Summary
Denne protokollen beskriver lysstofffluorescerende mikroskopi og automatiserte programvareassisterte metoder for å visualisere og nøyaktig kvantifisere prolifererende og sovende Trypanosoma cruzi-parasitter og T-celler i intakte, klarerte organer og vev. Disse teknikkene gir en pålitelig måte å evaluere behandlingsresultater og gir ny innsikt i parasitt-vert-interaksjoner.
Abstract
Chagas sykdom er en forsømt patologi som påvirker millioner av mennesker over hele verden, hovedsakelig i Latin-Amerika. Chagas sykdomsmiddel, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), er en obligatorisk intracellulær parasitt med en mangfoldig biologi som infiserer flere pattedyrarter, inkludert mennesker, som forårsaker hjerte- og fordøyelsespatologier. Pålitelig påvisning av T. cruzi in vivo-infeksjoner har lenge vært nødvendig for å forstå Chagas sykdoms komplekse biologi og nøyaktig evaluere utfallet av behandlingsregimer. Den nåværende protokollen demonstrerer en integrert rørledning for automatisert kvantifisering av T. cruzi-infiserte celler i 3D-rekonstruerte, ryddede organer. Light-sheet fluorescerende mikroskopi muliggjør nøyaktig visualisering og kvantifisering av aktivt prolifererende og sovende T. cruzi parasitter og immuneffektorceller i hele organer eller vev. Også CUBIC-HistoVision-rørledningen for å oppnå ensartet merking av klarerte organer med antistoffer og kjernefysiske flekker ble vellykket vedtatt. Vevsrydding kombinert med 3D-immunstaining gir en objektiv tilnærming til omfattende evaluering av legemiddelbehandlingsprotokoller, forbedrer forståelsen av den cellulære organisasjonen av T. cruzi-infisert vev, og forventes å fremme funn relatert til anti-T. cruzi immunresponser, vevskader og reparasjon i Chagas sykdom.
Introduction
Chagas sykdom, forårsaket av protozoparasitten T. cruzi, er blant verdens mest forsømte tropiske sykdommer, og forårsaker omtrent 13.000 årlige dødsfall. Infeksjonen utvikler seg ofte fra et akutt til et kronisk stadium som produserer hjertepatologi hos 30% av pasientene, inkludert arytmier, hjertesvikt og plutselig død 1,2. Til tross for den sterke vertsimmunresponsen som fremkalles mot parasitten i den akutte fasen, fortsetter lavt antall parasitter kronisk gjennom vertsens liv i vev som hjerte og skjelettmuskulatur. Flere faktorer, inkludert forsinket utbrudd av adaptive immunresponser og tilstedeværelsen av ikke-replikerende former for parasitten, kan bidra til kapasiteten til T. cruzi for å unngå fullstendig eliminering av immunsystemet 3,4,5,6. Videre viser ikke-replikerende sovende former av parasitten lav følsomhet for trypanocidale legemidler og kan delvis være ansvarlig for behandlingssvikt observert i mange tilfeller 7,8.
Utviklingen av nye avbildningsteknikker gir en mulighet til å få innsikt i den romlige fordelingen av parasittene i det infiserte vevet og deres forhold til immuncellene som er involvert i deres kontroll. Disse egenskapene er avgjørende for en bedre forståelse av prosessene for parasittkontroll av immunsystemet og sporing av de sjeldne sovende parasittene som er tilstede i kronisk vev.
Light-sheet fluorescensmikroskopi (LSFM) er en av de mest omfattende og objektive metodene for 3D-avbildning av store vev eller organer uten tynnsnitt. Lysarkmikroskoper bruker et tynt ark med lys for bare å opphisse fluoroforene i fokalplanet, redusere fotobleking og fototoksisitet av prøver, og ta bilder av tusenvis av vevslag ved hjelp av ultra-raske kameraer. Det høye nivået av vevsgjennomsiktighet som er nødvendig for riktig penetrasjon av laserlyset i vev, oppnås ved å homogenisere brytningsindeksen (RI) etter vevsdelipidering og avfarging, noe som reduserer spredning av lys og gjengir bilder av høy kvalitet 9,10,11.
Vevsryddingsmetoder er utviklet for avbildning av hele mus 12,13,14, organoider 15,16,17, organer som uttrykker reporter fluorescerende markører 18,19,20,21,22,23, og nylig et begrenset antall humane vev 24 . De nåværende metodene for vevsrydding er klassifisert i tre familier: (1) organiske løsningsmiddelbaserte metoder som DISCO-protokoller 25,26, (2) hydrogelbaserte metoder, som CLARITY27, og vandige metoder, for eksempel CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . KUBIC-protokoller opprettholder organform og vevsintegritet, og bevarer fluorescensen av endogent uttrykte reporterproteiner. Den siste oppdateringen av denne teknikken, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), tillater også påvisning av epitoper ved bruk av fluorescerende merkede antistoffer og DNA-merking28.
I denne protokollen ble CUBIC-rørledningen for å oppdage T. cruzi som uttrykker fluorescerende proteiner i avklart intakt musevev brukt. Optisk gjennomsiktig vev ble LSFM-avbildet, 3D-rekonstruert, og det nøyaktige totale antallet T. cruzi-infiserte celler, sovende amastigoter og T-celler per organ ble automatisk kvantifisert. Også denne protokollen ble vellykket vedtatt for å oppnå ensartet merking av klarerte organer med antistoffer og kjernefysiske flekker. Disse tilnærmingene er avgjørende for å forstå utvidelse og kontroll av T. cruzi i infiserte verter og er nyttige for full evaluering av kjemo- og immunterapi for Chagas sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i strengt samsvar med Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care akkrediteringsretningslinjer. Animal Use Protocol (kontroll av T. cruzi-infeksjon hos mus-A2021 04-011-Y1-A0) ble godkjent av University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J og C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mus (hunn,1-2 måneder gamle) ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Infeksjon, perfusjon og disseksjon
- Intraperitonealt infisere mus med vevskultur-avledede trypomastigoter av Colombiana (DTU TcI) eller Brasil (DTU TcV) T. cruzi-stamme som uttrykker henholdsvis tdTomat eller GFP fluorescerende proteiner. Infeksjonsdosen kan variere fra 50.000 til 200.000 trypomastigoter fortynnet i 100 μL 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Spesifikke detaljer om generering av reporterparasitter og musemodeller av infeksjon er tilgjengelige i Canavaci et al. 29 og Bustamante m.fl.30. - Avliv musene ved innånding av karbondioksid ved en strømningshastighet på 3-7 l / min. Så snart dyrene slutter å vise pedalrefleks, gjør du et langsgående snitt gjennom huden fra magen mot brystbenet. Klipp deretter kroppsveggen fra magen og fortsett gjennom ribbeina på hver side av thoraxen til brystbenet kan løftes bort, og utsetter hjertet.
