Summary
O presente protocolo descreve microscopia fluorescente de folha de luz e métodos automatizados assistidos por software para visualizar e quantificar precisamente parasitas Trypanosoma cruzi e células T intactos e limpos. Essas técnicas fornecem uma maneira confiável de avaliar os resultados do tratamento e oferecem novas percepções sobre as interações parasita-host.
Abstract
A doença de Chagas é uma patologia negligenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente na América Latina. O agente da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é um parasita intracelular obrigatório com uma biologia diversificada que infecta várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causando patologias cardíacas e digestivas. A detecção confiável de infecções in vivo de T. cruzi há muito tempo é necessária para entender a biologia complexa da doença de Chagas e avaliar com precisão o resultado dos regimes de tratamento. O protocolo atual demonstra um pipeline integrado para quantificação automatizada de células infectadas por T. cruzi em órgãos limpos em 3D. A microscopia fluorescente de folha de luz permite visualizar e quantificar com precisão parasitas T. cruzi e células de efeito imunológico em órgãos ou tecidos inteiros. Além disso, o gasoduto CUBIC-HistoVision para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares foi adotado com sucesso. A limpeza tecidual aliada à imunostaining 3D fornece uma abordagem imparcial para avaliar de forma abrangente os protocolos de tratamento de drogas, melhorar a compreensão da organização celular dos tecidos infectados por T. cruzi, e espera-se que avancem descobertas relacionadas às respostas imunes anti-T. cruzi , danos teciduais e reparação na doença de Chagas.
Introduction
A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário T. cruzi, está entre as doenças tropicais mais negligenciadas do mundo, causando aproximadamente 13.000 mortes anuais. A infecção muitas vezes progride de um estágio agudo para um estágio crônico produzindo patologia cardíaca em 30% dos pacientes, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita 1,2. Apesar da forte resposta imune hospedeira provocada contra o parasita durante a fase aguda, o baixo número de parasitas cronicamente persiste ao longo da vida do hospedeiro em tecidos como o coração e o músculo esquelético. Vários fatores, incluindo o início atrasado das respostas imunes adaptativas e a presença de formas não replicantes do parasita, podem contribuir para a capacidade de T. cruzi para evitar uma eliminação completa pelo sistema imunológico 3,4,5,6. Além disso, as formas dormentes não replicadas do parasita apresentam baixa suscetibilidade aos fármacos trypanocidas e podem, em parte, ser responsáveis pela falha de tratamento observada em muitos casos 7,8.
O desenvolvimento de novas técnicas de imagem proporciona uma oportunidade de obter uma visão sobre a distribuição espacial dos parasitas nos tecidos infectados e sua relação com as células imunes envolvidas em seu controle. Essas características são cruciais para uma melhor compreensão dos processos de controle de parasitas pelo sistema imunológico e rastreamento dos raros parasitas dormentes presentes nos tecidos crônicos.
A microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) é um dos métodos mais abrangentes e imparcial para imagens 3D de grandes tecidos ou órgãos sem secção fina. Microscópios de folha de luz utilizam uma fina folha de luz para apenas excitar os fluoroforos no plano focal, reduzir o fotobleaching e a fototoxicidade das amostras, e gravar imagens de milhares de camadas de tecido usando câmeras ultrarrápidas. O alto nível de transparência tecidual necessário para a penetração adequada da luz laser nos tecidos é obtido pela homogeneização do índice de refração (RI) após a delipidação e descoloração do tecido, o que reduz a dispersão da luz e torna imagens de alta qualidade 9,10,11.
Abordagens de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para a imagem de camundongos inteiros 12,13,14, organoides 15,16,17, órgãos expressando marcadores fluorescentes repórteres 18,19,20,21,22,23, e recentemente um número limitado de tecidos humanos24 . Os métodos atuais de limpeza tecidual são classificados em três famílias: (1) métodos orgânicos à base de solventes, como os protocolos DISCO 25,26, (2) métodos à base de hidrogel, como CLARITY27, e métodos aquosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis)18,19,28,29 . Os protocolos CÚBICOS mantêm a forma dos órgãos e a integridade dos tecidos, preservando a fluorescência das proteínas de repórteres expressas endógenamente. A atualização mais recente desta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), também permite a detecção de epítopos usando anticorpos fluorescentes e rotulagem de DNA28.
No presente protocolo, utilizou-se o pipeline CUBIC para detecção de T. cruzi expressando proteínas fluorescentes em tecidos de camundongos intactos esclarecidos. Os tecidos opticamente transparentes foram imagens LSFM, reconstruídas em 3D, e o número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes dormentes e células T por órgão foram automaticamente quantificados. Além disso, este protocolo foi adotado com sucesso para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares. Essas abordagens são essenciais para a compreensão da expansão e controle de T. cruzi em hospedeiros infectados e são úteis para avaliar plenamente a quimioterapia e a imunoterapia para a doença de Chagas.
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Protocol
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com a Política de Serviços Públicos de Saúde sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e Associação para Avaliação e Acreditação das Diretrizes de Credenciamento de Cuidados Com Animais Laboratoriais. O Protocolo de Uso animal (controle da infecção por T. cruzi em camundongos-A2021 04-011-Y1-A0) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia. O B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Osortm14(CAG-tdTomato)Hze/J e C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (fêmea, 1-2 meses) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Infecção, perfusão e dissecção
- Infectar camundongos intraperitonealmente com tripolas derivados da cultura tecidual da Colombiana (DTU TcI) ou do Brasil (DTU TcV) T. cruzi que expressam proteínas fluorescentes tdTomato ou GFP, respectivamente. A dose de infecção pode variar de 50.000 a 200.000 trypomastigotes diluídos em 100 μL de 1x Salina Tamponada com Fosfato (PBS).
