Summary
Den nuværende protokol beskriver lysark fluorescerende mikroskopi og automatiserede softwareassisterede metoder til at visualisere og præcist kvantificere prolifererende og sovende Trypanosoma cruzi parasitter og T-celler i intakte, ryddede organer og væv. Disse teknikker giver en pålidelig måde at evaluere behandlingsresultater og tilbyde ny indsigt i parasit-vært interaktioner.
Abstract
Chagas sygdom er en forsømt patologi, der påvirker millioner af mennesker over hele verden, hovedsageligt i Latinamerika. Chagas sygdomsmiddel, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), er en obligatorisk intracellulær parasit med en forskelligartet biologi, der inficerer flere pattedyrarter, herunder mennesker, der forårsager hjerte- og fordøjelsespatologier. Pålidelig påvisning af T. cruzi in vivo-infektioner har længe været nødvendig for at forstå Chagas sygdoms komplekse biologi og nøjagtigt evaluere resultatet af behandlingsregimer. Den nuværende protokol demonstrerer en integreret pipeline til automatiseret kvantificering af T. cruzi-inficerede celler i 3D-rekonstruerede, ryddede organer. Lysark fluorescerende mikroskopi giver mulighed for nøjagtigt visualisering og kvantificering af aktivt prolifererende og sovende T. cruzi parasitter og immuneffektorceller i hele organer eller væv. CUBIC-HistoVision-rørledningen for at opnå ensartet mærkning af ryddede organer med antistoffer og nukleare pletter blev også vedtaget med succes. Vævsrensning kombineret med 3D-immunostaining giver en upartisk tilgang til omfattende evaluering af lægemiddelbehandlingsprotokoller, forbedrer forståelsen af den cellulære organisation af T. cruzi-inficerede væv og forventes at fremme opdagelser relateret til anti-T. cruzi-immunresponser, vævsskade og reparation i Chagas sygdom.
Introduction
Chagas sygdom, forårsaget af protozoparasitten T. cruzi, er blandt verdens mest oversete tropiske sygdomme og forårsager ca. 13.000 årlige dødsfald. Infektionen udvikler sig ofte fra et akut til et kronisk stadium, der producerer hjertepatologi hos 30% af patienterne, herunder arytmier, hjertesvigt og pludselig død 1,2. På trods af det stærke værtsimmunrespons, der fremkaldes mod parasitten i den akutte fase, vedvarer et lavt antal parasitter kronisk i hele værtsens liv i væv som hjerte og skeletmuskulatur. Flere faktorer, herunder forsinket indtræden af adaptive immunresponser og tilstedeværelsen af ikke-replikerende former for parasitten, kan bidrage til T. cruzis evne til at undgå en fuldstændig eliminering af immunsystemet 3,4,5,6. Desuden udviser ikke-replikerende sovende former for parasitten en lav modtagelighed for trypanocidale lægemidler og kan til dels være ansvarlig for den behandlingsfejl, der i mange tilfælde er observeret 7,8.
Udviklingen af nye billeddannelsesteknikker giver mulighed for at få indsigt i parasitternes rumlige fordeling i det inficerede væv og deres forhold til de immunceller, der er involveret i deres kontrol. Disse egenskaber er afgørende for en bedre forståelse af immunsystemets parasitkontrolprocesser og sporing af de sjældne sovende parasitter, der findes i kronisk væv.
Lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM) er en af de mest omfattende og upartiske metoder til 3D-billeddannelse af store væv eller organer uden tynd sektionering. Lysarkmikroskoper bruger et tyndt lysark til kun at ophidse fluoroforerne i brændplanet, reducere fotoblegning og fototoksicitet af prøver og optage billeder af tusindvis af vævslag ved hjælp af ultrahurtige kameraer. Det høje niveau af vævsgennemsigtighed, der er nødvendigt for korrekt indtrængning af laserlyset i væv, opnås ved homogenisering af brydningsindekset (RI) efter vævsdelipidering og affarvning, hvilket reducerer spredningen af lys og gengiver billeder af høj kvalitet 9,10,11.
Der er udviklet vævsrensningsmetoder til billeddannelse af hele mus 12,13,14, organoider 15,16,17, organer, der udtrykker fluorescerende markører 18,19,20,21,22,23, og for nylig et begrænset antal humane væv 24 . De nuværende metoder til vævsrensning er klassificeret i tre familier: (1) organiske opløsningsmiddelbaserede metoder såsom DISCO-protokoller 25,26, (2) hydrogelbaserede metoder, såsom CLARITY27, og vandige metoder, såsom CUBIC (Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-protokoller opretholder organform og vævsintegritet og bevarer fluorescensen af endogent udtrykte reporterproteiner. Den seneste opdatering af denne teknik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), tillader også påvisning af epitoper ved hjælp af fluorescerende mærkede antistoffer og DNA-mærkning28.
I den nuværende protokol blev CUBIC-rørledningen til påvisning af T. cruzi, der udtrykker fluorescerende proteiner i klaret intakt musevæv, anvendt. Optisk gennemsigtige væv blev LSFM-afbildet, 3D-rekonstrueret, og det nøjagtige samlede antal T. cruzi-inficerede celler, sovende amastigotes og T-celler pr. Organ blev automatisk kvantificeret. Denne protokol blev også vedtaget med succes for at opnå ensartet mærkning af ryddede organer med antistoffer og nukleare pletter. Disse tilgange er afgørende for at forstå udvidelsen og kontrollen af T. cruzi hos inficerede værter og er nyttige til fuldt ud at evaluere kemo- og immunterapi for Chagas sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care akkrediteringsretningslinjer. Animal Use Protocol (kontrol af T. cruzi-infektion hos mus-A2021 04-011-Y1-A0) blev godkendt af University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J og C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mus (hun,1-2 måneder gamle) blev anvendt til denne undersøgelse. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
1. Infektion, perfusion og dissektion
- Intraperitonealt inficerer mus med vævskulturafledte trypomastigotes af henholdsvis Colombiana (DTU TcI) eller Brasilien (DTU TcV ) T. cruzi-stamme , der udtrykker tdTomat- eller GFP-fluorescerende proteiner. Infektionsdosis kan variere fra 50.000 til 200.000 trypomastigotes fortyndet i 100 μL 1x phosphatbufferet saltvand (PBS).
