Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte softwaregestützte Methoden zur Visualisierung und genauen Quantifizierung proliferierender und ruhender Trypanosoma-cruzi-Parasiten und T-Zellen in intakten, gereinigten Organen und Geweben. Diese Techniken bieten eine zuverlässige Möglichkeit, Behandlungsergebnisse zu bewerten und neue Einblicke in Parasiten-Wirt-Interaktionen zu bieten.
Abstract
Die Chagas-Krankheit ist eine vernachlässigte Pathologie, die Millionen von Menschen weltweit betrifft, hauptsächlich in Lateinamerika. Der Erreger der Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ist ein obligater intrazellulärer Parasit mit einer vielfältigen Biologie, der mehrere Säugetierarten, einschließlich des Menschen, infiziert und Herz- und Verdauungspathologien verursacht. Der zuverlässige Nachweis von T. cruzi-In-vivo-Infektionen ist seit langem erforderlich, um die komplexe Biologie der Chagas-Krankheit zu verstehen und das Ergebnis von Behandlungsschemata genau zu bewerten. Das aktuelle Protokoll demonstriert eine integrierte Pipeline zur automatisierten Quantifizierung von T. cruzi-infizierten Zellen in 3D-rekonstruierten, geklärten Organen. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die genaue Visualisierung und Quantifizierung von aktiv proliferierenden und ruhenden T. cruzi-Parasiten und Immuneffektorzellen in ganzen Organen oder Geweben. Auch die CUBIC-HistoVision-Pipeline zur einheitlichen Markierung von befreiten Organen mit Antikörpern und nuklearen Färbungen wurde erfolgreich übernommen. Die Gewebereinigung in Verbindung mit der 3D-Immunfärbung bietet einen unvoreingenommenen Ansatz zur umfassenden Bewertung von Arzneimittelbehandlungsprotokollen, zur Verbesserung des Verständnisses der zellulären Organisation von T. cruzi-infizierten Geweben und soll Entdeckungen im Zusammenhang mit Anti-T-Cruzi-Immunantworten, Gewebeschäden und Reparaturen bei der Chagas-Krankheit vorantreiben.
Introduction
Die Chagas-Krankheit, verursacht durch den Protozoenparasiten T. cruzi, gehört zu den am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten der Welt und verursacht jährlich etwa 13.000 Todesfälle. Die Infektion schreitet häufig von einem akuten zu einem chronischen Stadium fort, was bei 30% der Patienten zu einer Herzpathologie führt, einschließlich Arrhythmien, Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod 1,2. Trotz der starken Immunantwort des Wirts gegen den Parasiten während der akuten Phase bleiben während des gesamten Lebens des Wirts eine geringe Anzahl von Parasiten in Geweben wie Herz und Skelettmuskulatur chronisch bestehen. Mehrere Faktoren, einschließlich des verzögerten Einsetzens adaptiver Immunantworten und des Vorhandenseins nicht replizierender Formen des Parasiten, können dazu beitragen, dass T. cruzi eine vollständige Eliminierung durch das Immunsystem vermeidenkann 3,4,5,6. Darüber hinaus zeigen nicht-replizierende ruhende Formen des Parasiten eine geringe Anfälligkeit für trypanocide Medikamente und können teilweise für das in vielen Fällen beobachtete Behandlungsversagen verantwortlich sein 7,8.
Die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren bietet die Möglichkeit, Einblicke in die räumliche Verteilung der Parasiten in den infizierten Geweben und ihre Beziehung zu den an ihrer Bekämpfung beteiligten Immunzellen zu gewinnen. Diese Eigenschaften sind entscheidend für ein besseres Verständnis der Prozesse der Parasitenkontrolle durch das Immunsystem und die Verfolgung der seltenen schlafenden Parasiten, die in chronischen Geweben vorhanden sind.
Die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist eine der umfassendsten und unvoreingenommensten Methoden zur 3D-Bildgebung großer Gewebe oder Organe ohne Dünnschnitt. Lichtblattmikroskope verwenden eine dünne Lichtschicht, um nur die Fluorophore in der Fokusebene anzuregen, Photobleiche und Phototoxizität von Proben zu reduzieren und Bilder von Tausenden von Gewebeschichten mit ultraschnellen Kameras aufzunehmen. Die hohe Gewebetransparenz, die für das ordnungsgemäße Eindringen des Laserlichts in Gewebe erforderlich ist, wird durch Homogenisierung des Brechungsindex (RI) nach Gewebeentfettung und -entfärbung erreicht, wodurch die Lichtstreuung reduziert und qualitativ hochwertige Bilder erzeugtwerden 9,10,11.
Gewebereinigungsansätze wurden für die Bildgebung ganzer Mäuse 12,13,14, Organoide 15,16,17, Organe, die Reporterfluoreszenzmarker exprimieren, 18,19,20,21,22,23 und kürzlich einer begrenzten Anzahl menschlicher Gewebe entwickelt 24 . Die derzeitigen Methoden zur Gewebereinigung werden in drei Familien eingeteilt: (1) organische lösungsmittelbasierte Methoden wie die DISCO-Protokolle 25,26, (2) Hydrogel-basierte Methoden wie CLARITY27 und wässrige Methoden wie CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-Protokolle erhalten Organform und Gewebeintegrität und bewahren die Fluoreszenz endogen exprimierter Reporterproteine. Die neueste Aktualisierung dieser Technik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), erlaubt auch den Nachweis von Epitopen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper und DNA-Markierung28.
