
    REMARQUE: À la fin de cette période d’incubation, les tissus doivent être presque complètement transparents.
  3. Laver les organes transparents avec du PBS (complété par 0,05%NaN3) pendant 2 h (trois fois) à 37 °C en secouant doucement (5 x g). Transférer les mouchoirs dans un nouveau tube conique de 50 ml à chaque lavage pour éliminer le Triton X-100.
    REMARQUE : Comme décrit à la figure 2B, si le but de l’expérience est de visualiser des protéines rapporteures exprimées de manière endogène à partir de parasites ou de souris transgéniques de T. cruzi (Figure 2C-F), sautez les étapes 3, 4 et 5 et passez directement à l’étape 6.

3. Coloration de l’ADN

  1. Diluer le colorant d’acide nucléique disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) dans 5 mL de tampon de coloration (inclus dans la trousse) à 1/2 500 de dilution.
  2. Immerger le tissu dans la solution de colorant nucléaire et incuber à 37 °C en rotation douce pendant 5 jours à l’aide de tubes coniques de 15 ml en position debout.
  3. Laver avec 15 ml de tampon de lavage anticoloration nucléaire 3D (inclus dans la trousse) pendant 2 h (trois fois) à TA en secouant doucement (5 x g).
    NOTE: D’autres colorants ADN peuvent être utilisés dans ces concentrations et temps d’incubation: DAPI (inclus dans le kit): 1/200, 5 jours d’incubation; BOBO-1: 1/400, 5 jours d’incubation; Iodure de propidium (PI) (inclus dans le kit): 1/100, 3 jours d’incubation; RedDot2 : 1/250, 3 jours d’incubation. Si le but spécifique de l’expérience est de visualiser à la fois les protéines rapporteures exprimées endogènes et d’utiliser des colorants nucléaires, sautez les étapes 4 et 5 et passez directement à l’étape 6.

4. Digestion de la matrice extracellulaire (ECM)

NOTE: La digestion hyaluronidase de l’ECM doit être effectuée pour faciliter la pénétration correcte des anticorps dans les régions profondes des tissus28.

  1. Immerger les organes individuels dans 15 mL de tampon de réaction hyaluronidase pendant 2 h à 37 °C dans un tube conique de 50 mL en position plate à l’abri de la lumière.
    NOTE: Pour préparer le tampon de réaction de la hyaluronidase, dissoudre 10 mM de CAPSO; 150 mM de chlorure de sodium (NaCl) et 0,05 % deNaN3 (voir le tableau des matières) dans de l’eau bidistillée et ajuster le pH à 10.
  2. Préparer la solution enzymatique en mélangeant 75 μL de 20 mg/mL de bouillon de hyaluronidase dans 425 μL de tampon réactionnel hyaluronidase. Pour préparer 20 mg/mL de stock de hyaluronidase, dissoudre la hyaluronidase dans 50 mM de tampon carbonaté, 150 mM de NaCl, 0,01 % de BSA et 0,05 % deNaN3 (voir le tableau des matières). Ajuster le pH à 10 et aliquote dans des volumes de 77 μL à -30 °C.
  3. Jeter le tampon réactionnel de la hyaluronidase à l’aide d’une pipette et immerger l’organe dans la solution enzymatique (500 μL dans un tube conique de 15 mL) en position debout à l’abri de la lumière pendant 24 h à 37 °C en agitant doucement (5 x g).
  4. Laver l’échantillon dans 15 mL de tampon de lavage hyaluronidase dans un tube conique de 50 mL en position horizontale à l’abri de la lumière pendant 2 h (trois fois) à 37 °C en agitant doucement (5 x g).
    1. Pour préparer le tampon de lavage hyaluronidase, dissoudre 50 mM de tampon carbonate, 150 mM de NaCl, 0,1% (v / v) de Triton X-100, 5% (v / v) de méthanol et 0,05% NaN3. Ajuster le pH à 10. Pour préparer 10x le stock tampon de NaCl de carbonate, dissoudre 2,96 g de carbonate de sodium, 1,86 g d’hydrogénocarbonate de sodium et 8,77 g de NaCl dans 100 mL d’eau bidistillée avec 0,05 % deNaN3 (voir le tableau des matériaux) et ajuster le pH à 10.