NOTA: Detalhes específicos sobre a geração de parasitas repórteres e modelos de infecção de camundongos estão disponíveis em Canavaci et al. 29 e Bustamante et al.30. - Eutanize os camundongos por inalação de dióxido de carbono a uma taxa de fluxo de 3-7 L/min. Assim que os animais pararem de mostrar qualquer reflexo do pedal, faça uma incisão longitudinal através da pele do abdômen em direção ao esterno. Em seguida, corte a parede do corpo do abdômen e continue através das costelas de cada lado do tórax até que o esterno possa ser levantado, expondo o coração.
- Como descrito na Figura 1, faça uma incisão de 2,5 mm no aurículo direito do coração e colete o sangue drenante usando uma ponta de micropipette de 1 mL.
- Insira uma agulha borboleta (conectada a uma extremidade do sistema de perfusão) no ápice do ventrículo esquerdo até atingir a aorta ascendente. Use cola à base de gel (ver Tabela de Materiais) para selar o orifício de entrada ao redor da agulha e manter a agulha em posição durante as perfusões.
- Perfunda os camundongos30 com 50 mL de Heparin-PBS frio (pH 7.4, 10 U/mL de Heparina) ou até que o fluido que sai do rato em direção à bandeja de coleta esteja livre de sangue.
- Perfuse com 50 mL de frio 4% (w/v) paraformaldeído (PFA) (pH 7.4) em PBS.
NOTA: A fixação do tecido PFA é provavelmente uma das etapas críticas do protocolo, especialmente para a manutenção de estruturas de epítope e imunodetação subsequente. A PFA degrada-se com o tempo, por isso deve estar preparada recentemente. O pH da solução também é importante para evitar a super fixação, o que pode levar à má limpeza dos tecidos.
ATENÇÃO: O PFA é moderadamente tóxico pelo contato com a pele. A exposição aguda também é altamente irritante para o nariz, olhos e garganta. A exposição a longo prazo a baixos níveis no ar ou na pele pode causar irritação na pele, como dermatite e coceira, e problemas respiratórios semelhantes à asma. Use proteção facial e ocular e não respire poeira, gás, névoa, vapores ou vapores.- Seguindo a perfusão pfa, perfusam o mouse com 100 mL de buffer CUBIC-P para atingir os níveis de esclarecimento mencionados na etapa 1.5.
- Para preparar o buffer CUBIC-P, dissolva 10% N-butildiethanolamina, 5% Triton X-100 e 5% 1-N-Metilimidazole em água duplamente destilada ou use os coquetéis comerciais (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Passos 1.6.1.-1.6.2. são recomendados apenas para órgãos altamente pigmentados, como coração e rim, uma vez que requerem uma etapa de pré-compensação para obter níveis aumentados de transparência. Após o uso do CUBIC-P, disseca os órgãos e proceda diretamente à etapa 2: Limpeza tecidual.
- Disseca as amostras/órgãos de tecido30 a serem imagens e depois corrigi-las em 4% (w/v) PFA em PBS (~10 mL/órgão inteiro) durante a noite (ON) a 4 °C com agitação suave (não mais que 5 x g) em tubos cônicos de 50 mL.
NOTA: Todas as incubações do futuro devem ser realizadas em tubos que estejam horizontalmente a 20-30 °C protegidos da luz. - Lave a amostra em 10 mL de PBS (suplementada com azida de sódio de 0,05% (NaN3) por 3h (três vezes) à temperatura ambiente (RT) com agitação suave (5 x g).
NOTA: Os tecidos podem ser congelados incubando em 10 mL de 30% de sacarose em PBS com agitação suave (5 x g) a 4 °C ON em tubos cônicos de 50 mL. Depois que os tecidos afundarem na parte inferior do tubo, incorpore-os no composto OCT e mantenha-os a -80 °C. Descongele no RT até que o composto OCT derreta completamente, depois lave em PBS (~10 mL/órgão inteiro) ON a 4 °C com agitação suave (5 x g) em tubos cônicos de 50 mL. Prossiga para a etapa 2.
2. Limpeza de tecidos
NOTA: Todas as clareiras de tecido realizadas neste trabalho foram feitas utilizando o protocolo CUBIC I22. Foram utilizados três coquetéis diferentes: CUBIC-P para delipidação e descoloração rápida durante perfusões, CUBIC-L para delipidação e descoloração, e CUBIC-R para correspondência de RI. A coloração de DNA e as imunossagens foram realizadas utilizando-se kit de coloração nuclear CUBIC-HV 1 3D e kit de imunostaining CUBIC-HV 1 3D, respectivamente (ver Tabela de Materiais).
- Mergulhe órgãos individuais em 10 mL de 50% cubic-l diluído pela água (ver Tabela de Materiais) com agitação suave (5 x g) em RT (ON) em tubos cônicos de 50 mL. Mantenha os tubos lisos na placa de agitação.
NOTA: Para evitar danos teciduais, os órgãos são mantidos no mesmo tubo, e as soluções são coletadas usando um sistema de vácuo. Para preparar o CUBIC-L, dissolva 10% de N-butyldiethanolamina e 10% Triton X-100 em água duplamente destilada usando os coquetéis comerciais (ver Tabela de Materiais).
ATENÇÃO: O CUBIC-L causa sérios danos oculares. Use proteção de olhos e rostos. Descarte em uma usina de disposição aprovada. - Mergulhe a amostra em 10 mL de 100% CUBIC-L por 6 dias (refrescando a solução no dia 3).
NOTA: Ao final deste período de incubação, os tecidos devem ser quase completamente transparentes. - Lave os órgãos transparentes com PBS (suplementado com 0,05% NaN3) por 2h (três vezes) a 37 °C com agitação suave (5 x g). Transfira os tecidos para um novo tubo cônico de 50 mL a cada lavagem para remover Triton X-100.
NOTA: Conforme descrito na Figura 2B, se o objetivo do experimento é visualizar proteínas repórteres endógenas de parasitas ou camundongos transgênicos T. cruzi (Figura 2C-F), pule as etapas 3, 4 e 5 e continue diretamente ao passo 6.