Im vorliegenden Protokoll wurde die CUBIC-Pipeline zum Nachweis von T. cruzi exprimierenden fluoreszierenden Proteinen in geklärten intakten Mausgeweben verwendet. Optisch transparente Gewebe wurden LSFM abgebildet, 3D rekonstruiert und die genaue Gesamtzahl der T. cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen pro Organ automatisch quantifiziert. Dieses Protokoll wurde auch erfolgreich übernommen, um eine einheitliche Kennzeichnung von gereinigten Organen mit Antikörpern und nukleären Färbungen zu erhalten. Diese Ansätze sind essentiell für das Verständnis der Expansion und Kontrolle von T. cruzi in infizierten Wirten und sind nützlich für die vollständige Bewertung von Chemo- und Immuntherapeutika für die Chagas-Krankheit.
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Protocol
Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und den Akkreditierungsrichtlinien der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt. Das Animal Use Protocol (Control of T. cruzi infection in mice-A2021 04-011-Y1-A0) wurde vom University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J und C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Mäuse (weiblich,1-2 Monate alt) wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Infektion, Perfusion und Dissektion
- Intraperitoneal infizieren Mäuse mit Gewebekultur-abgeleiteten Trypomastigoten des Colombiana (DTU TcI) oder Brasilien (DTU TcV) T. cruzi-Stammes , der tdTomato- bzw. GFP-fluoreszierende Proteine exprimiert. Die Infektionsdosis könnte zwischen 50.000 und 200.000 Trypomastigoten liegen, verdünnt in 100 μL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
HINWEIS: Spezifische Details über die Erzeugung von Reporterparasiten und Mausmodellen der Infektion sind in Canavaci et al. 29 und Bustamante et al.30. - Euthanasieren Sie die Mäuse durch Kohlendioxidinhalation mit einer Flussrate von 3-7 L / min. Sobald die Tiere keinen Pedalreflex mehr zeigen, machen Sie einen Längsschnitt durch die Haut vom Bauch in Richtung Brustbein. Dann schneiden Sie die Körperwand aus dem Bauch und fahren Sie durch die Rippen auf jeder Seite des Thorax, bis das Brustbein weggehoben werden kann und das Herz freigelegt wird.
- Wie in Abbildung 1 beschrieben, machen Sie einen 2,5-mm-Schnitt in der rechten Ohrmuschel des Herzens und sammeln Sie das abfließende Blut mit einer 1-ml-Mikropipettenspitze.
- Führen Sie eine Schmetterlingsnadel (verbunden mit einem Ende des Perfusionssystems) in die Spitze des linken Ventrikels ein, bis sie die aufsteigende Aorta erreicht. Verwenden Sie Klebstoff auf Gelbasis (siehe Materialtabelle), um das Einlassloch um die Nadel zu versiegeln und die Nadel während der Perfusionen in Position zu halten.
- Durchbluten Sie die Mäuse30 mit 50 ml kaltem Heparin-PBS (pH 7,4, 10 U/ml Heparin) oder bis die Flüssigkeit, die aus der Maus in Richtung der Auffangschale kommt, frei von Blut ist.
- Perfusion mit 50 ml kaltem 4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,4) in PBS.
HINWEIS: Die PFA-Gewebefixierung ist wahrscheinlich einer der kritischen Schritte des Protokolls, insbesondere für die Aufrechterhaltung von Epitopstrukturen und die anschließende Immundetektion. PFA baut sich im Laufe der Zeit ab, daher muss es frisch zubereitet werden. Der pH-Wert der Lösung ist auch wichtig, um eine Überfixierung zu vermeiden, die zu einer schlechten Reinigung des Gewebes führen könnte.
ACHTUNG: PFA ist bei Hautkontakt mäßig toxisch. Akute Exposition ist auch stark reizend für Nase, Augen und Rachen. Langfristige Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen in der Luft oder der Haut kann Hautreizungen wie Dermatitis und Juckreiz sowie asthmaähnliche Atemwegsprobleme verursachen. Tragen Sie Gesichts- und Augenschutz und atmen Sie keinen Staub, Gas, Nebel, Dämpfe oder Dämpfe ein.- Nach der PFA-Perfusion wird die Maus mit 100 ml CUBIC-P-Puffer durchblutet, um die in Schritt 1.5 genannten Klärungswerte zu erreichen.
- Zur Herstellung des CUBIC-P-Puffers werden 10% N-Butyldiethanolamin, 5% Triton X-100 und 5% 1-N-Methylimidazol in doppelt destilliertem Wasser gelöst oder die handelsüblichen Cocktails verwendet (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Schritte 1.6.1.-1.6.2. werden nur für hochpigmentierte Organe wie Herz und Niere empfohlen, da sie einen Vorab-Clearing-Schritt erfordern, um ein erhöhtes Maß an Transparenz zu erhalten. Nach der Anwendung von CUBIC-P sezieren Sie die Organe und fahren Sie direkt mit Schritt 2 fort: Gewebereinigung.
- Sezieren Sie die zu fotografierenden Gewebeproben/Organe 30 und fixieren Sie sie nachträglich in 4% (w/v) PFA in PBS (~10 ml/ganzes Organ) über Nacht (ON) bei 4 °C mit leichtem Schütteln (nicht mehr als 5 x g) in50 ml konischen Röhrchen.
HINWEIS: Alle Inkubationen von nun an müssen an Rohren durchgeführt werden, die horizontal bei 20-30 °C vor Licht geschützt liegen. - Die Probe wird in 10 ml PBS (ergänzt mit 0,05% Natriumazid (NaN3) für 3 h (dreimal) bei Raumtemperatur (RT) mit leichtem Schütteln (5 x g) gewaschen.
