Summary
Настоящий протокол описывает флуоресцентную микроскопию и автоматизированные программные методы визуализации и точной количественной оценки размножающихся и спящих паразитов Trypanosoma cruzi и Т-клеток в неповрежденных, очищенных органах и тканях. Эти методы обеспечивают надежный способ оценки результатов лечения и предлагают новое понимание взаимодействия паразита и хозяина.
Abstract
Болезнь Шагаса является забытой патологией, которая поражает миллионы людей во всем мире, в основном в Латинской Америке. Возбудитель болезни Шагаса, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), является облигатным внутриклеточным паразитом с разнообразной биологией, который заражает несколько видов млекопитающих, включая человека, вызывая сердечные и пищеварительные патологии. Надежное выявление инфекций T. cruzi in vivo уже давно необходимо для понимания сложной биологии болезни Шагаса и точной оценки результатов схем лечения. Текущий протокол демонстрирует интегрированный конвейер для автоматизированной количественной оценки клеток, инфицированных T. cruzi, в 3D-реконструированных, очищенных органах. Флуоресцентная микроскопия позволяет точно визуализировать и количественно оценивать активно размножающихся и спящих паразитов T. cruzi и иммунных эффекторных клеток в целых органах или тканях. Также был успешно принят конвейер CUBIC-HistoVision для получения равномерной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Очистка тканей в сочетании с 3D-иммуноокрашиванием обеспечивает непредвзятый подход к всесторонней оценке протоколов лечения лекарственными препаратами, улучшает понимание клеточной организации тканей, инфицированных T. cruzi, и, как ожидается, будет способствовать открытиям, связанным с иммунными реакциями против T. cruzi , повреждением тканей и восстановлением при болезни Шагаса.
Introduction
Болезнь Шагаса, вызванная простейшим паразитом T. cruzi, является одной из самых забытых тропических болезней в мире, вызывая около 13 000 ежегодных смертей. Инфекция часто прогрессирует от острой к хронической стадии, вызывая сердечную патологию у 30% пациентов, включая аритмии, сердечную недостаточность и внезапную смерть 1,2. Несмотря на сильный иммунный ответ хозяина, вызванный против паразита во время острой фазы, низкое количество паразитов хронически сохраняется на протяжении всей жизни хозяина в тканях, таких как сердце и скелетные мышцы. Несколько факторов, включая отсроченное начало адаптивных иммунных реакций и наличие нереплицирующих форм паразита, могут способствовать способности T. cruzi избегать полного устранения иммунной системой 3,4,5,6. Кроме того, невоспроизводящиеся спящие формы паразита демонстрируют низкую восприимчивость к трипаноцидным препаратам и могут частично быть ответственны за неудачу лечения, наблюдаемую во многих случаях 7,8.
Разработка новых методов визуализации дает возможность получить представление о пространственном распределении паразитов в инфицированных тканях и их взаимосвязи с иммунными клетками, участвующими в их контроле. Эти характеристики имеют решающее значение для лучшего понимания процессов борьбы с паразитами иммунной системой и отслеживания редких спящих паразитов, присутствующих в хронических тканях.
Светоплавная флуоресцентная микроскопия (LSFM) является одним из наиболее полных и непредвзятых методов для 3D-визуализации крупных тканей или органов без тонкого сечения. Световые микроскопы используют тонкий лист света, чтобы возбуждать только флуорофоры в фокальной плоскости, уменьшать фотоотбеливание и фототоксичность образцов и записывать изображения тысяч слоев тканей с помощью сверхбыстрых камер. Высокий уровень прозрачности тканей, необходимый для правильного проникновения лазерного света в ткани, получен путем гомогенизации показателя преломления (RI) после делипидации и обесцвечивания тканей, что уменьшает рассеяние света и выдаетвысококачественные изображения 9,10,11.
Разработаны подходы к очистке тканей для визуализации целых мышей 12,13,14, органоидов 15,16,17, органов, экспрессирующих репортерные флуоресцентные маркеры 18,19,20,21,22,23, а в последнее время ограниченного числа тканей человека 24 . Современные методы очистки тканей подразделяются на три семейства: (1) методы на основе органических растворителей, такие как протоколы DISCO 25,26, (2) методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY27, и водные методы, такие как CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Протоколы CUBIC поддерживают форму органа и целостность тканей, сохраняя флуоресценцию эндогенно экспрессируемых репортерных белков. Самое последнее обновление этого метода, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), также позволяет обнаруживать эпитопы с использованием флуоресцентно меченых антител и маркировки ДНК28.
В настоящем протоколе использовался конвейер CUBIC для обнаружения T. cruzi , экспрессирующих флуоресцентные белки в осветленных интактных тканях мыши. Оптически прозрачные ткани были визуализированы LSFM, реконструированы в 3D, а точное общее количество инфицированных T. cruzi клеток, спящих амастиготов и Т-клеток на орган было автоматически количественно определено. Также этот протокол был успешно принят для получения единообразной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Эти подходы необходимы для понимания расширения и контроля T. cruzi у инфицированных хозяев и полезны для полной оценки химио- и иммунотерапевтических средств для болезни Шагаса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в строгом соответствии с Политикой Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Руководством Ассоциации по оценке и аккредитации аккредитации по уходу за лабораторными животными. Протокол использования животных (контроль инфекции T. cruzi у мышей-A2021 04-011-Y1-A0) был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Джорджии. В6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J и C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J мыши (самки, 1-2 месяца) использовались для настоящего исследования. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
1. Инфекция, перфузия и рассечение
- Внутрибрюшинно заражают мышей трипомастиготами колумбийского (DTU TcI) или бразильского (DTU TcV) штамма T. cruzi , экспрессирующими флуоресцентные белки tdTomato или GFP соответственно. Доза инфекции может варьироваться от 50 000 до 200 000 трипомастиготов, разбавленных в 100 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные подробности о генерации паразитов-репортеров и мышиных моделях инфекции доступны в Canavaci et al. пункт 29 и Бустаманте и др.30. - Усыпляют мышей путем вдыхания углекислого газа со скоростью потока 3-7 л/мин. Как только животные перестанут проявлять какой-либо педальный рефлекс, сделайте продольный разрез через кожу от брюшка по направлению к грудине. Затем отрежьте стенку тела от живота и продолжайте через ребра с каждой стороны грудной клетки, пока грудина не будет поднята, обнажая сердце.