3. Coloração de DNA
- Diluir o corante nucleico ácido comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em 5 mL de tampão de coloração (incluído no kit) a 1/2.500 diluição.
- Mergulhe o tecido na solução de corante nuclear e incubar a 37 °C com rotação suave por 5 dias usando tubos cônicos de 15 mL em posição de pé.
- Lave com 15 mL de tampão de lavagem de manchas nucleares 3D (incluído no kit) por 2 h (três vezes) no RT com agitação suave (5 x g).
NOTA: Outros corantes de DNA podem ser usados nessas concentrações e tempos de incubação: DAPI (incluído no kit): 1/200, 5 dias de incubação; BOBO-1: 1/400, 5 dias de incubação; Iodeto de propidium (PI) (incluído no kit): 1/100, incubação de 3 dias; RedDot2: 1/250, 3 dias de incubação. Se o objetivo específico do experimento é visualizar tanto proteínas repórteres endógenas expressas quanto usar manchas nucleares, pule as etapas 4 e 5 e continue diretamente ao passo 6.
4. Digestão da matriz extracelular (ECM)
NOTA: A digestão de Hialuronidase do ECM deve ser realizada para facilitar a penetração adequada dos anticorpos em regiões profundas dos tecidos28.
- Mergulhe órgãos individuais em 15 mL de tampão de reação de hialuronidase por 2 h a 37 °C em um tubo cônico de 50 mL em posição plana protegido da luz.
NOTA: Para preparar o tampão de reação de hialuronidase, dissolva 10 mM de CAPSO; 150 mM de Cloreto de Sódio (NaCl) e 0,05% de NaN3 (ver Tabela de Materiais) em água duplamente destilada e ajuste pH para 10. - Prepare a Solução enzimática misturando 75 μL de 20 mg/mL de estoque de hialuronidase em 425 μL de tampão de reação de hialuronidase. Para preparar 20 mg/mL de estoque de hialuronidase, dissolva a hialuronidase em 50 mM de tampão de carbonato, 150 mM de NaCl, 0,01% de BSA e 0,05% de NaN3 (ver Tabela de Materiais). Ajuste o pH para 10 e aliquot em volumes de 77 μL a -30 °C.
- Descarte o tampão de reação de hialuronidase usando uma pipeta e mergulhe o órgão na Solução enzima (500 μL em um tubo cônico de 15 mL) em posição de pé protegida da luz por 24 h a 37 °C com agitação suave (5 x g).
- Lave a amostra em 15 mL de tampão de lavagem de hialuronidase em um tubo cônico de 50 mL em posição horizontal protegida da luz por 2h (três vezes) a 37 °C com agitação suave (5 x g).
- Para preparar o tampão de lavagem de hialuronidase, dissolva 50 mM de tampão de carbonato, 150 mM de NaCl, 0,1% (v/v) de Triton X-100, 5% (v/v) de Metanol e 0,05% NaN3. Ajuste pH para 10. Para preparar 10x calção carbonato-NaCl, dissolva 2,96 g de Carbonato de Sódio, 1,86 g de Carbonato de Hidrogênio de Sódio e 8,77 g de NaCl em 100 mL de água dupla destilada com 0,05% NaN3 (ver Tabela de Materiais) e ajuste pH para 10.
5. Imunostaining
- Rotular vasculatura usando anticorpos anti-α-SMA (alfa-pequeno actin muscular, ver Tabela de Materiais) seguindo os passos abaixo.
- Gerar complexo de anticorpos secundários de fragmentos fab primários mais conjugados. Inicie esta reação 1,5 h antes do procedimento de coloração.
- Calcule a quantidade necessária de anticorpos primários e secundários (misture a uma razão de 1:0,5 por peso).
NOTA: Para o anticorpo primário anti-α-SMA, 3,5 μg são necessários para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 2,5 mg/mL, é necessário 3,5/2,5 = 1,4 μL de solução de anticorpos. Para o anticorpo secundário AlexaFluor 647 fragmento fab anti-mouse, 1,75 μg é necessário para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 1,7 mg/mL, é necessário 1,75/1,7 = 1 μL de solução de anticorpos. - Misture anticorpos primários e secundários em um tubo âmbar de 2 mL e incubar por 1,5 h a 37 °C.
- Calcule a quantidade necessária de anticorpos primários e secundários (misture a uma razão de 1:0,5 por peso).
- Para troca de tampão, misture 7,5 mL de tampão de imunostaining 2x HV1 3D (incluído no kit, veja Tabela de Materiais) com 7,5 mL de água dupla destilada e mergulhe a amostra de tecido por 1,5 h a 32 °C com agitação suave (5 x g) em um tubo cônico de 15 mL em posição horizontal. Inicie essa reação simultaneamente como a geração de anticorpos complexos (1,5 h antes do procedimento de imunossuagem).
- Gerar complexo de anticorpos secundários de fragmentos fab primários mais conjugados. Inicie esta reação 1,5 h antes do procedimento de coloração.
- Realize a imunostaining 3D seguindo as etapas abaixo.
- Em um tubo cônico de 15 mL, prepare a solução de coloração de anticorpos seguindo o Arquivo Suplementar 1.
- Colete a amostra de tecido da mídia de troca de buffer (passo 5.1.2) e mergulhe-a na solução de coloração de anticorpos. Incubar tecidos individualmente durante 1 semana a 32 °C com agitação suave (5 x g) dos tubos em posição de pé protegida da luz. Sele o tubo com filme de parafina para evitar a evaporação.
- Mova-se para 4 °C e incubar ON em posição de pé.
- Cool 1x HV1 3D imunostaining wash buffer (incluído no kit, ver Tabela de Materiais) a 4 °C e lavar a amostra com 15 mL tampão (duas vezes) por 30 min cada a 4 °C com agitação suave (5 x g). Mantenha tubos cônicos de 15 mL em posição horizontal até o passo 5.2.7.
- Diluir a formalina para 1% em 1x HV1 3D imunostaining wash buffer e imergir a amostra em 8 mL da solução por 24 h a 4 °C com agitação suave (5 x g).
