Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصوير الكمي 3D للخلايا المصابة بداء المثقبيات ، و amastigotes النائمة ، والخلايا التائية في الأعضاء المصفاة السليمة

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63919
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

ويصف هذا البروتوكول الفحص المجهري الفلوري الخفيف والأساليب الآلية بمساعدة البرمجيات لتصور طفيليات المثقبيات والخلايا التائية المنتشرة والنائمة في الأعضاء والأنسجة السليمة والواضحة وتحديدها كميا بدقة. توفر هذه التقنيات طريقة موثوقة لتقييم نتائج العلاج وتقديم رؤى جديدة حول التفاعلات بين الطفيليات والمضيف.

Abstract

مرض شاغاس هو مرض مهمل يؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم ، وخاصة في أمريكا اللاتينية. عامل مرض شاغاس ، Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ، هو طفيلي ملزم داخل الخلايا مع بيولوجيا متنوعة تصيب العديد من أنواع الثدييات ، بما في ذلك البشر ، مما يسبب أمراض القلب والجهاز الهضمي. لطالما كانت هناك حاجة إلى الكشف الموثوق به عن عدوى T. cruzi في الجسم الحي لفهم البيولوجيا المعقدة لمرض شاغاس وتقييم نتائج أنظمة العلاج بدقة. يوضح البروتوكول الحالي خط أنابيب متكامل للقياس الكمي الآلي للخلايا المصابة ب T. cruzi في الأعضاء المعاد بناؤها وتطهيرها بتقنية 3D. يسمح الفحص المجهري الفلوري ذو الألواح الضوئية بتصور دقيق وتحديد كمي لطفيليات T. cruzi المنتشرة والنائمة بنشاط والخلايا المستجيبة المناعية في الأعضاء أو الأنسجة بأكملها. أيضا ، تم اعتماد خط أنابيب CUBIC-HistoVision للحصول على علامات موحدة للأعضاء التي تم تطهيرها بالأجسام المضادة والبقع النووية بنجاح. يوفر تطهير الأنسجة إلى جانب التلطيخ المناعي 3D نهجا غير متحيز لتقييم بروتوكولات العلاج الدوائي بشكل شامل ، وتحسين فهم التنظيم الخلوي للأنسجة المصابة ب T. cruzi ، ومن المتوقع أن يعزز الاكتشافات المتعلقة بالاستجابات المناعية المضادة ل T. cruzi ، وتلف الأنسجة ، والإصلاح في مرض شاغاس.

Introduction

يعد مرض شاغاس ، الذي يسببه الطفيلي الأولي T. cruzi ، من بين أكثر الأمراض المدارية إهمالا في العالم ، مما يتسبب في حوالي 13000 حالة وفاة سنوية. غالبا ما تتطور العدوى من مرحلة حادة إلى مرحلة مزمنة تنتج أمراض القلب في 30٪ من المرضى ، بما في ذلك عدم انتظام ضربات القلب وفشل القلب والموت المفاجئ 1,2. على الرغم من الاستجابة المناعية القوية للمضيف التي أثيرت ضد الطفيلي خلال المرحلة الحادة ، إلا أن أعدادا منخفضة من الطفيليات تستمر بشكل مزمن طوال حياة المضيف في أنسجة مثل القلب والعضلات الهيكلية. قد تساهم عدة عوامل ، بما في ذلك تأخر ظهور الاستجابات المناعية التكيفية ووجود أشكال غير متكررة من الطفيلي ، في قدرة T. cruzi على تجنب القضاء التام من قبل الجهاز المناعي3،4،5،6. علاوة على ذلك ، فإن الأشكال النائمة غير المكررة للطفيلي تظهر قابلية منخفضة للعقاقير المثقبسية وقد تكون مسؤولة جزئيا عن فشل العلاج الذي لوحظ في كثير من الحالات 7,8.

يوفر تطوير تقنيات تصوير جديدة فرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التوزيع المكاني للطفيليات في الأنسجة المصابة وعلاقتها بالخلايا المناعية المشاركة في السيطرة عليها. هذه الخصائص حاسمة لفهم أفضل لعمليات السيطرة على الطفيليات من قبل الجهاز المناعي وتتبع الطفيليات النائمة النادرة الموجودة في الأنسجة المزمنة.

يعد الفحص المجهري الفلوري ذو الألواح الضوئية (LSFM) أحد أكثر الطرق شمولا وغير متحيزة للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة أو الأعضاء الكبيرة دون تقسيم رقيق. تستخدم المجاهر ذات الألواح الضوئية صفيحة رقيقة من الضوء لإثارة الفلوروفورات فقط في المستوى البؤري ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية للعينات ، وتسجيل صور لآلاف طبقات الأنسجة باستخدام كاميرات فائقة السرعة. يتم الحصول على المستوى العالي من شفافية الأنسجة اللازمة للاختراق السليم لضوء الليزر في الأنسجة عن طريق تجانس معامل الانكسار (RI) بعد إزالة الدهون من الأنسجة وإزالة اللون ، مما يقلل من تشتت الضوء ويجعل الصور عالية الجودة9،10،11.

تم تطوير أساليب تطهير الأنسجة لتصوير الفئران الكاملة 12،13،14 ، والمواد العضوية 15،16،17 ، والأعضاء التي تعبر عن علامات الفلورسنت المراسلة18،19،20،21،22،23 ، ومؤخرا عدد محدود من الأنسجة البشرية 24 . تصنف الطرق الحالية لإزالة الأنسجة إلى ثلاث عائلات: (1) الطرق القائمة على المذيبات العضوية مثل بروتوكولات DISCO 25,26 ، (2) الطرق القائمة على الهيدروجيل ، مثل CLARITY27 ، والطرق المائية ، مثل CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة وغير المعيقة والتحليل الحسابي) 18,19,28,29 . تحافظ بروتوكولات CUBIC على شكل العضو وسلامة الأنسجة ، مع الحفاظ على تألق البروتينات المراسلة الداخلية المعبر عنها. يسمح آخر تحديث لهذه التقنية ، CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV) ، أيضا بالكشف عن الظواهر باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت ووضع علامات الحمض النووي28.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام خط أنابيب CUBIC للكشف عن T. cruzi الذي يعبر عن البروتينات الفلورية في أنسجة الفئران السليمة الواضحة. تم تصوير الأنسجة الشفافة بصريا LSFM ، وإعادة بناء 3D ، وتم تحديد العدد الإجمالي الدقيق للخلايا المصابة ب T. cruzi ، و amastigotes النائمة ، والخلايا التائية لكل عضو تلقائيا. أيضا ، تم اعتماد هذا البروتوكول بنجاح للحصول على علامات موحدة للأعضاء التي تم تطهيرها مع الأجسام المضادة والبقع النووية. هذه النهج ضرورية لفهم توسع ومكافحة T. cruzi في المضيفين المصابين وهي مفيدة للتقييم الكامل للعلاجات الكيميائية والمناعية لمرض شاغاس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة بما يتفق تماما مع سياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وجمعية تقييم واعتماد المبادئ التوجيهية لاعتماد رعاية المختبرات. تمت الموافقة على بروتوكول استخدام الحيوانات (مكافحة عدوى T. cruzi في الفئران-A2021 04-011-Y1-A0) من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة جورجيا. ب 6. تم استخدام C+A2:A44g-GT(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J و C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J الفئران (الإناث،1-2 أشهر من العمر) لهذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. العدوى والتروية والتشريح