- Как описано на рисунке 1, сделайте разрез 2,5 мм в правой ушной раковине сердца и соберите дренажную кровь с помощью кончика микропипетки объемом 1 мл.
- Вставьте иглу бабочки (соединенную с одним концом перфузионной системы) в вершину левого желудочка, пока она не достигнет восходящей аорты. Используйте клей на основе геля (см. Таблицу материалов) для герметизации входного отверстия вокруг иглы и поддержания иглы в положении во время перфузий.
- Перфьюируйте мышей30 с 50 мл холодного гепарина-PBS (рН 7,4, 10 Ед/мл гепарина) или до тех пор, пока жидкость, которая выходит из мыши к лотку для сбора, не будет очищена от крови.
- Перфьюсировать с 50 мл холодного 4% (мас./об.) параформальдегида (PFA) (рН 7,4) в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация ткани PFA, вероятно, является одним из критических этапов протокола, особенно для поддержания эпитопных структур и последующей иммунодетекции. PFA со временем разлагается, поэтому он должен быть свежеприготовленным. рН раствора также важен, чтобы избежать чрезмерной фиксации, которая может привести к плохой очистке тканей.
ВНИМАНИЕ: PFA умеренно токсичен при контакте с кожей. Острое воздействие также сильно раздражает нос, глаза и горло. Длительное воздействие низких уровней в воздухе или коже может вызвать раздражение кожи, такое как дерматит и зуд, а также астматические респираторные проблемы. Носите защиту лица и глаз и не дышите пылью, газом, туманом, парами или парами.- После перфузии PFA перфузии перфьюируйте мышь 100 мл буфера CUBIC-P для достижения уровней прояснения, упомянутых на этапе 1.5.
- Для получения буфера CUBIC-P растворите 10% N-бутилдиэтаноламина, 5% тритона X-100 и 5% 1-N-метилимидазола в двухдистиллированной воде или используйте коммерческие коктейли (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.6.1.-1.6.2. рекомендуются только для высокопигментированных органов, таких как сердце и почки, поскольку они требуют предварительного этапа очистки для получения повышенного уровня прозрачности. После использования CUBIC-P рассекните органы и приступайте непосредственно к шагу 2: Очистка тканей.
- Рассекните образцы тканей/органов30 для получения изображения и зафиксируйте их в 4% (мас./об.) PFA в PBS (~10 мл/весь орган) в течение ночи (ON) при 4 °C с мягким встряхиванием (не более 5 x g) в конических трубках по 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инкубации, начиная с этого момента, должны выполняться на трубах, укладываемых горизонтально при температуре 20-30 °C, защищенных от света. - Промыть образец в 10 мл PBS (дополненного 0,05% азида натрия (NaN3) в течение 3 ч (три раза) при комнатной температуре (RT) с легким встряхиванием (5 x g).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани могут быть заморожены путем инкубации в 10 мл 30% сахарозы в PBS с мягким встряхиванием (5 х г) при 4 °C ON в конических пробирках по 50 мл. После того, как ткани опустятся на дно трубки, вставьте их в соединение OCT и держите при -80 °C. Разморозить при РТ до полного расплавления соединения ОКТ, затем промыть в PBS (~10 мл/весь орган) ON при 4 °C с мягким встряхиванием (5 х г) в конических пробирках по 50 мл. Перейдите к шагу 2.
2. Очистка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Все очистки тканей, выполненные в этой работе, были выполнены с использованием протокола CUBIC I22. Были использованы три различных коктейля: CUBIC-P для делипидации и быстрого обесцвечивания во время перфузий, CUBIC-L для делипидации и обесцвечивания и CUBIC-R для сопоставления RI. Окрашивание ДНК и иммуноокрашивание проводились с использованием набора для ядерного окрашивания CUBIC-HV 1 3D и комплекта иммуноокрашивания CUBIC-HV 1 3D соответственно (см. Таблицу материалов).
- Погружают отдельные органы в 10 мл 50% разбавленного водой CUBIC-L (см. Таблицу материалов) с легким встряхиванием (5 х г) при РТ (ON) в конических трубках по 50 мл. Держите трубки плоскими на трясущейся пластине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повреждения тканей, органы поддерживаются в одной трубке, а растворы собираются с помощью вакуумной системы. Для приготовления CUBIC-L растворяют 10% N-бутилдиэтаноламин и 10% Тритон Х-100 в двухдистиллированной воде с использованием коммерческих коктейлей (см. Таблицу материалов).
ВНИМАНИЕ: CUBIC-L вызывает серьезные повреждения глаз. Носите средства защиты для глаз и лица. Утилизируйте на утвержденном заводе по утилизации отходов. - Погружают образец в 10 мл 100% CUBIC-L в течение 6 дней (освежая раствор на 3 день).
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого инкубационного периода ткани должны быть почти полностью прозрачными. - Промыть прозрачные органы PBS (дополненным 0,05% NaN3) в течение 2 ч (три раза) при 37 °C с легким встряхиванием (5 х г). Переносите ткани в новую коническую трубку объемом 50 мл с каждой промывкой, чтобы удалить Triton X-100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано на рисунке 2B, если целью эксперимента является визуализация эндогенно экспрессированных репортерных белков трансгенных паразитов T. cruzi или мышей (рисунок 2C-F), пропустите шаги 3, 4 и 5 и перейдите непосредственно к шагу 6.
3. Окрашивание ДНК
- Разбавляют коммерчески доступный краситель нуклеиновой кислоты (см. Таблицу материалов) в 5 мл окрашивающего буфера (входит в комплект) при разведении 1/2 500.