- Incubar em solução fresca de 1% de formalina por 1h a 37 °C com agitação suave (5 x g).
- Lave em 15 mL de PBS por 2h a 25 °C com agitação suave (5 x g).
- Boost tdTomato sinal usando anticorpos anti-Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) seguindo as etapas abaixo.
- Siga os mesmos tempos de incubação e temperaturas da etapa 5.2.2. Calcule a quantidade de anticorpos primários e secundários (ver Tabela de Materiais) e misture-os a uma razão de 1:0,5 por peso.
NOTA: Para o anticorpo primário anti-RFP, 5 μg é necessário para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 1,25 mg/mL, é necessário 5/1,25 = 4 μL da solução. Para o anticorpo secundário Alexa Fluor 647 fragmento fab anti-coelho, 2,5 μg é necessário para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 1,5 mg/mL, é necessário 2,5/1,5 = 1,7 μL da solução. - Prepare a solução de coloração de anticorpos conforme mencionado no Arquivo Complementar 1.
- Siga os mesmos tempos de incubação e temperaturas da etapa 5.2.2. Calcule a quantidade de anticorpos primários e secundários (ver Tabela de Materiais) e misture-os a uma razão de 1:0,5 por peso.
- Aumente os sinais GFP usando nanomá corpos anti-GFP seguindo as etapas abaixo.
- Siga os mesmos tempos de incubação e temperaturas mencionados na etapa 5.2.2.
NOTA: Os nanocorpos anti-GFP (ver Tabela de Materiais) são conjugados com Alexa Fluor 647, de modo que a geração complexa de anticorpos é desnecessária. - Prepare a solução de coloração de anticorpos conforme mencionado no Arquivo Complementar 1.
- Siga os mesmos tempos de incubação e temperaturas mencionados na etapa 5.2.2.
6. Correspondência ri
- Mergulhe órgãos transparentes em 5 mL de solução CUBIC-R+ diluída em água de 50% (ver Tabela de Materiais) em RT (ON) com agitação suave (5 x g) em um tubo cônico de 50 mL. Mantenha os tubos em posição de pé durante toda a etapa de correspondência do RI.
NOTA: As soluções CCS recicladas de experimentos anteriores podem ser reutilizadas (até quatro vezes) nesta etapa. Para preparar a solução CUBIC-R+, dissolva 45% de 2,3-Dimethyl-1-fenil-5-pyrazolona (Antipirina), 30% de Nicotinamida ou N-Metilnicotinamida, e 0,5% de N-butildiethanolamina em água duplamente destilada ou usar o tampão CUBIC-R+ comercial (ver Tabela de Materiais).
ATENÇÃO: CUBIC-R+ causa irritação na pele, irritação grave dos olhos e danos aos órgãos. Use luvas de proteção e garanta proteção dos olhos e rostos. Não respire poeira, vapores, gás, névoa ou vapores. Descarte em uma usina de disposição aprovada. - Substitua 50% CUBIC-R+ por 5 mL de 100% CUBIC-R+ e incubar com agitação suave (5 x g) em RT por 2 dias. Em seguida, transfira os tecidos para uma pilha de lenços sem fiapos e gire cuidadosamente os tecidos para remover a solução CUBIC-R+ das superfícies do órgão por 5 minutos.
7. Montagem
- Depois de secar os tecidos, transfira-os para 5 mL de Solução de Montagem (RI = 1.520) (ver Tabela de Materiais) em uma placa de cultura celular de seis poços e incuba-os (ON) na RT. Frequentemente gire os tecidos para eliminar bolhas de ar, especialmente nas superfícies dos órgãos.
NOTA: Os órgãos podem ser armazenados por mais de 6 meses em Solução de Montagem ou CUBIC-R+. - Adere os tecidos ao suporte da amostra de microscópio usando cola de gel à base de cianoacrilato.
- Mergulhe as amostras no microscópio de quartzo cuvette preenchido com 120 mL de Solução de Montagem e imagem-as transversalmente ao seu eixo longitudinal. Adere ao coração com o ápice e a aorta alinhada horizontalmente.
NOTA: Os órgãos limpos e montados podem ser seccionados com um vibratome e imageados em alta ampliação por microscopia confocal. Incorporar os órgãos em 2% de agarose e cortar seções de 100-500 μm. Os órgãos também podem ser seccionados manualmente com uma lâmina afiada para produzir seções de tecido grosso (>1000 μm). Após a secção, coloque as fatias em pratos petri de 35 mm, monte usando a mesma solução de montagem, vedação com esmalte e imagem com um microscópio confocal.
8. Aquisição de imagens
- Imagem as amostras montadas com um microscópio de folha de luz (ver Tabela de Materiais). Defina a ampliação e o tamanho do passo entre as fatias individuais até 3 μm, e use lasers de folha de luz direita e esquerda com espessuras de 5 μm e 100% de largura. Ajuste o tempo de exposição constante em 50-100 ms, e ajuste a potência do laser de 10% a 80% dependendo da intensidade do sinal de fluorescência.
- Para a co-detecção de parasitas que expressam tdTomato e amastigotes dormentes manchados de DIR (Figura 2C), use canais vermelhos (Ex/Em 561/620-660 nm) e infra-vermelhos (Ex/Em 785/845-55 nm), respectivamente. Para a co-detecção de células T e parasitas que expressam tdTomato no mouse repórter CD8 (Figura 2D), use verde (Ex/Em 488/525-50 nm) e canal vermelho, respectivamente.
- Para os ensaios coinfecções (Figura 2E), bem como para a co-detecção de parasitas que expressam GFP em camundongos repórteres de núcleos (Figura 2F), use os canais verde e vermelho, respectivamente. Para a detecção de parasitas que expressam tdTomato, corante nuclear e vasculatura cardíaca (Figura 3B,C), utilize os canais vermelho, verde e vermelho (Ex/Em 640/680-730 nm), respectivamente.