HINWEIS: Gewebe können eingefroren werden, indem in 10 ml 30% Saccharose in PBS mit leichtem Schütteln (5 x g) bei 4 °C ON in 50 ml konischen Röhrchen inkubiert wird. Nachdem das Gewebe auf den Boden des Röhrchens gesunken ist, betten Sie es in die OCT-Verbindung ein und halten Sie es bei -80 ° C. Bei RT auftauen, bis die OCT-Verbindung vollständig geschmolzen ist, dann PBS (~ 10 ml / ganzes Organ) bei 4 ° C mit leichtem Schütteln (5 x g) in 50 ml konischen Röhrchen waschen. Fahren Sie mit Schritt 2 fort.
2. Gewebereinigung
HINWEIS: Alle in dieser Arbeit durchgeführten Gewebereinigungen wurden unter Verwendung des CUBIC-Protokolls I22 durchgeführt. Drei verschiedene Cocktails wurden verwendet: CUBIC-P für die Delipidierung und schnelle Entfärbung während der Perfusionen, CUBIC-L für die Delipidierung und Entfärbung und CUBIC-R für das RI-Matching. DNA-Färbungen und Immunfärbungen wurden mit CUBIC-HV 1 3D-Kernfärbungskit bzw. CUBIC-HV 1 3D-Immunfärbungskit durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Tauchen Sie einzelne Organe in 10 mL 50% wasserverdünntes CUBIC-L (siehe Materialtabelle) mit leichtem Schütteln (5 x g) bei RT (ON) in 50 mL konische Röhrchen. Halten Sie die Röhrchen flach auf der Schüttelplatte.
HINWEIS: Um Gewebeschäden zu vermeiden, werden Organe im selben Röhrchen gehalten und Lösungen werden mit einem Vakuumsystem gesammelt. Zur Herstellung von CUBIC-L werden 10% N-Butyldiethanolamin und 10% Triton X-100 in doppelt destilliertem Wasser unter Verwendung der handelsüblichen Cocktails gelöst (siehe Materialtabelle).
ACHTUNG: CUBIC-L verursacht schwere Augenschäden. Tragen Sie Augen- und Gesichtsschutz. Entsorgung in einer zugelassenen Abfallentsorgungsanlage. - Tauchen Sie die Probe 6 Tage lang in 10 ml 100% CUBIC-L (Auffrischen der Lösung am 3. Tag).
HINWEIS: Am Ende dieser Inkubationszeit müssen die Gewebe fast vollständig transparent sein. - Die transparenten Organe mit PBS (ergänzt mit 0,05% NaN3) für 2 h (dreimal) bei 37 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) waschen. Übertragen Sie das Gewebe bei jeder Wäsche in ein neues 50-ml-konisches Röhrchen, um Triton X-100 zu entfernen.
HINWEIS: Wie in Abbildung 2B beschrieben, überspringen Sie die Schritte 3, 4 und 5 und fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort, wenn das Ziel des Experiments darin besteht, endogen exprimierte Reporterproteine von transgenen T. cruzi-Parasiten oder Mäusen sichtbar zu machen (Abbildung 2C-F).
3. DNA-Färbung
- Verdünnen Sie den handelsüblichen Nukleinsäurefarbstoff (siehe Materialtabelle) in 5 ml Färbepuffer (im Kit enthalten) bei einer Verdünnung von 1/2.500.
- Tauchen Sie das Gewebe in die Kernfarbstofflösung und inkubieren Sie bei 37 °C in sanfter Rotation für 5 Tage mit 15 ml konischen Röhrchen im Stehen.
- Waschen Sie mit 15 ml 3D-Kernfärbungspuffer (im Kit enthalten) für 2 h (dreimal) bei RT mit leichtem Schütteln (5 x g).
HINWEIS: Andere DNA-Farbstoffe können in diesen Konzentrationen und Inkubationszeiten verwendet werden: DAPI (im Kit enthalten): 1/200, 5 Tage Inkubation; BOBO-1: 1/400, 5 Tage Inkubation; Propidiumiodid (PI) (im Kit enthalten): 1/100, 3 Tage Inkubation; RedDot2: 1/250, 3 Tage Inkubation. Wenn das spezifische Ziel des Experiments darin besteht, sowohl endogen exprimierte Reporterproteine sichtbar zu machen als auch Kernfärbungen zu verwenden, überspringen Sie die Schritte 4 und 5 und fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort.
4. Verdauung der extrazellulären Matrix (ECM)
HINWEIS: Die Hyaluronidase-Verdauung der ECM muss durchgeführt werden, um das ordnungsgemäße Eindringen der Antikörper in tiefe Regionen des Gewebeszu erleichtern 28.
- Einzelne Organe in 15 mL Hyaluronidase-Reaktionspuffer für 2 h bei 37 °C in ein 50 mL konisches Röhrchen in flacher, lichtgeschützter Position tauchen.
HINWEIS: Um Hyaluronidase-Reaktionspuffer herzustellen, lösen Sie 10 mM CAPSO auf; 150 mM Natriumchlorid (NaCl) und 0,05%NaN3 (siehe Materialtabelle) in doppelt destilliertem Wasser und pH-Wert auf 10 einstellen. - Enzymlösung wird hergestellt, indem 75 μL 20 mg/ml Hyaluronidase-Brühe in 425 μL Hyaluronidase-Reaktionspuffer gemischt werden. Um 20 mg/ml Hyaluronidase-Brühe herzustellen, wird Hyaluronidase in 50 mM Karbonatpuffer, 150 mM NaCl, 0,01% BSA und 0,05%NaN3 gelöst (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den pH-Wert auf 10 und aliquot in Volumina von 77 μL bei -30 °C ein.