BEMÆRK: Specifikke detaljer om generering af reporterparasitter og musemodeller af infektion er tilgængelige i Canavaci et al. 29 og Bustamante et al.30. - Afliv musene ved indånding af kuldioxid med en strømningshastighed på 3-7 L/min. Så snart dyrene holder op med at vise en pedalrefleks, skal du lave et langsgående snit gennem huden fra maven mod brystbenet. Skær derefter kropsvæggen fra maven og fortsæt gennem ribbenene på hver side af brystkassen, indtil brystbenet kan løftes væk og udsætte hjertet.
- Som beskrevet i figur 1 skal du lave et 2,5 mm snit i hjertets højre auricle og samle det drænende blod ved hjælp af en 1 ml mikropipettespids.
- Indsæt en sommerfuglnål (forbundet til den ene ende af perfusionssystemet) i toppen af venstre ventrikel, indtil den når den stigende aorta. Brug gelbaseret lim (se Materialetabel) til at forsegle indløbshullet omkring nålen og holde nålen på plads under perfusioner.
- Overfør musene 30 med 50 ml koldt Heparin-PBS (pH 7,4,10 U/ml Heparin), eller indtil væsken, der kommer ud af musen mod opsamlingsbakken, er fri for blod.
- Perfuse med 50 ml koldt 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA) (pH 7,4) i PBS.
BEMÆRK: PFA-vævsfiksering er sandsynligvis et af de kritiske trin i protokollen, især for at opretholde epitopstrukturer og efterfølgende immundetektion. PFA nedbrydes over tid, så det skal være frisklavet. Opløsningens pH er også vigtig for at undgå overfiksering, hvilket kan føre til dårlig rydning af væv.
FORSIGTIG: PFA er moderat giftigt ved hudkontakt. Akut eksponering er også meget irriterende for næse, øjne og hals. Langvarig eksponering for lave niveauer i luften eller huden kan forårsage hudirritation såsom dermatitis og kløe og astmalignende åndedrætsbesvær. Brug ansigts- og øjenbeskyttelse, og indånd ikke støv, gas, tåge, dampe eller dampe.- Efter PFA-perfusionen perfuses musen med 100 ml CUBIC-P-buffer for at nå de klaringsniveauer, der er nævnt i trin 1.5.
- For at forberede CUBIC-P-buffer opløses 10% N-butyldiethanolamin, 5% Triton X-100 og 5% 1-N-methylimidazol i dobbeltdestilleret vand eller brug de kommercielle cocktails (se Materialetabel).
BEMÆRK: Trin 1.6.1.-1.6.2. anbefales kun til stærkt pigmenterede organer som hjerte og nyre, da de kræver et forudgående rydningstrin for at opnå øget gennemsigtighed. Efter brug af CUBIC-P dissekeres organerne og går direkte til trin 2: Vævsrensning.
- Dissekere vævsprøverne/organerne30 , der skal afbildes, og efterfiksere dem i 4% (w/v) PFA i PBS (~10 ml/hele organet) natten over (ON) ved 4 °C med blid omrystning (højst 5 x g) i 50 ml koniske rør.
BEMÆRK: Alle inkubationer herfra skal udføres på rør, der ligger vandret ved 20-30 °C beskyttet mod lys. - Prøven vaskes i 10 ml PBS (suppleret med 0,05% natriumazid (NaN 3) i3 timer (tre gange) ved stuetemperatur (RT) med forsigtig omrystning (5 x g).
BEMÆRK: Væv kan fryses ved inkubation i 10 ml 30% saccharose i PBS med blid omrystning (5 x g) ved 4 °C ON i 50 ml koniske rør. Når vævene synker til bunden af røret, skal du indlejre dem i OCT-forbindelsen og holde dem ved -80 °C. Optøning ved RT, indtil OCT-forbindelsen smelter fuldstændigt, og vask derefter i PBS (~ 10 ml / hele organet) ON ved 4 ° C med blid omrystning (5 x g) i 50 ml koniske rør. Fortsæt til trin 2.
2. Vævsrensning
BEMÆRK: Alle vævsclearinger udført i dette arbejde blev udført ved hjælp af CUBIC-protokol I22. Tre forskellige cocktails blev brugt: CUBIC-P til delipidering og hurtig affarvning under perfusioner, CUBIC-L til delipidering og affarvning og CUBIC-R til RI-matchning. DNA-farvning og immunostainings blev udført ved hjælp af henholdsvis CUBIC-HV 1 3D nukleart farvningssæt og CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit (se Materialetabel).
- Nedsænk individuelle organer i 10 ml 50% vandfortyndet CUBIC-L (se Materialetabel) med blid omrystning (5 x g) ved RT (ON) i 50 ml koniske rør. Hold rørene flade på rystepladen.
BEMÆRK: For at undgå vævsskade opretholdes organer i samme rør, og opløsninger opsamles ved hjælp af et vakuumsystem. For at fremstille CUBIC-L opløses 10% N-butyldiethanolamin og 10% Triton X-100 i dobbeltdestilleret vand ved hjælp af de kommercielle cocktails (se Materialetabel).
FORSIGTIG: CUBIC-L forårsager alvorlig øjenskade. Brug øjen- og ansigtsbeskyttelse. Bortskaf til et godkendt affaldsbortskaffelsesanlæg. - Prøven nedsænkes i 10 ml 100% CUBIC-L i 6 dage (opfriskning af opløsningen på dag 3).
BEMÆRK: Ved afslutningen af denne inkubationsperiode skal vævene være næsten fuldstændig gennemsigtige. - De gennemsigtige organer vaskes med PBS (suppleret med 0,05 % NaN3) i 2 timer (tre gange) ved 37 °C med forsigtig omrystning (5 x g). Overfør væv til et nyt 50 ml konisk rør med hver vask for at fjerne Triton X-100.