5. Immunomarquage

  1. Marquez le système vasculaire à l’aide d’anticorps anti-α-SMA (actine alpha-petite musculaire, voir le tableau des matériaux) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Générer un complexe d’anticorps secondaires de fragment Fab primaire plus conjugué. Commencez cette réaction 1,5 h avant la procédure de coloration.
      1. Calculer la quantité requise d’anticorps primaires et secondaires (mélanger dans un rapport de 1:0,5 en poids).
        REMARQUE: Pour l’anticorps primaire anti-α-SMA, 3,5 μg sont nécessaires pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour un produit à 2,5 mg/mL, 3,5/2,5 = 1,4 μL de solution d’anticorps est nécessaire. Pour l’anticorps secondaire AlexaFluor 647 anti-souris Fab fragment, 1,75 μg est nécessaire pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour 1,7 mg/mL de produit, 1,75/1,7 = 1 μL de solution d’anticorps est nécessaire.
      2. Mélanger les anticorps primaires et secondaires dans un tube ambré de 2 mL et incuber pendant 1,5 h à 37 °C.
    2. Pour l’échange de tampon, mélanger 7,5 mL de 2x tampon d’immunomarquage 3D HV1 (inclus dans la trousse, voir le tableau des matériaux) avec 7,5 mL d’eau bidistillée et immerger l’échantillon de tissu pendant 1,5 h à 32 °C en agitant doucement (5 x g) dans un tube conique de 15 mL en position horizontale. Commencez cette réaction simultanément à la génération du complexe d’anticorps (1,5 h avant la procédure d’immunomarquage).
  2. Effectuez une immunocoloration 3D en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Dans un tube conique de 15 mL, préparer la solution de coloration des anticorps après le dossier supplémentaire 1.
    2. Prélever l’échantillon de tissu dans le milieu d’échange tampon (étape 5.1.2) et l’immerger dans la solution de coloration des anticorps. Incuber les tissus individuellement pendant 1 semaine à 32 °C en secouant doucement (5 x g) les tubes en position debout à l’abri de la lumière. Scellez le tube avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation.
    3. Passer à 4 °C et incuber en position debout.
    4. Refroidir 1x tampon de lavage immunostatique 3D HV1 (inclus dans la trousse, voir le tableau des matières) à 4 °C et laver l’échantillon avec 15 ml de tampon (deux fois) pendant 30 minutes chacun à 4 °C en agitant doucement (5 x g). Conserver les tubes coniques de 15 ml en position horizontale jusqu’à l’étape 5.2.7.
    5. Diluer le formol à 1 % dans 1x tampon de lavage immunostatique HV1 3D et immerger l’échantillon dans 8 mL de la solution pendant 24 h à 4 °C en agitant doucement (5 x g).
    6. Incuber dans une solution fraîche de formol à 1% pendant 1 h à 37 °C en agitant doucement (5 x g).
    7. Laver dans 15 mL de PBS pendant 2 h à 25 °C en secouant doucement (5 x g).
  3. Boostez le signal tdTomato en utilisant des anticorps anti-Red Fluorescent Protein (RFP) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Suivez les mêmes temps et températures d’incubation qu’à l’étape 5.2.2. Calculez la quantité d’anticorps primaires et secondaires (voir le tableau des matières) et mélangez-les dans un rapport de 1:0,5 en poids.
      REMARQUE: Pour les anticorps primaires anti-RFP, 5 μg sont nécessaires pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour 1,25 mg/mL de produit, 5/1,25 = 4 μL de la solution sont nécessaires. Pour l’anticorps secondaire Alexa Fluor 647 anti-lapin Fab fragment, 2,5 μg sont nécessaires pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour 1,5 mg/mL de produit, 2,5/1,5 = 1,7 μL de la solution est nécessaire.
    2. Préparer la solution de coloration des anticorps comme mentionné dans le dossier supplémentaire 1.
  4. Boostez les signaux GFP à l’aide de nanocorps anti-GFP en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Suivez les mêmes temps et températures d’incubation que ceux mentionnés à l’étape 5.2.2.
      REMARQUE: Les nanocorps anti-GFP (voir le tableau des matériaux) sont conjugués avec Alexa Fluor 647, de sorte que la génération de complexe d’anticorps est inutile.
    2. Préparer la solution de coloration des anticorps comme mentionné dans le dossier supplémentaire 1.

6. Correspondance IR

  1. Tremper les organes transparents dans 5 mL de solution CUBIC-R+ diluée à 50 % dans l’eau (voir le tableau des matières) à TA (ON) en agitant doucement (5 x g) dans un tube conique de 50 mL. Gardez les tubes en position debout pendant toute l’étape d’appariement de l’IR.
    REMARQUE: Les solutions CUBIC R+ recyclées provenant d’expériences antérieures pourraient être réutilisées (jusqu’à quatre fois) à cette étape. Pour préparer la solution CUBIC-R+, dissoudre 45 % de 2,3-diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone (antipyrine), 30 % de nicotinamide ou de N-méthylnicotinamide et 0,5 % de N-butyldiéthanolamine dans de l’eau bidistillée ou utiliser le tampon CUBIC-R+ commercial (voir le tableau des matières).
    ATTENTION : CUBIC-R+ provoque une irritation de la peau, une irritation oculaire grave et des dommages aux organes. Portez des gants de protection et assurez-vous de protéger les yeux et le visage. Ne respirez pas de poussière, de fumées, de gaz, de brouillard ou de vapeurs. Éliminer dans une usine d’élimination des déchets agréée.
  2. Remplacer 50% CUBIC-R+ par 5 mL de 100% CUBIC-R+ et incuber en secouant doucement (5 x g) à TA pendant 2 jours. Ensuite, transférez les tissus sur une pile de lingettes non pelucheuses et tournez soigneusement les mouchoirs pour retirer la solution CUBIC-R+ des surfaces des organes pendant 5 minutes.