- Detecte anticorpos anti-RFP com os nanomutos de canal vermelho e anti-GFP usando o canal verde (Figura 3D).
- Converta as pilhas de imagens TIFF adquiridas e reconstrua os órgãos usando o software Imaris v9.7.2 (ver Tabela de Materiais).
9. Reconstrução de superfície e quantificação com software Imaris
- Selecione a ferramenta de algoritmo de detecção de superfícies e inicie o assistente no software de análise de imagens.
- Realize uma análise inicial em uma região de interesse 3D (selecionada aleatoriamente) e, em seguida, aplique-a a toda a reconstrução de órgãos 3D. Depois de escolher uma região de interesse (ROI), selecione o canal a ser analisado, desmarque o botão liso e selecione subtração de fundo.
NOTA: A subtração de fundo calcula um valor de fundo local único para cada voxel e subtrai isso do valor original do pixel. O diâmetro da maior esfera que se encaixa no objeto deve ser de até 200 μm para células infectadas por T. cruzi, 10 μm para células T e 5 μm para parasitas individuais. - Use o histograma para ajustar a classificação e a lista de queda do filtro para selecionar as medidas para classificação.
NOTA: Use o histograma para ajustar a classificação: elíptica (oblado) e medidas de esfericidade são recomendadas. - Finalize o assistente, pressione o botão de estatística e recupere o número total de células infectadas por parasitas ou células T como o número de componentes desconectados por ponto de tempo.
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Representative Results
Os tecidos fixos cúbicos foram lavados com PBS para remover fixativos e, em seguida, incubados com coquetéis CUBIC-L, uma solução básica tamponada de aminocos que extraem pigmentos e lipídios do tecido resultando em descoloração do tecido, mantendo a arquitetura tecidual. As linhas de grade no papel podem ser vistas através dos tecidos indicando uma limpeza adequada dos órgãos (Figura 2A). Após a delipidação, os tecidos foram lavados e imersos em CUBIC-R+ e solução de montagem para homogeneização e imagem de RI, respectivamente (Figura 2B).
Um rato de tipo selvagem foi infectado com tripolas que expressam tdTomato pré-manchados com o corante de cianeina quase infravermelho DiR. O rato foi eutanizado 15 dias após a infecção, e o coração intacto foi dissecado, fixo e limpo. A imagem LSFM e a reconstrução 3D nos permitiram visualizar os parasitas T. cruzi que expressam tdTomato (vermelho). Os níveis de autofluorescência no canal vermelho podem ser usados para a visualização correta da estrutura cardíaca e das bordas (Figura 2C i). A LSFM também foi útil para identificar formas dormentes resistentes a medicamentos 7,8. A coloração pré-infecção de parasitas com corante DiR permite o rastreamento de parasitas adormecidos visualizando os parasitas que não haviam diluído o corante através da replicação, como relatado anteriormente para CellTrace Violet7.
Parasitas dormentes (ciano) podem ser identificados no coração como descritos nos insets ampliados em 3D (setas amarelas) (Figura 2C ii,iii). A fluorescência de projeção Z foi segmentada automaticamente para gerar um modelo de superfície 3D reconstruído para visualização espacial e quantificação do número total de células infectadas por T. cruzi e parasitas dormentes durante toda a reconstrução 3D (Figura 2A). A análise do modelo de superfície 3D revelou 186 células infectadas por T. cruzi com maior proporção de células infectadas no átrio cardíaco (123) em comparação com ventrículos (63) e 18 parasitas dormentes em todo o coração (Figura 2C i). Em um relatório anterior, um oleoduto semelhante para monitorar o número de células infectadas por T. cruzi e parasitas dormentes em tecidos de camundongos esclarecidos após o tratamento medicamentoso foi relatado31. É importante notar que as estimativas para o número de parasitas adormecidos são provavelmente uma subcontagem, pois a técnica de diluição de corante permite a detecção apenas de parasitas que não se replicaram significativamente desde a infecção inicial, mas não detectam aqueles que ficaram dormentes mais tarde na infecção após várias rodadas de divisão.
Uma abordagem semelhante foi utilizada para monitorar a interação entre diferentes cepas de T. cruzi em camundongos deficientes de interferon (IFN)-gama. A produção de IFN-gama por células T effector é essencial para o controle imunológico de T. cruzi. Em camundongos deficientes ifn-gama, os parasitas proliferam com restrição imunológica mínima, produzindo um número muito alto de células infectadas em órgãos. Esses modelos imunodeficientes são ferramentas úteis para estudar a eficácia de novos fármacos sem a restrição imposta pelo reconhecimento imunológico e, assim, permitem a detecção de recaída de parasita após o tratamento. Os camundongos deficientes ifn-gama foram cunhados com cepas de colombiana (vermelha) e gfp-expressando brasil (azul) t. cruzi. Os camundongos foram eutanizados 17 dias após a infecção, e os corações intactos foram dissecados, fixos e limpos. Neste modelo imunodeficente, as células hospedeiras infectadas com ambas as cepas de T. cruzi podem ser observadas em vários estágios do desenvolvimento de parasitas, incluindo grandes, médias e pequenas células infectadas e recentemente estouradas. O corte através dos tecidos mostra abundantes células infectadas por parasitas no coração atria em várias profundidades teciduais (Figura 2E i-iii e Filme 1).
Uma cruz de C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J e B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, em que todas as células T expressam a proteína fluorescente verde ZsGreen1, foram usadas para monitorar o recrutamento de células T em tecidos infectados por T. cruzi . Os camundongos foram eutanizados 14 dias após a infecção com parasitas que expressam tdTomato, e o músculo esquelético foi extirpado, limpo e imageado pela LSFM. Células T expressas ZsGreen1 (azul) e T. cruzi-infectadas (vermelhas) foram detectadas robustamente (Figura 2D i e Filme 2). zoom-ins 3D da reconstrução 3D identificou células T na região de uma célula infectada (Figura 2D ii). Seções de espessura vibratome (200-500 μm) do mesmo tecido permitem visualizar a interface das células T e hospedeiras de células infectadas por microscopia confocal (Figura 2D iii).