BEMÆRK: Som beskrevet i figur 2B, hvis målet med eksperimentet er at visualisere endogent udtrykte reporterproteiner fra transgene T. cruzi-parasitter eller mus (figur 2C-F), skal du springe trin 3, 4 og 5 over og fortsætte direkte til trin 6.
3. DNA-farvning
- Fortynd det kommercielt tilgængelige nukleinsyrefarvestof (se Materialetabel) i 5 ml farvningsbuffer (inkluderet i sættet) ved 1/2.500 fortynding.
- Væv nedsænkes i kernefarveopløsningen, og der inkuberes ved 37 °C med blid rotation i 5 dage ved hjælp af 15 ml koniske rør i stående stilling.
- Vask med 15 ml 3D-nuklear farvningsvaskebuffer (inkluderet i sættet) i 2 timer (tre gange) ved RT med blid omrystning (5 x g).
BEMÆRK: Andre DNA-farvestoffer kan bruges i disse koncentrationer og inkubationstider: DAPI (inkluderet i sættet): 1/200, 5 dages inkubation; BOBO-1: 1/400, 5 dages inkubation; Propidiumiodid (PI) (inkluderet i sættet): 1/100, 3 dages inkubation; RedDot2: 1/250, 3 dages inkubation. Hvis det specifikke mål med eksperimentet er at visualisere både endogent udtrykte reporterproteiner og bruge nukleare pletter, skal du springe trin 4 og 5 over og fortsætte direkte til trin 6.
4. Ekstracellulær matrix (ECM) fordøjelse
BEMÆRK: Hyaluronidasefordøjelse af ECM skal udføres for at lette korrekt indtrængning af antistofferne i dybe områder af vævene28.
- De enkelte organer nedsænkes i 15 ml hyaluronidasereaktionsbuffer i 2 timer ved 37 °C i et 50 ml konisk rør i flad position beskyttet mod lys.
BEMÆRK: For at forberede hyaluronidase reaktionsbuffer opløses 10 mM CAPSO; 150 mM natriumchlorid (NaCl) og 0,05 % NaN3 (se materialetabel) i dobbeltdestilleret vand og justerer pH-værdien til 10. - Enzymopløsning fremstilles ved at blande 75 μL 20 mg/ml hyaluronidasebestand i 425 μL hyaluronidasereaktionsbuffer. For at fremstille 20 mg/ml hyaluronidasebestand opløses hyaluronidase i 50 mM karbonatbuffer, 150 mM NaCl, 0,01 % BSA og 0,05 % NaN3 (se materialetabel). PH justeres til 10 og aliquot i volumener på 77 μL ved -30 °C.
- Hyaluronidasereaktionsbufferen kasseres ved hjælp af en pipette, og organet nedsænkes i enzymopløsningen (500 μL i et konisk rør på 15 ml) i stående stilling beskyttet mod lys i 24 timer ved 37 °C med forsigtig omrystning (5 x g).
- Prøven vaskes i 15 ml hyaluronidasevaskebuffer i et konisk rør på 50 ml i vandret position beskyttet mod lys i 2 timer (tre gange) ved 37 °C med forsigtig omrystning (5 x g).
- For at forberede hyaluronidase vaskebuffer opløses 50 mM karbonatbuffer, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Triton X-100, 5% (v / v) methanol og 0,05% NaN3. Juster pH til 10. For at forberede 10x karbonatbuffer-NaCl-lager opløses 2,96 g natriumcarbonat, 1,86 g natriumhydrogencarbonat og 8,77 g NaCl i 100 ml dobbeltdestilleret vand med 0,05% NaN3 (se materialetabel) og pH justeres til 10.
5. Immunostaining
- Mærk vaskulatur ved hjælp af anti-α-SMA (alfa-lille muskelactin, se Materialetabel) antistoffer ved at følge nedenstående trin.
- Generer primært plus konjugeret Fab fragment sekundært antistofkompleks. Start denne reaktion 1,5 timer før farvningsproceduren.
- Beregn den krævede mængde primære og sekundære antistoffer (bland i forholdet 1:0,5 efter vægt).
BEMÆRK: For det primære antistof anti-α-SMA er der brug for 3,5 μg for at mærke hele hjertet eller et fragment af skeletmuskulatur af lignende dimensioner. For 2,5 mg / ml produkt er 3,5 / 2,5 = 1,4 μL antistofopløsning nødvendig. For sekundært antistof AlexaFluor 647 anti-mus Fab fragment er 1,75 μg nødvendigt for at mærke hele hjertet eller et fragment af skeletmuskulatur af lignende dimensioner. For 1,7 mg / ml produkt er 1,75 / 1,7 = 1 μL antistofopløsning nødvendig. - Bland primære og sekundære antistoffer i et ravfarvet 2 ml rør og inkuberes i 1,5 timer ved 37 °C.
- Beregn den krævede mængde primære og sekundære antistoffer (bland i forholdet 1:0,5 efter vægt).
- Til bufferudveksling blandes 7,5 ml 2x HV1 3D-immunfarvningsbuffer (inkluderet i sættet, se Materialetabel) med 7,5 ml dobbeltdestilleret vand og nedsænkes vævsprøven i 1,5 timer ved 32 °C med blid omrystning (5 x g) i et 15 ml konisk rør i vandret position. Start denne reaktion samtidigt som dannelsen af antistofkompleks (1,5 timer før immunostainingproceduren).
- Generer primært plus konjugeret Fab fragment sekundært antistofkompleks. Start denne reaktion 1,5 timer før farvningsproceduren.
- Udfør 3D-immunfarvning ved at følge nedenstående trin.
- I et 15 ml konisk rør fremstilles antistoffarvningsopløsningen efter supplerende fil 1.
- Vævsprøven opsamles fra bufferudvekslingsmediet (trin 5.1.2), og den nedsænkes i antistoffarvningsopløsningen. Der inkuberes væv enkeltvis i 1 uge ved 32 °C med forsigtig omrystning (5 x g) af rørene i stående stilling beskyttet mod lys. Forsegl røret med paraffinfilm for at undgå fordampning.
- Flyt til 4 °C og inkuber ON i stående stilling.