  1. تصيب الفئران داخل الصفاق بسلالة T. cruzi المشتقة من زراعة الأنسجة من كولومبيا (DTU TcI) أو البرازيل (DTU TcV) T. cruzi التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت tdTomato أو GFP ، على التوالي. يمكن أن تتراوح جرعة العدوى من 50000 إلى 200000 تريبوماستيجوت مخفف في 100 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: تتوفر تفاصيل محددة حول توليد طفيليات المراسلين ونماذج الفئران للعدوى في Canavaci et al. (29) وبوستامانتي وآخرون.30.
  2. القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بمعدل تدفق 3-7 لتر / دقيقة. بمجرد أن تتوقف الحيوانات عن إظهار أي رد فعل دواسة ، قم بعمل شق طولي عبر الجلد من البطن نحو القص. ثم قطع جدار الجسم من البطن والاستمرار من خلال الأضلاع على كل جانب من جوانب الصدر حتى يمكن رفع القص بعيدا ، مما يعرض القلب.
  3. كما هو موضح في الشكل 1 ، قم بعمل شق 2.5 مم في الأذن اليمنى للقلب وجمع الدم المستنزف باستخدام طرف ماصة دقيقة 1 مل.
  4. أدخل إبرة فراشة (متصلة بأحد طرفي نظام التروية) في قمة البطين الأيسر حتى تصل إلى الشريان الأورطي الصاعد. استخدم الغراء القائم على الهلام (انظر جدول المواد) لإغلاق فتحة المدخل حول الإبرة والحفاظ على الإبرة في موضعها أثناء التروية.
  5. قم بفحص الفئران30 مع 50 مل من الهيبارين-PBS البارد (الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 10 U / mL من الهيبارين) أو حتى يصبح السائل الذي يخرج من الماوس نحو صينية التجميع خاليا من الدم.
  6. بيرفيوز مع 50 مل من البرد 4٪ (ث / v) بارافورمالديهايد (PFA) (الرقم الهيدروجيني 7.4) في PBS.
    ملاحظة: من المحتمل أن يكون تثبيت أنسجة PFA أحد الخطوات الحاسمة للبروتوكول ، خاصة للحفاظ على هياكل epitope والكشف المناعي اللاحق. يتحلل PFA بمرور الوقت ، لذلك يجب إعداده طازجا. الرقم الهيدروجيني للمحلول مهم أيضا لتجنب الإفراط في التثبيت ، مما قد يؤدي إلى ضعف إزالة الأنسجة.
    تحذير: PFA سامة بشكل معتدل عن طريق ملامسة الجلد. التعرض الحاد هو أيضا مزعج للغاية للأنف والعينين والحلق. قد يسبب التعرض على المدى الطويل لمستويات منخفضة في الهواء أو الجلد تهيج الجلد مثل التهاب الجلد والحكة ، ومشاكل في الجهاز التنفسي تشبه الربو. ارتد حماية الوجه والعين ولا تتنفس الغبار أو الغاز أو الضباب أو الأبخرة أو الأبخرة.
    1. بعد تروية PFA ، قم بدمج الماوس مع 100 مل من المخزن المؤقت CUBIC-P للوصول إلى مستويات التوضيح المذكورة في الخطوة 1.5.
    2. لإعداد المخزن المؤقت CUBIC-P ، قم بإذابة 10٪ N-butyldiethanolamine و 5٪ Triton X-100 و 5٪ 1-N-Methylimidazole في ماء مقطر مزدوج أو استخدم الكوكتيلات التجارية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: الخطوات 1.6.1.-1.6.2. يوصى بها فقط للأعضاء شديدة التصبغ مثل القلب والكلى لأنها تتطلب خطوة ما قبل التطهير للحصول على مستويات متزايدة من الشفافية. بعد استخدام CUBIC-P ، قم بتشريح الأعضاء وانتقل مباشرة إلى الخطوة 2: تطهير الأنسجة.
  7. تشريح عينات الأنسجة / الأعضاء 30 ليتم تصويرها وبعد إصلاحها في 4٪ (ث / v) PFA في PBS (~ 10 مل / عضو كامل) بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (لا يزيد عن 5 × غرام) في أنابيب مخروطية50 مل.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الحضانات من الآن فصاعدا على أنابيب موضوعة أفقيا عند 20-30 درجة مئوية محمية من الضوء.
  8. اغسل العينة في 10 مل من PBS (مع استكمالها ب 0.05٪ من أزيد الصوديوم (NaN 3) لمدة3 ساعات (ثلاث مرات) في درجة حرارة الغرفة (RT) مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    ملاحظة: يمكن تجميد الأنسجة عن طريق احتضان 10 مل من السكروز بنسبة 30٪ في PBS مع اهتزاز لطيف (5 × جم) عند 4 درجات مئوية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. بعد أن تغرق الأنسجة في قاع الأنبوب ، قم بتضمينها في مركب OCT واحتفظ بها عند -80 درجة مئوية. تذوب في RT حتى يذوب مركب OCT تماما ، ثم تغسل في PBS (~ 10 مل / عضو كامل) ON عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في أنابيب مخروطية 50 مل. انتقل إلى الخطوة 2.

2. تطهير الأنسجة

ملاحظة: تم إجراء جميع عمليات إزالة الأنسجة التي أجريت في هذا العمل باستخدام بروتوكول CUBIC I22. تم استخدام ثلاثة كوكتيلات مختلفة: CUBIC-P لإزالة الدهون وإزالة اللون السريع أثناء التروية ، CUBIC-L لإزالة الدهون وإزالة اللون ، و CUBIC-R لمطابقة RI. تم إجراء تلطيخ الحمض النووي والتلطيخ المناعي باستخدام مجموعة التلطيخ النووي CUBIC-HV 1 3D ومجموعة التلطيخ المناعي CUBIC-HV 1 3D ، على التوالي (انظر جدول المواد).

  1. اغمر الأعضاء الفردية في 10 مل من CUBIC-L المخفف بالماء بنسبة 50٪ (انظر جدول المواد) مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في RT (ON) في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. حافظ على الأنابيب مسطحة على لوحة الاهتزاز.
    ملاحظة: لتجنب تلف الأنسجة ، يتم الحفاظ على الأعضاء في نفس الأنبوب ، ويتم جمع المحاليل باستخدام نظام فراغ. لتحضير CUBIC-L ، قم بإذابة 10٪ N-butyldiethanolamine و 10٪ Triton X-100 في ماء مقطر مزدوج باستخدام الكوكتيلات التجارية (انظر جدول المواد).
    تحذير: يسبب CUBIC-L تلفا خطيرا في العين. ارتداء حماية العين والوجه. تخلص منها في محطة معتمدة للتخلص من النفايات.
  2. اغمر العينة في 10 مل من 100٪ CUBIC-L لمدة 6 أيام (تحديث المحلول في اليوم 3).
    ملاحظة: في نهاية فترة الحضانة هذه ، يجب أن تكون الأنسجة شفافة تماما تقريبا.
  3. اغسل الأعضاء الشفافة باستخدام PBS (مع 0.05٪ NaN3) لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم). انقل المناديل الورقية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل مع كل غسل لإزالة Triton X-100.
    ملاحظة: كما هو موضح في الشكل 2B، إذا كان الهدف من التجربة هو تصور بروتينات المراسل المعبر عنها داخليا من طفيليات T. cruzi المعدلة وراثيا أو الفئران (الشكل 2C-F)، تخطي الخطوات 3 و 4 و 5 واستمر مباشرة إلى الخطوة 6.