- Verwerfen Sie den Hyaluronidase-Reaktionspuffer mit einer Pipette und tauchen Sie das Organ in die Enzymlösung (500 μL in einem 15 ml konischen Röhrchen) in einer stehenden Position geschützt vor Licht für 24 h bei 37 °C mit leichtem Schütteln (5 x g).
- Waschen Sie die Probe in 15 mL Hyaluronidase-Waschpuffer in einem 50-ml-konischen Röhrchen in einer horizontalen, lichtgeschützten Position für 2 h (dreimal) bei 37 °C mit leichtem Schütteln (5 x g).
- Zur Herstellung des Hyaluronidase-Waschpuffers werden 50 mM Karbonatpuffer, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 5 % (v/v) Methanol und 0,05 %NaN3 gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 10 ein. Um 10x Carbonat-Puffer-NaCl-Schaft herzustellen, lösen Sie 2,96 g Natriumcarbonat, 1,86 g Natriumhydrogencarbonat und 8,77 g NaCl in 100 ml doppelt destilliertem Wasser mit 0,05% NaN3 (siehe Tabelle der Materialien) und stellen Sie den pH-Wert auf 10 ein.
5. Immunfärbung
- Beschriften Sie das Gefäßsystem mit Anti-α-SMA-Antikörpern (alpha-small muscle actin, siehe Tabelle der Materialien) nach den folgenden Schritten.
- Erzeugen Sie einen primären plus konjugierten sekundären Fab-Fragment-Antikörperkomplex. Starten Sie diese Reaktion 1,5 h vor dem Färbevorgang.
- Berechnen Sie die erforderliche Menge an primären und sekundären Antikörpern (Mischung im Verhältnis 1:0,5 nach Gewicht).
HINWEIS: Für den primären Antikörper Anti-α-SMA werden 3,5 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment der Skelettmuskulatur ähnlicher Größe zu markieren. Für 2,5 mg/ml Produkt werden 3,5/2,5 = 1,4 μL Antikörperlösung benötigt. Für den sekundären Antikörper AlexaFluor 647 Anti-Maus-Fab-Fragment werden 1,75 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment des Skelettmuskels ähnlicher Größe zu markieren. Für 1,7 mg/ml Produkt werden 1,75/1,7 = 1 μL Antikörperlösung benötigt. - Primäre und sekundäre Antikörper in einem bernsteinfarbenen 2-ml-Röhrchen mischen und 1,5 h bei 37 °C inkubieren.
- Berechnen Sie die erforderliche Menge an primären und sekundären Antikörpern (Mischung im Verhältnis 1:0,5 nach Gewicht).
- Für den Pufferaustausch mischen Sie 7,5 ml 2x HV1 3D-Immunfärbungspuffer (im Kit enthalten, siehe Materialtabelle) mit 7,5 ml doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie die Gewebeprobe für 1,5 h bei 32 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) in ein 15-ml-konisches Röhrchen in horizontaler Position. Starten Sie diese Reaktion gleichzeitig mit der Erzeugung des Antikörperkomplexes (1,5 h vor dem Immunfärbungsverfahren).
- Erzeugen Sie einen primären plus konjugierten sekundären Fab-Fragment-Antikörperkomplex. Starten Sie diese Reaktion 1,5 h vor dem Färbevorgang.
- Führen Sie eine 3D-Immunfärbung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- In einem konischen 15-ml-Röhrchen wird die Antikörperfärbelösung gemäß Zusatzdossier 1 hergestellt.
- Entnehmen Sie die Gewebeprobe aus dem Pufferaustauschmedium (Schritt 5.1.2) und tauchen Sie sie in die Antikörperfärbelösung. Gewebe einzeln für 1 Woche bei 32 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) der Röhrchen im Stehen vor Licht schützen. Verschließen Sie das Röhrchen mit Paraffinfolie, um Verdunstung zu vermeiden.
- Auf 4 °C bewegen und ON im Stehen inkubieren.
- 1x HV1 3D Immunfärbungs-Waschpuffer (im Kit enthalten, siehe Materialtabelle) auf 4 °C abkühlen lassen und die Probe mit 15 mL Puffer (zweimal) jeweils 30 min bei 4 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) waschen. Halten Sie 15 ml konische Röhrchen bis Schritt 5.2.7 in horizontaler Position.
- Formalin in 1x HV1 3D-Immunfärbungs-Waschpuffer auf 1% verdünnen und die Probe 24 h bei 4 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) in 8 ml der Lösung eintauchen.
- In frischer 1%iger Formalinlösung 1 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) inkubieren.
- In 15 mL PBS für 2 h bei 25 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) waschen.
- Verstärken Sie das tdTomato-Signal mit Anti-Red Fluorescent Protein (RFP)-Antikörpern, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Befolgen Sie die gleichen Inkubationszeiten und Temperaturen wie in Schritt 5.2.2. Berechnen Sie die Menge an primären und sekundären Antikörpern (siehe Materialtabelle) und mischen Sie sie im Verhältnis 1:0,5 nach Gewicht.