- Afkøl 1x HV1 3D immunfarvningsvaskebuffer (inkluderet i sættet, se Materialetabel) til 4 °C, og vask prøven med 15 ml buffer (to gange) i 30 minutter hver ved 4 °C med skånsom omrystning (5 x g). 15 ml koniske rør holdes vandret indtil trin 5.2.7.
- Fortynd formalin til 1% i 1x HV1 3D immunostaining vaskebuffer og nedsænk prøven i 8 ml af opløsningen i 24 timer ved 4 °C med forsigtig omrystning (5 x g).
- Der inkuberes i frisk 1% formalinopløsning i 1 time ved 37 °C med forsigtig omrystning (5 x g).
- Der vaskes i 15 ml PBS i 2 timer ved 25 °C med forsigtig omrystning (5 x g).
- Boost tdTomato-signal ved hjælp af anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antistoffer ved at følge nedenstående trin.
- Følg de samme inkubationstider og temperaturer som i trin 5.2.2. Beregn mængden af primære og sekundære antistoffer (se Materialetabel) og bland dem i forholdet 1:0,5.
BEMÆRK: For primært antistof anti-RFP er 5 μg nødvendigt for at mærke hele hjertet eller et fragment af skeletmuskulatur af lignende dimensioner. For 1,25 mg/ml produkt kræves 5/1,25 = 4 μL af opløsningen. For sekundært antistof Alexa Fluor 647 anti-kanin Fab fragment er 2,5 μg nødvendigt for at mærke hele hjertet eller et fragment af skeletmuskulatur af lignende dimensioner. For 1,5 mg / ml produkt er 2,5 / 1,5 = 1,7 μL af opløsningen nødvendig. - Forbered antistoffarvningsopløsningen som nævnt i supplerende fil 1.
- Følg de samme inkubationstider og temperaturer som i trin 5.2.2. Beregn mængden af primære og sekundære antistoffer (se Materialetabel) og bland dem i forholdet 1:0,5.
- Boost GFP-signaler ved hjælp af anti-GFP nanobodies ved at følge nedenstående trin.
- Følg de samme inkubationstider og temperaturer som nævnt i trin 5.2.2.
BEMÆRK: Anti-GFP nanobodies (se Tabel over materialer) er konjugeret med Alexa Fluor 647, så antistofkompleksgenereringen er unødvendig. - Forbered antistoffarvningsopløsningen som nævnt i supplerende fil 1.
- Følg de samme inkubationstider og temperaturer som nævnt i trin 5.2.2.
6. RI-matchning
- Gennemsigtige organer nedsænkes i 5 ml 50% vandfortyndet CUBIC-R+ opløsning (se materialetabel) ved RT (ON) med skånsom omrystning (5 x g) i et 50 ml konisk rør. Hold rørene stående under hele RI-matchningstrinnet.
BEMÆRK: Genanvendte CUBIC R+-løsninger fra tidligere eksperimenter kan genbruges (op til fire gange) i dette trin. Til fremstilling af CUBIC-R+-opløsning opløses 45 % af 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon (antipyrin), 30 % nicotinamid- eller N-methylnicotinamid og 0,5 % N-butyldiethanolamin i dobbeltdestilleret vand eller den kommercielle CUBIC-R+-buffer (se materialetabel).
FORSIGTIG: CUBIC-R+ forårsager hudirritation, alvorlig øjenirritation og skader på organer. Brug beskyttelseshandsker, og sørg for øjen- og ansigtsbeskyttelse. Indånd ikke støv, dampe, gas, tåge eller dampe. Bortskaf til et godkendt affaldsbortskaffelsesanlæg. - Udskift 50% CUBIC-R+ med 5 ml 100% CUBIC-R+ og inkubér med skånsom omrystning (5 x g) ved RT i 2 dage. Overfør derefter vævene til en stak fnugfrie klude, og drej forsigtigt vævene for at fjerne CUBIC-R+ opløsningen fra organoverfladerne i 5 minutter.
7. Montering
- Efter tørring af vævene overføres dem til 5 ml monteringsopløsning (RI = 1.520) (se materialetabel) i en seks-brønds cellekulturplade og inkuberer dem (ON) ved RT. Drej ofte vævene for at fjerne luftbobler, især på organernes overflader.
BEMÆRK: Organer kan opbevares i mere end 6 måneder i Mounting Solution eller CUBIC-R+. - Klæber vævene til mikroskopprøveholderen ved hjælp af cyanoacrylatbaseret gellim.
- Dyp prøverne i mikroskopkvartskuvetten fyldt med 120 ml monteringsopløsning, og billede dem på tværs til deres længdeakse. Hold hjertet med toppen og aorta vandret justeret.
BEMÆRK: Ryddede og monterede organer kan sektioneres med et vibratom og afbildes ved høj forstørrelse ved konfokal mikroskopi. Integrer organerne i 2% agarose og skær sektioner på 100-500 μm. Organer kan også manuelt sektioneres med et skarpt blad for at producere tykvævssektioner (>1000 μm). Efter sektionering placeres skiverne i glasbund 35 mm petriskåle, monteres ved hjælp af den samme monteringsopløsning, forsegles med neglelak og billede med et konfokalmikroskop.
8. Erhvervelse af billeder
- Billede de monterede prøver med et lysarkmikroskop (se Materialetabel). Indstil forstørrelse og trinstørrelse mellem individuelle skiver til 3 μm, og brug højre og venstre lysarklasere med 5 μm tykkelser og 100% bredde. Indstil eksponeringstidskonstanten til 50-100 ms, og juster lasereffekten fra 10% til 80% afhængigt af fluorescenssignalintensiteten.
- Til medpåvisning af tdTomato-ekspressive parasitter og DiR-farvede sovende amastigotes (figur 2C) anvendes henholdsvis røde (Ex/Em 561/620-660 nm) og infrarøde (Ex/Em 785/845-55 nm). Til medpåvisning af T-celler og tdTomato-ekspressive parasitter i CD8-reportermus (figur 2D) anvendes henholdsvis grøn (Ex/Em 488/525-50 nm) og rød kanal.