3. تلطيخ الحمض النووي

  1. قم بتخفيف صبغة الحمض النووي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) في 5 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ (المضمن في المجموعة) عند تخفيف 1/2500.
  2. اغمر الأنسجة في محلول الصبغة النووية واحتضنها عند 37 درجة مئوية مع دوران لطيف لمدة 5 أيام باستخدام أنابيب مخروطية 15 مل في وضع الوقوف.
  3. يغسل ب 15 مل من المخزن المؤقت للغسيل النووي ثلاثي الأبعاد (المضمن في المجموعة) لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) في RT مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    ملاحظة: يمكن استخدام أصباغ الحمض النووي الأخرى في هذه التركيزات وأوقات الحضانة: DAPI (المدرجة في المجموعة): 1/200 ، حضانة لمدة 5 أيام. BOBO-1: 1/400 ، حضانة لمدة 5 أيام ؛ يوديد البروبيديوم (PI) (المدرجة في المجموعة): 1/100 ، حضانة لمدة 3 أيام ؛ RedDot2: 1/250 ، حضانة لمدة 3 أيام. إذا كان الهدف المحدد من التجربة هو تصور كل من بروتينات المراسل المعبر عنها داخليا واستخدام البقع النووية ، فتخطى الخطوتين 4 و 5 واستمر مباشرة إلى الخطوة 6.

4. هضم المصفوفة خارج الخلية (ECM)

ملاحظة: يجب إجراء هضم هيالورونيداز ل ECM لتسهيل الاختراق السليم للأجسام المضادة في المناطق العميقة من الأنسجة28.

  1. اغمر الأعضاء الفردية في 15 مل من المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل في وضع مسطح محمي من الضوء.
    ملاحظة: لإعداد المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز ، قم بإذابة 10 mM من CAPSO ؛ 150 مللي متر من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.05٪ من NaN3 (انظر جدول المواد) في الماء المقطر المزدوج وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.
  2. تحضير محلول الإنزيم عن طريق خلط 75 ميكرولتر من 20 ملغ / مل من مخزون الهيالورونيداز في 425 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز. لإعداد 20 ملغ / مل من مخزون الهيالورونيداز ، قم بإذابة الهيالورونيداز في 50 ملليمتر من المخزن المؤقت للكربونات ، و 150 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، و 0.01 ٪ من BSA ، و 0.05 ٪ من NaN3 (انظر جدول المواد). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10 و aliquot في أحجام 77 ميكرولتر عند -30 درجة مئوية.
  3. تخلص من المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز باستخدام ماصة واغمر العضو في محلول الإنزيم (500 ميكرولتر في أنبوب مخروطي 15 مل) في وضع الوقوف المحمي من الضوء لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
  4. اغسل العينة في 15 مل من المخزن المؤقت لغسيل الهيالورونيداز في أنبوب مخروطي سعة 50 مل في وضع أفقي محمي من الضوء لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    1. لإعداد المخزن المؤقت لغسيل الهيالورونيداز ، قم بإذابة 50 مللي متر من المخزن المؤقت للكربونات ، و 150 ملليمتر من كلوريد الصوديوم ، و 0.1٪ (v / v) من Triton X-100 ، و 5٪ (v / v) من الميثانول ، و 0.05٪ NaN3. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10. لإعداد مخزون كلوريد الصوديوم العازل 10x من الكربونات ، قم بإذابة 2.96 جم من كربونات الصوديوم ، و 1.86 جم من كربونات هيدروجين الصوديوم ، و 8.77 جم من كلوريد الصوديوم في 100 مل من الماء المقطر المزدوج مع 0.05٪ NaN3 (انظر جدول المواد) واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.

5. تلطيخ المناعة

  1. قم بتسمية الأوعية الدموية باستخدام الأجسام المضادة المضادة α-SMA (أكتين العضلات الصغيرة ألفا ، انظر جدول المواد) باتباع الخطوات أدناه.
    1. توليد الأولية بالإضافة إلى مجمع الأجسام المضادة الثانوية Fab شظايا مترافقة. ابدأ هذا التفاعل قبل 1.5 ساعة من إجراء التلطيخ.
      1. احسب الكمية المطلوبة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية (اخلطها بنسبة 1:0.5 بالوزن).
        ملاحظة: بالنسبة للجسم المضاد الأساسي المضاد α-SMA ، هناك حاجة إلى 3.5 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 2.5 مجم / مل ، هناك حاجة إلى 3.5 / 2.5 = 1.4 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة. بالنسبة للجسم المضاد الثانوي AlexaFluor 647 المضاد للفأر Fab ، هناك حاجة إلى 1.75 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 1.7 ملغم / مل ، هناك حاجة إلى 1.75 / 1.7 = 1 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة.
      2. امزج الأجسام المضادة الأولية والثانوية في أنبوب كهرماني سعة 2 مل واحتضنها لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. للتبادل العازل، امزج 7.5 مل من المخزن المؤقت للبقع المناعية HV1 3D 2x (المضمن في المجموعة، انظر جدول المواد) مع 7.5 مل من الماء المقطر المزدوج واغمر عينة الأنسجة لمدة 1.5 ساعة عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في أنبوب مخروطي 15 مل في وضع أفقي. ابدأ هذا التفاعل في وقت واحد كتوليد مركب الأجسام المضادة (1.5 ساعة قبل إجراء التلطيخ المناعي).
  2. أداء 3D تلطيخ المناعة باتباع الخطوات أدناه.
    1. في أنبوب مخروطي 15 مل ، قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة بعد الملف التكميلي 1.
    2. اجمع عينة الأنسجة من وسائط التبادل العازلة (الخطوة 5.1.2) واغمرها في محلول تلطيخ الأجسام المضادة. احتضان الأنسجة بشكل فردي لمدة 1 أسبوع عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم) للأنابيب في وضع الوقوف المحمي من الضوء. ختم الأنبوب مع فيلم البارافين لتجنب التبخر.
    3. انتقل إلى 4 درجات مئوية واحتضن ON في وضع الوقوف.
    4. قم بتبريد 1x HV1 3D مناعي غسل الغسيل العازل (المدرجة في المجموعة ، انظر جدول المواد) إلى 4 درجات مئوية واغسل العينة بمخزن مؤقت 15 مل (مرتين) لمدة 30 دقيقة لكل منها عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم). احتفظ بأنابيب مخروطية سعة 15 مل في وضع أفقي حتى الخطوة 5.2.7.
    5. قم بتخفيف الفورمالين إلى 1٪ في 1x HV1 3D مناعي غسل المخزن المؤقت وغمر العينة في 8 مل من المحلول لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    6. احتضان في محلول الفورمالين الطازج بنسبة 1٪ لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    7. يغسل في 15 مل من PBS لمدة 2 ساعة عند 25 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
  3. عزز إشارة tdTomato باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) باتباع الخطوات أدناه.
    1. اتبع نفس أوقات الحضانة ودرجات الحرارة كما في الخطوة 5.2.2. احسب كمية الأجسام المضادة الأولية والثانوية (انظر جدول المواد) واخلطها بنسبة 1:0.5 بالوزن.
      ملاحظة: بالنسبة للأجسام المضادة الأولية المضادة RFP ، هناك حاجة إلى 5 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 1.25 مجم / مل ، يلزم 5/1.25 = 4 ميكرولتر من المحلول. بالنسبة للجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 647 المضاد للأرانب Fab ، هناك حاجة إلى 2.5 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 1.5 مجم / مل ، هناك حاجة إلى 2.5 / 1.5 = 1.7 ميكرولتر من المحلول.
    2. تحضير محلول تلطيخ الأجسام المضادة كما هو مذكور في الملف التكميلي 1.
  4. عزز إشارات GFP باستخدام الأجسام النانوية المضادة ل GFP باتباع الخطوات أدناه.
    1. اتبع نفس أوقات الحضانة ودرجات الحرارة كما هو مذكور في الخطوة 5.2.2.
      ملاحظة: الأجسام النانوية المضادة ل GFP (انظر جدول المواد) مقترنة ب Alexa Fluor 647 ، وبالتالي فإن توليد الأجسام المضادة المعقدة غير ضروري.
    2. تحضير محلول تلطيخ الأجسام المضادة كما هو مذكور في الملف التكميلي 1.