- Погрузить ткань в раствор ядерного красителя и инкубировать при 37 °C с мягким вращением в течение 5 дней с использованием конических трубок по 15 мл в положении стоя.
- Промывайте 15 мл 3D ядерного окрашивающего промывочного буфера (входит в комплект) в течение 2 ч (три раза) на РТ с мягким встряхиванием (5 х г).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие ДНК-красители могут быть использованы в этих концентрациях и времени инкубации: DAPI (входит в комплект): 1/200, 5 дней инкубации; БОБО-1: 1/400, 5 дней инкубации; Пропидия йодида (PI) (входит в комплект): 1/100, 3 дня инкубации; RedDot2: 1/250, 3 дня инкубации. Если конкретная цель эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать оба эндогенно экспрессированных репортерных белка и использовать ядерные пятна, пропустите шаги 4 и 5 и перейдите непосредственно к шагу 6.
4. Пищеварение внеклеточного матрикса (ECM)
ПРИМЕЧАНИЕ: Гиалуронидазное переваривание ECM должно быть выполнено для облегчения надлежащего проникновения антител в глубокие области тканей28.
- Погружайте отдельные органы в 15 мл реакционного буфера гиалуронидазы в течение 2 ч при 37 °C в коническую трубку объемом 50 мл в плоском положении, защищенном от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения реакционного буфера гиалуронидазы растворяют 10 мМ КАПСО; 150 мМ хлорида натрия (NaCl) и 0,05% NaN3 (см. Таблицу материалов) в двухдистиллированной воде и отрегулируйте рН до 10. - Готовят ферментный раствор путем смешивания 75 мкл 20 мг/мл гиалуронидазы с 425 мкл реакционного буфера гиалуронидазы. Для получения 20 мг/мл запаса гиалуронидазы растворяют гиалуронидазу в 50 мМ карбонатного буфера, 150 мМ NaCl, 0,01% BSA и 0,05% NaN3 (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте pH до 10 и аликвоту в объемах 77 мкл при -30 °C.
- Откажитесь от реакционного буфера гиалуронидазы с помощью пипетки и погрузите орган в раствор фермента (500 мкл в конической трубке объемом 15 мл) в положении стоя, защищенном от света в течение 24 ч при 37 °C с легким встряхиванием (5 х г).
- Промыть образец в 15 мл гиалуронидазы промывочного буфера в конической трубке объемом 50 мл в горизонтальном положении, защищенном от света в течение 2 ч (три раза) при 37 °C с легким встряхиванием (5 х г).
- Для получения промывного буфера гиалуронидазы растворяют 50 мМ карбонатного буфера, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) тритона X-100, 5% (v/v) метанола и 0,05% NaN3. Отрегулируйте pH до 10. Для получения 10-кратного карбонатного буфера-запаса NaCl растворите 2,96 г карбоната натрия, 1,86 г гидрокарбоната натрия и 8,77 г NaCl в 100 мл двухдистиллированной воды с 0,05% NaN3 (см. Таблицу материалов) и отрегулируйте рН до 10.
5. Иммуноокрашивание
- Маркируйте сосудистую систему с помощью антител против α-СМА (альфа-малый мышечный актин, см. Таблицу материалов), следуя приведенным ниже шагам.
- Генерация первичного плюс конъюгированного Fab фрагмента вторичного комплекса антител. Начните эту реакцию за 1,5 ч до процедуры окрашивания.
- Рассчитайте необходимое количество первичных и вторичных антител (смешайте в соотношении 1:0,5 по весу).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичного антитела анти-α-СМА необходимо 3,5 мкг для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 2,5 мг/мл необходимо 3,5/2,5 = 1,4 мкл раствора антител. Для вторичного антитела AlexaFluor 647 антимышечного fab фрагмента необходимо 1,75 мкг для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 1,7 мг/мл необходимо 1,75/1,7 = 1 мкл раствора антител. - Смешайте первичные и вторичные антитела в янтарной пробирке 2 мл и инкубируйте в течение 1,5 ч при 37 °C.
- Рассчитайте необходимое количество первичных и вторичных антител (смешайте в соотношении 1:0,5 по весу).
- Для буферного обмена смешайте 7,5 мл 2x HV1 3D иммуноразрушающего буфера (входит в комплект, см. Таблицу материалов) с 7,5 мл двойной дистилированной воды и погружайте образец ткани на 1,5 ч при 32 °C с мягким встряхиванием (5 х г) в конической трубке объемом 15 мл в горизонтальном положении. Начинают эту реакцию одновременно с генерацией комплекса антител (за 1,5 ч до процедуры иммуноокрашивания).
- Генерация первичного плюс конъюгированного Fab фрагмента вторичного комплекса антител. Начните эту реакцию за 1,5 ч до процедуры окрашивания.
- Выполните 3D-иммуноокрашивание, выполнив следующие действия.
- В конической пробирке объемом 15 мл приготовьте раствор для окрашивания антител после дополнительного файла 1.
- Соберите образец ткани из буферной обменной среды (этап 5.1.2) и погрузите его в раствор для окрашивания антител. Инкубировать ткани индивидуально в течение 1 недели при 32 °C с легким встряхиванием (5 х г) трубок в положении стоя, защищенном от света. Запечатайте трубку парафиновой пленкой, чтобы избежать испарения.
- Переместите до 4 °C и высиживайте ON в положении стоя.
- Охладите 1x HV1 3D иммуноокрашивающий промывочный буфер (входит в комплект, см. Таблицу материалов) до 4 °C и промывайте образец буфером 15 мл (два раза) в течение 30 мин каждый при 4 °C с мягким встряхиванием (5 x g). Держите конические трубки объемом 15 мл в горизонтальном положении до шага 5.2.7.
- Развести формалин до 1% в 1x HV1 3D иммуноразрушающий промывочный буфер и погрузить образец в 8 мл раствора на 24 ч при 4 °C с мягким встряхиванием (5 х г).
- Инкубировать в свежем 1% растворе формалина в течение 1 ч при 37 °С с легким встряхиванием (5 х г).