- Som beskrevet i figur 1, gjør et 2,5 mm snitt i hjertets høyre auricle og samle drenerende blod ved hjelp av en 1 ml mikropipettespiss.
- Sett en sommerfuglnål (koblet til den ene enden av perfusjonssystemet) inn i toppen av venstre ventrikel til den når den stigende aorta. Bruk gelbasert lim (se Materialfortegnelse) for å forsegle innløpshullet rundt nålen og holde nålen på plass under perfusjoner.
- Perfuse musene 30 med 50 ml kald heparin-PBS (pH 7,4,10 U / ml heparin) eller til væsken som kommer ut av musen mot oppsamlingsbrettet er fri for blod.
- Perfuse med 50 ml kaldt 4% (w / v) paraformaldehyd (PFA) (pH 7,4) i PBS.
MERK: PFA-vevsfiksering er sannsynligvis et av de kritiske trinnene i protokollen, spesielt for å opprettholde epitopstrukturer og påfølgende immundeteksjon. PFA brytes ned over tid, så det må tilberedes nylaget. PH i løsningen er også viktig for å unngå overfiksering, noe som kan føre til dårlig rydding av vev.
FORSIKTIG: PFA er moderat giftig ved hudkontakt. Akutt eksponering er også svært irriterende for nese, øyne og hals. Langvarig eksponering for lave nivåer i luften eller huden kan forårsake hudirritasjon som dermatitt og kløe, og astma-lignende luftveisproblemer. Bruk ansikts- og øyevern og ikke pust inn støv, gass, tåke, røyk eller damp.- Etter PFA-perfusjonen, perfuse musen med 100 ml CUBIC-P-buffer for å nå avklaringsnivåene nevnt i trinn 1.5.
- For å forberede CUBIC-P-buffer, oppløs 10% N-butyldietanolamin, 5% Triton X-100 og 5% 1-N-metylimidazol i dobbeltdestillert vann eller bruk kommersielle cocktailer (se Materialtabell).
MERK: Trinn 1.6.1.-1.6.2. anbefales kun for høyt pigmenterte organer som hjerte og nyre, siden de krever et pre-clearing-trinn for å oppnå økte nivåer av gjennomsiktighet. Etter bruk av CUBIC-P, disseker organene og fortsett direkte til trinn 2: Vevsrydding.
- Dissekere vevsprøvene/organene30 som skal avbildes, og fest dem i 4 % (w/v) PFA i PBS (~10 ml/hele organet) over natten (ON) ved 4 °C med forsiktig risting (ikke mer enn 5 x g) i 50 ml koniske rør.
MERK: Alle inkubasjoner herfra må utføres på rør som ligger horisontalt ved 20-30 °C beskyttet mot lys. - Vask prøven i 10 ml PBS (supplert med 0,05% natriumazid (NaN 3) i3 timer (tre ganger) ved romtemperatur (RT) med forsiktig risting (5 x g).
MERK: Vev kan fryses ved å inkubere i 10 ml 30% sukrose i PBS med forsiktig risting (5 x g) ved 4 ° C PÅ i 50 ml koniske rør. Etter at vev synker til bunnen av røret, legg dem inn i OCT-forbindelsen og hold dem ved -80 ° C. Tin ved RT til OCT-forbindelsen smelter helt, vask deretter i PBS (~ 10 ml / hele orgel) PÅ ved 4 ° C med forsiktig risting (5 x g) i 50 ml koniske rør. Gå videre til trinn 2.
2. Rydding av vev
MERK: Alle vevsryddingene som ble utført i dette arbeidet ble gjort ved hjelp av KUBIC-protokoll I22. Tre forskjellige cocktailer ble brukt: CUBIC-P for delipidering og rask avfarging under perfusjoner, CUBIC-L for delipidering og avfarging, og CUBIC-R for RI-matching. DNA-farging og immunostainings ble utført ved bruk av henholdsvis CUBIC-HV 1 3D nukleærfargingssett og CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit (se materialtabell).
- Senk individuelle organer i 10 ml 50% vannfortynnet CUBIC-L (se materialtabell) med forsiktig risting (5 x g) ved RT (ON) i 50 ml koniske rør. Hold rørene flate på risteplaten.
MERK: For å unngå vevskader opprettholdes organer i samme rør, og løsninger samles ved hjelp av et vakuumsystem. For å tilberede CUBIC-L, oppløs 10% N-butyldietanolamin og 10% Triton X-100 i dobbeltdestillert vann ved hjelp av kommersielle cocktailer (se materialtabell).
FORSIKTIG: CUBIC-L forårsaker alvorlig øyeskade. Bruk øye- og ansiktsbeskyttelse. Kast til godkjent avfallsmottak. - Senk prøven i 10 ml 100% CUBIC-L i 6 dager (forfriskende løsningen på dag 3).
MERK: På slutten av denne inkubasjonsperioden må vevet være nesten helt gjennomsiktig. - Vask de gjennomsiktige organene med PBS (supplert med 0,05% NaN3) i 2 timer (tre ganger) ved 37 °C med forsiktig risting (5 x g). Overfør vev til et nytt 50 ml konisk rør med hver vask for å fjerne Triton X-100.
MERK: Som beskrevet i figur 2B, hvis målet med eksperimentet er å visualisere endogent uttrykte reporterproteiner fra transgene T. cruzi-parasitter eller mus (figur 2C-F), hopp over trinn 3, 4 og 5 og fortsett direkte til trinn 6.