6. مطابقة RI

  1. اغمر الأعضاء الشفافة في 5 مل من محلول CUBIC-R + المخفف بالماء بنسبة 50٪ (انظر جدول المواد) في RT (ON) مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. حافظ على الأنابيب في وضع الوقوف خلال خطوة مطابقة المثيل المحجوز بالكامل.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام حلول CUBIC R+ المعاد تدويرها من التجارب السابقة (حتى أربع مرات) في هذه الخطوة. لإعداد محلول CUBIC-R + ، قم بإذابة 45٪ من 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine) ، و 30٪ من Nicotinamide أو N-Methylnicotinamide ، و 0.5٪ من N-butyldiethanolamine في الماء المقطر المزدوج أو استخدم المخزن المؤقت CUBIC-R + التجاري (انظر جدول المواد).
    تحذير: يسبب CUBIC-R+ تهيج الجلد وتهيج العين الخطير وتلف الأعضاء. ارتداء قفازات واقية، وضمان حماية العين والوجه. لا تتنفس الغبار أو الأبخرة أو الغاز أو الضباب أو الأبخرة. التخلص منها في محطة معتمدة للتخلص من النفايات.
  2. استبدل 50٪ CUBIC-R + ب 5 مل من 100٪ CUBIC-R + واحتضنه باهتزاز لطيف (5 × جم) في RT لمدة يومين. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى كومة من المناديل المبللة الخالية من الوبر وقم بتدوير الأنسجة بعناية لإزالة محلول CUBIC-R + من أسطح الأعضاء لمدة 5 دقائق.

7. تصاعد

  1. بعد تجفيف الأنسجة ، انقلها إلى 5 مل من محلول التركيب (RI = 1.520) (انظر جدول المواد) في لوحة زراعة خلايا من ستة آبار واحتضنها (ON) في RT. قم بتدوير الأنسجة بشكل متكرر للقضاء على فقاعات الهواء ، خاصة على أسطح الأعضاء.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأعضاء لأكثر من 6 أشهر في محلول التركيب أو CUBIC-R+.
  2. التزم الأنسجة بحامل عينة المجهر باستخدام غراء هلام قائم على سيانواكريلات.
  3. اغمر العينات في كوفيت كوارتز المجهر المملوء ب 120 مل من محلول التركيب وصورها بشكل عرضي إلى محورها الطولي. التمسك القلب مع القمة والشريان الأورطي محاذاة أفقيا.
    ملاحظة: يمكن تقسيم الأعضاء التي تم تطهيرها وتركيبها باستخدام اهتزاز وتصويرها بتكبير عال بواسطة الفحص المجهري البؤري. تضمين الأعضاء في 2 ٪ agarose وقطع أقسام من 100-500 ميكرومتر. يمكن أيضا تقسيم الأعضاء يدويا بشفرة حادة لإنتاج مقاطع الأنسجة السميكة (>1000 ميكرومتر). بعد التقسيم ، ضع الشرائح في أطباق بتري ذات قاع زجاجي 35 مم ، وقم بالتركيب باستخدام نفس محلول التركيب ، وختم بطلاء الأظافر ، وصورة باستخدام مجهر متحد البؤرة.

8. الحصول على الصور

  1. صور العينات المثبتة باستخدام مجهر ورقة الضوء (انظر جدول المواد). اضبط التكبير وحجم الخطوة بين الشرائح الفردية على 3 ميكرومتر، واستخدم ليزر ورقة الضوء اليمنى واليسرى بسماكة 5 ميكرومتر وعرض 100٪. اضبط وقت التعرض الثابت على 50-100 مللي ثانية ، واضبط طاقة الليزر من 10٪ إلى 80٪ اعتمادا على شدة إشارة التألق.
    1. للكشف المشترك عن الطفيليات المعبرة عن الطماطم والأماستيجوت النائمة الملطخة ب DiR (الشكل 2C) ، استخدم القنوات الحمراء (Ex / Em 561/620-660 nm) والأشعة تحت الحمراء (Ex / Em 785/845-55 nm) ، على التوالي. للكشف المشترك عن الخلايا التائية والطفيليات المعبرة عن الطماطم في ماوس مراسل CD8 (الشكل 2D) ، استخدم القناة الخضراء (Ex / Em 488/525-50 nm) والقناة الحمراء ، على التوالي.
    2. بالنسبة لمقايسات العدوى المشتركة (الشكل 2E) ، وكذلك للكشف المشترك عن الطفيليات التي تعبر عن GFP في الفئران مراسلة النوى (الشكل 2F) ، استخدم القنوات الخضراء والحمراء ، على التوالي. للكشف عن الطفيليات المعبرة عن الطماطم ، والصبغة النووية ، والأوعية الدموية القلبية (الشكل 3B ، C) ، استخدم القنوات الحمراء والخضراء والحمراء البعيدة (Ex / Em 640/680-730 nm) ، على التوالي.
    3. الكشف عن الأجسام المضادة المضادة RFP مع القناة الحمراء البعيدة والأجسام النانوية المضادة ل GFP باستخدام القناة الخضراء (الشكل 3D).
  2. قم بتحويل مكدسات صور TIFF المكتسبة وإعادة بناء الأعضاء ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج Imaris v9.7.2 (انظر جدول المواد).