Uma maneira alternativa de monitorar focos de inflamação é baseada no acúmulo de núcleos celulares em torno de células infectadas por T. cruzi. Um rato repórter em que todos os núcleos celulares expressam a proteína fluorescente tdTomato foi usado para este fim. A expressão tdTomato nuclear (vermelho) foi facilmente detectada nos tecidos após o processo de limpeza. Um rato repórter nuclear foi infectado com parasitas T. cruzi expressos em GFP (ciano), e 35 dias após a infecção, foi eutanizado, e os músculos esqueléticos foram extirpados, limpos e imagens por LSFM (Figura 2F i-iii). Seções ópticas ampliadas do músculo esquelético revelam aumento da celularidade acumulando núcleos vermelhos ao longo de parasitas que expressam GFP (Figura 2F ii). As seções vibratome do mesmo tecido confirmam o acúmulo anteriormente descrito de núcleos vermelhos ao longo de parasitas expressos de GFP por microscopia confocal (Figura 2F iii).
O protocolo CUBIC também foi adaptado para a imunossuagem e rotulagem de DNA de órgãos e tecidos intactos e limpos infectados com T. cruzi (Figura 3A). Os camundongos foram eutanizados 40 dias após a infecção com parasitas que expressam tdTomato, e os corações foram dissecados, fixos e limpos. O coração limpo intacto foi lavado e manchado por 5 dias com um marcador de DNA verde, depois lavado novamente e imunossuado por 7 dias com anticorpos contra α-SMA. As amostras foram pós-fixadas, lavadas, RI combinadas e imagens com LSFM. A detecção simultânea de múltiplos sinais fluorescentes, incluindo núcleos, vasculatura e células infectadas por T. cruzi, foi possível seguindo este protocolo. α-SMA imunostaining (branco) apresentou altos níveis de sinal revelando a vasculatura intrincada do coração (Figura 3B ii e Filme 3). Uma seção óptica de regiões cardíacas mais profundas retrata a penetração tecidual de anticorpos α-SMA nas condições estabelecidas (Figura 3B v). A coloração de DNA (azul) também apresentou boa penetração tecidual, níveis de fluorescência e coloração volumosa estável. Algumas áreas com rotulagem intensa de DNA foram identificadas em diferentes locais cardíacos (Figura 3B i) e em torno de fibras musculares esqueléticas (Figura 3C i e Filme 4). Uma imagem ampliada do músculo esquelético mostrou um acúmulo de núcleos azuis em áreas com poucos ou indetectáveis parasitas tdTomato, sugerindo o recrutamento de células imunes em locais de infecção atual ou anterior de T. cruzi (Figura 3C ii). Em outros casos, as células hospedeiras infectadas tinham pouca ou nenhuma evidência de infiltrados celulares próximos (setas brancas) (Figura 3C i). Seções vibratome do mesmo tecido da Figura 3C ii mostram a coloração de DNA das células e parasitas que expressam tdTomato por microscopia confocal (Figura 3C iii).
Experimentos anteriores mostraram que parasitas dormentes apresentaram expressão baixa ou insignificante de proteínas tdTomato ou repórter GFP (Figura 2C ii e iii). Para melhorar a detecção dessas proteínas fluorescentes, os tecidos limpos foram imunossuados com anticorpos anti-RFP ou -GFP. Tecidos musculares esqueléticos intactos de camundongos infectados com parasitas expressando tdTomato ou GFP foram fixados, esclarecidos e imunossuídos com anticorpos contra RFP (RFP Booster) (Figura 3D) ou nanomutos contra GFP conjugados com Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Figura 3E), respectivamente. As amostras foram pós-fixadas, lavadas, RI combinadas e imagens com LSFM. Em ambos os casos, o aumento dos sinais GFP e tdTomato pelos anticorpos resultou em forte fluorescência (Figura 3D ii e 3E ii). As imunossagens que utilizam anticorpos estimulantes representam uma ferramenta versátil que será usada para detectar dormitórios T. cruzi em órgãos e tecidos inteiros esclarecidos e detectar qualquer sinal sub-representado das proteínas repórteres da RFP ou do membro da família GFP.