3. DNA-farging
- Fortynn det kommersielt tilgjengelige nukleinsyrefargestoffet (se materialfortegnelse) i 5 ml fargebuffer (inkludert i settet) ved 1/2,500 fortynning.
- Senk vevet i nukleærfargeløsningen og inkuber ved 37 ° C med forsiktig rotasjon i 5 dager ved bruk av 15 ml koniske rør i stående stilling.
- Vask med 15 ml 3D kjernefysisk fargevaskbuffer (inkludert i settet) i 2 timer (tre ganger) ved RT med forsiktig risting (5 x g).
MERK: Andre DNA-fargestoffer kan brukes i disse konsentrasjonene og inkubasjonstidene: DAPI (inkludert i settet): 1/200, 5 dager inkubasjon; BOBO-1: 1/400, 5 dager inkubasjon; Propidiumjodid (PI) (inkludert i settet): 1/100, 3 dager inkubasjon; RedDot2: 1/250, 3 dager inkubasjon. Hvis det spesifikke målet med eksperimentet er å visualisere både endogent uttrykte reporterproteiner og bruke kjernefysiske flekker, hopp over trinn 4 og 5 og fortsett direkte til trinn 6.
4. Ekstracellulær matrise (ECM) fordøyelse
MERK: Hyaluronidase fordøyelsen av ECM må utføres for å lette riktig penetrasjon av antistoffene i dype områder av vevet28.
- Senk individuelle organer i 15 ml hyaluronidase reaksjonsbuffer i 2 timer ved 37 ° C i et 50 ml konisk rør i flat stilling beskyttet mot lys.
MERK: For å klargjøre hyaluronidase reaksjonsbuffer, oppløs 10 mM CAPSO; 150 mM natriumklorid (NaCl) og 0,05 % av NaN3 (se materialfortegnelse) i dobbeltdestillert vann og juster pH til 10. - Klargjør enzymoppløsning ved å blande 75 mikroliter 20 mg/ml hyaluronidasebestand til 425 mikroliter hyaluronidasereaksjonsbuffer. For å fremstille 20 mg/ml hyaluronidasebestander, oppløs hyaluronidase i 50 mM karbonatbuffer, 150 mM NaCl, 0,01 % BSA og 0,05 % av NaN3 (se materialtabell). Juster pH til 10 og aliquot i volumer på 77 μL ved -30 °C.
- Kast hyaluronidase reaksjonsbuffer ved hjelp av en pipette og senk orgelet i enzymoppløsningen (500 μL i et 15 ml konisk rør) i stående stilling beskyttet mot lys i 24 timer ved 37 ° C med forsiktig risting (5 x g).
- Vask prøven i 15 ml hyaluronidase vaskebuffer i et 50 ml konisk rør i horisontal stilling beskyttet mot lys i 2 timer (tre ganger) ved 37 °C med forsiktig risting (5 x g).
- For å forberede hyaluronidase vaskebuffer, oppløs 50 mM karbonatbuffer, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Triton X-100, 5% (v / v) Metanol og 0, 05% NaN3. Juster pH til 10. For å forberede 10x karbonatbuffer-NaCl-lager, oppløs 2,96 g natriumkarbonat, 1,86 g natriumhydrogenkarbonat og 8,77 g NaCl i 100 ml dobbeltdestillert vann med 0,05% NaN3 (se materialtabell) og juster pH til 10.
5. Immunostaining
- Merk vaskulaturen ved hjelp av anti-α-SMA (alfa-liten muskelaktin, se Tabell over materialer) antistoffer ved å følge trinnene nedenfor.
- Generer primært pluss konjugert Fab fragment sekundært antistoffkompleks. Start denne reaksjonen 1,5 time før fargingsprosedyren.
- Beregn den nødvendige mengden primære og sekundære antistoffer (bland i et 1: 0,5-forhold i vekt).
MERK: For det primære antistoffet anti-α-SMA er 3,5 μg nødvendig for å merke hele hjertet eller et fragment av skjelettmuskulatur av lignende dimensjoner. For 2,5 mg/ml produkt er 3,5/2,5 = 1,4 mikroliter antistoffvæske nødvendig. For sekundært antistoff AlexaFluor 647 anti-mus Fab fragment, er 1,75 μg nødvendig for å merke hele hjertet eller et fragment av skjelettmuskulatur av lignende dimensjoner. For 1,7 mg/ml produkt er 1,75/1,7 = 1 mikroliter antistoffoppløsning nødvendig. - Bland primære og sekundære antistoffer i et gult 2 ml rør og inkuber i 1,5 timer ved 37 °C.
- Beregn den nødvendige mengden primære og sekundære antistoffer (bland i et 1: 0,5-forhold i vekt).
- For bufferutveksling, bland 7,5 ml 2x HV1 3D-immunostainingbuffer (inkludert i settet, se materialtabell) med 7,5 ml dobbeltdestillert vann og senk vevsprøven i 1,5 timer ved 32 ° C med forsiktig risting (5 x g) i et 15 ml konisk rør i horisontal stilling. Start denne reaksjonen samtidig som generering av antistoffkompleks (1,5 timer før immunfargingsprosedyren).
- Generer primært pluss konjugert Fab fragment sekundært antistoffkompleks. Start denne reaksjonen 1,5 time før fargingsprosedyren.
- Utfør 3D-immunfarging ved å følge trinnene nedenfor.
- I et 15 ml konisk rør, klargjør antistofffargingsløsningen etter tilleggsfil 1.
- Samle vevsprøven fra bufferutvekslingsmediet (trinn 5.1.2) og senk den ned i antistofffargeløsningen. Inkuber vev individuelt i 1 uke ved 32 ° C med forsiktig risting (5 x g) av rørene i stående stilling beskyttet mot lys. Forsegl røret med parafinfilm for å unngå fordampning.
- Flytt til 4 °C og inkuber PÅ i stående stilling.
- Avkjøl 1x HV1 3D immunostaining vaskebuffer (inkludert i settet, se Materialfortegnelse) til 4 °C og vask prøven med 15 ml buffer (to ganger) i 30 minutter hver ved 4 °C med forsiktig risting (5 x g). Hold 15 ml koniske rør i horisontal stilling til trinn 5.2.7.