9. إعادة بناء السطح وتحديد كميته باستخدام برنامج Imaris

  1. حدد أداة خوارزمية اكتشاف الأسطح وابدأ المعالج في برنامج تحليل الصور.
  2. قم بإجراء تحليل أولي في منطقة اهتمام ثلاثية الأبعاد (تم اختيارها عشوائيا) ثم قم بتطبيقه على إعادة بناء الجهاز ثلاثي الأبعاد بأكمله. بعد اختيار منطقة الاهتمام (ROI) ، حدد القناة المراد تحليلها ، وقم بإلغاء تحديد الزر السلس ، وحدد طرح الخلفية.
    ملاحظة: يقوم طرح الخلفية بحساب قيمة خلفية محلية فريدة لكل فوكسل ويطرحها من قيمة البيكسل الأصلية. يجب أن يصل قطر أكبر كرة تتناسب مع الجسم إلى 200 ميكرومتر للخلايا المصابة ب T. cruzi ، و 10 ميكرومتر للخلايا التائية ، و 5 ميكرومتر للطفيليات الفردية.
  3. استخدم الرسم البياني لضبط التصنيف والقائمة المنسدلة عامل التصفية لتحديد قياسات التصنيف.
    ملاحظة: استخدم الرسم البياني لضبط التصنيف: يوصى بقياسات القطع الناقص (المفلطح) والكروية.
  4. قم بوضع اللمسات الأخيرة على المعالج، واضغط على زر الإحصاءات ، واسترجع العدد الإجمالي للخلايا المصابة بالطفيليات أو الخلايا التائية كعدد المكونات غير المتصلة لكل نقطة زمنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم غسل الأنسجة الثابتة المكعبة باستخدام PBS لإزالة المثبتات ثم تم احتضانها بكوكتيلات CUBIC-L ، وهو محلول أساسي مخزن مؤقتا من الكحول الأميني الذي يستخرج الأصباغ والدهون من الأنسجة مما يؤدي إلى إزالة لون الأنسجة مع الحفاظ على بنية الأنسجة. يمكن رؤية خطوط الشبكة في الورقة من خلال الأنسجة التي تشير إلى تطهير مناسب للأعضاء (الشكل 2A). بعد إزالة الدهون ، تم غسل الأنسجة وغمرها في محلول CUBIC-R + ومحلول التركيب لتجانس RI والتصوير ، على التوالي (الشكل 2B)".

أصيب فأر من النوع البري بداء المثقبيات المعبر عن الطماطم الملطخة مسبقا بصبغة السيانين القريبة من الأشعة تحت الحمراء DiR. تم قتل الفأر الرحيم بعد 15 يوما من الإصابة ، وتم تشريح القلب السليم وإصلاحه وتطهيره. سمح لنا تصوير LSFM وإعادة الإعمار 3D بتصور طفيليات T. cruzi المتكاثرة (الحمراء) التي تعبر عن الطماطم (الحمراء). يمكن استخدام مستويات التألق الذاتي في القناة الحمراء للتصور الصحيح لبنية القلب وحوافه (الشكل 2C i). كان LSFM مفيدا أيضا لتحديد الأشكال النائمة المقاومة للأدوية 7,8. يسمح تلطيخ الطفيليات قبل العدوى بصبغة DiR بتتبع الطفيليات النائمة من خلال تصور الطفيليات التي لم تخفف الصبغة من خلال التكرار ، كما ذكر سابقا ل CellTrace Violet7.

يمكن تحديد الطفيليات النائمة (السماوية) في القلب كما هو موضح في الإدخالات الموسعة ثلاثية الأبعاد (الأسهم الصفراء) (الشكل 2C ii ، iii). تم تقسيم التألق Z-projection تلقائيا لإنشاء نموذج سطح ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤه للتصور المكاني وتحديد العدد الإجمالي للخلايا المصابة ب T. cruzi والطفيليات النائمة طوال عملية إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد بأكملها (الشكل 2A). كشف تحليل نموذج السطح ثلاثي الأبعاد عن 186 خلية مصابة ب T. cruzi مع نسبة أعلى من الخلايا المصابة في أذين القلب (123) مقارنة بالبطينين (63) و 18 طفيليا نائما في القلب كله (الشكل 2C i). في تقرير سابق ، تم الإبلاغ عن خط أنابيب مماثل لرصد عدد الخلايا المصابة ب T. cruzi والطفيليات النائمة في أنسجة الفئران الواضحة بعد العلاج بالعقاقير31. من المهم ملاحظة أن التقديرات الخاصة بأعداد الطفيليات النائمة من المحتمل أن تكون أقل من العدد ، حيث أن تقنية تخفيف الصبغة تسمح فقط بالكشف عن الطفيليات التي لم تتكاثر بشكل كبير منذ الإصابة الأولية ، ولكنها لا تكتشف تلك التي أصبحت نائمة في وقت لاحق من العدوى بعد جولات متعددة من الانقسام.

تم استخدام نهج مماثل لرصد التفاعل بين سلالات T. cruzi المختلفة في الفئران التي تعاني من نقص الإنترفيرون (IFN) وغاما. يعد إنتاج IFN-gamma بواسطة الخلايا التائية المستجيبة أمرا ضروريا للتحكم المناعي في T. cruzi. في الفئران التي تعاني من نقص IFN-gamma ، تتكاثر الطفيليات مع الحد الأدنى من تقييد المناعة ، مما ينتج عنه أعداد كبيرة جدا من الخلايا المصابة في الأعضاء. هذه النماذج التي تعاني من نقص المناعة هي أدوات مفيدة لدراسة فعالية الأدوية الجديدة دون القيود التي يفرضها التعرف المناعي ، وبالتالي تسمح بالكشف عن انتكاس الطفيليات بعد العلاج. وأصيبت الفئران التي تعاني من نقص في مادة غاما IFN-بسلالات T. cruzi التي تعبر عن الطماطم (الحمراء) والبرازيلية التي تعبر عن GFP (الزرقاء). تم قتل الفئران الرحيم بعد 17 يوما من الإصابة ، وتم تشريح القلوب السليمة وإصلاحها وتطهيرها. في هذا النموذج الذي يعاني من نقص المناعة ، يمكن ملاحظة الخلايا المضيفة المصابة بكل من سلالات T. cruzi في مراحل مختلفة من تطور الطفيليات ، بما في ذلك الخلايا المصابة الكبيرة والمتوسطة والصغيرة والخلايا التي انفجرت مؤخرا. يظهر التقطيع عبر الأنسجة خلايا وفيرة مصابة بالطفيليات في أذينين القلب على أعماق الأنسجة المختلفة (الشكل 2E i-iii والفيلم 1).

تم استخدام صليب من C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J و B6.Cg-GT(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J الفئران، حيث تعبر جميع الخلايا التائية عن البروتين الفلوري الأخضر ZsGreen1، لمراقبة تجنيد الخلايا التائية في الأنسجة المصابة ببكتيريا T. cruzi. تم قتل الفئران الرحيمة بعد 14 يوما من الإصابة بالطفيليات التي تعبر عن الطماطم ، وتم استئصال العضلات الهيكلية وتطهيرها وتصويرها بواسطة LSFM. تم الكشف بقوة عن ZsGreen1 التي تعبر عن الخلايا التائية (الزرقاء) والخلايا المصابة ب T. cruzi (الحمراء) (الشكل 2D i و Movie 2). تسمح لنا المقاطع السميكة الاهتزازية (200-500 ميكرومتر) من نفس الأنسجة بتصور واجهة الخلايا التائية واستضافة الخلايا المصابة بواسطة المجهر البؤري (الشكل 2D iii).

تعتمد الطريقة البديلة لمراقبة بؤر الالتهاب على تراكم نوى الخلايا حول الخلايا المصابة ب T. cruzi. تم استخدام فأر مراسل حيث تعبر جميع نوى الخلايا عن بروتين tdTomato الفلورسنت لهذا الغرض. تم اكتشاف تعبير tdTomato النووي (الأحمر) بسهولة في الأنسجة بعد عملية التطهير. أصيب فأر مراسل نووي بطفيليات T. cruzi المعبرة عن GFP (سماوي) ، وبعد 35 يوما من الإصابة ، تم القتل الرحيم ، وتم استئصال عضلات الهيكل العظمي وتطهيرها وتصويرها بواسطة LSFM (الشكل 2F i-iii). تكشف المقاطع البصرية المكبرة للعضلات الهيكلية عن زيادة الخلوية عن طريق تراكم النوى الحمراء على طول الطفيليات المعبرة عن GFP (الشكل 2F ii). تؤكد الأقسام الاهتزازية من نفس النسيج تراكم النوى الحمراء الموصوفة سابقا على طول الطفيليات المعبرة عن GFP بواسطة الفحص المجهري البؤري (الشكل 2F iii).