- Промыть в 15 мл PBS в течение 2 ч при 25 °C с легким встряхиванием (5 х г).
- Повышайте сигнал tdTomato с помощью антител к красному флуоресцентному белку (RFP), следуя приведенным ниже шагам.
- Соблюдайте те же сроки инкубации и температуры, что и на этапе 5.2.2. Рассчитайте количество первичных и вторичных антител (см. Таблицу материалов) и смешайте их в соотношении 1:0,5 по весу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичного антитела анти-RFP необходимо 5 мкг для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 1,25 мг/мл требуется 5/1,25 = 4 мкл раствора. Для вторичного антитела Alexa Fluor 647 anti-rabbit Fab fragment, 2,5 мкг необходимо для маркировки всего сердца или фрагмента скелетной мышцы аналогичных размеров. Для продукта 1,5 мг/мл необходимо 2,5/1,5 = 1,7 мкл раствора. - Приготовьте раствор для окрашивания антител, как указано в дополнительном файле 1.
- Соблюдайте те же сроки инкубации и температуры, что и на этапе 5.2.2. Рассчитайте количество первичных и вторичных антител (см. Таблицу материалов) и смешайте их в соотношении 1:0,5 по весу.
- Увеличьте сигналы GFP с помощью нанотел против GFP, следуя приведенным ниже шагам.
- Соблюдайте те же сроки инкубации и температуры, что и в шаге 5.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нанотела анти-GFP (см. Таблицу материалов) конъюгированы с Alexa Fluor 647, поэтому генерация комплекса антител не нужна. - Приготовьте раствор для окрашивания антител, как указано в дополнительном файле 1.
- Соблюдайте те же сроки инкубации и температуры, что и в шаге 5.2.2.
6. Сопоставление RI
- Погрузить прозрачные органы в 5 мл 50% разбавленного водой раствора CUBIC-R+ (см. Таблицу материалов) при РТ (ON) с легким встряхиванием (5 х г) в конической трубке объемом 50 мл. Держите трубы в положении стоя в течение всего шага согласования RI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переработанные решения CUBIC R+ из предыдущих экспериментов могут быть повторно использованы (до четырех раз) на этом этапе. Для приготовления раствора CUBIC-R+ растворяют 45% 2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолона (антипирина), 30% никотинамида или N-метилникотинамида и 0,5% N-бутилдиэтаноламина в двухдистиллированной воде или используют коммерческий буфер CUBIC-R+ (см. Таблицу материалов).
ВНИМАНИЕ: CUBIC-R+ вызывает раздражение кожи, серьезное раздражение глаз и повреждение органов. Носите защитные перчатки и обеспечьте защиту глаз и лица. Не дышите пылью, парами, газом, туманом или парами. Утилизация на утвержденном заводе по утилизации отходов. - Заменить 50% CUBIC-R+ на 5 мл 100% CUBIC-R+ и инкубировать с мягким встряхиванием (5 х г) на RT в течение 2 дней. Затем переложите ткани на стопку безворсовых салфеток и осторожно переверните ткани, чтобы удалить раствор CUBIC-R+ с поверхностей органов в течение 5 минут.
7. Монтаж
- После высыхания тканей перенесут их в 5 мл монтажного раствора (RI = 1,520) (см. Таблицу материалов) в шестилуночной пластине для культивирования клеток и инкубируют их (ON) в RT. Часто переворачивают ткани для устранения пузырьков воздуха, особенно на поверхностях органов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органы могут храниться более 6 месяцев в монтажном растворе или CUBIC-R+. - Приклейте ткани к держателю образца микроскопа с помощью гелевого клея на основе цианоакрилата.
- Погрузите образцы в кварцевую кювету микроскопа, заполненную 120 мл монтажного раствора, и визуализируйте их поперечно к их продольной оси. Прилипайте к сердцу с вершиной, а аорта горизонтально выровнена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные и установленные органы могут быть разделены вибратомом и изображены с большим увеличением с помощью конфокальной микроскопии. Встраивают органы в 2% агарозу и разрезают участки по 100-500 мкм. Органы также могут быть вручную разделены острым лезвием для получения толстых тканевых срезов (>1000 мкм). После секционирования поместите срезы в стеклянные 35-миллиметровые чашки Петри, смонтируйте с помощью того же монтажного раствора, запечатайте лаком для ногтей и нанесите изображение с помощью конфокального микроскопа.
8. Получение изображений
- Изобразите смонтированные образцы с помощью светового микроскопа (см. Таблицу материалов). Установите увеличение и размер шага между отдельными срезами до 3 мкм, а также используйте правые и левые листовые лазеры толщиной 5 мкм и шириной 100%. Установите постоянную продолжительность экспозиции на уровне 50-100 мс, а мощность лазера от 10% до 80% в зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала.
- Для совместного обнаружения tdTomato-экспрессирующих паразитов и Окрашенных DiR спящих амастиготов (рисунок 2C) используют красный (Ex/Em 561/620-660 нм) и инфракрасный (Ex/Em 785/845-55 нм) каналы соответственно. Для совместного обнаружения Т-клеток и tdTomato-экспрессирующих паразитов в CD8-репортерной мыши (рисунок 2D) используют зеленый (Ex/Em 488/525-50 нм) и красный канал соответственно.
- Для анализа коинфекций (рисунок 2E), а также для совместного обнаружения паразитов, экспрессирующих GFP в ядрах репортерных мышей (рисунок 2F), используют зеленый и красный каналы соответственно. Для обнаружения tdTomato-экспрессирующих паразитов, ядерного красителя и сосудистой системы сердца (рисунок 3B,C) используют красный, зеленый и дальний красный (Ex/Em 640/680-730 нм) каналы соответственно.
- Обнаружение анти-RFP антител с дальне-красным каналом и анти-GFP нанотел с помощью зеленого канала (рисунок 3D).
- Конвертируйте полученные стеки изображений TIFF и 3D реконструируйте органы с помощью программного обеспечения Imaris v9.7.2 (см. Таблицу материалов).