- Til coinfektionsassays (figur 2E) samt til medpåvisning af parasitter, der udtrykker GFP i kernereportermus (figur 2F), skal du bruge henholdsvis de grønne og røde kanaler. Til påvisning af tdTomato-ekspressive parasitter, nukleart farvestof og hjertevaskulatur (figur 3B, C) skal du bruge henholdsvis de røde, grønne og farrøde (Ex/Em 640/680-730 nm).
- Detekter anti-RFP-antistoffer med den langt røde kanal og anti-GFP-nanobodies ved hjælp af den grønne kanal (figur 3D).
- Konverter de erhvervede TIFF-billedstakke og 3D-rekonstruer organerne ved hjælp af Imaris v9.7.2-software (se Materialetabel).
9. Overfladerekonstruktion og kvantificering med Imaris-software
- Vælg værktøjet til algoritmer til registrering af overflader , og start guiden i billedanalysesoftwaren.
- Udfør en indledende analyse i et 3D-område af interesse (tilfældigt udvalgt), og anvend det derefter på hele 3D-organrekonstruktionen. Når du har valgt et interesseområde (ROI), skal du vælge den kanal , der skal analyseres, fjerne markeringen af glatknappen og vælge baggrundssubtraktion.
BEMÆRK: Baggrundssubtraktion beregner en unik lokal baggrundsværdi for hver voxel og trækker denne fra den oprindelige pixelværdi. Diameteren af den største kugle, der passer ind i objektet, skal være op til 200 μm for T. cruzi-inficerede celler, 10 μm for T-celler og 5 μm for individuelle parasitter. - Brug histogrammet til at justere klassificeringen og rullelisten med filtre til at vælge målingerne til klassificering.
BEMÆRK: Brug histogrammet til at justere klassificeringen: ellipticitet (oblat) og sfæricitetsmålinger anbefales. - Afslut guiden, tryk på statistikknappen , og hent det samlede antal parasitinficerede celler eller T-celler som antallet af frakoblede komponenter pr. Tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CUBIC-fikseret væv blev vasket med PBS for at fjerne fikseringsmidler og derefter inkuberet med CUBIC-L-cocktails, en grundlæggende bufferopløsning af aminoalkoholer, der ekstraherer pigmenter og lipider fra vævet, hvilket resulterer i affarvning af væv, samtidig med at vævsarkitekturen opretholdes. Gitterlinjer i papiret kan ses gennem vævene, hvilket indikerer en passende rydning af organerne (figur 2A). Efter delipidering blev væv vasket og nedsænket i CUBIC-R + og monteringsopløsning til henholdsvis RI-homogenisering og billeddannelse (figur 2B).
En vildtypemus blev inficeret med tdTomato-ekspressive trypomastigotes forfarvet med DiR nær-infrarødt cyaninfarvestof. Musen blev aflivet 15 dage efter infektion, og det intakte hjerte blev dissekeret, fikseret og ryddet. LSFM-billeddannelse og 3D-rekonstruktion gjorde det muligt for os at visualisere tdTomato-ekspressive prolifererende T. cruzi-parasitter (rød). Autofluorescensniveauer i den røde kanal kan bruges til korrekt visualisering af hjertestruktur og kanter (figur 2C i). LSFM var også nyttig til at identificere lægemiddelresistente sovende former 7,8. Farvning af parasitter før infektion med DiR-farvestof gør det muligt at spore sovende parasitter ved at visualisere de parasitter, der ikke havde fortyndet farvestoffet gennem replikation, som tidligere rapporteret for CellTrace Violet7.
Sovende parasitter (cyan) kan identificeres i hjertet som afbildet i de 3D-forstørrede indsatser (gule pile) (figur 2C ii, iii). Z-projektionsfluorescens blev segmenteret automatisk for at generere en rekonstrueret 3D-overflademodel til rumlig visualisering og kvantificering af det samlede antal T. cruzi-inficerede celler og sovende parasitter gennem hele 3D-rekonstruktionen (figur 2A). Analyse af 3D-overflademodellen afslørede 186 T. cruzi-inficerede celler med en højere andel af inficerede celler i hjerteatriet (123) sammenlignet med ventrikler (63) og 18 sovende parasitter i hele hjertet (figur 2C i). I en tidligere rapport blev en lignende pipeline til overvågning af antallet af T. cruzi-inficerede celler og sovende parasitter i klaret musevæv efter lægemiddelbehandling rapporteret31. Det er vigtigt at bemærke, at estimaterne for antallet af sovende parasitter sandsynligvis er en undertælling, da farvefortyndingsteknikken kun tillader påvisning af parasitter, der ikke har replikeret signifikant siden den oprindelige infektion, men ikke opdager dem, der blev sovende senere i infektionen efter flere divisionsrunder.
En lignende tilgang blev brugt til at overvåge interaktionen mellem forskellige T. cruzi-stammer i interferon (IFN) -gamma-mangelfulde mus. Produktionen af IFN-gamma af effektor T-celler er afgørende for immunkontrol af T. cruzi. I IFN-gamma-mangelfulde mus spredes parasitter med minimal immunbegrænsning, hvilket giver et meget stort antal inficerede celler i organer. Disse immundefekte modeller er nyttige værktøjer til at studere effekten af nye lægemidler uden den begrænsning, der pålægges af immungenkendelse, og tillader således påvisning af parasittilbagefald efter behandling. IFN-gamma-mangelfulde mus blev inficeret med tdTomato-ekspressive Colombiana (rød) og GFP-ekspressive Brasilien (blå) T. cruzi-stammer. Musene blev aflivet 17 dage efter infektionen, og de intakte hjerter blev dissekeret, fikseret og ryddet. I denne immundefekte model kan værtsceller inficeret med begge T. cruzi-stammer observeres på forskellige stadier af parasitudvikling, herunder store, mellemstore og små inficerede celler og for nylig sprængte. Udskæring gennem vævene viser rigelige parasitinficerede celler i hjerteatrierne på forskellige vævsdybder (figur 2E i-iii og film 1).