7. Montage

  1. Après avoir séché les tissus, transférez-les dans 5 mL de solution de montage (RI = 1,520) (voir le tableau des matériaux) dans une plaque de culture cellulaire à six puits et incuberez-les (ON) à TA. Retournez fréquemment les tissus pour éliminer les bulles d’air, en particulier à la surface des organes.
    REMARQUE: Les organes peuvent être conservés pendant plus de 6 mois dans une solution de montage ou CUBIC-R+.
  2. Collez les tissus au porte-échantillon du microscope en utilisant de la colle gel à base de cyanoacrylate.
  3. Immergez les échantillons dans la cuvette de quartz au microscope remplie de 120 ml de solution de montage et imagez-les transversalement à leur axe longitudinal. Adhérer au cœur avec l’apex et l’aorte alignés horizontalement.
    REMARQUE: Les organes dégagés et montés peuvent être sectionnés avec un vibratome et imagés à fort grossissement par microscopie confocale. Incorporer les organes dans de l’agarose à 2% et couper des sections de 100 à 500 μm. Les organes peuvent également être sectionnés manuellement avec une lame tranchante pour produire des sections de tissus épais (>1000 μm). Après la section, placez les tranches dans des boîtes de Petri de 35 mm à fond de verre, montez en utilisant la même solution de montage, scellez avec du vernis à ongles et imagez avec un microscope confocal.

8. Acquisition d’images

  1. Imagez les échantillons montés à l’aide d’un microscope à feuille de lumière (voir le tableau des matériaux). Réglez le grossissement et la taille des pas entre les tranches individuelles à 3 μm, et utilisez des lasers à feuille de lumière droite et gauche avec des épaisseurs de 5 μm et une largeur de 100%. Réglez la durée d’exposition constante à 50-100 ms et réglez la puissance laser de 10% à 80% en fonction de l’intensité du signal de fluorescence.
    1. Pour la co-détection des parasites exprimant la tomate td et des amastigotes dormants colorés par le DiR (Figure 2C), utilisez respectivement des canaux rouges (Ex/Em 561/620-660 nm) et infrarouges (Ex/Em 785/845-55 nm). Pour la co-détection des lymphocytes T et des parasites exprimant la tomate td chez la souris rapporteuse CD8 (Figure 2D), utiliser respectivement le canal vert (Ex/Em 488/525-50 nm) et le canal rouge.
    2. Pour les tests de co-infection (Figure 2E), ainsi que pour la co-détection des parasites exprimant la GFP chez les souris rapporteurs de noyaux (Figure 2F), utilisez les canaux vert et rouge, respectivement. Pour la détection des parasites exprimant la tomate, du colorant nucléaire et du système vasculaire cardiaque (Figure 3B,C), utilisez respectivement les canaux rouge, vert et rouge lointain (Ex/Em 640/680-730 nm).
    3. Détecter les anticorps anti-RFP avec le canal rouge lointain et les nanocorps anti-GFP à l’aide du canal vert (Figure 3D).
  2. Convertissez les piles d’images TIFF acquises et reconstruisez les organes en 3D à l’aide du logiciel Imaris v9.7.2 (voir Tableau des matériaux).

9. Reconstruction et quantification de surface avec le logiciel Imaris

  1. Sélectionnez l’outil d’algorithme de détection de surfaces et lancez l’assistant dans le logiciel d’analyse d’image.
  2. Effectuez une analyse initiale dans une région d’intérêt 3D (sélectionnée au hasard), puis appliquez-la à l’ensemble de la reconstruction d’organes 3D. Après avoir choisi une région d’intérêt (ROI), sélectionnez le canal à analyser, décochez le bouton lisse et sélectionnez soustraction d’arrière-plan.
    Remarque : La soustraction d’arrière-plan calcule une valeur d’arrière-plan locale unique pour chaque voxel et la soustrait de la valeur de pixel d’origine. Le diamètre de la plus grande sphère qui s’insère dans l’objet doit aller jusqu’à 200 μm pour les cellules infectées par T. cruzi, 10 μm pour les cellules T et 5 μm pour les parasites individuels.
  3. Utilisez l’histogramme pour ajuster la classification et la liste déroulante des filtres pour sélectionner les mesures à classer.
    REMARQUE : Utilisez l’histogramme pour ajuster la classification : des mesures d’ellipticité (oblat) et de sphéricité sont recommandées.
  4. Finalisez l’assistant, appuyez sur le bouton statistiques et récupérez le nombre total de cellules infectées par un parasite ou de cellules T en tant que nombre de composants déconnectés par point de temps.