- Fortynn formalin til 1% i 1x HV1 3D immunostaining vaskebuffer og senk prøven i 8 ml av løsningen i 24 timer ved 4 ° C med forsiktig risting (5 x g).
- Inkuber i fersk 1% formalinoppløsning i 1 time ved 37 ° C med mild risting (5 x g).
- Vask i 15 ml PBS i 2 timer ved 25 °C ved forsiktig risting (5 x g).
- Øk tdTomato-signalet ved hjelp av anti-rødt fluorescerende protein (RFP) antistoffer ved å følge trinnene nedenfor.
- Følg de samme inkubasjonstidene og temperaturene som i trinn 5.2.2. Beregn mengden primære og sekundære antistoffer (se materialfortegnelse) og bland dem i et vektforhold på 1: 0,5.
MERK: For primær antistoff anti-RFP er 5 μg nødvendig for å merke hele hjertet eller et fragment av skjelettmuskulatur av lignende dimensjoner. For 1,25 mg/ml produkt er 5/1,25 = 4 μL av oppløsningen nødvendig. For sekundært antistoff Alexa Fluor 647 anti-kanin Fab fragment, er 2,5 μg nødvendig for å merke hele hjertet eller et fragment av skjelettmuskulatur av lignende dimensjoner. For 1,5 mg/ml produkt er 2,5/1,5 = 1,7 mikroliter oppløsning nødvendig. - Klargjør antistofffargeløsningen som nevnt i tilleggsfil 1.
- Følg de samme inkubasjonstidene og temperaturene som i trinn 5.2.2. Beregn mengden primære og sekundære antistoffer (se materialfortegnelse) og bland dem i et vektforhold på 1: 0,5.
- Øk GFP-signaler ved hjelp av anti-GFP nanolegemer ved å følge trinnene nedenfor.
- Følg samme inkubasjonstider og temperaturer som nevnt i trinn 5.2.2.
MERK: Anti-GFP nanolegemer (se Tabell over materialer) er konjugert med Alexa Fluor 647, så antistoffkompleksgenereringen er unødvendig. - Klargjør antistofffargeløsningen som nevnt i tilleggsfil 1.
- Følg samme inkubasjonstider og temperaturer som nevnt i trinn 5.2.2.
6. RI-matching
- Senk gjennomsiktige organer i 5 ml 50% vannfortynnet CUBIC-R + løsning (se materialtabell) ved RT (ON) med forsiktig risting (5 x g) i et 50 ml konisk rør. Hold rørene i stående stilling under hele RI-matchende trinn.
MERK: Resirkulerte CUBIC R+-løsninger fra tidligere eksperimenter kunne gjenbrukes (opptil fire ganger) i dette trinnet. For å fremstille CUBIC-R + -løsning, oppløs 45% av 2,3-dimetyl-1-fenyl-5-pyrazolon (antipyrin), 30% nikotinamid eller N-metylnikotinamid og 0,5% N-butyldietanolamin i dobbeltdestillert vann eller bruk den kommersielle CUBIC-R + bufferen (se materialtabell).
FORSIKTIG: CUBIC-R+ forårsaker hudirritasjon, alvorlig øyeirritasjon og skade på organer. Bruk vernehansker, og sørg for øye- og ansiktsbeskyttelse. Ikke pust inn støv, røyk, gass, tåke eller damp. Kast til godkjent avfallsmottak. - Bytt ut 50% CUBIC-R+ med 5 ml 100% CUBIC-R+ og inkuber med forsiktig risting (5 x g) ved RT i 2 dager. Overfør deretter vevet til en stabel med lofrie kluter og vri vevet forsiktig for å fjerne CUBIC-R + -løsningen fra organoverflatene i 5 minutter.
7. Montering
- Etter tørking av vevet, overfør dem til 5 ml monteringsløsning (RI = 1.520) (se Materialtabell) i en seksbrønns cellekulturplate og inkuberer dem (ON) ved RT. Snu ofte vevet for å eliminere luftbobler, spesielt på organets overflater.
MERK: Organer kan lagres i mer enn 6 måneder i monteringsløsning eller CUBIC-R+. - Fest vevet til mikroskopprøveholderen ved å bruke cyanoakrylatbasert gellim.
- Senk prøvene i mikroskopkvartskuvetten fylt med 120 ml monteringsløsning og avbilde dem transversalt til lengdeaksen. Hold hjertet med toppunktet og aorta horisontalt justert.
MERK: Klarerte og monterte organer kan seksjoneres med en vibratom og avbildes ved høy forstørrelse ved konfokal mikroskopi. Legg organene i 2% agarose og kutt seksjoner på 100-500 μm. Organer kan også seksjoneres manuelt med et skarpt blad for å produsere tykke vevsseksjoner (>1000 μm). Etter seksjonering, legg skivene i 35 mm petriskåler med glassbunn, monter med samme monteringsløsning, forsegl med neglelakk og bilde med et konfokalt mikroskop.
8. Anskaffelse av bilder
- Avbilde de monterte prøvene med et lysarkmikroskop (se Materialfortegnelse). Sett forstørrelse og trinnstørrelse mellom individuelle skiver til 3 μm, og bruk høyre og venstre lysarklasere med 5 μm tykkelser og 100% bredde. Still eksponeringstidskonstanten til 50-100 ms, og juster lasereffekten fra 10% til 80% avhengig av fluorescenssignalintensiteten.
- For samtidig påvisning av tdTomato-uttrykkende parasitter og DiR-fargede sovende amastigoter (figur 2C), bruk henholdsvis røde (Ex/Em 561/620-660 nm) og infrarøde (Ex/Em 785/845-55 nm) kanaler. For samtidig påvisning av T-celler og tdTomato-uttrykkende parasitter i CD8-reportermus (figur 2D), bruk henholdsvis grønn (Ex/Em 488/525-50 nm) og rød kanal.