HINWEIS: Für primäre Antikörper-Anti-RFP werden 5 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment der Skelettmuskulatur ähnlicher Abmessungen zu markieren. Für 1,25 mg/ml Produkt sind 5/1,25 = 4 μL der Lösung erforderlich. Für den sekundären Antikörper Alexa Fluor 647 Anti-Kaninchen-Fab-Fragment werden 2,5 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment der Skelettmuskulatur ähnlicher Größe zu markieren. Für 1,5 mg/ml Produkt werden 2,5/1,5 = 1,7 μL der Lösung benötigt. - Bereiten Sie die Antikörperfärbelösung wie in Zusatzdatei 1 beschrieben vor.
- Befolgen Sie die gleichen Inkubationszeiten und Temperaturen wie in Schritt 5.2.2. Berechnen Sie die Menge an primären und sekundären Antikörpern (siehe Materialtabelle) und mischen Sie sie im Verhältnis 1:0,5 nach Gewicht.
- Verstärken Sie GFP-Signale mit Anti-GFP-Nanokörpern, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Befolgen Sie die gleichen Inkubationszeiten und Temperaturen wie in Schritt 5.2.2 beschrieben.
HINWEIS: Anti-GFP-Nanobodies (siehe Materialtabelle) werden mit Alexa Fluor 647 konjugiert, so dass die Erzeugung von Antikörperkomplexen nicht erforderlich ist. - Bereiten Sie die Antikörperfärbelösung wie in Zusatzdatei 1 beschrieben vor.
- Befolgen Sie die gleichen Inkubationszeiten und Temperaturen wie in Schritt 5.2.2 beschrieben.
6. RI-Abgleich
- Tauchen Sie transparente Organe in 5 ml 50% wasserverdünnte CUBIC-R+ Lösung (siehe Materialtabelle) bei RT (ON) mit leichtem Schütteln (5 x g) in ein 50 ml konisches Röhrchen. Halten Sie die Rohre während des gesamten RI-Matching-Schritts in stehender Position.
HINWEIS: Recycelte CUBIC R+ Lösungen aus früheren Experimenten konnten in diesem Schritt (bis zu viermal) wiederverwendet werden. Zur Herstellung der CUBIC-R+-Lösung werden 45 % 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon (Antipyrin), 30 % Nicotinamid oder N-Methylnicotinamid und 0,5 % N-Butyldiethanolamin in doppelt destilliertem Wasser gelöst oder der handelsübliche CUBIC-R+-Puffer verwendet (siehe Materialtabelle).
ACHTUNG: CUBIC-R+ verursacht Hautreizungen, schwere Augenreizungen und Organschäden. Tragen Sie Schutzhandschuhe und sorgen Sie für Augen- und Gesichtsschutz. Atmen Sie keinen Staub, Dämpfe, Gas, Nebel oder Dämpfe ein. Entsorgung in einer zugelassenen Entsorgungsanlage. - 50% CUBIC-R+ durch 5 ml 100% CUBIC-R+ ersetzen und 2 Tage lang mit leichtem Schütteln (5 x g) bei RT inkubieren. Übertragen Sie dann das Gewebe auf einen Stapel fusselfreier Tücher und drehen Sie das Gewebe vorsichtig, um die CUBIC-R+-Lösung für 5 Minuten von den Organoberflächen zu entfernen.
7. Montage
- Nach dem Trocknen der Gewebe werden sie in 5 ml Montagelösung (RI = 1,520) (siehe Materialtabelle) in eine Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen überführt und bei RT inkubiert (ON). Drehen Sie häufig das Gewebe, um Luftblasen zu beseitigen, insbesondere auf den Oberflächen der Organe.
HINWEIS: Organe können länger als 6 Monate in Mounting Solution oder CUBIC-R+ gelagert werden. - Kleben Sie die Gewebe mit Cyanacrylat-basiertem Gelkleber auf den Probenhalter des Mikroskops.
- Tauchen Sie die Proben in die mit 120 mL Montagelösung gefüllte Quarzküvette des Mikroskops und bilden Sie sie quer zu ihrer Längsachse ab. Kleben Sie das Herz mit der Spitze und der Aorta horizontal ausgerichtet.
HINWEIS: Gereinigte und montierte Organe können mit einem Vibratom geschnitten und bei hoher Vergrößerung durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden. Die Organe in 2% Agarose einbetten und Abschnitte von 100-500 μm schneiden. Organe können auch manuell mit einer scharfen Klinge geschnitten werden, um dicke Gewebeschnitte (>1000 μm) zu erzeugen. Nach dem Schneiden die Scheiben in 35 mm große Petrischalen mit Glasboden geben, mit derselben Montagelösung montieren, mit Nagellack versiegeln und mit einem konfokalen Mikroskop abbilden.
8. Bildaufnahme
- Bilden Sie die montierten Proben mit einem Lichtblattmikroskop ab (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Vergrößerung und Schrittweite zwischen den einzelnen Scheiben auf 3 μm ein und verwenden Sie rechte und linke Lichtblattlaser mit 5 μm Dicke und 100% Breite. Stellen Sie die Belichtungszeitkonstante auf 50-100 ms ein und stellen Sie die Laserleistung je nach Intensität des Fluoreszenzsignals von 10% bis 80% ein.
- Für die Kodetektion von tdTomato-exprimierenden Parasiten und DiR-gefärbten ruhenden Amastigoten (Abbildung 2C) verwenden Sie rote (Ex/Em 561/620-660 nm) bzw. Infrarotkanäle (Ex/Em 785/845-55 nm). Für die Kodetektion von T-Zellen und tdTomato-exprimierenden Parasiten in CD8-Reportermaus (Abbildung 2D) verwenden Sie grünen (Ex/Em 488/525-50 nm) bzw. roten Kanal.