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Representative Results

Les tissus fixes CUBIC ont été lavés avec du PBS pour éliminer les fixateurs, puis incubés avec des cocktails CUBIC-L, une solution tamponnée de base d’alcools aminés qui extrait les pigments et les lipides du tissu, ce qui entraîne une décoloration des tissus tout en maintenant l’architecture des tissus. Les lignes de la grille dans le papier peuvent être vues à travers les tissus indiquant une clairance appropriée des organes (Figure 2A). Après délipidation, les tissus ont été lavés et immergés dans CUBIC-R+ et la solution de montage pour l’homogénéisation et l’imagerie IR, respectivement (Figure 2B).

Une souris de type sauvage a été infectée par des trypomastigotes exprimant la tomate et pré-colorés avec le colorant cyanine proche infrarouge DiR. La souris a été euthanasiée 15 jours après l’infection, et le cœur intact a été disséqué, réparé et nettoyé. L’imagerie LSFM et la reconstruction 3D nous ont permis de visualiser tdTomato-exprimant la prolifération des parasites T. cruzi (rouge). Les niveaux d’autofluorescence dans le canal rouge peuvent être utilisés pour la visualisation correcte de la structure et des bords du cœur (Figure 2C i). LSFM a également été utile pour identifier les formes dormantes résistantes aux médicaments 7,8. La coloration pré-infection des parasites avec le colorant DiR permet de suivre les parasites dormants en visualisant les parasites qui n’avaient pas dilué le colorant par réplication, comme indiqué précédemment pour CellTrace Violet7.

Les parasites dormants (cyan) peuvent être identifiés dans le cœur comme le montrent les encarts agrandis 3D (flèches jaunes) (Figure 2C ii,iii). La fluorescence de projection Z a été segmentée automatiquement pour générer un modèle de surface 3D reconstruit pour la visualisation spatiale et la quantification du nombre total de cellules infectées par T. cruzi et de parasites dormants tout au long de la reconstruction 3D (Figure 2A). L’analyse du modèle de surface 3D a révélé 186 cellules infectées par T. cruzi avec une proportion plus élevée de cellules infectées dans l’oreillette cardiaque (123) par rapport aux ventricules (63) et 18 parasites dormants dans tout le cœur (Figure 2C i). Dans un rapport précédent, un pipeline similaire pour surveiller le nombre de cellules infectées par T. cruzi et de parasites dormants dans les tissus clarifiés de souris après un traitement médicamenteux a été signalé31. Il est important de noter que les estimations du nombre de parasites dormants sont probablement sous-estimées, car la technique de dilution du colorant ne permet de détecter que les parasites qui ne se sont pas répliqués de manière significative depuis l’infection initiale, mais ne détecte pas ceux qui sont devenus dormants plus tard dans l’infection après plusieurs cycles de division.

Une approche similaire a été utilisée pour surveiller l’interaction entre différentes souches de T. cruzi chez des souris déficientes en interféron (IFN)-gamma. La production d’IFN-gamma par les lymphocytes T effecteurs est essentielle pour le contrôle immunitaire de T. cruzi. Chez les souris déficientes en IFN-gamma, les parasites prolifèrent avec une restriction immunitaire minimale, produisant un nombre très élevé de cellules infectées dans les organes. Ces modèles immunodéficients sont des outils utiles pour étudier l’efficacité de nouveaux médicaments sans la restriction imposée par la reconnaissance immunitaire, et permettent ainsi la détection de la rechute parasitaire après traitement. Des souris déficientes en IFN-gamma ont été co-infectées par des souches de T. cruzi exprimant la tdTomate (rouge) et de T. cruzi exprimant la GFP du Brésil. Les souris ont été euthanasiées 17 jours après l’infection, et les cœurs intacts ont été disséqués, réparés et nettoyés. Dans ce modèle immunodéficient, les cellules hôtes infectées par les deux souches de T. cruzi peuvent être observées à différents stades du développement du parasite, y compris les grandes, moyennes et petites cellules infectées et les cellules récemment éclatées. Le découpage à travers les tissus montre une abondance de cellules infectées par des parasites dans les oreillettes cardiaques à différentes profondeurs tissulaires (Figure 2E i-iii et Film 1).

Un croisement de souris C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J et B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, dans lequel toutes les cellules T expriment la protéine fluorescente verte ZsGreen1, a été utilisé pour surveiller le recrutement des lymphocytes T dans les tissus infectés par T. cruzi. Les souris ont été euthanasiées 14 jours après l’infection par des parasites exprimant la tomate td, et le muscle squelettique a été excisé, nettoyé et imagé par LSFM. ZsGreen1 exprimant des cellules T (bleu) et des cellules infectées par T. cruzi (rouge) ont été détectées de manière robuste (Figure 2D i et Film 2). Les zooms 3D de la reconstruction 3D ont permis d’identifier des lymphocytes T dans la région d’une cellule infectée (Figure 2D ii). Des sections épaisses de vibratome (200-500 μm) du même tissu nous permettent de visualiser l’interface des lymphocytes T et des cellules infectées hôtes par microscopie confocale (Figure 2D iii).