- For koinfeksjonsanalysene (figur 2E), samt for samtidig påvisning av parasitter som uttrykker GFP i kjernereportermus (figur 2F), bruk henholdsvis de grønne og røde kanalene. For påvisning av tdTomato-uttrykkende parasitter, nukleært fargestoff og hjertevaskulatur (figur 3B, C), bruk henholdsvis de røde, grønne og langt røde (Ex/Em 640/680-730 nm) kanalene.
- Oppdag anti-RFP-antistoffer med den langt røde kanalen og anti-GFP nanolegemer ved hjelp av den grønne kanalen (figur 3D).
- Konverter de oppkjøpte TIFF-bildestablene og 3D-rekonstruer organene ved hjelp av Imaris v9.7.2-programvare (se materialfortegnelse).
9. Overflaterekonstruksjon og kvantifisering med Imaris-programvare
- Velg algoritmeverktøyet for overflatedeteksjon , og start veiviseren i bildeanalyseprogramvaren.
- Utfør en innledende analyse i et 3D-område av interesse (tilfeldig valgt) og bruk det deretter på hele 3D-organrekonstruksjonen. Når du har valgt et interesseområde (ROI), velger du kanalen som skal analyseres, fjerner merket for avrundingsknappen og velger bakgrunnssubtraksjon.
MERK: Subtraksjon i bakgrunnen beregner en unik lokal bakgrunnsverdi for hver voxel og trekker denne fra den opprinnelige bildepunktverdien. Diameteren til den største sfæren som passer inn i objektet må være opptil 200 μm for T. cruzi-infiserte celler, 10 μm for T-celler og 5 μm for individuelle parasitter. - Bruk histogrammet til å justere klassifiseringen og rullegardinlisten for filter for å velge målene for klassifisering.
MERK: Bruk histogrammet til å justere klassifiseringen: elliptisitetsmålinger (oblat) og sfærisitetsmålinger anbefales. - Fullfør veiviseren, trykk på statistikkknappen , og hent totalt antall parasittinfiserte celler eller T-celler som antall frakoblede komponenter per tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KUBISK fast vev ble vasket med PBS for å fjerne fikseringsmidler og deretter inkubert med CUBIC-L-cocktailer, en grunnleggende bufret løsning av aminoalkoholer som trekker ut pigmenter og lipider fra vevet, noe som resulterer i avfarging av vev samtidig som vevsarkitekturen opprettholdes. Rutenettlinjer i papiret kan ses gjennom vevet som indikerer en passende rydding av organene (figur 2A). Etter delipidering ble vev vasket og nedsenket i CUBIC-R + og monteringsløsning for henholdsvis RI-homogenisering og avbildning (figur 2B).
En villtype mus ble infisert med tdTomato-uttrykkende trypomastigoter forhåndsfarget med DiR nær-infrarød cyaninfargestoff. Musen ble avlivet 15 dager etter infeksjon, og det intakte hjertet ble dissekert, fikset og ryddet. LSFM-avbildning og 3D-rekonstruksjon tillot oss å visualisere tdTomato-uttrykkende prolifererende T. cruzi-parasitter (rød). Autofluorescensnivåer i den røde kanalen kan brukes til riktig visualisering av hjertestruktur og kanter (figur 2C i). LSFM var også nyttig for å identifisere stoffresistente sovende former 7,8. Preinfeksjonsfarging av parasitter med DiR-fargestoff muliggjør sporing av sovende parasitter ved å visualisere parasittene som ikke hadde fortynnet fargestoffet gjennom replikasjon, som tidligere rapportert for CellTrace Violet7.
Sovende parasitter (cyan) kan identifiseres i hjertet som avbildet i 3D-forstørrede innsatser (gule piler) (figur 2C ii,iii). Z-projeksjonfluorescens ble segmentert automatisk for å generere en rekonstruert 3D-overflatemodell for romlig visualisering og kvantifisering av det totale antallet T. cruzi-infiserte celler og sovende parasitter gjennom hele 3D-rekonstruksjonen (figur 2A). Analyse av 3D-overflatemodellen viste 186 T. cruzi-infiserte celler med høyere andel infiserte celler i hjertets atrium (123) sammenlignet med ventrikler (63) og 18 sovende parasitter i hele hjertet (figur 2C i). I en tidligere rapport ble en lignende rørledning for å overvåke antall T. cruzi-infiserte celler og sovende parasitter i avklarte musevev etter narkotikabehandling rapportert31. Det er viktig å merke seg at estimatene for antall sovende parasitter sannsynligvis er en undertelling, da fargestofffortynningsteknikken bare tillater påvisning av parasitter som ikke har replikert betydelig siden den første infeksjonen, men oppdager ikke de som ble sovende senere i infeksjonen etter flere divisjonsrunder.
En lignende tilnærming ble brukt til å overvåke samspillet mellom forskjellige T. cruzi-stammer i interferon (IFN) -gamma mangelfulle mus. Produksjonen av IFN-gamma av effektor T-celler er avgjørende for immunkontrollen av T. cruzi. I IFN-gamma mangelfulle mus sprer parasitter seg med minimal immunbegrensning, noe som gir svært høyt antall infiserte celler i organer. Disse immunsviktmodellene er nyttige verktøy for å studere effekten av nye legemidler uten begrensningen som følge av immungjenkjenning, og dermed tillate påvisning av tilbakefall av parasitter etter behandling. IFN-gamma mangelfulle mus ble coinfected med tdTomato-uttrykkende Colombiana (rød) og GFP-uttrykkende Brasil (blå) T. cruzi-stammer. Musene ble avlivet 17 dager etter infeksjon, og de intakte hjertene ble dissekert, fikset og ryddet. I denne immundefekte modellen kan vertsceller infisert med begge T. cruzi-stammene observeres i ulike stadier av parasittutvikling, inkludert store, mellomstore og små infiserte celler og nylig briste. Skiver gjennom vevet viser rikelig med parasittinfiserte celler i hjerteatriene på ulike vevsdyp (figur 2E i-iii og film 1).