- Für die Koinfektionstests (Abbildung 2E) sowie für die Kodetektion von Parasiten, die GFP in Nuclei-Reportermäusen exprimieren (Abbildung 2F), verwenden Sie den grünen bzw. roten Kanal. Für den Nachweis von tdTomato-exprimierenden Parasiten, Kernfarbstoff und Herzgefäßen (Abbildung 3B,C) verwenden Sie die roten, grünen und tiefroten Kanäle (Ex/Em 640/680-730 nm).
- Nachweis von Anti-RFP-Antikörpern mit dem Dunkelroten Kanal und Anti-GFP-Nanobodies mit dem grünen Kanal (Abbildung 3D).
- Konvertieren Sie die aufgenommenen TIFF-Bildstapel und rekonstruieren Sie die Organe in 3D mit der Software Imaris v9.7.2 (siehe Materialtabelle).
9. Oberflächenrekonstruktion und Quantifizierung mit Imaris Software
- Wählen Sie das Oberflächenerkennungsalgorithmus-Tool aus und starten Sie den Assistenten in der Bildanalysesoftware.
- Führen Sie eine erste Analyse in einer 3D-Region von Interesse durch (zufällig ausgewählt) und wenden Sie sie dann auf die gesamte 3D-Organrekonstruktion an. Nachdem Sie eine Region von Interesse (ROI) ausgewählt haben, wählen Sie den zu analysierenden Kanal aus, deaktivieren Sie die Schaltfläche "Glätten" und wählen Sie Hintergrundsubtraktion.
HINWEIS: Die Hintergrundsubtraktion berechnet für jedes Voxel einen eindeutigen lokalen Hintergrundwert und subtrahiert diesen vom ursprünglichen Pixelwert. Der Durchmesser der größten Kugel, die in das Objekt passt, muss bis zu 200 μm für T. cruzi-infizierte Zellen, 10 μm für T-Zellen und 5 μm für einzelne Parasiten betragen. - Verwenden Sie das Histogramm , um die Klassifizierung anzupassen, und die Filter-Dropdown-Liste, um die Messungen für die Klassifizierung auszuwählen.
HINWEIS: Verwenden Sie das Histogramm, um die Klassifizierung anzupassen: Elliptizitäts- (abgeflachte) und Sphärizitätsmessungen werden empfohlen. - Schließen Sie den Assistenten ab, drücken Sie die Schaltfläche Statistik und rufen Sie die Gesamtzahl der mit Parasiten infizierten Zellen oder T-Zellen als Anzahl der getrennten Komponenten pro Zeitpunkt ab.
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Representative Results
CUBIC fixierte Gewebe wurden mit PBS gewaschen, um Fixiermittel zu entfernen, und dann mit CUBIC-L-Cocktails inkubiert, einer basischen gepufferten Lösung von Aminoalkoholen, die Pigmente und Lipide aus dem Gewebe extrahieren, was zu einer Entfärbung des Gewebes unter Beibehaltung der Gewebearchitektur führt. Gitterlinien im Papier sind durch die Gewebe hindurch zu sehen, was auf eine entsprechende Reinigung der Organe hinweist (Abbildung 2A). Nach der Delipidierung wurden die Gewebe gewaschen und in CUBIC-R+ und eine Montagelösung für die RI-Homogenisierung bzw. Bildgebung getaucht (Abbildung 2B).
Eine Wildtyp-Maus wurde mit tdTomato-exprimierenden Trypomastigoten infiziert, die mit dem DiR-Nahinfrarot-Cyaninfarbstoff vorgefärbt waren. Die Maus wurde 15 Tage nach der Infektion eingeschläfert, und das intakte Herz wurde seziert, fixiert und gereinigt. LSFM-Bildgebung und 3D-Rekonstruktion ermöglichten es uns, tdTomato-exprimierende proliferierende T. cruzi-Parasiten (rot) sichtbar zu machen. Autofluoreszenzwerte im roten Kanal können für die korrekte Visualisierung von Herzstruktur und -kanten verwendet werden (Abbildung 2C i). LSFM war auch nützlich für die Identifizierung arzneimittelresistenter ruhender Formen 7,8. Die präinfektiöse Färbung von Parasiten mit DiR-Farbstoff ermöglicht die Verfolgung ruhender Parasiten durch Visualisierung der Parasiten, die den Farbstoff nicht durch Replikation verdünnt hatten, wie zuvor für CellTrace Violet7 berichtet.
Ruhende Parasiten (Cyan) können im Herzen identifiziert werden, wie in den 3D-vergrößerten Einschüben (gelbe Pfeile) dargestellt (Abbildung 2C ii,iii). Die Z-Projektionsfluoreszenz wurde automatisch segmentiert, um ein rekonstruiertes 3D-Oberflächenmodell zur räumlichen Visualisierung und Quantifizierung der Gesamtzahl der T. cruzi-infizierten Zellen und schlafenden Parasiten während der gesamten 3D-Rekonstruktion zu generieren (Abbildung 2A). Die Analyse des 3D-Oberflächenmodells ergab 186 T. cruzi-infizierte Zellen mit einem höheren Anteil infizierter Zellen im Herzvorhof (123) im Vergleich zu Ventrikeln (63) und 18 ruhende Parasiten im gesamten Herzen (Abbildung 2C i). In einem früheren Bericht wurde eine ähnliche Pipeline zur Überwachung der Anzahl von T. cruzi-infizierten Zellen und ruhenden Parasiten in geklärten Mäusegeweben nach einer medikamentösen Behandlung berichtet31. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schätzungen für die Anzahl der ruhenden Parasiten wahrscheinlich eine Unterzählung sind, da die Farbstoffverdünnungstechnik nur den Nachweis von Parasiten ermöglicht, die sich seit der Erstinfektion nicht signifikant repliziert haben, aber nicht diejenigen, die später in der Infektion nach mehreren Teilungsrunden inaktiv wurden.
Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um die Interaktion zwischen verschiedenen T. cruzi-Stämmen in Interferon (IFN)-gamma-defizienten Mäusen zu überwachen. Die Produktion von IFN-gamma durch Effektor-T-Zellen ist essentiell für die Immunkontrolle von T. cruzi. In IFN-gamma-defizienten Mäusen vermehren sich Parasiten mit minimaler Immunrestriktion, was zu einer sehr hohen Anzahl infizierter Zellen in Organen führt. Diese immundefizienten Modelle sind nützliche Werkzeuge, um die Wirksamkeit neuer Medikamente ohne die Einschränkung durch die Immunerkennung zu untersuchen und ermöglichen so den Nachweis eines Parasitenrückfalls nach der Behandlung. IFN-gamma-defiziente Mäuse wurden mit tdTomato-exprimierenden Colombiana (rot) und GFP-exprimierenden Brazil (blau) T. cruzi-Stämmen koinfiziert. Die Mäuse wurden 17 Tage nach der Infektion eingeschläfert, und die intakten Herzen wurden seziert, fixiert und gereinigt. In diesem immundefizienten Modell können Wirtszellen, die mit beiden T. cruzi-Stämmen infiziert sind, in verschiedenen Stadien der Parasitenentwicklung beobachtet werden, einschließlich großer, mittlerer und kleiner infizierter Zellen und kürzlich geplatzter. Das Durchschneiden der Gewebe zeigt reichlich parasiteninfizierte Zellen in den Herzvorhöfen in verschiedenen Gewebetiefen (Abbildung 2E i-iii und Film 1).
Eine Kreuzung von C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J und B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J-Mäusen, in denen alle T-Zellen das grün fluoreszierende Protein ZsGreen1 exprimieren, wurde verwendet, um die T-Zell-Rekrutierung in T. cruzi-infiziertem Gewebe zu überwachen. Mäuse wurden 14 Tage nach der Infektion mit tdTomato-exprimierenden Parasiten eingeschläfert, und die Skelettmuskulatur wurde von LSFM herausgeschnitten, gereinigt und abgebildet. ZsGreen1 exprimierende T-Zellen (blau) und T. cruzi-infizierte Zellen (rot) wurden robust nachgewiesen (Abbildung 2D i und Film 2). 3D-Zoom-Ins der 3D-Rekonstruktion identifizierten T-Zellen im Bereich einer infizierten Zelle (Abbildung 2D ii). Vibratomdicke Schnitte (200-500 μm) desselben Gewebes ermöglichen es uns, die Grenzfläche von T-Zellen und infizierten Zellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen (Abbildung 2D iii).
Eine alternative Möglichkeit, Entzündungsherde zu überwachen, basiert auf der Ansammlung von Zellkernen um T. cruzi-infizierte Zellen. Dazu wurde eine Reportermaus verwendet, bei der alle Zellkerne das fluoreszierende tdTomato-Protein exprimieren. Die nukleare tdTomato-Expression (rot) war nach dem Reinigungsprozess im Gewebe leicht nachzuweisen. Eine nukleare Reportermaus wurde mit GFP-exprimierenden T. cruzi-Parasiten (Cyan) infiziert und 35 Tage nach der Infektion eingeschläfert, und die Skelettmuskulatur wurde durch LSFM herausgeschnitten, gereinigt und abgebildet (Abbildung 2F i-iii). Vergrößerte optische Schnitte der Skelettmuskulatur zeigen eine erhöhte Zellularität durch Ansammlung roter Kerne entlang GFP-exprimierender Parasiten (Abbildung 2F ii). Vibratomschnitte desselben Gewebes bestätigen die zuvor beschriebene Akkumulation roter Kerne entlang GFP-exprimierender Parasiten durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 2F iii).
Das CUBIC-Protokoll wurde auch für die Immunfärbung und DNA-Markierung von intakten, gereinigten Organen und Geweben, die mit T. cruzi infiziert sind, angepasst (Abbildung 3A). Mäuse wurden 40 Tage nach der Infektion mit tdTomato-exprimierenden Parasiten eingeschläfert, und die Herzen wurden seziert, fixiert und gereinigt. Das intakte gereinigte Herz wurde gewaschen und 5 Tage lang mit einem grünen DNA-Marker gefärbt, dann erneut gewaschen und 7 Tage lang mit Antikörpern gegen α-SMA immungefärbt. Die Proben wurden nachfixiert, gewaschen, RI abgeglichen und mit LSFM abgebildet. Die gleichzeitige Detektion mehrerer fluoreszierender Signale, einschließlich Kerne, Gefäße und T. cruzi-infizierte Zellen, war nach diesem Protokoll möglich. α-SMA-Immunfärbung (weiß) zeigte hohe Signalwerte, die das komplizierte Gefäßsystem des Herzens enthüllten (Abbildung 3B ii und Film 3). Ein optischer Schnitt aus tieferen Herzregionen zeigt die Gewebepenetration von α-SMA-Antikörpern unter den etablierten Bedingungen (Abbildung 3B v). Die DNA-Färbung (blau) zeigte auch eine gute Gewebepenetration, Fluoreszenzwerte und stabile volumetrische Färbung. Einige Bereiche mit intensiver DNA-Markierung wurden an verschiedenen Herzstellen (Abbildung 3B i) und um Skelettmuskelfasern herum identifiziert (Abbildung 3C i und Film 4). Ein vergrößertes Bild der Skelettmuskulatur zeigte eine Ansammlung von blauen Kernen in Bereichen mit wenigen oder nicht nachweisbaren tdTomato-Parasiten, was auf die Rekrutierung von Immunzellen an Stellen der aktuellen oder früheren T. cruzi-Infektion hindeutet (Abbildung 3C ii). In anderen Fällen hatten infizierte Wirtszellen wenig bis gar keine Hinweise auf nahe gelegene zelluläre Infiltrate (weiße Pfeile) (Abbildung 3C i). Vibratomschnitte des gleichen Gewebes wie in Abbildung 3C ii zeigen DNA-Färbung von Zellen und tdTomato-exprimierenden Parasiten durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 3C iii).