Une autre façon de surveiller les foyers d’inflammation est basée sur l’accumulation de noyaux cellulaires autour des cellules infectées par T. cruzi. Une souris reporter dans laquelle tous les noyaux cellulaires expriment la protéine fluorescente tdTomato a été utilisée à cette fin. L’expression nucléaire de la tomate (rouge) a été facilement détectée dans les tissus après le processus d’effacement. Une souris rapporteur nucléaire a été infectée par des parasites T. cruzi exprimant la GFP (cyan) et, 35 jours après l’infection, a été euthanasiée et les muscles squelettiques ont été excisés, nettoyés et imagés par LSFM (Figure 2F i-iii). Les coupes optiques zoomées du muscle squelettique révèlent une cellularité accrue en accumulant des noyaux rouges le long des parasites exprimant la GFP (Figure 2F ii). Des coupes de vibratomes du même tissu confirment l’accumulation précédemment décrite de noyaux rouges le long des parasites exprimant la GFP par microscopie confocale (Figure 2F iii).

Le protocole CUBIC a également été adapté pour l’immunomarquage et le marquage de l’ADN d’organes et de tissus intacts et clairs infectés par T. cruzi (Figure 3A). Les souris ont été euthanasiées 40 jours après l’infection par des parasites exprimant la tomate td, et les cœurs ont été disséqués, réparés et nettoyés. Le cœur intact a été lavé et coloré pendant 5 jours avec un marqueur ADN vert, puis lavé à nouveau et immunocoloré pendant 7 jours avec des anticorps contre α-SMA. Les échantillons ont été post-fixés, lavés, appariés RI et imagés avec LSFM. La détection simultanée de plusieurs signaux fluorescents, y compris les noyaux, le système vasculaire et les cellules infectées par T. cruzi, a été possible grâce à ce protocole. L’immunomarquage α-SMA (blanc) a présenté des niveaux de signal élevés révélant le système vasculaire complexe du cœur (Figure 3B ii et Film 3). Une coupe optique provenant de régions cardiaques plus profondes illustre la pénétration tissulaire des anticorps α-SMA dans les conditions établies (Figure 3B v). La coloration de l’ADN (bleu) a également montré une bonne pénétration tissulaire, des niveaux de fluorescence et une coloration volumétrique stable. Certaines zones avec un marquage ADN intense ont été identifiées dans différents endroits cardiaques (Figure 3B i) et autour des fibres musculaires squelettiques (Figure 3C i et Film 4). Une image agrandie du muscle squelettique a montré une accumulation de noyaux bleus dans des zones où les parasites de la tomate td sont peu nombreux ou indétectables, ce qui suggère le recrutement de cellules immunitaires sur les sites d’infection actuelle ou antérieure à T. cruzi (Figure 3C ii). Dans d’autres cas, les cellules hôtes infectées présentaient peu ou pas de signes d’infiltrats cellulaires à proximité (flèches blanches) (Figure 3C i). Des coupes de vibratomes du même tissu que sur la figure 3C ii montrent une coloration de l’ADN des cellules et des parasites exprimant la tomate td par microscopie confocale (Figure 3C iii). 

Des expériences antérieures ont montré que les parasites dormants présentaient une expression faible ou négligeable des protéines rapporteures tdTomato ou GFP (Figure 2C ii et iii). Pour améliorer la détection de ces protéines fluorescentes, les tissus dégagés ont été immunocolorés avec des anticorps anti-RFP ou -GFP. Des tissus musculaires squelettiques intacts de souris infectées par des parasites exprimant la tomate td ou la GFP ont été fixés, clarifiés et immunocolorés avec des anticorps contre RFP (RFP Booster) (Figure 3D) ou des nanocorps contre la GFP conjugués avec Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Figure 3E), respectivement. Les échantillons ont été post-fixés, lavés, appariés RI et imagés avec LSFM. Dans les deux cas, l’amplification des signaux GFP et tdTomato par les anticorps a entraîné une forte fluorescence (Figure 3D ii et 3E ii). Les immunocolorations utilisant des anticorps stimulants représentent un outil polyvalent qui sera utilisé pour détecter les dormants de T. cruzi dans les organes entiers clarifiés et les tissus et détecter tout signal sous-représenté des protéines rapporteures RFP ou GFP des membres de la famille.