Et kryss av C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J og B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J-mus, der alle T-celler uttrykker det grønne fluorescerende proteinet ZsGreen1, ble brukt til å overvåke T-cellerekruttering i T. cruzi-infisert vev. Mus ble avlivet 14 dager etter infeksjon med tdTomato-uttrykkende parasitter, og skjelettmuskulaturen ble skåret ut, ryddet og avbildet av LSFM. ZsGreen1 som uttrykker T-celler (blå) og T. cruzi-infiserte celler (rød) ble robust påvist (figur 2D i og film 2). 3D-zoom-ins av 3D-rekonstruksjonen identifiserte T-celler i regionen av en infisert celle (figur 2D ii). Vibratome tykke seksjoner (200-500 μm) av samme vev tillater oss å visualisere grensesnittet til T-celler og være vert for infiserte celler ved konfokal mikroskopi (figur 2D iii).
En alternativ måte å overvåke betennelsesfokus på er basert på cellekjerneakkumulering rundt T. cruzi-infiserte celler. En reportermus hvor alle cellekjerner uttrykker det fluorescerende tdTomatoproteinet ble brukt til dette formålet. Det kjernefysiske tdTomato-uttrykket (rødt) ble lett oppdaget i vevet etter clearingprosessen. En nukleær reportermus ble infisert med GFP-uttrykkende T. cruzi-parasitter (cyan), og 35 dager etter infeksjon ble avlivet, og skjelettmuskulaturen ble skåret ut, ryddet og avbildet av LSFM (figur 2F i-iii). Zoomede optiske snitt av skjelettmuskulatur viser økt cellularitet ved å akkumulere røde kjerner langs GFP-uttrykkende parasitter (figur 2F ii). Vibratomseksjoner av samme vev bekrefter tidligere beskrevet akkumulering av røde kjerner langs GFP-uttrykkende parasitter ved konfokal mikroskopi (figur 2F iii).
KUBIC-protokollen ble også tilpasset immunfarging og DNA-merking av intakte, klarerte organer og vev infisert med T. cruzi (figur 3A). Mus ble avlivet 40 dager etter infeksjon med tdTomato-uttrykkende parasitter, og hjertene ble dissekert, festet og ryddet. Det intakte klarerte hjertet ble vasket og farget i 5 dager med en grønn DNA-markør, deretter vasket igjen og immunostained i 7 dager med antistoffer mot α-SMA. Prøvene ble postfiksert, vasket, RI matchet og avbildet med LSFM. Samtidig påvisning av flere fluorescerende signaler, inkludert kjerner, vaskulatur og T. cruzi-infiserte celler, var mulig etter denne protokollen. α-SMA presenterte immunostaining (hvit) høye signalnivåer som avslørte hjertets intrikate vaskulatur (figur 3B ii og film 3). En optisk seksjon fra dypere hjerteregioner viser vevspenetrasjonen av α-SMA-antistoffer under de etablerte forholdene (figur 3B v). DNA-farging (blå) viste også god vevspenetrasjon, fluorescensnivåer og stabil volumetrisk farging. Noen områder med intens DNA-merking ble identifisert på forskjellige hjertesteder (figur 3B i) og rundt skjelettmuskelfibre (figur 3C i og film 4). Et zoomet bilde av skjelettmuskulatur viste en akkumulering av blå kjerner i områder med få eller uoppdagelige tdTomato-parasitter, noe som tyder på rekruttering av immunceller på steder med nåværende eller tidligere T. cruzi-infeksjon (figur 3C ii). I andre tilfeller hadde infiserte vertsceller lite eller ingen tegn på nærliggende cellulære infiltrater (hvite piler) (figur 3C i). Vibratomeseksjoner av samme vev som i figur 3C ii viser DNA-farging av celler og tdTomato-uttrykkende parasitter ved konfokal mikroskopi (figur 3C iii).
Tidligere eksperimenter har vist at sovende parasitter viste lavt eller ubetydelig uttrykk for tdTomato eller GFP reporterproteiner (figur 2C ii og iii). For å forbedre deteksjonen av disse fluorescerende proteinene ble ryddet vev immunostained med anti-RFP eller -GFP antistoffer. Intakt skjelettmuskelvev fra mus infisert med parasitter som uttrykker tdTomato eller GFP ble fikset, avklart og immunstained med antistoffer mot RFP (RFP Booster) (figur 3D) eller nanolegemer mot GFP konjugert med Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (figur 3E), henholdsvis. Prøvene ble postfiksert, vasket, RI matchet og avbildet med LSFM. I begge tilfeller resulterte boosting av GFP- og tdTomato-signalene av antistoffene i sterk fluorescens (figur 3D ii og 3E ii). Immunostainings ved hjelp av boosting antistoffer representerer et allsidig verktøy som vil bli brukt til å oppdage T. cruzi sovende i avklart hele organ og vev og oppdage eventuelle underrepresenterte signal fra RFP eller GFP familiemedlemmets reporter proteiner.