En krydsning af C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J og B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J-mus, hvor alle T-celler udtrykker det grønne fluorescerende protein ZsGreen1, blev brugt til at overvåge T-cellerekruttering i T. cruzi-inficeret væv. Mus blev aflivet 14 dage efter infektion med tdTomato-ekspressive parasitter, og skeletmuskulatur blev udskåret, ryddet og afbildet af LSFM. ZsGreen1, der udtrykker T-celler (blå) og T. cruzi-inficerede celler (rød), blev robust detekteret (figur 2D i og film 2). 3D-zoom-ins af 3D-rekonstruktionen identificerede T-celler i området af en inficeret celle (figur 2D ii). Vibrerende tykke sektioner (200-500 μm) af det samme væv giver os mulighed for at visualisere grænsefladen mellem T-celler og værtsinficerede celler ved konfokal mikroskopi (figur 2D iii).
En alternativ måde at overvåge inflammationsfoci er baseret på cellekerneakkumulering omkring T. cruzi-inficerede celler. En reportermus, hvor alle cellekerner udtrykker det fluorescerende tdTomato-protein, blev brugt til dette formål. Det nukleare tdTomato-udtryk (rødt) blev let detekteret i vævene efter rydningsprocessen. En nuklear reportermus blev inficeret med GFP-ekspressive T. cruzi-parasitter (cyan), og 35 dage efter infektion blev aflivet, og skeletmuskler blev udskåret, ryddet og afbildet af LSFM (figur 2F i-iii). Zoomede optiske sektioner af skeletmuskulatur afslører øget cellularitet ved at akkumulere røde kerner langs GFP-ekspressive parasitter (figur 2F ii). Vibrerende sektioner af det samme væv bekræfter den tidligere beskrevne ophobning af røde kerner langs GFP-ekspressive parasitter ved konfokal mikroskopi (figur 2F iii).
CUBIC-protokollen blev også tilpasset til immunfarvning og DNA-mærkning af intakte, ryddede organer og væv inficeret med T. cruzi (figur 3A). Mus blev aflivet 40 dage efter infektion med tdTomato-ekspressive parasitter, og hjerterne blev dissekeret, fikseret og ryddet. Det intakte rensede hjerte blev vasket og farvet i 5 dage med en grøn DNA-markør, derefter vasket igen og immunostained i 7 dage med antistoffer mod α-SMA. Prøverne blev efterrettet, vasket, RI matchet og afbildet med LSFM. Samtidig påvisning af flere fluorescerende signaler, herunder kerner, vaskulatur og T. cruzi-inficerede celler, var mulig efter denne protokol. α-SMA immunostaining (hvid) præsenterede høje signalniveauer, der afslørede hjertets indviklede vaskulatur (figur 3B ii og film 3). En optisk sektion fra dybere hjerteområder viser vævsindtrængningen af α-SMA-antistoffer under de etablerede forhold (figur 3B v). DNA-farvning (blå) udviste også god vævsindtrængning, fluorescensniveauer og stabil volumetrisk farvning. Nogle områder med intens DNA-mærkning blev identificeret på forskellige hjerteplaceringer (figur 3B i) og omkring skeletmuskelfibre (figur 3C i og film 4). Et zoomet billede af skeletmuskulatur viste en ophobning af blå kerner i områder med få eller uopdagelige tdTomatparasitter, hvilket tyder på rekruttering af immunceller på steder med nuværende eller tidligere T. cruzi-infektion (figur 3C ii). I andre tilfælde havde inficerede værtsceller ringe eller ingen tegn på nærliggende cellulære infiltrater (hvide pile) (figur 3C i). Vibrerende dele af det samme væv som i figur 3C ii viser DNA-farvning af celler og tdTomato-ekspressive parasitter ved konfokal mikroskopi (figur 3C iii).
Tidligere forsøg har vist, at sovende parasitter udviste lav eller ubetydelig ekspression af tdTomat- eller GFP-reporterproteiner (figur 2C ii og iii). For at forbedre påvisningen af disse fluorescerende proteiner blev ryddede væv immunfarvet med anti-RFP- eller -GFP-antistoffer. Intakte skeletmuskelvæv fra mus inficeret med parasitter, der udtrykker tdTomato eller GFP, blev fikseret, afklaret og immunfarvet med antistoffer mod RFP (RFP Booster) (figur 3D) eller nanobodies mod GFP konjugeret med Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (figur 3E). Prøverne blev efterrettet, vasket, RI matchet og afbildet med LSFM. I begge tilfælde resulterede antistoffernes forøgelse af GFP- og tdTomato-signalerne i stærk fluorescens (figur 3D ii og 3E ii). Immunostainings ved hjælp af boostende antistoffer repræsenterer et alsidigt værktøj, der vil blive brugt til at detektere T. cruzi sovende i klaret hele organ og væv og detektere ethvert underrepræsenteret signal fra RFP eller GFP familiemedlems reporter proteiner.