Figura 1: Inserção da agulha durante a perfusão transcardíaca. (A) Uma representação esquemática mostrando os passos realizados antes de perfumar o mouse através do coração e a posição e direção corretas da agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Foi realizada uma pequena incisão no átrio direito, e foi coletada drenagem de sangue (1); uma agulha borboleta foi inserida no ápice do coração. Mantenha a direção para que a agulha não perfure o septo (2). O orifício de entrada ao redor da agulha foi selado usando cola à base de gel (3). O fígado está cheio de sangue e aparece vermelho antes da perfusão; no entanto, após a perfusão, ele perde a pigmentação e fica pálido. RA, auricle direito; LA, auricle esquerdo; RV, ventrículo direito; LV, ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visualização de células infectadas por T. cruzi, amastigotes dormentes e focos de inflamação em órgãos limpos. (A) Esquema de órgãos inteiros T. cruzi-detecção de células infectadas usando limpeza de tecido, imagem LSFM e quantificação assistida por software em modelos de superfície 3D. (eu) Imagens de campo brilhante do coração e músculo esquelético antes (esquerda) e depois (direita) limpando (barra de escala: 1000 μm). (Ii) Microscópio de fluorescência de folha de luz. (Iii) IFN-gama-deficiente o camundongo foi infectado com 2 x 105 tdTomato-expressando tripolas. Aos 17 dias após a infecção, o coração foi dissecado, o CUBIC limpo e a imagem LSFM (barra de escala: 500 μm). (Iv) A fluorescência de projeção Z foi segmentada automaticamente para gerar um modelo de superfície 3D reconstruído para visualização espacial e quantificação do número de T. cruzi- células infectadas. Um total de 736 T. cruzi-células infectadas foram detectadas em todo o coração (barra de escala: 500 μm). (v) mostra ampliações do volume indicado em (Iv), onde os objetos cianos representam T. cruzi-células infectadas (barra de escala: 50 μm). (B) Protocolo de limpeza de órgãos integrais cubic. (C) Visualização de proliferação e dormente T. cruzi parasitas em coração de rato transparente. (eu) Um rato selvagem foi infectado com 2 x 105 tripoladores de expressão tdTomato manchados com um corante de cianeina quase infravermelho. O coração foi dissecado, limpo e LSFM imagem. tdTomato-expressa proliferando (vermelho) e dormente (ciano) T. cruzi parasitas podem ser identificados. Os níveis de autofluorescência foram mantidos para permitir a visualização correta da estrutura cardíaca. Um rato foi morto 15 dias após a infecção com base no pico de células infectadas por parasitas e amastigotes dormentes encontrados em trabalhos anteriores (barra de escala: 400 μm). (Ii) e (iii) mostrar ampliações do volume indicado em (eu), onde setas amarelas indicam parasitas dormentes (ciano) (barra de escala: 200 μm). (D) Detecção de recrutamento de células T no mouse repórter CD8 infectado. (eu) Mouse repórter foi infectado com 2 x 105 Tripolas de expressão tdTomato, e músculo esquelético foi dissecado, limpo, e LSFM imagem 14 dias após a infecção, um ponto de tempo em que respostas celulares substanciais são detectadas. ZsGreen1 expressando células T (azul) bem como T. cruzi-células infectadas (vermelhas) foram visualizadas (barra de escala: 400 μm) (veja também Filme 2). (Ii) mostra ampliações do volume indicado em (eu) (barra de escala: 50 μm). (Iii) retrata o acúmulo de células T em torno de um T. cruzi-célula infectada em uma seção de tecido (200 μm) do mesmo órgão (barra de escala: 8 μm). (E) Interação entre diferentes T. cruzi Cepas. (eu) Camundongos deficientes IFN-gama foram cunhados com 2 x 105 tdTomato-expressando colombiano (vermelho) e GFP expressando Brasil (azul) T. cruzi Cepas. Os camundongos foram eutanizados, e os corações intactos foram dissecados, fixados e limpos aos 17 dias após a infecção (barra de escala: 400 μm). (Ii) mostra ampliações do volume indicado em (eu) (barra de escala: 250 μm). (Iii) mostra uma seção óptica ampliada revelando células infectadas com colombiana (vermelho) e Brasil (azul) T. cruzi cepas (barra de escala: 150 μm). (F) Visualização da celularidade ao longo de células infectadas usando o rato repórter de núcleos. (eu) Um rato repórter nuclear foi infectado com 2 x 105 Tripulações de expressão de GFP, e músculo esquelético foi dissecado, limpo e LSFM imageado a 35 dias após a infecção. Foram detectadas expressões nucleares de tdTomato das células hospedeiras (vermelhas), bem como expressão de parasita GFP (ciano), (barra de escala: 400 μm). (Ii) mostra uma seção óptica ampliada revelando o acúmulo de núcleos vermelhos ao longo de parasitas expressos de GFP (barra de escala: 90 μm). (Iii) confirma o aumento da celularidade por imagem confocal de seções teciduais do mesmo órgão (barra de escala: 8 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Rotulagem de órgãos infectados por T. cruzi com anticorpos e manchas nucleares. (A) Protocolo CÚBICO para limpeza de tecidos, imunossustaining 3D e rotulagem de DNA de órgãos inteiros. (B) Rotulagem de coração de rato para vasculatura e detecção de DNA (ver também Filme 3). (i-iii) Um rato selvagem foi infectado com parasitas expressantes de 2 x 105 tdTomato. O rato foi eutanizado 40 dias após a infecção, e o coração foi dissecado, fixo e limpo. O coração limpo foi rotulado com um marcador de DNA e imunossuado com anticorpos contra α-SMA. Foi possível a detecção simultânea de núcleos celulares (azul), vasculatura (branco) e T. cruzi-infectado (vermelho). O rato foi morto neste momento pós-infecção quando a remodelação de tecido e vasculatura especial pode ser avaliada (barra de escala: 400 μm). (iv) mostra um volume ampliado de regiões cardíacas profundas de (iii) representando núcleos celulares, vasculatura e células infectadas (barra de escala: 90 μm). v Representa uma seção óptica obtida de (iii) (barra de escala: 90 μm). (C) Aumento da celularidade visualizada pela rotulagem de DNA de todo o músculo esquelético liberado. (i) O tecido muscular esquelético do experimento anterior foi manchado de DNA, revelando áreas com rotulagem nuclear intensa (azul) bem como células infectadas por T. cruzi (vermelho) (barra de escala: 200 μm) (ver também Filme 4). (ii) revela um intenso acúmulo de núcleos azuis em áreas com menor ou nenhuma detecção de parasita tdTomato (barra de escala: 100 μm). (iii) alta ampliação (60x) a imagem confocal identifica rotulagem de DNA de células e parasitas em seções teciduais (barra de escala: 10 μm). (D) Aumento de marcadores de repórteres parasitas tdTomato em todo o músculo esquelético liberado. (i-iii) Tecidos musculares esqueléticos intactos de camundongos infectados com 2 x 105 parasitas