كما تم تكييف بروتوكول CUBIC للتلطيخ المناعي ووضع العلامات على الحمض النووي للأعضاء والأنسجة السليمة والواضحة والمصابة ب T. cruzi (الشكل 3A). تم قتل الفئران الرحيمة بعد 40 يوما من الإصابة بالطفيليات التي تعبر عن الطماطم ، وتم تشريح القلوب وإصلاحها وتطهيرها. تم غسل القلب السليم الذي تم تطهيره وتلطيخه لمدة 5 أيام بعلامة الحمض النووي الخضراء ، ثم غسله مرة أخرى ومناعيته لمدة 7 أيام بالأجسام المضادة ضد α-SMA. تم إصلاح العينات بعد إصلاحها وغسلها ومطابقة RI وتصويرها باستخدام LSFM. كان من الممكن الكشف المتزامن عن إشارات الفلورسنت المتعددة ، بما في ذلك النوى والأوعية الدموية والخلايا المصابة ب T. cruzi ، بعد هذا البروتوكول. قدم تلطيخ المناعة α-SMA (أبيض) مستويات عالية من الإشارات التي تكشف عن الأوعية الدموية المعقدة للقلب (الشكل 3B ii والفيلم 3). يصور مقطع بصري من مناطق القلب العميقة اختراق الأنسجة للأجسام المضادة α-SMA في الظروف المحددة (الشكل 3B v). كما أظهر تلطيخ الحمض النووي (الأزرق) اختراقا جيدا للأنسجة ، ومستويات التألق ، وتلطيخا حجميا مستقرا. تم تحديد بعض المناطق التي تحتوي على وسم الحمض النووي المكثف في مواقع مختلفة للقلب (الشكل 3B i) وحول ألياف العضلات الهيكلية (الشكل 3C i والفيلم 4). أظهرت صورة مكبرة للعضلات الهيكلية تراكما للنوى الزرقاء في المناطق التي بها عدد قليل من طفيليات الطماطم أو التي لا يمكن اكتشافها، مما يشير إلى تجنيد الخلايا المناعية في مواقع عدوى T. cruzi الحالية أو السابقة (الشكل 3C ii)". وفي حالات أخرى، لم يكن لدى الخلايا المضيفة المصابة سوى القليل من الأدلة على التسلل الخلوي القريب (الأسهم البيضاء) (الشكل 3C i). تظهر المقاطع الاهتزازية من نفس الأنسجة كما في الشكل 3C II تلطيخ الحمض النووي للخلايا والطفيليات المعبرة عن الطماطم بواسطة المجهر البؤري (الشكل 3C iii).  

وقد أظهرت التجارب السابقة أن الطفيليات النائمة أظهرت تعبيرا منخفضا أو ضئيلا عن بروتينات tdTomato أو GFP مراسل (الشكل 2C II و III). لتحسين الكشف عن هذه البروتينات الفلورية ، تم تلطيخ الأنسجة التي تم تطهيرها بالأجسام المضادة المضادة ل RFP أو -GFP. تم إصلاح أنسجة العضلات الهيكلية السليمة من الفئران المصابة بالطفيليات التي تعبر عن tdTomato أو GFP وتوضيحها ومناعيتها بالأجسام المضادة ضد RFP (RFP Booster) (الشكل 3D) أو الأجسام النانوية ضد GFP المترافقة مع Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (الشكل 3E) ، على التوالي. تم إصلاح العينات بعد إصلاحها وغسلها ومطابقة RI وتصويرها باستخدام LSFM. في كلتا الحالتين ، أدى تعزيز إشارات GFP و tdTomato بواسطة الأجسام المضادة إلى تألق قوي (الشكل 3D ii و 3E ii ). تمثل البقع المناعية التي تستخدم الأجسام المضادة المعززة أداة متعددة الاستخدامات سيتم استخدامها للكشف عن نائمات T. cruzi في الأعضاء والأنسجة الكاملة الواضحة واكتشاف أي إشارة ممثلة تمثيلا ناقصا من بروتينات مراسل RFP أو GFP لأحد أفراد الأسرة.