Figur 1: Nåleindsættelse under transkardial perfusion. (A) En skematisk gengivelse, der viser de trin, der er udført, før musen føres gennem hjertet, og den korrekte position og retning af perfusionsnålen i venstre ventrikel. Et lille snit i højre atrium blev udført, og dræning af blod blev indsamlet (1); En sommerfuglnål blev indsat i hjertetoppen. Vedligehold retningen, så nålen ikke gennemborer septum (2). Indløbshullet omkring nålen blev forseglet ved hjælp af gelbaseret lim (3). Leveren er fyldt med blod og ser rød ud før perfusion; Men efter perfusion mister den pigmentering og bliver bleg. RA, højre auricle; LA, venstre auricle; RV, højre ventrikel; LV, venstre ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visualisering af T. cruzi-inficerede celler, sovende amastigotes og inflammationsfokus i ryddede organer. A) Ordning af hele organ T. cruzi-detektion af inficerede celler ved hjælp af vævsclearing, LSFM-billeddannelse og softwareassisteret kvantificering i 3D-overflademodeller. (Jeg) Lysfeltbilleder af hjerte- og skeletmuskulaturen før (venstre) og efter (højre) rydning (skalalinje: 1000 μm). (ii) Lysstofindtagelsesmikroskop. (Iii) IFN-gamma-mangelfuld mus var inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressive trypomastigotes. 17 dage efter infektion blev hjertet dissekeret, CUBIC ryddet og LSFM afbildet (skala bar: 500 μm). (Iv) Z-projektionsfluorescens blev segmenteret automatisk for at generere en rekonstrueret 3D-overflademodel til rumlig visualisering og kvantificering af antallet af T. cruzi-inficerede celler. I alt 736 T. cruzi-inficerede celler blev påvist i hele hjertet (skalabar: 500 μm). (v) viser forstørrelser af den angivne volumen i (Iv), hvor cyanobjekter repræsenterer T. cruzi-inficerede celler (skala bar: 50 μm). (B) Protokol for kubisk helorganclearing. (C) Visualisering af voksende og sovende T. cruzi parasitter i gennemsigtigt musehjerte. (Jeg) En vildtype mus blev inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressive trypomastigotes farvet med et DiR nær-infrarødt cyaninfarvestof. Hjertet blev dissekeret, ryddet og LSFM afbildet. tdTomato-ekspressiverende spredning (rød) og sovende (cyan) T. cruzi Parasitter kan identificeres. Autofluorescensniveauer blev opretholdt for at muliggøre korrekt visualisering af hjertestrukturen. En mus blev dræbt 15 dage efter infektion baseret på toppen af parasitinficerede celler og sovende amastigotes fundet i tidligere værker (skala bar: 400 μm). (ii) og iii) viser forstørrelser af det angivne volumen i (Jeg), hvor gule pile angiver sovende parasitter (cyan) (skala bar: 200 μm). (D) Påvisning af T-cellerekruttering i inficeret CD8-reportermus. (Jeg) Reportermusen var inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressive trypomastigotes og skeletmuskulatur blev dissekeret, ryddet og LSFM afbildet 14 dage efter infektion, et tidspunkt, hvor der påvises betydelige celleresponser. ZsGreen1 udtrykker T-celler (blå) såvel som T. cruzi-inficerede celler (røde) blev visualiseret (skalalinje: 400 μm) (se også Film 2). (ii) viser forstørrelser af den angivne volumen i (Jeg) (skala bar: 50 μm). (Iii) viser T-celleakkumulering omkring en T. cruzi-inficeret celle i en vævssektion (200 μm) af det samme organ (skalabar: 8 μm). (E) Samspillet mellem forskellige T. cruzi Stammer. (Jeg) IFN-gamma-mangelfulde mus blev inficeret med 2 x 105 tdTomato-udtrykker Colombiana (rød) og GFP-udtrykker Brasilien (blå) T. cruzi Stammer. Musene blev aflivet, og de intakte hjerter blev dissekeret, fikseret og ryddet 17 dage efter infektion (skala bar: 400 μm). (ii) viser forstørrelser af den angivne volumen i (Jeg) (skala bar: 250 μm). (Iii) viser en forstørret optisk sektion, der afslører celler inficeret med Colombiana (rød) og Brasilien (blå) T. cruzi stammer (skala bar: 150 μm). (F) Visualisering af cellularitet langs inficerede celler ved hjælp af kernereportermus. (Jeg) En nuklear reportermus blev inficeret med 2 x 105 GFP-ekspressive trypomastigotes og skeletmuskulatur blev dissekeret, ryddet og LSFM afbildet 35 dage efter infektion. Nuklear tdTomat ekspression af værtscellerne (rød) samt GFP parasitekspression (cyan) blev detekteret (skala bar: 400 μm). (ii) viser en forstørret optisk sektion, der afslører ophobning af røde kerner langs GFP-ekspressive parasitter (skalabjælke: 90 μm). (Iii) bekræfter øget cellularitet ved konfokal billeddannelse af vævssektioner fra samme organ (skala bar: 8 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mærkning af ryddede T. cruzi-inficerede organer med antistoffer og nuclearstains. (A) CUBIC-protokol til vævsclearing, 3D-immunostaining og DNA-mærkning af hele organer. (B) Mærkning af musehjerte til vaskulatur og DNA-detektion (se også film 3). (I-iii) En vildtypemus blev inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressive parasitter. Musen blev aflivet 40 dage efter infektion, og hjertet blev dissekeret, fikseret og ryddet. Det rensede hjerte blev mærket med en DNA-markør og immunfarvet med antistoffer mod α-SMA. Samtidig påvisning af cellekerner (blå), vaskulatur (hvid) og T. cruzi-inficerede celler (rød) var mulige. Musen blev dræbt på dette tidspunkt efter infektion, når væv og speciel vaskulatur ombygning kan vurderes (skala bar: 400 μm). (iv) viser et forstørret volumen fra dybe hjerteområder på (iii), der viser cellekerner, vaskulatur og inficerede celler (skala bar: 90 μm). v) viser en optisk sektion opnået på (iii) (skalabjælke: 90 μm). (C) Øget cellularitet visualiseret ved DNA-mærkning af hele ryddet skeletmuskulatur. (i) Skeletmuskelvæv fra det foregående eksperiment var DNA-farvet og afslørede områder med intens nuklear mærkning (blå) samt T. cruzi-inficerede celler (rød) (skala bar: 200 μm) (se også film 4). ii) afslører en intens ophobning af blå kerner i områder med lavere eller ingen påvisning af tdTomato parasit (skala bar: 100 μm). iii) konfokal billeddannelse med høj forstørrelse (60x) identificerer DNA-mærkning af celler og parasitter i vævssektioner (skalabar: 10 μm). (D) Forøgelse af tdTomato parasit reporter markører i hele ryddet skeletmuskulatur. (I-iii) Intakte skeletmuskelvæv fra mus inficeret med 2 x 105 parasitter, der udtrykker tdTomato, blev