Figur 1: Nålinnsetting under transkardiell perfusjon. (A) En skjematisk fremstilling som viser trinnene som utføres før musen gjennomsyres gjennom hjertet og riktig posisjon og retning av perfusjonsnålen i venstre ventrikel. Et lite snitt i høyre atrium ble utført, og drenering av blod ble samlet inn (1); En sommerfuglnål ble satt inn i hjertets toppunkt. Hold retningen slik at nålen ikke stikker gjennom septum (2). Innløpshullet rundt nålen ble tettet med gelbasert lim (3). Leveren er fylt med blod og virker rød før perfusjon; Men etter perfusjon mister den pigmentering og blir blek. RA, høyre auricle; LA, venstre auricle; RV, høyre ventrikel; LV, venstre ventrikel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Visualisering av T. cruzi-infiserte celler, sovende amastigoter og betennelsesfokus i klarerte organer. (A) Ordning med hele orgel T. cruzi-deteksjon av infiserte celler ved hjelp av vevsrydding, LSFM-avbildning og programvareassistert kvantifisering i 3D-overflatemodeller. (jeg) Lysfeltbilder av hjerte og skjelettmuskulatur før (venstre) og etter (høyre) rydding (skalalinje: 1000 μm). (Ii) Light-sheet fluorescens mikroskop. (Iii) IFN-gamma- mangelfull mus ble infisert med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende trypomastigoter. 17 dager etter infeksjon ble hjertet dissekert, CUBIC ryddet og LSFM avbildet (skalalinje: 500 μm). (Iv) Z-projeksjonsfluorescens ble segmentert automatisk for å generere en rekonstruert 3D-overflatemodell for romlig visualisering og kvantifisering av antall T. cruzi-infiserte celler. Totalt 736 T. cruzi-infiserte celler ble påvist i hele hjertet (skala bar: 500 μm). (v) viser forstørrelser av det angitte volumet i (Iv), der cyanobjekter representerer T. cruzi-infiserte celler (målestokk: 50 μm). (B) Protokoll for CUBIC hele orgel clearing. (C) Visualisering av spredning og sovende T. cruzi parasitter i gjennomsiktig musehjerte. (jeg) En villtype mus ble infisert med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende trypomastigoter farget med et DiR nær-infrarødt cyaninfargestoff. Hjertet ble dissekert, ryddet og LSFM avbildet. tdTomato-uttrykkende spredning (rød) og sovende (cyan) T. cruzi parasitter kan identifiseres. Autofluorescensnivåer ble opprettholdt for å muliggjøre korrekt visualisering av hjertestrukturen. En mus ble drept 15 dager etter infeksjon basert på toppen av parasittinfiserte celler og sovende amastigoter funnet i tidligere arbeider (skalastang: 400 μm). (Ii) og (iii) vise forstørrelser av det angitte volumet i (jeg), der gule piler indikerer sovende parasitter (cyan) (skalalinje: 200 μm). (D) Påvisning av T-cellerekruttering i infisert CD8 reportermus. (jeg) Reporter musen ble infisert med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende trypomastigoter og skjelettmuskulatur ble dissekert, fjernet og LSFM avbildet 14 dager etter infeksjon, et tidspunkt hvor betydelige celleresponser oppdages. ZsGreen1 uttrykker T-celler (blå) så vel som T. cruzi-infiserte celler (rød) ble visualisert (skalastang: 400 μm) (se også Film 2). (Ii) viser forstørrelser av det angitte volumet i (jeg) (skala bar: 50 μm). (Iii) viser T-celleakkumulering rundt en T. cruzi-infisert celle i et vevssnitt (200 μm) av samme organ (skalastang: 8 μm). (E) Interaksjon mellom ulike T. cruzi Stammer. (jeg) IFN-gamma mangelfulle mus ble coinfected med 2 x 105 tdTomato-uttrykker Colombiana (rød) og GFP-uttrykker Brasil (blå) T. cruzi Stammer. Musene ble avlivet, og de intakte hjertene ble dissekert, fikset og fjernet 17 dager etter infeksjon (skalastang: 400 μm). (Ii) viser forstørrelser av det angitte volumet i (jeg) (skala bar: 250 μm). (Iii) viser en forstørret optisk seksjon som avslører celler infisert med Colombiana (rød) og Brasil (blå) T. cruzi stammer (skala bar: 150 μm). (F) Visualisering av cellularitet langs infiserte celler ved hjelp av kjerner reporter mus. (jeg) En kjernefysisk reporter mus ble infisert med 2 x 105 GFP-uttrykkende trypomastigoter og skjelettmuskulatur ble dissekert, fjernet og LSFM avbildet 35 dager etter infeksjon. Nukleær tdTomato-uttrykk av vertscellene (rød), samt GFP-parasittuttrykk (cyan), ble påvist (skalastang: 400 μm). (Ii) viser en forstørret optisk seksjon som avslører akkumulering av røde kjerner langs GFP-uttrykkende parasitter (skalalinje: 90 μm). (Iii) bekrefter økt cellularitet ved konfokal avbildning av vevssnitt fra samme organ (skalastang: 8 μm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Merking av klarerte T. cruzi-infiserte organer med antistoffer og nuclearstains. (A) KUBIC-protokoll for vevsrydding, 3D-immunfarging og DNA-merking av hele organer. (B) Merking av musehjerte for vaskulatur og DNA-deteksjon (se også film 3). (i-iii) En villtype mus ble infisert med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende parasitter. Musen ble avlivet 40 dager etter infeksjon, og hjertet ble dissekert, fikset og ryddet. Det klarerte hjertet ble merket med en DNA-markør og immunstained med antistoffer mot α-SMA. Samtidig påvisning av cellekjerner (blå), vaskulatur (hvit) og T. cruzi-infiserte celler (rød) var mulig. Musen ble drept på dette tidspunktet etter infeksjon når vev og spesiell vaskulatur remodeling kan vurderes (skala bar: 400 μm). (iv) viser et forstørret volum fra dype hjerteregioner av (iii) som viser cellekjerner, vaskulatur og infiserte celler (skalalinje: 90 μm). (v) viser en optisk seksjon oppnådd av (iii) (skalalinje: 90 μm). (C) Økt cellularitet visualisert ved DNA-merking av hele ryddet skjelettmuskulatur. (i) Skjelettmuskelvev fra forrige eksperiment var DNA-farget, og avslørte områder med intens kjernefysisk merking (blå) samt T. cruzi-infiserte celler (rød) (skalastang: 200 μm) (se også film 4). (ii) avslører en intens akkumulering av blå kjerner i områder med lavere eller ingen påvisning av tdTomato-parasitt (skalastang: 100 μm). (iii) høy forstørrelse (60x) konfokal avbildning identifiserer DNA-merking av celler og parasitter i vevsseksjoner (skalalinje: 10 μm). (D) Boosting av tdTomato parasitt reporter markører i hele ryddet skjelettmuskulatur. (i-iii) Intakt skjelettmuskelvev fra mus infisert med 2 x 105 parasitter som uttrykker