Figure 1
Figure 1 : Insertion de l’aiguille pendant la perfusion transcardiaque. (A) Une représentation schématique montrant les étapes effectuées avant de perfuser la souris dans le cœur et la position et la direction correctes de l’aiguille de perfusion dans le ventricule gauche. Une petite incision dans l’oreillette droite a été pratiquée et du sang drainé a été recueilli (1); Une aiguille papillon a été insérée dans l’apex du cœur. Maintenez la direction de sorte que l’aiguille ne perce pas le septum (2). Le trou d’entrée autour de l’aiguille a été scellé à l’aide de colle à base de gel (3). Le foie est rempli de sang et apparaît rouge avant la perfusion; Cependant, après perfusion, il perd sa pigmentation et devient pâle. RA, oreillette droite; LA, oreillette gauche; RV, ventricule droit; LV, ventricule gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2: Visualisation des cellules infectées par T. cruzi, des amastigotes dormants et des foyers d’inflammation dans les organes nettoyés. (A) Schéma de l’organe entier T. cruzi-détection des cellules infectées à l’aide du nettoyage tissulaire, de l’imagerie LSFM et de la quantification assistée par logiciel dans des modèles de surface 3D. (Je) Images en champ clair du cœur et des muscles squelettiques avant (à gauche) et après (à droite) l’éclaircissage (barre d’échelle: 1000 μm). (Ii) Microscope à fluorescence à feuille de lumière. (Iii) déficiente en IFN-gamma chez la souris a été infectée par 2 x 105 tdTrypomastigotes exprimant la tomate. 17 jours après l’infection, le cœur a été disséqué, CUBIC effacé et LSFM imagé (barre d’échelle: 500 μm). (Iv) La fluorescence de projection Z a été segmentée automatiquement pour générer un modèle de surface 3D reconstruit pour la visualisation spatiale et la quantification du nombre de T. cruzi-cellules infectées. Un total de 736 T. cruziont été détectées dans l’ensemble du cœur (barre d’échelle : 500 μm). (v) affiche les grossissements du volume indiqué dans (Iv), où les objets cyan représentent T. cruzi(barre d’échelle : 50 μm). (B) Protocole de compensation des organes entiers CUBIC. (C) Visualisation de la prolifération et de la dormance T. cruzi parasites dans le cœur de souris transparent. (Je) Une souris de type sauvage a été infectée par 2 x 105 tdTrypomastigotes exprimant la tomate colorés avec un colorant cyanine proche infrarouge DiR. Le cœur a été disséqué, dégagé et LSFM imagée. tdTomate exprimant la prolifération (rouge) et dormante (cyan) T. cruzi Les parasites peuvent être identifiés. Les niveaux d’autofluorescence ont été maintenus pour permettre une visualisation correcte de la structure cardiaque. Une souris a été tuée 15 jours après l’infection sur la base du pic de cellules infectées par des parasites et d’amastigotes dormants trouvés dans des travaux antérieurs (barre d’échelle: 400 μm). (Ii) et (iii) afficher les grossissements du volume indiqué dans (Je), où les flèches jaunes indiquent les parasites dormants (cyan) (barre d’échelle : 200 μm). (D) Détection du recrutement des lymphocytes T chez une souris rapporteure CD8 infectée. (Je) Reporter mouse a été infecté par 2 x 105 tdLes trypomastigotes exprimant la tomate et le muscle squelettique ont été disséqués, nettoyés et LSFM imagé 14 jours après l’infection, un moment où des réponses cellulaires substantielles sont détectées. ZsGreen1 exprimant les lymphocytes T (bleu) ainsi que T. cruzi(rouge) ont été visualisées (barre d’échelle : 400 μm) (voir aussi Film 2). (Ii) affiche les grossissements du volume indiqué dans (Je) (barre d’échelle: 50 μm). (Iii) représente l’accumulation de lymphocytes T entourant un T. cruzidans une coupe de tissu (200 μm) du même organe (barre d’échelle: 8 μm). (E) Interaction entre différents T. cruzi Souches. (Je) déficientes en IFN-gamma ont été co-infectées par 2 x 105 tdColombiena exprimant la tomate (rouge) et le Brésil exprimant la GFP (bleu) T. cruzi Souches. Les souris ont été euthanasiées et les cœurs intacts ont été disséqués, réparés et éliminés 17 jours après l’infection (barre d’échelle: 400 μm). (Ii) affiche les grossissements du volume indiqué dans (Je) (barre d’échelle: 250 μm). (Iii) montre une coupe optique agrandie révélant des cellules infectées par Colombiana (rouge) et Brazil (bleu) T. cruzi (barre d’échelle : 150 μm). (F) Visualisation de la cellularité le long des cellules infectées à l’aide de noyaux souris rapporteur. (Je) Une souris rapporteur nucléaire a été infectée par 2 x 105 Les trypomastigotes exprimant la GFP et les muscles squelettiques ont été disséqués, nettoyés et LSFM imagés 35 jours après l’infection. L’expression nucléaire de la tomate des cellules hôtes (rouge), ainsi que l’expression du parasite GFP (cyan), ont été détectées (barre d’échelle : 400 μm). (Ii) montre une coupe optique agrandie révélant une accumulation de noyaux rouges le long des parasites exprimant la GFP (barre d’échelle : 90 μm). (Iii) confirme une augmentation de la cellularité par imagerie confocale de coupes tissulaires provenant d’un même organe (barre d’échelle : 8 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Marquage des organes infectés par T. cruzi avec des anticorps et des colorants nucléaires. (A) Protocole CUBIC pour le nettoyage des tissus, l’immunomarquage 3D et le marquage de l’ADN d’organes entiers. (B) Marquage du cœur de souris pour le système vasculaire et la détection de l’ADN (voir aussi le film 3). (i-iii) Une souris de type sauvage a été infectée par 2 x 105 tdTomate-exprimant des parasites. La souris a été euthanasiée 40 jours après l’infection, et le cœur a été disséqué, réparé et nettoyé. Le cœur dégagé a été marqué avec un marqueur