9. Реконструкция и количественная оценка поверхности с помощью программного обеспечения Imaris
- Выберите инструмент алгоритма обнаружения поверхностей и запустите мастер в программном обеспечении для анализа изображений.
- Выполните первоначальный анализ в интересующей 3D-области (случайно выбранной), а затем примените его ко всей 3D-реконструкции органа. После выбора интересующей области (ROI) выберите канал для анализа, снимите флажок кнопки smooth и выберите вычитание фона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вычитание фона вычисляет уникальное локальное фоновое значение для каждого вокселя и вычитает его из исходного значения пикселя. Диаметр самой большой сферы, которая помещается в объект, должен составлять до 200 мкм для клеток, инфицированных T. cruzi, 10 мкм для Т-клеток и 5 мкм для отдельных паразитов. - Используйте гистограмму для настройки классификации и раскрывающийся список фильтров для выбора измерений для классификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гистограмму для корректировки классификации: рекомендуется измерение эллиптичности (сплюснутости) и сферичности. - Завершите работу мастера, нажмите кнопку статистики и получите общее количество инфицированных паразитами клеток или Т-клеток в виде количества отключенных компонентов на определенный момент времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фиксированные ткани CUBIC промывали PBS для удаления фиксаторов, а затем инкубировали с коктейлями CUBIC-L, основным буферным раствором аминоспиртов, которые извлекают пигменты и липиды из ткани, что приводит к обесцвечиванию ткани при сохранении тканевой архитектуры. Линии сетки на бумаге можно увидеть сквозь ткани, указывающие на соответствующее очищение органов (рисунок 2А). После делипидации ткани промывали и погружали в CUBIC-R+ и монтажный раствор для гомогенизации и визуализации RI соответственно (рисунок 2B).
Мышь дикого типа была заражена tdTomato-экспрессирующими трипомастиготами, предварительно окрашенными цианиновым красителем DiR в ближнем инфракрасном диапазоне. Мышь была усыплена через 15 дней после заражения, а неповрежденное сердце было рассечено, исправлено и очищено. Визуализация LSFM и 3D-реконструкция позволили нам визуализировать tdTomato-экспрессирующие размножающиеся паразиты T. cruzi (красный). Уровни автофлуоресценции в красном канале могут быть использованы для правильной визуализации структуры и краев сердца (рисунок 2C i). LSFM также был полезен для выявления лекарственно-устойчивых спящих форм 7,8. Предварительное окрашивание паразитов красителем DiR позволяет отслеживать спящих паразитов путем визуализации паразитов, которые не разбавляли краситель путем репликации, как сообщалось ранее для CellTrace Violet7.
Спящие паразиты (голубой) могут быть идентифицированы в сердце, как показано на 3D увеличенных вставках (желтые стрелки) (рисунок 2C ii,iii). Z-проекционная флуоресценция была сегментирована автоматически для создания реконструированной 3D-модели поверхности для пространственной визуализации и количественной оценки общего количества T. cruzi-инфицированных клеток и спящих паразитов на протяжении всей 3D-реконструкции (рисунок 2A). Анализ 3D-модели поверхности выявил 186 T. cruzi-инфицированных клеток с более высокой долей инфицированных клеток в предсердиях сердца (123) по сравнению с желудочками (63) и 18 спящими паразитами во всем сердце (рисунок 2C i). В предыдущем отчете сообщалось о подобном конвейере для мониторинга количества T. cruzi-инфицированных клеток и спящих паразитов в тканях осветленных мышей послемедикаментозного лечения 31. Важно отметить, что оценки количества спящих паразитов, вероятно, занижены, поскольку метод разбавления красителя позволяет обнаруживать только паразитов, которые не реплицировались значительно с момента первоначальной инфекции, но не обнаруживает тех, кто стал спящим позже при инфекции после нескольких раундов деления.
Аналогичный подход был использован для мониторинга взаимодействия между различными штаммами T. cruzi у мышей с дефицитом интерферона (IFN)-гамма-дефицита. Производство IFN-гамма эффекторными Т-клетками имеет важное значение для иммунного контроля T. cruzi. У мышей с дефицитом IFN-гамма паразиты размножаются с минимальным иммунным ограничением, давая очень большое количество инфицированных клеток в органах. Эти иммунодефицитные модели являются полезными инструментами для изучения эффективности новых препаратов без ограничений, налагаемых иммунным распознаванием, и, таким образом, позволяют обнаружить рецидив паразита после лечения. Мыши с дефицитом ИФН-гамма были коинфицированы tdTomato-экспрессирующими colombiana (красный) и GFP-экспрессирующими бразильскими (синими) штаммами T. cruzi. Мыши были усыплены через 17 дней после заражения, а неповрежденные сердца были рассечены, исправлены и очищены. В этой иммунодефицитной модели клетки-хозяева, инфицированные обоими штаммами T. cruzi, могут наблюдаться на различных стадиях развития паразита, включая крупные, средние и мелкие инфицированные клетки и недавно лопнувшие. Разрезание тканей показывает обильное присутствие паразитов в сердцах на различных глубинах тканей (рисунок 2E i-iii и фильм 1).
Скрещивание C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J и B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J мышей, у которых все Т-клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок ZsGreen1, использовали для мониторинга рекрутирования Т-клеток в тканях, инфицированных T. cruzi . Мышей усыпляли через 14 дней после заражения tdTomato-экспрессирующими паразитами, а скелетные мышцы были иссечены, очищены и сфотографированы LSFM. ZsGreen1, экспрессирующие Т-клетки (синие) и T. cruzi-инфицированные клетки (красные), были надежно обнаружены (рисунок 2D i и фильм 2). 3D-масштабирование 3D-реконструкции идентифицировало Т-клетки в области инфицированной клетки (рисунок 2D ii). Вибратомные толстые срезы (200-500 мкм) одной и той же ткани позволяют визуализировать интерфейс Т-клеток и инфицированных клеток хозяина с помощью конфокальной микроскопии (рисунок 2D iii).