Figure 1
الشكل 1: إدخال الإبرة أثناء التروية عبر القلب. (أ) تمثيل تخطيطي يوضح الخطوات التي تم تنفيذها قبل اختراق الماوس عبر القلب والموضع والاتجاه الصحيحين لإبرة التروية في البطين الأيسر. تم إجراء شق صغير في الأذين الأيمن ، وتم جمع الدم المستنزف (1) ؛ تم إدخال إبرة فراشة في قمة القلب. الحفاظ على الاتجاه بحيث لا تخترق الإبرة الحاجز (2). تم إغلاق فتحة المدخل حول الإبرة باستخدام الغراء القائم على الهلام (3). يمتلئ الكبد بالدم ويظهر باللون الأحمر قبل التروية. ومع ذلك ، بعد التروية ، فإنه يفقد التصبغ ويصبح شاحبا. RA ، الأذن اليمنى. لوس أنجلوس ، الأذن اليسرى. RV ، البطين الأيمن. LV ، البطين الأيسر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2تصور الخلايا المصابة ب T. cruzi ، و amastigotes النائمة ، وبؤر الالتهاب في الأعضاء التي تم تطهيرها.: (أ) مخطط الجهاز كله T. cruzi-الكشف عن الخلايا المصابة باستخدام مسح الأنسجة ، وتصوير LSFM ، والقياس الكمي بمساعدة البرامج في النماذج السطحية 3D. (أنا) صور ذات مجال ساطع للقلب والعضلات الهيكلية قبل (يسار) وبعد (يمين) المقاصة (شريط المقياس: 1000 ميكرومتر). (الثاني) المجهر الفلوري ذو الورقة الضوئية. (الثالث) IFN-غاما - الفأر الناقص أصيب ب 2 × 105 tdTomato-التعبير عن trypomastigotes. في 17 يوما بعد الإصابة ، تم تشريح القلب ، ومسح مكعب ، وتصوير LSFM (شريط المقياس: 500 ميكرومتر). (رابعا) تم تقسيم التألق Z-projection تلقائيا لإنشاء نموذج سطح 3D أعيد بناؤه للتصور المكاني والقياس الكمي لعدد T. cruzi-الخلايا المصابة. ما مجموعه 736 T. cruzi- تم الكشف عن الخلايا المصابة في القلب كله (شريط المقياس: 500 ميكرومتر). (v) يوضح تكبير الحجم المشار إليه في (رابعا)، حيث تمثل الأجسام السماوية T. cruzi- الخلايا المصابة (شريط المقياس: 50 ميكرومتر). (B) بروتوكول التطهير المكعب للأعضاء بأكملها. (C) تصور التكاثر والنائم T. cruzi الطفيليات في قلب الفأر الشفاف. (أنا) أصيب فأر من النوع البري ب 2 × 105 tdTomato-expression-trypomastigotes ملطخة بصبغة السيانين بالأشعة تحت الحمراء القريبة من DiR. تم تشريح القلب وتطهيره وتصوير LSFM. tdالطماطم المعبرة عن التكاثر (الأحمر) والخاملة (سماوي) T. cruzi يمكن تحديد الطفيليات. تم الحفاظ على مستويات التألق الذاتي للسماح بالتصور الصحيح لبنية القلب. قتل فأر بعد 15 يوما من الإصابة بناء على ذروة الخلايا المصابة بالطفيليات والأماسيغوت النائمة الموجودة في الأعمال السابقة (شريط المقياس: 400 ميكرومتر). (الثاني) و (ثالثا) إظهار تكبيرات الحجم المشار إليه في (أنا)، حيث تشير الأسهم الصفراء إلى طفيليات نائمة (سماوية) (شريط مقياس: 200 ميكرومتر). (D) الكشف عن تجنيد الخلايا التائية في ماوس مراسل CD8 المصاب. (أنا) أصيب ماوس المراسل ب 2 × 105 تم تشريح المثقبيات المعبرة عن الطماطم ، والعضلات الهيكلية ، وتطهيرها ، وتصوير LSFM بعد 14 يوما من الإصابة ، وهي نقطة زمنية يتم فيها اكتشاف استجابات الخلايا الكبيرة. ZsGreen1 يعبر عن الخلايا التائية (الزرقاء) وكذلك T. cruzi- تم تصور الخلايا المصابة (الحمراء) (شريط المقياس: 400 ميكرومتر) (انظر أيضا الفيلم 2). (الثاني) يوضح تكبير الحجم المشار إليه في (أنا) (شريط المقياس: 50 ميكرومتر). (الثالث) يصور تراكم الخلايا التائية المحيطة T. cruzi- خلية مصابة في قسم الأنسجة (200 ميكرومتر) من نفس العضو (شريط المقياس: 8 ميكرومتر). (E) التفاعل بين مختلف T. cruzi سلالات. (أنا) كانت الفئران التي تعاني من نقص IFN-gamma مصابة بعدوى مشتركة مع 2 × 105 tdTomato-التعبير عن الكولومبية (الأحمر) و GFP التعبير عن البرازيل (الأزرق) T. cruzi سلالات. تم قتل الفئران الرحيم ، وتم تشريح القلوب السليمة وإصلاحها وتطهيرها في 17 يوما بعد الإصابة (شريط المقياس: 400 ميكرومتر). (الثاني) يوضح تكبير الحجم المشار إليه في (أنا) (شريط المقياس: 250 ميكرومتر). (الثالث) مقطع بصري مكبر يكشف عن الخلايا المصابة بالكولومبية (الحمراء) والبرازيل (الزرقاء) T. cruzi سلالات (شريط مقياس: 150 ميكرومتر). (F) تصور الخلوية على طول الخلايا المصابة باستخدام فأر مراسل النوى. (أنا) أصيب فأر مراسل نووي ب 2 × 105 تم تشريح المثقبيات المعبرة عن GFP ، والعضلات الهيكلية ، وتطهيرها ، وتصوير LSFM في 35 يوما بعد الإصابة. تم الكشف عن تعبير tdTomato النووي للخلايا المضيفة (الأحمر) ، وكذلك تعبير طفيلي GFP (سماوي) ، (شريط المقياس: 400 ميكرومتر). (الثاني) مقطعا بصريا مكبرا يكشف عن تراكم النوى الحمراء على طول الطفيليات المعبرة عن GFP (شريط المقياس: 90 ميكرومتر). (الثالث) يؤكد زيادة الخلوية عن طريق التصوير البؤري لأقسام الأنسجة من نفس العضو (شريط المقياس: 8 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: وضع العلامات على الأعضاء المصابة ب T. cruzi التي تم تطهيرها بالأجسام المضادة والبقع النووية. (أ) بروتوكول CUBIC لإزالة الأنسجة ، والتلطيخ المناعي ثلاثي الأبعاد ، ووضع العلامات على الحمض النووي لأعضاء بأكملها. (ب) وضع العلامات على قلب الفأر للكشف عن الأوعية الدموية والحمض النووي (انظر أيضا الفيلم 3). (ط-ج) أصيب فأر من النوع البري بطفيليات 2 × 105 tdTomato. تم قتل الفأر الرحيم بعد 40 يوما من الإصابة ، وتم تشريح القلب وإصلاحه وتطهيره. تم تصنيف القلب الذي تم تطهيره بعلامة الحمض النووي وملطخ بالمناعة بالأجسام المضادة ضد α-SMA. كان من الممكن الكشف المتزامن عن نوى الخلايا (الزرقاء) والأوعية الدموية (البيضاء) والخلايا المصابة ب T. cruzi (الحمراء). قتل الفأر في هذا الوقت بعد العدوى عندما يمكن تقييم الأنسجة وإعادة تشكيل الأوعية الدموية الخاصة (شريط المقياس: 400 ميكرومتر). (iv) يظهر حجما مكبرا من مناطق القلب العميقة من (iii) يصور نوى الخلايا والأوعية الدموية والخلايا المصابة (شريط المقياس: 90 ميكرومتر). (v) يصور قسما بصريا تم الحصول عليه من (iii) (شريط المقياس: 90 ميكرومتر). (ج) زيادة الخلوية التي تصورها وسم الحمض النووي للعضلات الهيكلية الكاملة التي تم تطهيرها. (ط) كانت الأنسجة العضلية الهيكلية من التجربة السابقة ملطخة بالحمض النووي، وكشفت عن مناطق ذات علامات نووية مكثفة (زرقاء) وكذلك خلايا مصابة ب T. cruzi (أحمر) (شريط مقياس: 200 ميكرومتر) (انظر أيضا الفيلم 4). (ii) يكشف عن تراكم مكثف للنوى الزرقاء في المناطق التي يقل فيها أو لا يكتشف فيها طفيلي tdTomato (شريط المقياس: 100 ميكرومتر). (iii) التصوير البؤري عالي التكبير (60x) يحدد وسم الحمض النووي للخلايا والطفيليات في أقسام الأنسجة (شريط المقياس: 10 ميكرومتر). (د) تعزيز علامات مراسل طفيليات tdTomato في العضلات الهيكلية التي تم تطهيرها بالكامل. (ط-ج) تم إصلاح أنسجة العضلات الهيكلية السليمة من الفئران المصابة بطفيليات 2 × 105 التي تعبر عن tdTomato وتوضيحها ومناعيتها بالأجسام المضادة ضد RFP (RFP Booster). تم الحصول على إشارة فلورسنت مكثفة وموحدة في القناة الحمراء البعيدة بعد تعزيز RFP (أخضر) لإشارة tdTomato (أحمر) (شريط المقياس: 100 ميكرومتر). (ه) تعزيز علامات مراسل طفيليات GFP باستخدام الأجسام النانوية المضادة ل GFP. (ط-ج) تم إصلاح أنسجة العضلات الهيكلية من الفئران المصابة بطفيليات 2 × 105 التي تعبر عن GFP وتوضيحها ومناعيتها باستخدام الأجسام النانوية المقترنة ب Alexa Fluor 647 ضد GFP (GFP Booster). تم الحصول على إشارة فلورسنت قوية في القناة الحمراء البعيدة بعد تعزيز GFP (أرجواني) من فلورة GFP (سماوي). قتل الفأر من (D) و (E) بعد 30 يوما من الإصابة لأن أحمال الطفيليات تصل إلى ذروتها في هذه المرحلة الزمنية ، ويمكن بسهولة اكتشاف الخلايا المصابة بالطفيليات في العضلات الهيكلية (شريط المقياس: 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم 1: عدوى T. cruzi في القلب والعضلات الهيكلية في الفئران IFN-gamma الناقصة. إعادة بناء 3D للأنسجة المبطنة مكعبة من الفئران التي تعاني من نقص IFN-gamma المصابة بعدوى مشتركة مع 2 × 105 tdTomato-expression Colombiana (أحمر) و GFP - التعبير عن البرازيل (أزرق) T. cruzi سلالات في اليوم 17 بعد الإصابة. تم الحصول على ما مجموعه 1151 شريحة فردية من القلب و 559 من العضلات الهيكلية عبر LSFM. تم تحقيق نتائج تصوير مماثلة في ثلاثة مستقلة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم 2: الكشف عن تجنيد الخلايا التائية في فأر مراسل CD8 المصاب ب T. cruzi. تصور ثلاثي الأبعاد لعضلة هيكلية مكعبة موضحة من فأر مراسل CD8 مصاب بسلالة 2 × 105 Tdtomato-التي تعبر عن الكولومبية T. cruzi (حمراء) وقتلت في 14 يوما بعد الإصابة. تم تصوير ما مجموعه 668 شريحة فردية من العضلات الهيكلية بواسطة LSFM. تم تصور ZsGreen1 التي تعبر عن الخلايا التائية (الزرقاء) وكذلك الخلايا المصابة ب T. cruzi (الحمراء). تم تحقيق نتائج تصوير مماثلة في حيوانين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم 3: الكشف المناعي للأوعية الدموية في قلب T. كروزي المصاب والمطهر. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لقلب مكعب واضح من الفئران من النوع البري المصابة ب 2 × 105 tdTomato-transston-Colombiana T. cruzi والملطخة بالمناعة بالأجسام المضادة ضد α-SMA (الأزرق) في 40 يوما بعد الإصابة. يكشف التقطيع عبر القلب عن الأوعية الدموية المعقدة للقلب واختراق الأنسجة للأجسام المضادة α-SMA. يمكن ملاحظة الخلايا المصابة بالطفيليات كبقع حمراء زاهية في أذينين القلب (أحمر ، يمين). تم تحقيق نتائج تصوير مماثلة في حيوانين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم 4:تلطيخ الحمض النووي للأعضاء الكاملة يكشف عن مناطق ذات بنية متزايدة. إعادة بناء 3D للعضلة الهيكلية المكعبة موضحة من الفأر من النوع البري في 40 يوما بعد الإصابة المصابة بسلالة 2 × 105 tdTomato-excinal Colombiana T. cruzi. كانت منطقة العضلات رباعية الرؤوس بأكملها ملطخة بصبغة نووية خضراء. تم تصور الخلايا المصابة ب T. cruzi (الحمراء) ونوى كل خلية في الأنسجة (الزرقاء). يكشف التكبير في إعادة الإعمار 3D عن تراكم النوى الزرقاء على طول المناطق التي تحتوي على عدد قليل أو معدوم من الكشف عن طفيليات tdTomato. تم تحقيق نتائج تصوير مماثلة في حيوانين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الملف التكميلي 1: تكوين محاليل تلطيخ الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن غياب التصوير الشامل للأعضاء الكاملة للطفيليات والاستجابة المناعية يحد من فهم تعقيد التفاعلات بين الطفيليات المضيفة ويعوق تقييم علاجات مرض شاغاس. اعتمدت هذه الدراسة خط أنابيب CUBIC لتوضيح وتلطيخ الأعضاء والأنسجة السليمة للفئران المصابة ب T. cruzi.