ADN et immunocoloré avec des anticorps contre α-SMA. La détection simultanée des noyaux cellulaires (bleu), vasculaires (blanc) et des cellules infectées par T. cruzi (rouge) était possible. La souris a été tuée à ce moment post-infection lorsque le remodelage des tissus et du système vasculaire spécial peut être évalué (barre d’échelle: 400 μm). (iv) montre un volume agrandi des régions profondes du cœur (iii) représentant les noyaux cellulaires, le système vasculaire et les cellules infectées (barre d’échelle: 90 μm). (v) représente une coupe optique obtenue de (iii) (barre d’échelle: 90 μm). (C) Augmentation de la cellularité visualisée par le marquage de l’ADN de l’ensemble du muscle squelettique dégagé. (i) Le tissu musculaire squelettique de l’expérience précédente était coloré à l’ADN, révélant des zones avec un marquage nucléaire intense (bleu) ainsi que des cellules infectées par T. cruzi (rouge) (barre d’échelle: 200 μm) (voir aussi le film 4). (ii) révèle une accumulation intense de noyaux bleus dans les zones où la détection du parasite tdtomate est faible ou nulle (barre d’échelle : 100 μm). (iii) l’imagerie confocale à fort grossissement (60x) identifie le marquage de l’ADN des cellules et des parasites dans les coupes de tissus (barre d’échelle: 10 μm). (D) Stimulation des marqueurs rapporteurs de parasites tdTomato dans l’ensemble du muscle squelettique dégagé. (i-iii) Les tissus musculaires squelettiques intacts de souris infectées par 2 x 105 parasites exprimant tdTomato ont été fixés, clarifiés et immunocolorés avec des anticorps contre RFP (RFP Booster). Un signal fluorescent intense et uniforme a été obtenu dans le canal rouge lointain après amplification RFP (vert) du signal tdTomato (rouge) (barre d’échelle: 100 μm). (E) Renforcement des marqueurs rapporteurs de parasites GFP à l’aide de nanocorps anti-GFP. (i-iii) Les tissus musculaires squelettiques de souris infectées par 2 x 105 parasites exprimant la GFP ont été fixés, clarifiés et immunocolorés avec des nanocorps conjugués Alexa Fluor 647 contre le GFP (GFP Booster). Un signal fluorescent fort a été obtenu dans le canal rouge lointain après amplification GFP (magenta) de la fluorescence GFP (cyan). Les souris de (D) et (E) ont été tuées 30 jours après l’infection parce que les charges parasitaires atteignent un pic à ce moment-là, et les cellules infectées par le parasite peuvent être facilement détectées dans le muscle squelettique (barre d’échelle: 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film 1: Infection à T. cruzi du cœur et du muscle squelettique chez des souris déficientes en IFN-gamma. Reconstructions 3D de tissus clarifiés CUBIC de souris déficientes en IFN-gamma co-infectées par 2 souches de T. cruzi exprimant 2 x 105 tdTomate exprimant Colombiana (rouge) et T. cruzi du Brésil (bleu) exprimant la GFP au jour 17 après l’infection. Un total de 1151 tranches individuelles du cœur et 559 du muscle squelettique ont été acquises via LSFM. Des résultats d’imagerie comparables ont été obtenus chez trois animaux indépendants. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 2: Détection du recrutement des lymphocytes T chez une souris reporter CD8 infectée par T. cruzi. Visualisation 3D d’un muscle squelettique clarifié CUBIC d’une souris rapporteur CD8 infectée par 2 x 105 souches de Tdtomato-exprimant Colombiana T. cruzi (rouge) et tuée 14 jours après l’infection. Un total de 668 tranches individuelles du muscle squelettique ont été imagées par LSFM. ZsGreen1 exprimant des lymphocytes T (bleu) ainsi que des lymphocytes infectés par T. cruzi (rouge) ont été visualisés. Des résultats d’imagerie comparables ont été obtenus chez deux animaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 3: Immunodétection du système vasculaire dans le cœur infecté par T. cruzi et dégagé. Reconstruction 3D d’un cœur clarifié CUBIC de souris de type sauvage infectées par 2 x 105 tdColombiana T. cruzi exprimant la tomate et immunocolorées avec des anticorps contre la α-SMA (bleu) 40 jours après l’infection. Le tranchage à travers le cœur révèle le système vasculaire complexe du cœur et la pénétration tissulaire des anticorps α-SMA. Les cellules infectées par le parasite pourraient être observées sous forme de taches rouge vif dans les oreillettes cardiaques (rouge, à droite). Des résultats d’imagerie comparables ont été obtenus chez deux animaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film 4: Lacoloration de l’ADN des organes entiers révèle des zones avec une cellularité accrue. Reconstruction 3D du muscle squelettique clarifié CUBIC de souris de type sauvage 40 jours après l’infection infectée par 2 x 105 tdSouche Colombiana T. cruzi exprimant la tomate. Toute la zone musculaire du quadriceps a été colorée avec un colorant nucléaire vert. Les cellules infectées par T. cruzi (rouge) et les noyaux de chaque cellule du tissu (bleu) ont été visualisés. Les zooms de la reconstruction 3D révèlent une accumulation de noyaux bleus le long de zones avec peu ou pas de détection de parasites tdTomato. Des résultats d’imagerie comparables ont été obtenus chez deux animaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Dossier supplémentaire 1 : Composition des solutions de coloration des anticorps utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’absence d’imagerie approfondie des parasites et de la réponse immunitaire limite la compréhension de la complexité des interactions hôte-parasite et entrave l’évaluation des thérapies pour la maladie de Chagas. La présente étude a adopté le pipeline CUBIC pour clarifier et colorer les organes et tissus intacts de souris infectées par T. cruzi.

Plusieurs protocoles de nettoyage tissulaire ont été testés dans cette étude (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 et fDISCO13); cependant, seul CUBIC a conservé des niveaux élevés de fluorescence du parasite tdTomato ou GFP. De même, des rapports antérieurs ont montré la préservation CUBIC de marqueurs exprimés de manière endogène par rapport à d’autres approches de nettoyage tissulaire35.

La capacité de résolution limitée est l’une des mises en garde actuelles de la microscopie conventionnelle à feuille de lumière. Cela est clair dans les difficultés de résolution des parasites individuels dans les cellules fortement infectées (Figure 2C). Les microscopes à feuille de lumière à carrelage nouvellement développés avec une capacité de résolution améliorée et l’adaptation des techniques d’expansion tissulaire pourraient résoudre ce problème36.

Les impuretés des tampons de lavage, des solutions de nettoyage ou d’autres organes peuvent précipiter dans les tissus, produisant des signaux non spécifiques qui peuvent être confondus avec des cellules infectées par des parasites, des parasites individuels ou d’autres structures. Cependant, ces artefacts sont généralement fluorescents dans plusieurs canaux, de sorte qu’après analyse d’image, ils peuvent être facilement éliminés du comptage automatisé en imageant les tissus dans un canal alternatif (généralement le canal vert). Les objets à double couleur ont été considérés comme des artefacts et exclus de la quantification automatisée.

Les colorations nucléaires DAPI, PI, RedDot2 et SYTOX-G présentent de bons niveaux de pénétration tissulaire et d’intensité de signal dans la plupart des organes CUBIC; cependant, le colorant ADN vert a montré les meilleures performances (Figure 3B, C et Film 4).

Ces résultats ont montré que les cellules infectées par T. cruzi pouvaient être facilement détectées et quantifiées avec précision tout en identifiant simultanément les signaux des souris rapporteures des cellules T ou des noyaux. Plus important encore, LSFM a détecté des événements biologiques rares, tels que des amastigotes dormants DiR-positifs, dans un environnement tissulaire complexe avec la capacité potentielle de l’étendre à l’immunomarquage des épitopes et au marquage de l’ADN. Les études actuelles explorent également l’utilité de ces approches pour surveiller l’activation des cellules effectrices immunitaires, les interactions entre plusieurs souches de parasites chez le même hôte et l’induction de lésions tissulaires et de réparation dans la maladie de Chagas.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Etsuo Susaki pour son aide précieuse et ses recommandations concernant les protocoles de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage. De plus, nous sommes reconnaissants à M. Kandasamy du noyau de microscopie biomédicale du CTEGD pour son soutien technique à l’aide de LSFM et de l’imagerie confocale. Nous remercions également tous les membres du Tarleton Research Group pour leurs suggestions utiles tout au long de cette étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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Immunologie et infection numéro 184 Trypanosoma cruzi Chagas éclaircissement immunocoloration CUBIC microscopie fluorescente à feuille claire
Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par <em>Trypanosoma cruzi</em>, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts
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Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M.,… More

Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

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