expressando tdTomato foram fixos, esclarecidos e imunossuídos com anticorpos contra RFP (RFP Booster). Um sinal fluorescente intenso e uniforme foi obtido no canal vermelho distante após o reforço de RFP (verde) do sinal tdTomato (vermelho) (barra de escala: 100 μm). (E) Impulsionamento dos marcadores de repórteres parasitas GFP usando nanomumentos anti-GFP. (i-iii) Os tecidos musculares esqueléticos de camundongos infectados com 2 x 105 parasitas expressando GFP foram corrigidos, esclarecidos e imunossuídos com nanomutos alexa fluor 647 conjugados contra GFP (GFP Booster). Um forte sinal fluorescente foi obtido no canal vermelho distante após o aumento de GFP (magenta) da fluorescência GFP (ciano). Camundongos de (D) e (E) foram mortos 30 dias após a infecção porque as cargas de parasitas atingem um pico neste momento, e células infectadas por parasitas podem ser facilmente detectadas no músculo esquelético (barra de escala: 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Infecção t. cruzi do coração e músculo esquelético em camundongos deficientes IFN-gama. Reconstruções 3D de tecidos clarificados com CUBIC de camundongos deficientes IFN-gama coinfectados com 2 x 105 tdTomato-expressando colombiana (vermelho) e GFP expressando cepas de T. cruzi no dia 17 pós-infecção. Um total de 1151 fatias individuais do coração e 559 do músculo esquelético foram adquiridos via LSFM. Resultados de imagem comparáveis foram obtidos em três animais independentes. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme 2: Detecção de recrutamento de células T no mouse repórter CD8 infectado por T. cruzi. Visualização 3D de um músculo esquelético clarificado pelo CUBIC de um rato repórter CD8 infectado com 2 x 105 Tdtomato-expressando cepa colombiana T. cruzi (vermelho) e morto aos 14 dias pós-infecção. Um total de 668 fatias individuais do músculo esquelético foram imagens pelo LSFM. Foram visualizadas células T (azul) e T. cruzi infectadas por T. cruzi (vermelha). Resultados de imagem comparáveis foram obtidos em dois animais. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme 3: Imunodetocção de vasculatura em T. cruzi-infectado e coração limpo. Reconstrução 3D de um coração clarificado com CUBIC de camundongos do tipo selvagem infectados com 2 x 105 tdTomato-expressando colombiana T. cruzi e imunossuados com anticorpos contra α-SMA (azul) aos 40 dias após a infecção. O corte através do coração revela a vasculatura intrincada do coração e a penetração tecidual dos anticorpos α-SMA. As células infectadas por parasitas podem ser observadas como manchas vermelhas brilhantes no coração atria (vermelho, à direita). Resultados de imagem comparáveis foram obtidos em dois animais. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme 4: Coloração de DNA de órgãosinteiros revela áreas com maior celularidade. Reconstrução 3D do músculo esquelético clarificado cúbico do camundongo tipo selvagem aos 40 dias pós-infecção infectado com 2 x 105 tdTomato-expressando cepa Colombiana T. cruzi . Toda a área muscular do quadríceps estava manchada com um corante nuclear verde. Foram visualizadas células infectadas por T. cruzi (vermelhas) e os núcleos de cada célula do tecido (azul). Zoom-ins da reconstrução 3D revela acúmulo de núcleos azuis ao longo de áreas com pouca ou nenhuma detecção de parasitas tdTomato. Resultados de imagem comparáveis foram obtidos em dois animais. Clique aqui para baixar este Filme.
Arquivo Complementar 1: Composição das soluções de coloração de anticorpos utilizadas no estudo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A ausência de imagens extensas e de órgãos inteiros de parasitas e a resposta imune limita a compreensão da complexidade das interações hospedeiro-parasita e impede a avaliação das terapias para a doença de Chagas. O presente estudo adotou o gasoduto CUBIC para esclarecer e manchar órgãos e tecidos intactos de camundongos infectados por T. cruzi.
Vários protocolos de limpeza de tecidos foram testados neste estudo (PACT32, ECi33, FLASH34, iDISCO11,26 e fDISCO13); no entanto, apenas o CUBIC preservou altos níveis de fluorescência de tdTomato ou GFP parasita. Da mesma forma, relatórios anteriores mostraram a preservação C CUBIC de marcadores expressos endógenos em comparação com outras abordagens de limpeza tecidual35.
A capacidade de resolução limitada é uma das ressalvas atuais da microscopia convencional da folha de luz. Isso fica claro nas dificuldades de resolução de parasitas individuais em células fortemente infectadas (Figura 2C). Os microscópios recém-desenvolvidos com uma capacidade de resolução melhorada e a adaptação das técnicas de expansão tecidual poderiam resolver esse problema36.
Impurezas dos tampões de lavagem, soluções de limpeza ou outros órgãos podem precipitar-se no tecido, produzindo sinais não específicos que podem ser confundidos com células infectadas por parasitas, parasitas individuais ou outras estruturas. No entanto, esses artefatos geralmente fluorescem brilhantemente em vários canais, então após a análise de imagem, eles podem ser facilmente descartados da contagem automatizada por tecidos de imagem em um canal alternativo (geralmente o canal verde). Objetos de cor dupla foram considerados artefatos e excluídos para quantificação automatizada.
As manchas nucleares DAPI, PI, RedDot2 e SYTOX-G apresentam bons níveis de penetração tecidual e intensidades de sinal na maioria dos órgãos limpos do CUBIC; no entanto, o corante de DNA verde apresentou o melhor desempenho (Figura 3B,C e Filme 4).
Esses resultados mostraram que as células infectadas por T. cruzi poderiam ser facilmente detectadas e quantificadas com precisão, ao mesmo tempo em que identificavam sinais de ratos de células T ou nuclei. Mais importante, a LSFM detectou raros eventos biológicos, como amastigotes dormentes positivos, dentro de um ambiente complexo de tecidos com a capacidade potencial de expandi-lo para a imunossuagem de epitope e rotulagem de DNA. Estudos atuais também estão explorando a utilidade dessas abordagens para monitorar a ativação de células efeitos imunológicos, as interações entre múltiplas cepas de parasitas no mesmo hospedeiro e a indução de danos teciduais e reparação na doença de Chagas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Etsuo Susaki por sua valiosa ajuda e recomendações sobre protocolos de limpeza de tecidos e imunossuagem. Além disso, somos gratos a M. Kandasamy do CtEGD Biomedical Microscopy Core por suporte técnico usando LSFM e imagem confocal. Agradecemos também a todos os membros do Tarleton Research Group por sugestões úteis ao longo deste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