تم اختبار بروتوكولات إزالة الأنسجة المتعددة في هذه الدراسة (PACT32 و ECi 33 و FLASH34 و iDISCO 11,26 و fDISCO 13) ؛ ومع ذلك ، فقط CUBIC حافظت على مستويات عالية من tdTomato أو GFP الطفيلي الفلوري. وبالمثل ، أظهرت التقارير السابقة الحفاظ على CUBIC للعلامات المعبر عنها داخليا مقارنة بنهج تطهير الأنسجة الأخرى35.

تعد سعة الدقة المحدودة واحدة من المحاذير الحالية للفحص المجهري التقليدي للصفائح الضوئية. هذا واضح في صعوبات حل الطفيليات الفردية في الخلايا المصابة بشدة (الشكل 2C). يمكن للمجاهر الضوئية المبلطة المطورة حديثا مع قدرة دقة محسنة وتكييف تقنيات توسيع الأنسجة أن تحل هذه المشكلة36.

قد تترسب الشوائب الناتجة عن مخازن الغسيل أو محاليل التطهير أو الأعضاء الأخرى في الأنسجة ، مما ينتج عنه إشارات غير محددة قد تكون خاطئة للخلايا المصابة بالطفيليات أو الطفيليات الفردية أو غيرها من الهياكل. ومع ذلك ، فإن هذه القطع الأثرية عادة ما تتألق بشكل ساطع في قنوات متعددة ، لذلك بعد تحليل الصور ، يمكن التخلص منها بسهولة من العد الآلي عن طريق تصوير الأنسجة في قناة بديلة (عادة القناة الخضراء). تم اعتبار الكائنات ذات اللون المزدوج قطعا أثرية وتم استبعادها للقياس الكمي الآلي.

البقع النووية DAPI و PI و RedDot2 و SYTOX-G ، تقدم مستويات جيدة من اختراق الأنسجة وكثافة الإشارة في معظم الأعضاء التي تم تطهيرها من قبل CUBIC ؛ ومع ذلك ، أظهرت صبغة الحمض النووي الأخضر أفضل أداء (الشكل 3B و C والفيلم 4).

أظهرت هذه النتائج أنه يمكن بسهولة اكتشاف الخلايا المصابة ب T. cruzi وتحديدها كميا بدقة مع تحديد إشارات الفئران ذات الخلايا التائية أو النوى في نفس الوقت. الأهم من ذلك ، اكتشف LSFM أحداثا بيولوجية نادرة ، مثل الأماسيغوت النائمة الإيجابية DiR ، داخل بيئة أنسجة معقدة مع القدرة المحتملة على توسيعها إلى تلطيخ المناعة الظهارية ووضع العلامات على الحمض النووي. تستكشف الدراسات الحالية أيضا فائدة هذه الأساليب لرصد تنشيط الخلايا المستجيبة المناعية ، والتفاعلات بين سلالات طفيليات متعددة في نفس المضيف ، وتحريض تلف الأنسجة وإصلاحها في مرض شاغاس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نشكر الدكتور إيتسو سوساكي على مساعدته القيمة وتوصياته فيما يتعلق ببروتوكولات تطهير الأنسجة والتلطيخ المناعي. أيضا ، نحن ممتنون ل M. Kandasamy من CTEGD Biomedical Microscopy Core على الدعم الفني باستخدام LSFM والتصوير البؤري. كما نشكر جميع أعضاء مجموعة تارلتون للأبحاث على اقتراحاتهم المفيدة طوال هذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 184، المثقبيات الكروزية، شاغاس، المقاصة، تلطيخ المناعة، مكعب، المجهر الفلورسنت ورقة الضوء
التصوير الكمي 3D للخلايا المصابة <em>بداء المثقبيات ،</em> و amastigotes النائمة ، والخلايا التائية في الأعضاء المصفاة السليمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M.,… More

Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter