Summary
Il presente protocollo descrive la microscopia fluorescente a foglio luminoso e metodi automatizzati assistiti da software per visualizzare e quantificare con precisione i parassiti proliferanti e dormienti del Trypanosoma cruzi e le cellule T in organi e tessuti intatti e cancellati. Queste tecniche forniscono un modo affidabile per valutare i risultati del trattamento e offrono nuove informazioni sulle interazioni parassita-ospite.
Abstract
La malattia di Chagas è una patologia trascurata che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, principalmente in America Latina. L'agente della malattia di Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), è un parassita intracellulare obbligato con una biologia diversificata che infetta diverse specie di mammiferi, compresi gli esseri umani, causando patologie cardiache e digestive. Il rilevamento affidabile delle infezioni in vivo da T. cruzi è stato a lungo necessario per comprendere la complessa biologia della malattia di Chagas e valutare accuratamente l'esito dei regimi di trattamento. L'attuale protocollo dimostra una pipeline integrata per la quantificazione automatizzata delle cellule infette da T. cruzi in organi ricostruiti in 3D e cancellati. La microscopia fluorescente a foglio luminoso consente di visualizzare e quantificare con precisione i parassiti T. cruzi attivamente proliferanti e dormienti e le cellule effettrici immunitarie in interi organi o tessuti. Inoltre, è stata adottata con successo la pipeline CUBIC-HistoVision per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. La pulizia dei tessuti accoppiata con l'immunocolorazione 3D fornisce un approccio imparziale per valutare in modo completo i protocolli di trattamento farmacologico, migliorare la comprensione dell'organizzazione cellulare dei tessuti infetti da T. cruzi e si prevede che farà avanzare le scoperte relative alle risposte immunitarie anti-T. cruzi, al danno tissutale e alla riparazione nella malattia di Chagas.
Introduction
La malattia di Chagas, causata dal parassita protozoo T. cruzi, è tra le malattie tropicali più trascurate al mondo, causando circa 13.000 morti all'anno. L'infezione spesso progredisce da uno stadio acuto a uno cronico producendo patologia cardiaca nel 30% dei pazienti, tra cui aritmie, insufficienza cardiaca e morte improvvisa 1,2. Nonostante la forte risposta immunitaria dell'ospite suscitata contro il parassita durante la fase acuta, un basso numero di parassiti persiste cronicamente per tutta la vita dell'ospite in tessuti come il cuore e il muscolo scheletrico. Diversi fattori, tra cui l'insorgenza ritardata delle risposte immunitarie adattative e la presenza di forme non replicanti del parassita, possono contribuire alla capacità di T. cruzi di evitare una completa eliminazione da parte del sistema immunitario 3,4,5,6. Inoltre, le forme dormienti non replicanti del parassita mostrano una bassa suscettibilità ai farmaci tripanocidi e possono in parte essere responsabili del fallimento del trattamento osservato in molti casi 7,8.
Lo sviluppo di nuove tecniche di imaging offre l'opportunità di ottenere informazioni sulla distribuzione spaziale dei parassiti nei tessuti infetti e sulla loro relazione con le cellule immunitarie coinvolte nel loro controllo. Queste caratteristiche sono cruciali per una migliore comprensione dei processi di controllo dei parassiti da parte del sistema immunitario e per tracciare i rari parassiti dormienti presenti nei tessuti cronici.
La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) è uno dei metodi più completi e imparziali per l'imaging 3D di tessuti o organi di grandi dimensioni senza sezionamento sottile. I microscopi a foglio di luce utilizzano un sottile foglio di luce per eccitare solo i fluorofori nel piano focale, ridurre il fotosbiancamento e la fototossicità dei campioni e registrare immagini di migliaia di strati di tessuto utilizzando telecamere ultraveloci. L'elevato livello di trasparenza tissutale necessario per la corretta penetrazione della luce laser nei tessuti si ottiene omogeneizzando l'indice di rifrazione (RI) dopo la delipidazione e la decolorazione dei tessuti, che riduce la dispersione della luce e rende immagini di alta qualità 9,10,11.
Sono stati sviluppati approcci di pulizia dei tessuti per l'imaging di topi interi 12,13,14, organoidi 15,16,17, organi che esprimono marcatori fluorescenti reporter 18,19,20,21,22,23 e recentemente un numero limitato di tessuti umani 24 . Gli attuali metodi per la pulizia dei tessuti sono classificati in tre famiglie: (1) metodi a base di solventi organici come i protocolli DISCO 25,26, (2) metodi a base di idrogel, come CLARITY27, e metodi acquosi, come CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . I protocolli CUBIC mantengono la forma degli organi e l'integrità dei tessuti, preservando la fluorescenza delle proteine reporter espresse endogenamente. L'aggiornamento più recente di questa tecnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), consente anche la rilevazione di epitopi utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza e marcatura del DNA28.
Nel presente protocollo, è stata utilizzata la pipeline CUBIC per rilevare T. cruzi che esprimono proteine fluorescenti in tessuti murini chiariti intatti. I tessuti otticamente trasparenti sono stati ripresi con LSFM, ricostruiti in 3D e il numero totale preciso di cellule infette da T. cruzi , amastigoti dormienti e cellule T per organo è stato quantificato automaticamente. Inoltre, questo protocollo è stato adottato con successo per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. Questi approcci sono essenziali per comprendere l'espansione e il controllo di T. cruzi negli ospiti infetti e sono utili per valutare pienamente la chemioterapia e l'immunoterapia per la malattia di Chagas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo studio è stato condotto in stretta conformità con la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento delle linee guida di accreditamento per la cura degli animali da laboratorio. Il protocollo sull'uso degli animali (controllo dell'infezione da T. cruzi nei topi-A2021 04-011-Y1-A0) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia. B6. Per il presente studio sono stati utilizzati topi C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J e C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (femmina,1-2 mesi di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Infezione, perfusione e dissezione
- Topi infettati per via intraperitoneale con tripomastigoti derivati da colture tissutali di Colombiana (DTU TcI) o Brasile (DTU TcV) ceppo di T. cruzi che esprimono rispettivamente proteine fluorescenti tdTomato o GFP. La dose di infezione potrebbe variare da 50.000 a 200.000 tripomastigoti diluiti in 100 μL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Dettagli specifici sulla generazione di parassiti reporter e modelli murini di infezione sono disponibili in Canavaci et al. 29 e Bustamante et al.30. - Eutanasia dei topi per inalazione di anidride carbonica ad una portata di 3-7 L/min. Non appena gli animali smettono di mostrare qualsiasi riflesso del pedale, fare un'incisione longitudinale attraverso la pelle dall'addome verso lo sterno. Quindi tagliare la parete del corpo dall'addome e continuare attraverso le costole su ciascun lato del torace fino a quando lo sterno può essere sollevato, esponendo il cuore.
- Come descritto nella Figura 1, praticare un'incisione di 2,5 mm nel padiglione auricolare destro del cuore e raccogliere il sangue drenante utilizzando una punta di micropipetta da 1 ml.
- Inserire un ago a farfalla (collegato a un'estremità del sistema di perfusione) nell'apice del ventricolo sinistro fino a raggiungere l'aorta ascendente. Utilizzare colla a base di gel (vedere la tabella dei materiali) per sigillare il foro di ingresso attorno all'ago e mantenere l'ago in posizione durante le perfusioni.
- Perfondere i topi30 con 50 ml di eparina-PBS fredda (pH 7,4, 10 U/ml di eparina) o fino a quando il fluido che esce dal mouse verso il vassoio di raccolta è libero da sangue.
- Perfondere con 50 mL di paraformaldeide (PFA) fredda al 4% (p/v) (pH 7,4) in PBS.
NOTA: La fissazione del tessuto PFA è probabilmente uno dei passaggi critici del protocollo, in particolare per il mantenimento delle strutture epitopiche e la successiva immunorilevazione. Il PFA si degrada nel tempo, quindi deve essere preparato al momento. Il pH della soluzione è anche importante per evitare una fissazione eccessiva, che potrebbe portare a una scarsa pulizia dei tessuti.
ATTENZIONE: Il PFA è moderatamente tossico per contatto con la pelle. L'esposizione acuta è anche altamente irritante per il naso, gli occhi e la gola. L'esposizione a lungo termine a bassi livelli nell'aria o nella pelle può causare irritazione cutanea come dermatiti e prurito e problemi respiratori simili all'asma. Indossare protezioni per viso e occhi e non respirare polvere, gas, nebbia, fumi o vapori.- Dopo la perfusione PFA, perfondere il topo con 100 mL di tampone CUBIC-P per raggiungere i livelli di chiarificazione menzionati al punto 1.5.
- Per preparare il tampone CUBIC-P, sciogliere il 10% di N-butildietanolammina, il 5% di Triton X-100 e il 5% di 1-N-metilimidazolo in acqua bidistillata o utilizzare i cocktail commerciali (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: passaggi 1.6.1.-1.6.2. sono raccomandati solo per organi altamente pigmentati come il cuore e i reni poiché richiedono una fase di pre-compensazione per ottenere maggiori livelli di trasparenza. Dopo aver usato CUBIC-P, sezionare gli organi e procedere direttamente al passaggio 2: Pulizia dei tessuti.
- Sezionare i campioni di tessuto/organi30 da visualizzare e post-fissarli in 4% (p/v) di PFA in PBS (~10 mL/intero organo) durante la notte (ON) a 4 °C con agitazione delicata (non più di 5 x g) in tubi conici da 50 ml.
NOTA: Tutte le incubazioni da qui in poi devono essere eseguite su tubi posti orizzontalmente a 20-30 °C al riparo dalla luce. - Lavare il campione in 10 mL di PBS (integrato con azoturo di sodio allo 0,05% (NaN 3) per3 ore (tre volte) a temperatura ambiente (RT) con agitazione delicata (5 x g).
NOTA: I tessuti possono essere congelati incubando in 10 ml di saccarosio al 30% in PBS con agitazione delicata (5 x g) a 4 °C ON in tubi conici da 50 ml. Dopo che i tessuti sono affondati sul fondo del tubo, incorporarli nel composto OCT e mantenerli a -80 °C. Scongelare a RT fino a quando il composto OCT si scioglie completamente, quindi lavare in PBS (~10 mL/organo intero) ON a 4 °C con agitazione delicata (5 x g) in tubi conici da 50 ml. Procedere al passaggio 2.
2. Pulizia dei tessuti
NOTA: Tutte le pulizie dei tessuti eseguite in questo lavoro sono state eseguite utilizzando il protocollo CUBIC I22. Sono stati utilizzati tre diversi cocktail: CUBIC-P per la delipidazione e la rapida decolorazione durante le perfusioni, CUBIC-L per la delipidazione e la decolorazione e CUBIC-R per l'abbinamento RI. La colorazione del DNA e l'immunocolorazione sono state eseguite utilizzando rispettivamente il kit di colorazione nucleare 3D CUBIC-HV 1 e il kit di immunocolorazione 3D CUBIC-HV 1 (vedi Tabella dei materiali).
- Immergere i singoli organi in 10 mL di CUBIC-L diluito al 50% in acqua (vedi Tabella dei materiali) agitando delicatamente (5 x g) a RT (ON) in tubi conici da 50 ml. Tenere i tubi piatti sulla piastra di agitazione.
NOTA: Per evitare danni ai tessuti, gli organi vengono mantenuti nello stesso tubo e le soluzioni vengono raccolte utilizzando un sistema di vuoto. Per preparare CUBIC-L, sciogliere il 10% di N-butildietanolammina e il 10% di Triton X-100 in acqua bidistillata utilizzando i cocktail commerciali (vedi Tabella dei materiali).
ATTENZIONE: CUBIC-L provoca gravi lesioni oculari. Indossare protezioni per occhi e viso. Smaltire in un impianto di smaltimento dei rifiuti riconosciuto. - Immergere il campione in 10 ml di 100% CUBIC-L per 6 giorni (rinfrescando la soluzione il giorno 3).
NOTA: Al termine di questo periodo di incubazione, i tessuti devono essere quasi completamente trasparenti. - Lavare gli organi trasparenti con PBS (integrato con 0,05% NaN3) per 2 ore (tre volte) a 37 °C con agitazione delicata (5 x g). Trasferire i fazzoletti in un nuovo tubo conico da 50 mL ad ogni lavaggio per rimuovere Triton X-100.
NOTA: Come descritto nella Figura 2B, se l'obiettivo dell'esperimento è quello di visualizzare proteine reporter espresse endogenamente da parassiti o topi transgenici di T. cruzi (Figura 2C-F), saltare i passaggi 3, 4 e 5 e continuare direttamente con il punto 6.
3. Colorazione del DNA
- Diluire il colorante di acidi nucleici disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) in 5 ml di tampone colorante (incluso nel kit) a 1/2.500 di diluizione.
- Immergere il tessuto nella soluzione di colorante nucleare e incubare a 37 °C con una leggera rotazione per 5 giorni utilizzando tubi conici da 15 mL in posizione eretta.
- Lavare con 15 ml di tampone di lavaggio 3D per macchie nucleari (incluso nel kit) per 2 ore (tre volte) a RT con agitazione delicata (5 x g).
NOTA: Altri coloranti di DNA possono essere utilizzati in queste concentrazioni e tempi di incubazione: DAPI (incluso nel kit): 1/200, 5 giorni di incubazione; BOBO-1: 1/400, 5 giorni di incubazione; Ioduro di propidio (PI) (incluso nel kit): 1/100, 3 giorni di incubazione; RedDot2: 1/250, 3 giorni di incubazione. Se lo scopo specifico dell'esperimento è quello di visualizzare sia le proteine reporter espresse endogenamente che utilizzare coloranti nucleari, saltare i passaggi 4 e 5 e continuare direttamente al punto 6.
4. Digestione della matrice extracellulare (ECM)
NOTA: La digestione della ialuronidasi della ECM deve essere eseguita per facilitare la corretta penetrazione degli anticorpi nelle regioni profonde dei tessuti28.
- Immergere i singoli organi in 15 mL di tampone di reazione ialuronidasi per 2 ore a 37 °C in un tubo conico da 50 mL in posizione piana al riparo dalla luce.
NOTA: Per preparare il tampone di reazione della ialuronidasi, sciogliere 10 mM di CAPSO; 150 mM di cloruro di sodio (NaCl) e 0,05% di NaN3 (vedi tabella dei materiali) in acqua bidistillata e regolare il pH a 10. - Preparare la soluzione enzimatica mescolando 75 μL di 20 mg/ml di stock di ialuronidasi in 425 μL di tampone di reazione ialuronidasi. Per preparare 20 mg/mL di stock di ialuronidasi, sciogliere la ialuronidasi in 50 mM di tampone carbonatico, 150 mM di NaCl, 0,01% di BSA e 0,05% di NaN3 (vedere Tabella dei materiali). Regolare il pH a 10 e aliquote in volumi di 77 μL a -30 °C.
- Eliminare il tampone di reazione della ialuronidasi con una pipetta e immergere l'organo nella soluzione enzimatica (500 μL in un tubo conico da 15 ml) in posizione eretta al riparo dalla luce per 24 ore a 37 °C con agitazione delicata (5 x g).
- Lavare il campione in 15 mL di tampone di lavaggio ialuronidasi in un tubo conico da 50 mL in posizione orizzontale al riparo dalla luce per 2 ore (tre volte) a 37 °C con agitazione delicata (5 x g).
- Per preparare il tampone di lavaggio ialuronidasi, sciogliere 50 mM di tampone carbonato, 150 mM di NaCl, 0,1% (v/v) di Triton X-100, 5% (v/v) di metanolo e 0,05% NaN3. Regolare il pH a 10. Per preparare 10 volte il brodo tampone di carbonato-NaCl, sciogliere 2,96 g di carbonato di sodio, 1,86 g di carbonato acido di sodio e 8,77 g di NaCl in 100 ml di acqua bidistillata con lo 0,05% di NaN3 (vedere la tabella dei materiali) e regolare il pH a 10.
5. Immunocolorazione
- Etichettare la vascolarizzazione utilizzando anticorpi anti-α-SMA (actina alfa-piccolo muscolo, vedere la tabella dei materiali) seguendo i passaggi seguenti.
- Generare complesso anticorpale secondario primario più coniugato Fab frammento. Inizia questa reazione 1,5 ore prima della procedura di colorazione.
- Calcolare la quantità richiesta di anticorpi primari e secondari (mescolare con un rapporto 1:0,5 in peso).
NOTA: Per l'anticorpo primario anti-α-SMA, sono necessari 3,5 μg per marcare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per il prodotto da 2,5 mg/ml, sono necessari 3,5/2,5 = 1,4 μL di soluzione anticorpale. Per l'anticorpo secondario AlexaFluor 647 anti-topo Fab fragment, sono necessari 1,75 μg per etichettare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per il prodotto da 1,7 mg/ml, è necessario 1,75/1,7 = 1 μL di soluzione anticorpale. - Mescolare gli anticorpi primari e secondari in una provetta ambrata da 2 mL e incubare per 1,5 ore a 37 °C.
- Calcolare la quantità richiesta di anticorpi primari e secondari (mescolare con un rapporto 1:0,5 in peso).
- Per lo scambio di tampone, miscelare 7,5 mL di 2x tampone immunocolorante 3D HV1 (incluso nel kit, vedere Tabella dei materiali) con 7,5 mL di acqua bidistillata e immergere il campione di tessuto per 1,5 ore a 32 °C con un leggero scuotimento (5 x g) in un tubo conico da 15 mL in posizione orizzontale. Iniziare questa reazione simultaneamente come generazione di complesso anticorpale (1,5 ore prima della procedura di immunocolorazione).
- Generare complesso anticorpale secondario primario più coniugato Fab frammento. Inizia questa reazione 1,5 ore prima della procedura di colorazione.
- Eseguire l'immunocolorazione 3D seguendo i passaggi seguenti.
- In una provetta conica da 15 ml, preparare la soluzione anticorpale colorante seguendo il file supplementare 1.
- Prelevare il campione di tessuto dal mezzo di scambio tampone (punto 5.1.2) e immergerlo nella soluzione anticorpale. Incubare i tessuti singolarmente per 1 settimana a 32 °C agitando delicatamente (5 x g) le provette in posizione eretta al riparo dalla luce. Sigillare il tubo con pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione.
- Passare a 4 °C e incubare ON in posizione eretta.
- Raffreddare 1x tampone immunocolorante 3D HV1 (incluso nel kit, vedere la tabella dei materiali) a 4 °C e lavare il campione con tampone da 15 ml (due volte) per 30 minuti ciascuno a 4 °C con agitazione delicata (5 x g). Tenere 15 mL di tubi conici in posizione orizzontale fino al punto 5.2.7.
- Diluire la formalina all'1% in 1x tampone di lavaggio immunocolorante HV1 3D e immergere il campione in 8 mL della soluzione per 24 ore a 4 °C agitando delicatamente (5 x g).
- Incubare in soluzione fresca di formalina all'1% per 1 h a 37 °C agitando delicatamente (5 x g).
- Lavare in 15 mL di PBS per 2 ore a 25 °C agitando delicatamente (5 x g).
- Aumentare il segnale tdTomato utilizzando anticorpi anti-Red Fluorescent Protein (RFP) seguendo i passaggi seguenti.
- Seguire gli stessi tempi di incubazione e le stesse temperature del punto 5.2.2. Calcolare la quantità di anticorpi primari e secondari (vedere la tabella dei materiali) e mescolarli in un rapporto 1:0,5 in peso.
NOTA: Per l'anticorpo primario anti-RFP, sono necessari 5 μg per etichettare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per 1,25 mg/mL di prodotto, sono necessari 5/1,25 = 4 μL della soluzione. Per l'anticorpo secondario Alexa Fluor 647 anti-coniglio Fab frammento, sono necessari 2,5 μg per etichettare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per il prodotto da 1,5 mg/ml, sono necessari 2,5/1,5 = 1,7 μL della soluzione. - Preparare la soluzione anticorpale come indicato nel file supplementare 1.
- Seguire gli stessi tempi di incubazione e le stesse temperature del punto 5.2.2. Calcolare la quantità di anticorpi primari e secondari (vedere la tabella dei materiali) e mescolarli in un rapporto 1:0,5 in peso.
- Potenzia i segnali GFP utilizzando nanocorpi anti-GFP seguendo i passaggi seguenti.
- Seguire gli stessi tempi di incubazione e le stesse temperature indicati al punto 5.2.2.
NOTA: I nanocorpi anti-GFP (vedi Tabella dei materiali) sono coniugati con Alexa Fluor 647, quindi la generazione del complesso anticorpale non è necessaria. - Preparare la soluzione anticorpale come indicato nel file supplementare 1.
- Seguire gli stessi tempi di incubazione e le stesse temperature indicati al punto 5.2.2.
6. Corrispondenza RI
- Immergere organi trasparenti in 5 mL di soluzione CUBIC-R+ diluita in acqua al 50% (vedere Tabella dei materiali) a RT (ON) agitando delicatamente (5 x g) in un tubo conico da 50 ml. Mantenere i tubi in posizione eretta durante l'intera fase di corrispondenza del RI.
NOTA: Le soluzioni riciclate di CUBIC R+ provenienti da esperimenti precedenti potrebbero essere riutilizzate (fino a quattro volte) in questa fase. Per preparare la soluzione CUBIC-R+, sciogliere il 45% di 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolone (antipirina), il 30% di nicotinamide o N-metilnicotinamide e lo 0,5% di N-butildietanolammina in acqua bidistillata o utilizzare il tampone commerciale CUBIC-R+ (vedere Tabella dei materiali).
ATTENZIONE: CUBIC-R+ provoca irritazione cutanea, grave irritazione oculare e danni agli organi. Indossare guanti protettivi e garantire la protezione degli occhi e del viso. Non respirare polvere, fumi, gas, nebbia o vapori. Smaltire in un impianto di smaltimento dei rifiuti riconosciuto. - Sostituire il 50% di CUBIC-R+ con 5 mL di 100% di CUBIC-R+ e incubare con un leggero agitamento (5 x g) a RT per 2 giorni. Quindi, trasferire i tessuti su una pila di salviette prive di lanugine e ruotare con attenzione i tessuti per rimuovere la soluzione CUBIC-R+ dalle superfici degli organi per 5 minuti.
7. Montaggio
- Dopo aver asciugato i tessuti, trasferirli in 5 ml di soluzione di montaggio (RI = 1,520) (vedere Tabella dei materiali) in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti e incubarli (ON) a RT. Girare frequentemente i tessuti per eliminare le bolle d'aria, specialmente sulle superfici degli organi.
NOTA: Gli organi possono essere conservati per più di 6 mesi in Mounting Solution o CUBIC-R+. - Far aderire i tessuti al supporto del campione del microscopio utilizzando colla gel a base di cianoacrilato.
- Immergere i campioni nella cuvetta di quarzo del microscopio riempita con 120 ml di soluzione di montaggio e visualizzarli trasversalmente al loro asse longitudinale. Aderire al cuore con l'apice e l'aorta allineati orizzontalmente.
NOTA: Gli organi chiariti e montati possono essere sezionati con una vibratoma e ripresi ad alto ingrandimento mediante microscopia confocale. Incorporare gli organi in agarosio al 2% e tagliare sezioni di 100-500 μm. Gli organi possono anche essere sezionati manualmente con una lama affilata per produrre sezioni di tessuto spesso (>1000 μm). Dopo il sezionamento, posizionare le fette in piastre di Petri da 35 mm con fondo di vetro, montare utilizzando la stessa soluzione di montaggio, sigillare con smalto per unghie e immagine con un microscopio confocale.
8. Acquisizione di immagini
- Immagina i campioni montati con un microscopio a foglio luminoso (vedi Tabella dei materiali). Impostare l'ingrandimento e la dimensione del passo tra le singole fette a 3 μm e utilizzare laser a foglio luminoso destro e sinistro con spessori di 5 μm e larghezza del 100%. Impostare la costante del tempo di esposizione a 50-100 ms e regolare la potenza del laser dal 10% all'80% a seconda dell'intensità del segnale di fluorescenza.
- Per la co-rilevazione di parassiti che esprimono il pomodoro e amastigoti dormienti colorati con DiR (Figura 2C), utilizzare rispettivamente canali rossi (Ex/Em 561/620-660 nm) e infrarossi (Ex/Em 785/845-55 nm). Per la co-rilevazione di cellule T e parassiti che esprimono tdTomato-espressi nel topo reporter CD8 (Figura 2D), utilizzare rispettivamente il canale verde (Ex/Em 488/525-50 nm) e il canale rosso.
- Per i saggi di coinfezione (Figura 2E), così come per la co-rilevazione di parassiti che esprimono GFP in topi reporter nuclei (Figura 2F), utilizzare rispettivamente i canali verde e rosso. Per la rilevazione di tdParassiti che esprimono il pomodoro, colorante nucleare e vascolarizzazione cardiaca (Figura 3B, C), utilizzare rispettivamente i canali rosso, verde e rosso lontano (Ex/Em 640/680-730 nm).
- Rilevare gli anticorpi anti-RFP con il canale rosso lontano e i nanocorpi anti-GFP utilizzando il canale verde (Figura 3D).
- Convertire gli stack di immagini TIFF acquisiti e ricostruire in 3D gli organi utilizzando il software Imaris v9.7.2 (vedi Tabella dei materiali).
9. Ricostruzione e quantificazione delle superfici con il software Imaris
- Selezionare lo strumento dell'algoritmo di rilevamento delle superfici e avviare la procedura guidata nel software di analisi delle immagini.
- Eseguire un'analisi iniziale in una regione 3D di interesse (selezionata casualmente) e quindi applicarla all'intera ricostruzione dell'organo 3D. Dopo aver scelto una regione di interesse (ROI), selezionare il canale da analizzare, deselezionare il pulsante Arrotonda e selezionare la sottrazione in background.
NOTA: la sottrazione dello sfondo calcola un valore di sfondo locale univoco per ogni voxel e lo sottrae dal valore pixel originale. Il diametro della sfera più grande che si inserisce nell'oggetto deve essere fino a 200 μm per le cellule infette da T. cruzi, 10 μm per le cellule T e 5 μm per i singoli parassiti. - Utilizzare l'istogramma per regolare la classificazione e l'elenco a discesa del filtro per selezionare le misure per la classificazione.
NOTA: Utilizzare l'istogramma per regolare la classificazione: si raccomandano misure di ellitticità (oblate) e sfericità. - Finalizzare la procedura guidata, premere il pulsante delle statistiche e recuperare il numero totale di cellule infette da parassiti o cellule T come numero di componenti disconnessi per punto temporale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I tessuti fissi CUBIC sono stati lavati con PBS per rimuovere i fissativi e quindi incubati con cocktail CUBIC-L, una soluzione tamponata di base di amminoalcoli che estraggono pigmenti e lipidi dal tessuto con conseguente decolorazione del tessuto mantenendo l'architettura tissutale. Le linee della griglia nella carta possono essere viste attraverso i tessuti che indicano un'appropriata pulizia degli organi (Figura 2A). Dopo la delipidazione, i tessuti sono stati lavati e immersi in CUBIC-R+ e soluzione di montaggio rispettivamente per l'omogeneizzazione RI e l'imaging (Figura 2B).
Un topo selvatico è stato infettato con tripomastigoti che esprimono tdTomato, pre-colorati con il colorante cianina nel vicino infrarosso DiR. Il topo è stato sottoposto a eutanasia 15 giorni dopo l'infezione e il cuore intatto è stato sezionato, riparato e cancellato. L'imaging LSFM e la ricostruzione 3D ci hanno permesso di visualizzare i parassiti proliferanti di T. cruzi che esprimono tdTomato. I livelli di autofluorescenza nel canale rosso possono essere utilizzati per la corretta visualizzazione della struttura e dei bordi del cuore (Figura 2C i). LSFM è stato utile anche per identificare le forme dormienti resistenti ai farmaci 7,8. La colorazione pre-infezione dei parassiti con colorante DiR consente il monitoraggio dei parassiti dormienti visualizzando i parassiti che non avevano diluito il colorante attraverso la replicazione, come precedentemente riportato per CellTrace Violet7.
I parassiti dormienti (ciano) possono essere identificati nel cuore come raffigurato negli inserti ingranditi 3D (frecce gialle) (Figura 2C ii,iii). La fluorescenza a proiezione Z è stata segmentata automaticamente per generare un modello di superficie 3D ricostruito per la visualizzazione spaziale e la quantificazione del numero totale di cellule infette da T. cruzi e parassiti dormienti durante l'intera ricostruzione 3D (Figura 2A). L'analisi del modello di superficie 3D ha rivelato 186 cellule infette da T. cruzi con una percentuale maggiore di cellule infette nell'atrio cardiaco (123) rispetto ai ventricoli (63) e 18 parassiti dormienti in tutto il cuore (Figura 2C i). In un precedente rapporto, è stata segnalata una pipeline simile per monitorare il numero di cellule infette da T. cruzi e parassiti dormienti nei tessuti dei topi chiariti dopo il trattamento farmacologico31. È importante notare che le stime per il numero di parassiti dormienti sono probabilmente sottostimate, poiché la tecnica di diluizione del colorante consente di rilevare solo i parassiti che non si sono replicati in modo significativo dall'infezione iniziale, ma non rileva quelli che sono diventati dormienti più tardi nell'infezione dopo più cicli di divisione.
Un approccio simile è stato utilizzato per monitorare l'interazione tra diversi ceppi di T. cruzi in topi carenti di interferone (IFN)-gamma. La produzione di IFN-gamma da parte delle cellule T effettrici è essenziale per il controllo immunitario di T. cruzi. Nei topi carenti di IFN-gamma, i parassiti proliferano con una restrizione immunitaria minima, producendo un numero molto elevato di cellule infette negli organi. Questi modelli immunodeficienti sono strumenti utili per studiare l'efficacia di nuovi farmaci senza la restrizione imposta dal riconoscimento immunitario, e quindi consentono di rilevare la recidiva del parassita dopo il trattamento. I topi carenti di IFN-gamma sono stati coinfettati con ceppi di Colombiana (rosso) che esprimono il pomodoro e del Brasile (blu) che esprimono GFP. I topi sono stati sottoposti a eutanasia 17 giorni dopo l'infezione e i cuori intatti sono stati sezionati, riparati e ripuliti. In questo modello immunodeficiente, le cellule ospiti infettate con entrambi i ceppi di T. cruzi possono essere osservate in varie fasi dello sviluppo del parassita, comprese le cellule infette grandi, medie e piccole e quelle recentemente scoppiate. Il taglio attraverso i tessuti mostra abbondanti cellule infette da parassiti negli atri cardiaci a varie profondità tissutali (Figura 2E i-iii e Filmato 1).
Un incrocio di topi C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J e B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, in cui tutte le cellule T esprimono la proteina fluorescente verde ZsGreen1, è stato utilizzato per monitorare il reclutamento delle cellule T nei tessuti infetti da T. cruzi. I topi sono stati sottoposti a eutanasia 14 giorni dopo l'infezione da parassiti che esprimono il pomodoro e il muscolo scheletrico è stato asportato, eliminato e ripreso da LSFM. ZsGreen1 che esprimono cellule T (blu) e cellule infette da T. cruzi (rosso) sono state rilevate in modo robusto (Figura 2D i e Filmato 2). Gli zoom 3D della ricostruzione 3D hanno identificato le cellule T nella regione di una cellula infetta (Figura 2D ii). Sezioni spesse di vibratomo (200-500 μm) dello stesso tessuto ci permettono di visualizzare l'interfaccia delle cellule T e delle cellule infettate dell'ospite mediante microscopia confocale (Figura 2D iii).