Альтернативный способ мониторинга очагов воспаления основан на накоплении клеточных ядер вокруг клеток, инфицированных T. cruzi. Для этой цели была использована мышь-репортер, в которой все ядра клеток экспрессируют флуоресцентный белок tdTomato. Экспрессия ядерного tdTomato (красный) легко обнаруживалась в тканях после процесса очистки. Мышь-ядерный репортер была инфицирована GFP-экспрессирующими паразитами T. cruzi (голубой), и через 35 дней после заражения была усыплена, а скелетные мышцы были иссечены, очищены и изображены LSFM (рисунок 2F i-iii). Увеличенные оптические участки скелетных мышц показывают повышенную клеточность за счет накопления красных ядер вдоль GFP-экспрессирующих паразитов (рисунок 2F ii). Вибратомные участки одной и той же ткани подтверждают ранее описанное накопление красных ядер вдоль GFP-экспрессирующих паразитов с помощью конфокальной микроскопии (рисунок 2F iii).
Протокол CUBIC также был адаптирован для иммуноокрашения и маркировки ДНК интактных, очищенных органов и тканей, инфицированных T. cruzi (Рисунок 3A). Мышей усыпляли через 40 дней после заражения tdTomato-экспрессирующими паразитами, а сердца рассекали, фиксировали и очищали. Неповрежденное очищенное сердце промывали и окрашивали в течение 5 дней зеленым маркером ДНК, затем снова промывали и иммуноокрашивали в течение 7 дней антителами против α-СМА. Образцы были постфиксированы, промыты, сопоставлены с RI и визуализированы с помощью LSFM. Одновременное обнаружение нескольких флуоресцентных сигналов, включая ядра, сосудистую систему и клетки, инфицированные T. cruzi, было возможно в соответствии с этим протоколом. иммуноокрашивание α-СМА (белый) представляло высокие уровни сигнала, раскрывающие сложную сосудистую систему сердца (рисунок 3B ii и фильм 3). Оптический срез из более глубоких областей сердца изображает проникновение в ткани антител α-СМА в установленных условиях (рисунок 3B v). Окрашивание ДНК (синий) также продемонстрировало хорошее проникновение в ткани, уровни флуоресценции и стабильное объемное окрашивание. Некоторые области с интенсивной маркировкой ДНК были идентифицированы в разных местах сердца (рисунок 3B i) и вокруг скелетных мышечных волокон (рисунок 3C i и фильм 4). Увеличенное изображение скелетных мышц показало накопление синих ядер в областях с небольшим количеством или неопределяемыми паразитами tdTomato, предполагая рекрутирование иммунных клеток в местах текущей или предшествующей инфекции T. cruzi (рисунок 3C ii). В других случаях инфицированные клетки-хозяева практически не имели признаков близлежащих клеточных инфильтратов (белые стрелки) (рисунок 3C i). Вибратомные участки той же ткани, что и на рисунке 3C ii, показывают окрашивание ДНК клеток и tdTomato-экспрессирующих паразитов с помощью конфокальной микроскопии (Рисунок 3C iii).
Предыдущие эксперименты показали, что спящие паразиты демонстрировали низкую или незначительную экспрессию теляторов tdTomato или GFP (рисунок 2C ii и iii). Чтобы улучшить обнаружение этих флуоресцентных белков, очищенные ткани были иммуноокрашены анти-RFP или -GFP антителами. Интактные скелетные мышечные ткани мышей, инфицированных паразитами, экспрессирующими tdTomato или GFP, были зафиксированы, очищены и иммуноокрашены антителами против RFP (RFP Booster) (Рисунок 3D) или нанотелами против GFP, конъюгированными с Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Рисунок 3E) соответственно. Образцы были постфиксированы, промыты, сопоставлены с RI и визуализированы с помощью LSFM. В обоих случаях усиление сигналов GFP и tdTomato антителами приводило к сильной флуоресценции (рисунки 3D ii и 3E ii). Иммуноокрашивание с использованием усиливающих антител представляет собой универсальный инструмент, который будет использоваться для обнаружения спящих веществ T. cruzi в осветленных целых органах и тканях и обнаружения любого недопредставленного сигнала от репортерных белков члена семейства RFP или GFP.
Рисунок 1: Введение иглы во время транскардиальной перфузии. (A) Схематическое изображение, показывающее шаги, выполненные перед перфузией мыши через сердце, а также правильное положение и направление перфузионной иглы в левом желудочке. Был выполнен небольшой разрез в правом предсердии и собрана дренажная кровь (1); игла бабочки была вставлена в верхушку сердца. Поддерживайте направление, чтобы игла не прокалывала перегородку (2). Входное отверстие вокруг иглы запечатывали с помощью клея на основе геля (3). Печень наполняется кровью и появляется красной перед перфузией; однако после перфузии он теряет пигментацию и становится бледным. РА, правая ушная раковина; Л.А., левая ушная раковина; RV, правый желудочек; ЛЖ, левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация T. cruzi-инфицированных клеток, спящих амастигот и очагов воспаления в очищенных органах. (А) Схема цельного органа T. cruzi-обнаружение инфицированных клеток с помощью очистки тканей, визуализации LSFM и программной количественной оценки в 3D-моделях поверхности. (я) Изображения сердца и скелетных мышц с ярким полем до (слева) и после (справа) очищения (шкала: 1000 мкм). (Ii) Световой флуоресцентный микроскоп. (iii) IFN-гамма-дефицитная мышь была инфицирована 2 x 105 tdТоматоэкспрессирующие трипомастиготы. Через 17 дней после заражения сердце было рассечено, CUBIC очищено, а LSFM визуализировано (шкала: 500 мкм). (IvZ-проекционная флуоресценция была сегментирована автоматически для создания реконструированной 3D-модели поверхности для пространственной визуализации и количественной оценки числа T. cruzi-инфицированные клетки. Всего 736 T. cruzi-инфицированные клетки были обнаружены во всем сердце (шкала бара: 500 мкм). (v) показывает увеличение указанного