fikseret, afklaret og immunfarvet med antistoffer mod RFP (RFP Booster). Et intenst og ensartet fluorescerende signal blev opnået i den langt røde kanal efter RFP-forstærkning (grøn) af tdTomato-signalet (rødt) (skalabjælke: 100 μm). (E) Forøgelse af GFP-parasitreportermarkører ved hjælp af anti-GFP nanobodies. (I-iii) Skeletmuskelvæv fra mus inficeret med 2 x 105 parasitter, der udtrykker GFP, blev fikseret, afklaret og immunfarvet med Alexa Fluor 647-konjugerede nanolegemer mod GFP (GFP Booster). Et stærkt fluorescerende signal blev opnået i den fjerne røde kanal efter GFP-forstærkning (magenta) af GFP-fluorescensen (cyan). Mus fra (D) og (E) blev dræbt 30 dage efter infektion, fordi parasitbelastninger når et højdepunkt på dette tidspunkt, og parasitinficerede celler let kan detekteres i skeletmuskulatur (skala bar: 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: T. cruzi infektion i hjerte og skeletmuskulatur i IFN-gamma mangelfulde mus. 3D-rekonstruktioner af CUBIC-klaret væv af IFN-gamma-mangelfulde mus inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressive Colombiana (rød) og GFP-ekspressive Brasilien (blå) T. cruzi-stammer på dag 17 efter infektion. I alt 1151 individuelle skiver af hjertet og 559 af skeletmuskulaturen blev erhvervet via LSFM. Sammenlignelige billeddannelsesresultater blev opnået hos tre uafhængige dyr. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Påvisning af T-cellerekruttering i T. cruzi-inficeret CD8-reportermus. 3D-visualisering af en CUBIC-afklaret skeletmuskel fra en CD8-reportermus inficeret med 2 x 105 Tdtomat-ekspressive Colombiana T. cruzi-stamme (rød) og dræbt 14 dage efter infektion. I alt 668 individuelle skiver af skeletmuskulaturen blev afbildet af LSFM. ZsGreen1, der udtrykker T-celler (blå) såvel som T. cruzi-inficerede celler (rød) blev visualiseret. Sammenlignelige billeddannelsesresultater blev opnået hos to dyr. Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Immunodetektion af vaskulatur i T. cruzi-inficeret og ryddet hjerte. 3D-rekonstruktion af et CUBIC-afklaret hjerte af vildtypemus inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressive Colombiana T. cruzi og immunfarvet med antistoffer mod α-SMA (blå) 40 dage efter infektion. Skæring gennem hjertet afslører hjertets indviklede vaskulatur og vævsindtrængningen af α-SMA-antistofferne. Parasitinficerede celler kunne observeres som lyse røde pletter i hjertet atria (rød, højre). Sammenlignelige billeddannelsesresultater blev opnået hos to dyr. Klik her for at downloade denne film.
Film 4:Dna-farvning af hele organer afslører områder med øget cellularitet. 3D-rekonstruktion af den CUBIC-afklarede skeletmuskel hos vildtypemus 40 dage efter infektion inficeret med 2 x 105 tdTomato-ekspressionerende Colombiana T. cruzi-stamme. Hele quadriceps muskelområdet blev farvet med et grønt nukleart farvestof. T. cruzi-inficerede celler (rød) og kernerne i hver celle i vævet (blå) blev visualiseret. Zoom-ins af 3D-rekonstruktionen afslører ophobning af blå kerner langs områder med få eller ingen påvisning af tdTomato parasitter. Sammenlignelige billeddannelsesresultater blev opnået hos to dyr. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende fil 1: Sammensætning af de antistoffarvningsopløsninger, der blev anvendt i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fraværet af omfattende helorganbilleddannelse af parasitter og immunresponset begrænser forståelsen af kompleksiteten af værts-parasit-interaktionerne og hindrer evalueringen af terapier for Chagas sygdom. Den nuværende undersøgelse vedtog CUBIC-rørledningen for at afklare og plette intakte organer og væv fra T. cruzi-inficerede mus.
Flere vævsrensningsprotokoller blev testet i denne undersøgelse (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 og fDISCO13); dog bevarede kun CUBIC høje niveauer af tdTomat eller GFP parasitfluorescens. Tilsvarende viste tidligere rapporter CUBIC-konservering af endogent udtrykte markører sammenlignet med andre vævsrensningsmetoder35.
Begrænset opløsningskapacitet er en af de nuværende advarsler ved konventionel lysarkmikroskopi. Dette er tydeligt i vanskelighederne med at løse individuelle parasitter i stærkt inficerede celler (figur 2C). De nyudviklede fliselysarkmikroskoper med en forbedret opløsningskapacitet og tilpasning af vævsudvidelsesteknikker kunne løse dette problem36.
Urenheder fra vaskebuffere, rydningsopløsninger eller andre organer kan udfældes i vævet og producere uspecifikke signaler, der kan forveksles med parasitinficerede celler, individuelle parasitter eller andre strukturer. Imidlertid fluorescerer disse artefakter normalt lyst i flere kanaler, så efter billedanalyse kan de let kasseres fra automatiseret tælling ved billeddannelse af væv i en alternativ kanal (normalt den grønne kanal). Dobbeltfarveobjekter blev betragtet som artefakter og udelukket til automatiseret kvantificering.
Nukleare pletter DAPI, PI, RedDot2 og SYTOX-G præsenterer gode niveauer af vævsindtrængning og signalintensiteter i de fleste af de CUBIC-ryddede organer; det grønne DNA-farvestof viste dog den bedste ydeevne (figur 3B, C og film 4).
Disse resultater viste, at T. cruzi-inficerede celler let kunne detekteres og nøjagtigt kvantificeres, samtidig med at T-celle- eller kernereportermus blev identificeret. Vigtigst af alt opdagede LSFM sjældne biologiske hændelser, såsom DiR-positive sovende amastigotes, inden for et komplekst vævsmiljø med den potentielle evne til at udvide det til epitopimmunfarvning og DNA-mærkning. Nuværende undersøgelser undersøger også nytten af disse tilgange til overvågning af aktiveringen af immuneffektorceller, interaktionerne mellem flere parasitstammer i samme vært og induktion af vævsskade og reparation i Chagas sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Etsuo Susaki for deres værdifulde hjælp og anbefalinger vedrørende vævsrensnings- og immunostainingprotokoller. Vi er også taknemmelige for M. Kandasamy fra CTEGD Biomedical Microscopy Core for teknisk support ved hjælp af LSFM og konfokal billeddannelse. Vi takker også alle medlemmerne af Tarleton Research Group for nyttige forslag i hele denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