Un modo alternativo per monitorare i focolai di infiammazione si basa sull'accumulo di nuclei cellulari intorno alle cellule infette da T. cruzi. Un topo reporter in cui tutti i nuclei cellulari esprimono la proteina fluorescente tdTomato è stato utilizzato per questo scopo. L'espressione nucleare del pomodoro (rosso) è stata facilmente rilevata nei tessuti dopo il processo di pulizia. Un topo reporter nucleare è stato infettato da parassiti T. cruzi che esprimono GFP (ciano) e, 35 giorni dopo l'infezione, è stato eutanasia e i muscoli scheletrici sono stati asportati, eliminati e ripresi da LSFM (Figura 2F i-iii). Le sezioni ottiche ingrandite del muscolo scheletrico rivelano una maggiore cellularità accumulando nuclei rossi lungo i parassiti che esprimono GFP (Figura 2F ii). Sezioni vibratome dello stesso tessuto confermano l'accumulo precedentemente descritto di nuclei rossi lungo i parassiti che esprimono GFP mediante microscopia confocale (Figura 2F iii).
Il protocollo CUBIC è stato anche adattato per l'immunocolorazione e l'etichettatura del DNA di organi e tessuti intatti e cancellati infetti da T. cruzi (Figura 3A). I topi sono stati sottoposti a eutanasia 40 giorni dopo l'infezione da parassiti che esprimono il pomodoro e i cuori sono stati sezionati, fissati e cancellati. Il cuore pulito intatto è stato lavato e colorato per 5 giorni con un marcatore di DNA verde, quindi lavato di nuovo e immunocolorato per 7 giorni con anticorpi contro la α-SMA. I campioni sono stati post-fissati, lavati, abbinati RI e fotografati con LSFM. Il rilevamento simultaneo di più segnali fluorescenti, inclusi nuclei, vascolarizzazione e cellule infette da T. cruzi, è stato possibile seguendo questo protocollo. L'immunocolorazione α-SMA (bianca) ha presentato alti livelli di segnale rivelando l'intricata vascolarizzazione del cuore (Figura 3B ii e Filmato 3). Una sezione ottica dalle regioni cardiache più profonde mostra la penetrazione tissutale degli anticorpi α-SMA nelle condizioni stabilite (Figura 3B v). La colorazione del DNA (blu) ha anche mostrato una buona penetrazione dei tessuti, livelli di fluorescenza e colorazione volumetrica stabile. Alcune aree con intensa marcatura del DNA sono state identificate in diverse posizioni cardiache (Figura 3B i) e intorno alle fibre muscolari scheletriche (Figura 3C i e Filmato 4). Un'immagine ingrandita del muscolo scheletrico ha mostrato un accumulo di nuclei blu in aree con pochi o non rilevabili parassiti del pomodoro, suggerendo il reclutamento di cellule immunitarie nei siti di infezione da T. cruzi attuale o precedente (Figura 3C ii). In altri casi, le cellule ospiti infette avevano poca o nessuna evidenza di infiltrati cellulari vicini (frecce bianche) (Figura 3C i). Le sezioni vibratomo dello stesso tessuto della Figura 3C ii mostrano la colorazione del DNA delle cellule e dei parassiti che esprimono il pomodoro mediante microscopia confocale (Figura 3C iii).
Esperimenti precedenti hanno dimostrato che i parassiti dormienti mostravano un'espressione bassa o trascurabile di proteine reporter tdTomato o GFP (Figura 2C ii e iii). Per migliorare la rilevazione di queste proteine fluorescenti, i tessuti eliminati sono stati immunocolorati con anticorpi anti-RFP o -GFP. I tessuti muscolari scheletrici intatti di topi infettati da parassiti che esprimono tdTomato o GFP sono stati fissati, chiariti e immunocolorati con anticorpi contro RFP (RFP Booster) (Figura 3D) o nanocorpi contro GFP coniugati con Alexa Fluor 647 (GFP Booster) (Figura 3E), rispettivamente. I campioni sono stati post-fissati, lavati, abbinati RI e fotografati con LSFM. In entrambi i casi, il potenziamento dei segnali GFP e tdTomato da parte degli anticorpi ha provocato una forte fluorescenza (Figura 3D ii e 3E ii). Le immunocolorazioni che utilizzano anticorpi potenzianti rappresentano uno strumento versatile che verrà utilizzato per rilevare i dormienti di T. cruzi in organi e tessuti interi chiarificati e rilevare qualsiasi segnale sottorappresentato dalle proteine reporter di RFP o GFP dei membri della famiglia.
Figura 1: Inserimento dell'ago durante la perfusione transcardiaca. (A) Una rappresentazione schematica che mostri i passi eseguiti prima di perfondere il topo attraverso il cuore e la corretta posizione e direzione dell'ago di perfusione nel ventricolo sinistro. È stata eseguita una piccola incisione nell'atrio destro ed è stato raccolto il sangue drenante (1); Un ago a farfalla è stato inserito nell'apice del cuore. Mantenere la direzione in modo che l'ago non penetri attraverso il setto (2). Il foro di ingresso attorno all'ago è stato sigillato con colla a base di gel (3). Il fegato è pieno di sangue e appare rosso prima della perfusione; Tuttavia, dopo la perfusione, perde la pigmentazione e diventa pallido. RA, padiglione auricolare destro; LA, padiglione auricolare sinistro; RV, ventricolo destro; LV, ventricolo sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione di cellule infette da T. cruzi, amastigoti dormienti e focolai di infiammazione negli organi eliminati. (A) Schema dell'organo intero T. cruzi-rilevamento delle cellule infette mediante pulizia dei tessuti, imaging LSFM e quantificazione assistita da software in modelli di superficie 3D. (io) Immagini in campo luminoso del cuore e del muscolo scheletrico prima (a sinistra) e dopo (a destra) la pulizia (barra della scala: 1000 μm). (Ii) Microscopio a fluorescenza a foglio di luce. (Iii) Il topo con deficit di IFN-gamma è stato infettato da 2 x 105 tdTripomastigoti che esprimono il pomodoro. A 17 giorni dopo l'infezione, il cuore è stato sezionato, CUBIC eliminato e LSFM ripreso (barra di scala: 500 μm). (IvLa fluorescenza a proiezione Z è stata segmentata automaticamente per generare un modello di superficie 3D ricostruito per la visualizzazione spaziale e la quantificazione del numero di T. cruzi-cellule infette. Un totale di 736 T. cruzi-cellule infette sono state rilevate in tutto il cuore (barra della scala: 500 μm). (v) mostra gli ingrandimenti del volume indicato in (Iv), dove gli oggetti ciano rappresentano T. cruzi-cellule infette (barra della scala: 50 μm). (B) Protocollo di clearing CUBIC dell'intero organo. (C) Visualizzazione di proliferanti e dormienti T. cruzi parassiti nel cuore di topo trasparente. (io) Un topo wild-type è stato infettato da 2 x 105 tdTripomastigoti che esprimono pomodoro colorati con un colorante di cianina nel vicino infrarosso DiR. Il cuore è stato sezionato, cancellato e LSFM è stato ripreso. tdEspressione del pomodoro proliferante (rosso) e dormiente (ciano) T. cruzi I parassiti possono essere identificati. I livelli di autofluorescenza sono stati mantenuti per consentire una corretta visualizzazione della struttura cardiaca. Un topo è stato ucciso 15 giorni dopo l'infezione sulla base del picco di cellule infette da parassiti e amastigoti dormienti trovati in lavori precedenti (barra di scala: 400 μm). (Ii) e (iii) Mostra ingrandimenti del volume indicato in (io), dove le frecce gialle indicano parassiti dormienti (ciano) (barra della scala: 200 μm). (D) Rilevamento del reclutamento di cellule T nel topo reporter CD8 infetto. (io) Reporter mouse è stato infettato da 2 x 105 tdI tripomastigoti che esprimono il pomodoro e il muscolo scheletrico sono stati sezionati, eliminati e LSFM è stato ripreso 14 giorni dopo l'infezione, un punto temporale in cui vengono rilevate risposte cellulari sostanziali. ZsGreen1 che esprime le cellule T (blu) e T. cruzi-sono state visualizzate cellule infette (rosso) (barra di scala: 400 μm) (vedi anche Filmato 2). (Ii) mostra gli ingrandimenti del volume indicato in (io) (barra scala: 50 μm). (Iii) raffigura l'accumulo di cellule T che circonda un T. cruzi-cellule infette in una sezione di tessuto (200 μm) dello stesso organo (barra della scala: 8 μm). (E) Interazione tra diversi T. cruzi Ceppi. (io) I topi con deficit di IFN-gamma sono stati coinfettati con 2 x 105 tdColombiana che esprime pomodoro (rosso) e Brasile che esprime GFP (blu) T. cruzi Ceppi. I topi sono stati eutanasizzati, e i cuori intatti sono stati sezionati, fissati e cancellati a 17 giorni dopo l'infezione (barra della scala: 400 μm). (Ii) mostra gli ingrandimenti del volume indicato in (io) (barra scala: 250 μm). (Iii) mostra una sezione ottica ingrandita che rivela cellule infettate da Colombiana (rosso) e Brasile (blu) T. cruzi ceppi (barra scala: 150 μm). (F) Visualizzazione della cellularità lungo le cellule infette utilizzando nuclei reporter del topo. (io) Un topo reporter nucleare è stato infettato con 2 x 105 I tripomastigoti che esprimono GFP e il muscolo scheletrico sono stati sezionati, eliminati e LSFM è stato ripreso a 35 giorni dopo l'infezione. Sono stati rilevati l'espressione nucleare del pomodoro delle cellule ospiti (rosso) e l'espressione del parassita GFP (ciano) (barra della scala: 400 μm). (Ii) mostra una sezione ottica ingrandita che rivela l'accumulo di nuclei rossi lungo i parassiti che esprimono GFP (barra di scala: 90 μm). (Iii) conferma l'aumento della cellularità mediante imaging confocale di sezioni di tessuto dello stesso organo (barra della scala: 8 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Marcatura di organi infetti da T. cruzi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. (A) Protocollo CUBIC per la pulizia dei tessuti, l'immunocolorazione 3D e l'etichettatura del DNA di interi organi. (B) Etichettatura del cuore di topo per la vascolarizzazione e il rilevamento del DNA (vedi anche Movie 3). (i-iii) Un topo selvatico è stato infettato da 2 x 105 tdParassiti che esprimono il pomodoro. Il topo è stato sottoposto a eutanasia 40 giorni dopo l'infezione e il cuore è stato sezionato, fissato e cancellato. Il cuore purificato è stato marcato con un marcatore di DNA e immunocolorato con anticorpi contro la α-SMA. Era possibile il rilevamento simultaneo di nuclei cellulari (blu), vascolarizzazione (bianco) e cellule infette da T. cruzi (rosso). Il topo è stato ucciso in questo momento dopo l'infezione quando è possibile valutare il rimodellamento tissutale e vascolaristico speciale (barra della scala: 400 μm). (iv) mostra un volume ingrandito dalle regioni cardiache profonde di (iii) raffigurante nuclei cellulari, vascolarizzazione e cellule infette (barra di scala: 90 μm). (v) raffigura una sezione ottica ottenuta di (iii) (barra di scala: 90 μm). (C) Aumento della cellularità visualizzato dall'etichettatura del DNA dell'intero muscolo scheletrico eliminato. (i) Il tessuto muscolare scheletrico dell'esperimento precedente era colorato con DNA, rivelando aree con intensa marcatura nucleare (blu) e cellule infette da T. cruzi (rosso) (barra della scala: 200 μm) (vedi anche Filmato 4). (ii) rivela un intenso accumulo di nuclei blu in aree con rilevamento inferiore o nullo del parassita tdTomato (barra della scala: 100 μm). (iii) l'imaging confocale ad alto ingrandimento (60x) identifica la marcatura del DNA di cellule e parassiti in sezioni di tessuto (barra della scala: 10 μm). (D) Potenziamento dei marcatori reporter del parassita tdTomato in tutto il muscolo scheletrico eliminato. (i-iii) I tessuti muscolari scheletrici intatti di topi infettati da 2 x 105 parassiti che esprimono tdTomato sono stati fissati, chiariti e immunocolorati con anticorpi contro RFP (RFP Booster). Un segnale fluorescente intenso e uniforme è stato ottenuto nel canale rosso lontano dopo l'amplificazione RFP (verde) del segnale tdTomato (rosso) (barra di scala: 100 μm). (E) Potenziamento dei marcatori reporter parassiti GFP utilizzando nanocorpi anti-GFP. (i-iii) I tessuti muscolari scheletrici di topi infettati con 2 x 105 parassiti che esprimono GFP sono stati fissati, chiariti e immunocolorati con nanocorpi coniugati Alexa Fluor 647 contro GFP (GFP Booster). Un forte segnale fluorescente è stato ottenuto nel canale rosso lontano dopo il potenziamento GFP (magenta) della fluorescenza GFP (ciano). I topi di (D) ed (E) sono stati uccisi 30 giorni dopo l'infezione perché i carichi di parassiti raggiungono un picco in questo momento e le cellule infette da parassiti possono essere facilmente rilevate nel muscolo scheletrico (barra della scala: 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Movie 1: Infezione da T. cruzi del cuore e del muscolo scheletrico in topi con deficit di IFN-gamma. Ricostruzioni 3D di tessuti chiarificati CUBIC di topi carenti di IFN-gamma coinfettati con 2 ceppi di Colombiana (rosso) e Brasile (blu) che esprimono GFP al giorno 17 dopo l'infezione. Un totale di 1151 singole fette del cuore e 559 del muscolo scheletrico sono state acquisite tramite LSFM. Risultati di imaging comparabili sono stati raggiunti in tre animali indipendenti. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 2: Rilevamento del reclutamento di cellule T nel topo reporter CD8 infetto da T. cruzi. Visualizzazione 3D di un muscolo scheletrico chiarificato da un topo reporter CD8 infettato da 2 x 105 ceppo colombiana Tdtomato-espresso (rosso) e ucciso a 14 giorni dopo l'infezione. Un totale di 668 singole fette del muscolo scheletrico sono state fotografate da LSFM. Sono state visualizzate le cellule T che esprimono ZsGreen1 (blu) e le cellule infette da T. cruzi (rosso). Risultati di imaging comparabili sono stati raggiunti in due animali. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 3: Immunorilevazione della vascolarizzazione nel cuore infetto e cancellato da T. cruzi. Ricostruzione 3D di un cuore chiarificato CUBIC di topi wild-type infettati da 2 x 105 tdColombiana T. cruzi che esprimono pomodoro e immunocolorati con anticorpi contro la α-SMA (blu) a 40 giorni dopo l'infezione. Tagliare il cuore rivela l'intricata vascolarizzazione del cuore e la penetrazione tissutale degli anticorpi α-SMA. Le cellule infette da parassiti potrebbero essere osservate come macchie rosse brillanti negli atri cardiaci (rosso, a destra). Risultati di imaging comparabili sono stati raggiunti in due animali. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 4: La colorazione del DNA dell'intero organorivela aree con maggiore cellularità. Ricostruzione 3D del muscolo scheletrico chiarificato CUBIC di topo selvatico a 40 giorni dopo l'infezione infettato da 2 x 105 tdCeppo Colombiana T. cruzi che esprime il pomodoro. L'intera area muscolare del quadricipite è stata colorata con un colorante nucleare verde. Sono state visualizzate le cellule infette da T. cruzi (rosso) e i nuclei di ogni cellula del tessuto (blu). Gli zoom della ricostruzione 3D rivelano l'accumulo di nuclei blu lungo aree con poca o nessuna rilevazione di parassiti tdTomato. Risultati di imaging comparabili sono stati raggiunti in due animali. Clicca qui per scaricare questo film.
File supplementare 1: Composizione delle soluzioni anticorpali utilizzate nello studio. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'assenza di un'ampia imaging dell'intero organo dei parassiti e della risposta immunitaria limita la comprensione della complessità delle interazioni ospite-parassita e impedisce la valutazione delle terapie per la malattia di Chagas. Il presente studio ha adottato la pipeline CUBIC per chiarire e colorare organi e tessuti intatti di topi infetti da T. cruzi.
In questo studio sono stati testati più protocolli di pulizia dei tessuti (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 e fDISCO13); tuttavia, solo CUBIC ha conservato alti livelli di fluorescenza del parassita tdTomato o GFP. Allo stesso modo, rapporti precedenti hanno mostrato la conservazione CUBICA di marcatori espressi endogenamente rispetto ad altri approcci di eliminazione dei tessuti35.
La capacità di risoluzione limitata è uno degli attuali avvertimenti della microscopia a foglio di luce convenzionale. Ciò è chiaro nelle difficoltà di risolvere i singoli parassiti nelle cellule fortemente infette (Figura 2C). I microscopi a foglio di luce piastrellati di nuova concezione con una migliore capacità di risoluzione e l'adattamento delle tecniche di espansione dei tessuti potrebbero risolvere questo problema36.
Le impurità provenienti dai tamponi di lavaggio, dalle soluzioni di pulizia o da altri organi possono precipitare nel tessuto, producendo segnali non specifici che possono essere scambiati per cellule infette da parassiti, singoli parassiti o altre strutture. Tuttavia, questi artefatti di solito fluorescenti in più canali, quindi dopo l'analisi delle immagini, possono essere facilmente scartati dal conteggio automatico mediante l'imaging dei tessuti in un canale alternativo (di solito il canale verde). Gli oggetti a doppio colore sono stati considerati artefatti ed esclusi per la quantificazione automatica.
Le colorazioni nucleari DAPI, PI, RedDot2 e SYTOX-G, presentano buoni livelli di penetrazione tissutale e intensità del segnale nella maggior parte degli organi eliminati da CUBIC; tuttavia, il colorante DNA verde ha mostrato le migliori prestazioni (Figura 3B, C e Filmato 4).
Questi risultati hanno mostrato che le cellule infette da T. cruzi potrebbero essere facilmente rilevate e quantificate con precisione mentre identificano contemporaneamente i segnali delle cellule T o dei nuclei dei topi reporter. Ancora più importante, LSFM ha rilevato eventi biologici rari, come amastigoti dormienti DiR-positivi, all'interno di un ambiente tissutale complesso con la potenziale capacità di espanderlo all'immunocolorazione epitopica e all'etichettatura del DNA. Gli studi attuali stanno anche esplorando l'utilità di questi approcci per monitorare l'attivazione delle cellule effettrici immunitarie, le interazioni tra più ceppi di parassiti nello stesso ospite e l'induzione di danni tissutali e la riparazione nella malattia di Chagas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Etsuo Susaki per il loro prezioso aiuto e le raccomandazioni riguardanti i protocolli di pulizia dei tessuti e immunocolorazione. Inoltre, siamo grati a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core per il supporto tecnico utilizzando LSFM e imaging confocale. Ringraziamo anche tutti i membri del Tarleton Research Group per gli utili suggerimenti durante questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