объема в (Iv), где голубые объекты представляют T. cruzi-инфицированные клетки (шкала: 50 мкм). (B) Протокол очистки всех органов CUBIC. (C) Визуализация распространяющихся и спящих T. cruzi паразиты в прозрачном сердце мыши. (я) Мышь дикого типа была заражена 2 x 105 tdТоматоэкспрессирующие трипомастиготы, окрашенные красителем цианина DiR ближнего инфракрасного диапазона. Сердце было рассечено, очищено и изображено LSFM. tdТомато-экспрессирующий пролиферирующий (красный) и спящий (голубой) T. cruzi паразиты могут быть идентифицированы. Уровни автофлуоресценции поддерживались, чтобы обеспечить правильную визуализацию структуры сердца. Мышь была убита через 15 дней после заражения на основе пика инфицированных паразитами клеток и спящих амастиготов, обнаруженных в предыдущих работах (шкала: 400 мкм). (Ii) и (iii) показать увеличение указанного объема в (я), где желтые стрелки указывают на спящих паразитов (голубой) (шкала: 200 мкм). (D) Обнаружение рекрутирования Т-клеток в инфицированной cd8-репортерной мыши. (я) Мышь репортера была заражена 2 x 105 tdТомато-экспрессирующие трипомастиготы и скелетные мышцы были рассечены, очищены и LSFM сфотографированы через 14 дней после заражения, момент времени, в который обнаруживаются существенные клеточные реакции. ZsGreen1 экспрессирующие Т-клетки (синий), а также T. cruzi-были визуализированы инфицированные клетки (красный) (шкала: 400 мкм) (см. также Фильм 2). (Ii) показывает увеличение указанного объема в (я) (шкала: 50 мкм). (iii) изображает накопление Т-клеток, окружающих T. cruzi-инфицированная клетка в тканевом срезе (200 мкм) того же органа (шкала бар: 8 мкм). (E) Взаимодействие между различными T. cruzi Штаммов. (я) Мыши с дефицитом IFN-гамма были коинфицированы 2 x 105 tdТомато-экспрессирующая колумбийская (красная) и GFP-экспрессирующая Бразилия (синяя) T. cruzi Штаммов. Мышей усыпляли, а неповрежденные сердца рассекли, зафиксировали и очистили через 17 дней после заражения (шкала бара: 400 мкм). (Ii) показывает увеличение указанного объема в (я) (шкала: 250 мкм). (iii) показывает увеличенный оптический участок, выявляющий клетки, инфицированные колумбийцами (красный) и Бразилией (синий) T. cruzi деформации (шкала: 150 мкм). (F) Визуализация клеточности вдоль инфицированных клеток с помощью мыши-репортера ядер. (яМышь ядерного репортера была заражена 2 x 105 GFP-экспрессирующие трипомастиготы и скелетные мышцы были рассечены, очищены и LSFM сфотографированы через 35 дней после заражения. Обнаружена экспрессия ядерного tdTomato клеток-хозяев (красный), а также экспрессия паразита GFP (голубой) (шкала бара: 400 мкм). (Ii) показывает увеличенный оптический участок, выявляющий скопление красных ядер вдоль GFP-экспрессирующих паразитов (шкала: 90 мкм). (iii) подтверждает повышенную клеточность путем конфокальной визуализации участков тканей одного и того же органа (шкала бара: 8 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Маркировка очищенных T. cruzi-инфицированных органов антителами и ядерными пятнами. (A) Протокол CUBIC для очистки тканей, 3D-иммуноокрашения и маркировки ДНК целых органов. (B) Маркировка сердца мыши для обнаружения сосудистой системы и ДНК (см. также Фильм 3). (i-iii) Мышь дикого типа была заражена 2 x 105 tdTomato-экспрессирующими паразитами. Мышь была усыплена через 40 дней после заражения, а сердце было рассечено, исправлено и очищено. Очищенное сердце было помечено ДНК-маркером и иммуноокрашено антителами против α-СМА. Возможно одновременное обнаружение клеточных ядер (синий), сосудистой системы (белый) и T. cruzi-инфицированных клеток (красный). Мышь была убита в это время после заражения, когда можно было оценить ремоделирование тканей и специальных сосудов (шкала: 400 мкм). (iv) показывает увеличенный объем из глубоких областей сердца (iii), изображающий ядра клеток, сосудистую систему и инфицированные клетки (шкала: 90 мкм). (v) изображает оптический срез, полученный из (iii) (шкала: 90 мкм). (C) Повышенная клеточность, визуализируемая маркировкой ДНК целых очищенных скелетных мышц. (i) Скелетная мышечная ткань из предыдущего эксперимента была окрашена ДНК, выявляя области с интенсивной ядерной маркировкой (синий), а также клетки, инфицированные T. cruzi (красный) (шкала: 200 мкм) (см. также Фильм 4). (ii) выявляет интенсивное накопление синих ядер в областях с более низким или нулевым обнаружением паразита tdTomato (шкала бара: 100 мкм). (iii) конфокальная визуализация с высоким увеличением (60x) идентифицирует ДНК-маркировку клеток и паразитов в срезах тканей (шкала: 10 мкм). (D) Усиление маркеров репортера паразитов tdTomato во всех очищенных скелетных мышцах. (i-iii) Интактные скелетные мышечные ткани мышей, инфицированных 2 x 105 паразитами, экспрессирующими tdTomato, были зафиксированы, очищены и иммуноокрашены антителами против RFP (RFP Booster). Интенсивный и равномерный флуоресцентный сигнал был получен в дальне-красном канале после усиления RFP (зеленый) сигнала tdTomato (красный) (шкала шкалы: 100 мкм). (E) Повышение маркеров репортеров паразитов GFP с использованием нанотел против GFP. (i-iii) Скелетные мышечные ткани мышей, инфицированных 2 x 105 паразитами, экспрессирующими GFP, были зафиксированы, очищены и иммуноокрашены конъюгированными нанотелами Alexa Fluor 647 против GFP (GFP Booster). Сильный флуоресцентный сигнал был получен в дальне-красном канале после усиления GFP (пурпурного) флуоресценции GFP (голубого). Мыши из (D) и (E) были убиты через 30 дней после заражения, потому что нагрузка паразитов достигает пика в этот момент времени, а инфицированные паразитами клетки могут быть легко обнаружены в скелетных мышцах (шкала: 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фильм 1: T. cruzi инфекция сердца и скелетных мышц у мышей с дефицитом IFN-гамма. 3D-реконструкции КУБИЧЕСКИ-осветленных тканей мышей с дефицитом IFN-гамма, коинфицированных 2 x 105 tdТомато-экспрессирующими колумбийскими (красными) и GFP-экспрессирующими бразильскими (синими) штаммами T. cruzi на 17-й день после заражения. В общей сложности 1151 отдельный срез сердца и 559 скелетных мышц были приобретены через LSFM. Сопоставимые результаты визуализации были достигнуты у трех независимых животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2: Обнаружение вербовки Т-клеток в зараженной T. cruzi cd8-репортерной мыши. 3D-визуализация осветленной КУБИЧЕСКИМИ мышцами скелетной мышцы от мыши-репортера CD8, инфицированной 2 x 105 Tdtomato-экспрессирующим штаммом Colombiana T. cruzi (красный) и убитой через 14 дней после заражения. В общей сложности 668 отдельных срезов скелетных мышц были сфотографированы LSFM. Были визуализированы ZsGreen1, экспрессирующие Т-клетки (синие), а также T. cruzi-инфицированные клетки (красные). Сопоставимые результаты визуализации были достигнуты у двух животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 3: Иммунодетекция сосудистой системы у T. cruzi-инфицированного и очищенного сердца. 3D-реконструкция CUBIC-осветленного сердца мышей дикого типа, инфицированных 2 x 105 tdTomato-экспрессирующим Colombiana T. cruzi и иммуноокрашенных антителами против α-SMA (синий) через 40 дней после заражения. Разрезание сердца выявляет сложную сосудистую систему сердца и проникновение в ткани антител α-СМА. Инфицированные паразитом клетки могут наблюдаться как ярко-красные пятна в предсердиях сердца (красные, справа). Сопоставимые результаты визуализации были достигнуты у двух животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 4:Окрашивание ДНК всего органа выявляет области с повышенной клеточностью. 3D-реконструкция CUBIC-осветленной скелетной мышцы мыши дикого типа через 40 дней после заражения штаммом 2 x 105 tdTomato-экспрессирующим штаммом Colombiana T. cruzi . Вся область четырехглавой мышцы была окрашена зеленым ядерным красителем. Были визуализированы T. cruzi-инфицированные клетки (красные) и ядра каждой клетки в ткани (синие). Увеличение 3D-реконструкции показывает накопление синих ядер вместе с областями с небольшим или нулевым обнаружением паразитов tdTomato. Сопоставимые результаты визуализации были достигнуты у двух животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный файл 1: Состав растворов для окрашивания антител, используемых в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Отсутствие обширной визуализации целых органов паразитов и иммунного ответа ограничивает понимание сложности взаимодействий хозяина и паразита и затрудняет оценку методов лечения болезни Шагаса. В настоящем исследовании был принят конвейер CUBIC для осветления и окрашивания неповрежденных органов и тканей мышей, инфицированных T. cruzi.
В этом исследовании были протестированы многочисленные протоколы очистки тканей (PACT32, ECi33, FLASH34, iDISCO11,26 и fDISCO13); однако только CUBIC сохранил высокие уровни флуоресценции паразитов tdTomato или GFP. Аналогичным образом, предыдущие отчеты показали сохранение CUBIC эндогенно выраженных маркеров по сравнению с другими подходами к очисткетканей 35.
Ограниченная емкость разрешения является одним из текущих предостережений обычной световой микроскопии. Это ясно видно по трудностям устранения отдельных паразитов в сильно инфицированных клетках (рисунок 2C). Недавно разработанные плиточные световые микроскопы с улучшенной разрешающей способностью и адаптацией методов расширения тканей могут решить эту проблему36.
Примеси из промывочных буферов, очищающих растворов или других органов могут выпадать в осадок в ткани, производя неспецифические сигналы, которые могут быть ошибочно приняты за инфицированные паразитами клетки, отдельных паразитов или другие структуры. Однако эти артефакты обычно ярко флуоресцируют в нескольких каналах, поэтому после анализа изображения их можно легко выбросить из автоматизированного подсчета путем визуализации тканей в альтернативном канале (обычно в зеленом канале). Двойные цветные объекты считались артефактами и исключались для автоматической количественной оценки.
Ядерные пятна DAPI, PI, RedDot2 и SYTOX-G обеспечивают хорошие уровни проникновения в ткани и интенсивности сигнала в большинстве очищенных КУБИЧЕСКИХ органов; тем не менее, зеленый краситель ДНК показал лучшую производительность (Рисунок 3B, C и Фильм 4).
Эти результаты показали, что клетки, инфицированные T. cruzi, могут быть легко обнаружены и точно количественно определены при одновременной идентификации сигналов Т-клеток или ядер мышей-репортеров. Самое главное, LSFM обнаружил редкие биологические события, такие как DiR-положительные спящие амастиготы, в сложной тканевой среде с потенциальной способностью расширять ее до иммуноокрашивания эпитопов и маркировки ДНК. Текущие исследования также изучают полезность этих подходов для мониторинга активации иммунных эффекторных клеток, взаимодействия между несколькими штаммами паразитов в одном и том же хозяине и индукции повреждения и восстановления тканей при болезни Шагаса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Эцуо Сусаки за ценную помощь и рекомендации относительно протоколов очистки тканей и иммуноокрашивания. Кроме того, мы благодарны М. Кандасами из CTEGD Biomedical Microscopy Core за техническую поддержку с использованием LSFM и конфокальной визуализации. Мы также благодарим всех членов Исследовательской группы Тарлтона за полезные предложения на протяжении всего этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