tdTomato ble fikset, avklart og immunstained med antistoffer mot RFP (RFP Booster). Et intenst og jevnt fluorescerende signal ble oppnådd i den langt røde kanalen etter RFP-boosting (grønn) av tdTomato-signalet (rød) (skalalinje: 100 μm). (E) Styrking av GFP parasitt reporter markører ved hjelp av anti-GFP nanolegemer. (i-iii) Skjelettmuskelvev fra mus infisert med 2 x 105 parasitter som uttrykker GFP ble fikset, avklart og immunostained med Alexa Fluor 647-konjugerte nanolegemer mot GFP (GFP Booster). Et sterkt fluorescerende signal ble oppnådd i den langt røde kanalen etter GFP-boosting (magenta) av GFP-fluorescensen (cyan). Mus fra (D) og (E) ble drept 30 dager etter infeksjon fordi parasittbelastningen når en topp på dette tidspunktet, og parasittinfiserte celler kan lett oppdages i skjelettmuskulatur (skalastang: 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: T. cruzi-infeksjon i hjerte og skjelettmuskulatur hos IFN-gamma mangelfulle mus. 3D-rekonstruksjoner av KUBIC-klargjort vev av IFN-gamma mangelfulle mus coinfected med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende Colombiana (rød) og GFP-uttrykkende Brasil (blå) T. cruzi-stammer på dag 17 etter infeksjon. Totalt 1151 individuelle skiver av hjertet og 559 av skjelettmuskulaturen ble anskaffet via LSFM. Sammenlignbare bilderesultater ble oppnådd hos tre uavhengige dyr. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Påvisning av T-cellerekruttering i T. cruzi-infisert CD8 reportermus. 3D-visualisering av en KUBISK-avklart skjelettmuskel fra en CD8-reportermus infisert med 2 x 105 Tdtomato-uttrykkende Colombiana T. cruzi-stamme (rød) og drept 14 dager etter infeksjon. Totalt 668 individuelle skiver av skjelettmuskulaturen ble avbildet av LSFM. ZsGreen1 som uttrykker T-celler (blå) så vel som T. cruzi-infiserte celler (rød) ble visualisert. Sammenlignbare bilderesultater ble oppnådd hos to dyr. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Immundeteksjon av vaskulatur i T. cruzi-infisert og ryddet hjerte. 3D-rekonstruksjon av et KUBISK-avklart hjerte av villtypemus infisert med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende Colombiana T. cruzi og immunostained med antistoffer mot α-SMA (blå) 40 dager etter infeksjon. Skiver gjennom hjertet avslører den intrikate vaskulaturen i hjertet og vevspenetrasjonen av α-SMA-antistoffene. Parasittinfiserte celler kunne observeres som lyse røde flekker i hjerteatriene (rød, høyre). Sammenlignbare bilderesultater ble oppnådd hos to dyr. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 4: Helorgan-DNA-fargingavslører områder med økt cellularitet. 3D-rekonstruksjon av CUBIC-avklart skjelettmuskulatur av villtype mus 40 dager etter infeksjon infisert med 2 x 105 tdTomato-uttrykkende Colombiana T. cruzi-stamme. Hele quadriceps muskelområdet ble farget med et grønt nukleært fargestoff. T. cruzi-infiserte celler (rød) og kjernene til hver celle i vevet (blå) ble visualisert. Zoom-ins av 3D-rekonstruksjonen avslører akkumulering av blå kjerner langs områder med få eller ingen påvisning av tdTomato-parasitter. Sammenlignbare bilderesultater ble oppnådd hos to dyr. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Tilleggsfil 1: Sammensetning av antistofffargeløsningene som ble brukt i studien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fraværet av omfattende, helorganavbildning av parasitter og immunresponsen begrenser forståelsen av kompleksiteten i vertsparasittinteraksjonene og hindrer evalueringen av terapier for Chagas sykdom. Den nåværende studien vedtok COCUIC-rørledningen for å klargjøre og flekke intakte organer og vev av T. cruzi-infiserte mus.
Flere vevsklareringsprotokoller ble testet i denne studien (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 og fDISCO13); Imidlertid bevarte bare CUBIC høye nivåer av tdTomato eller GFP parasittfluorescens. Tilsvarende viste tidligere rapporter kubisk bevaring av endogent uttrykte markører sammenlignet med andre vevsryddingstilnærminger35.
Begrenset oppløsningskapasitet er en av de nåværende forbeholdene for konvensjonell lysarkmikroskopi. Dette er tydelig i vanskelighetene med å løse individuelle parasitter i sterkt infiserte celler (figur 2C). De nyutviklede flisleggingsmikroskopene med forbedret oppløsningskapasitet og tilpasning av vevsutvidelsesteknikker kan løse dette problemet36.
Urenheter fra vaskebuffere, ryddeløsninger eller andre organer kan utfelle i vevet og produsere ikke-spesifikke signaler som kan forveksles med parasittinfiserte celler, individuelle parasitter eller andre strukturer. Imidlertid fluorescerer disse artefaktene vanligvis sterkt i flere kanaler, så etter bildeanalyse kan de enkelt kastes fra automatisert telling ved avbildning av vev i en alternativ kanal (vanligvis den grønne kanalen). Objekter med dobbel farge ble ansett som artefakter og ekskludert for automatisert kvantifisering.
Kjernefysiske flekker DAPI, PI, RedDot2 og SYTOX-G, presenterer gode nivåer av vevspenetrasjon og signalintensiteter i de fleste CUBIC-clearede organer; Det grønne DNA-fargestoffet viste imidlertid den beste ytelsen (figur 3B, C og film 4).
Disse resultatene viste at T. cruzi-infiserte celler lett kunne oppdages og kvantifiseres nøyaktig samtidig som de identifiserte T-celle- eller kjernereportermussignaler. Viktigst, LSFM oppdaget sjeldne biologiske hendelser, som DiR-positive sovende amastigoter, i et komplekst vevsmiljø med potensiell evne til å utvide den til epitopimmunfarging og DNA-merking. Nåværende studier undersøker også nytten av disse tilnærmingene for å overvåke aktiveringen av immuneffektorceller, samspillet mellom flere parasittstammer i samme vert, og induksjon av vevskader og reparasjon i Chagas sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Etsuo Susaki for deres verdifulle hjelp og anbefalinger angående vevsrydding og immunostaining protokoller. Vi er også takknemlige for M. Kandasamy fra CTEGD Biomedical Microscopy Core for teknisk støtte ved bruk av LSFM og konfokal bildebehandling. Vi takker også alle medlemmene i Tarleton Research Group for nyttige forslag gjennom hele denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