Frühere Experimente haben gezeigt, dass ruhende Parasiten eine geringe oder vernachlässigbare Expression von tdTomato- oder GFP-Reporterproteinen aufwiesen (Abbildung 2C ii und iii). Um den Nachweis dieser fluoreszierenden Proteine zu verbessern, wurden gereinigte Gewebe mit Anti-RFP- oder -GFP-Antikörpern immungefärbt. Intakte Skelettmuskelgewebe von Mäusen, die mit Parasiten infiziert waren, die tdTomato oder GFP exprimieren, wurden fixiert, geklärt und mit Antikörpern gegen RFP (RFP Booster) (Abbildung 3D) bzw. Nanobodies gegen GFP immungefärbt, die mit Alexa Fluor 647 (GFP Booster) konjugiert wurden (Abbildung 3E). Die Proben wurden nachfixiert, gewaschen, RI abgeglichen und mit LSFM abgebildet. In beiden Fällen führte die Verstärkung der GFP- und tdTomato-Signale durch die Antikörper zu einer starken Fluoreszenz (Abbildung 3D ii und 3E ii). Die Immunfärbungen mit verstärkenden Antikörpern stellen ein vielseitiges Werkzeug dar, das verwendet wird, um T. cruzi-Ruhezustände in geklärten ganzen Organen und Geweben zu erkennen und jedes unterrepräsentierte Signal von RFP- oder GFP-Familienmitgliedern zu erkennen.
Abbildung 1: Nadeleinführung während der transkardialen Perfusion. (A) Eine schematische Darstellung, die die Schritte zeigt, die vor der Perfusion der Maus durch das Herz durchgeführt wurden, sowie die korrekte Position und Richtung der Perfusionsnadel im linken Ventrikel. Ein kleiner Schnitt im rechten Vorhof wurde durchgeführt und abfließendes Blut wurde gesammelt (1); Eine Schmetterlingsnadel wurde in die Herzspitze eingeführt. Halten Sie die Richtung ein, damit die Nadel nicht durch das Septum sticht (2). Das Einlassloch um die Nadel wurde mit Klebstoff auf Gelbasis verschlossen (3). Die Leber ist mit Blut gefüllt und erscheint vor der Durchblutung rot; Nach der Perfusion verliert es jedoch die Pigmentierung und wird blass. RA, rechte Ohrmuschel; LA, linke Ohrmuschel; RV, rechter Ventrikel; LV, linker Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Visualisierung von T. cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und Entzündungsherden in geklärten Organen. (A) Schema des ganzen Organs T. cruzi-Nachweis infizierter Zellen mittels Gewebereinigung, LSFM-Bildgebung und softwaregestützter Quantifizierung in 3D-Oberflächenmodellen. (Ich) Hellfeldaufnahmen des Herzens und der Skelettmuskulatur vor (links) und nach (rechts) Klärung (Maßstabsbalken: 1000 μm). (Ii) Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop. (Iii) IFN-gamma- defiziente Maus wurde mit 2 x 10 infiziert5 tdTomaten-exprimierende Trypomastigoten. 17 Tage nach der Infektion wurde das Herz seziert, CUBIC geklärt und LSFM abgebildet (Maßstabsbalken: 500 μm). (Iv) Die Z-Projektionsfluoreszenz wurde automatisch segmentiert, um ein rekonstruiertes 3D-Oberflächenmodell zur räumlichen Visualisierung und Quantifizierung der Anzahl der T. cruzi-infizierte Zellen. Insgesamt 736 T. cruzi-infizierte Zellen wurden im ganzen Herzen nachgewiesen (Maßstabsbalken: 500 μm). (v) zeigt Vergrößerungen des angezeigten Volumens in (Iv), wobei cyanfarbene Objekte für T. cruzi-infizierte Zellen (Maßstabsbalken: 50 μm). (B) Protokoll der CUBIC-Ganzorganklärung. (C) Visualisierung von proliferierenden und ruhenden T. cruzi Parasiten im transparenten Mausherz. (Ich) Eine Wildtyp-Maus wurde mit 2 x 10 infiziert5 tdTomato-exprimierende Trypomastigoten, gefärbt mit einem DiR-Nahinfrarot-Cyaninfarbstoff. Das Herz wurde seziert, geklärt und LSFM abgebildet. tdTomaten-exprimierend proliferierend (rot) und ruhend (cyan) T. cruzi Parasiten können identifiziert werden. Die Autofluoreszenzwerte wurden beibehalten, um eine korrekte Visualisierung der Herzstruktur zu ermöglichen. Eine Maus wurde 15 Tage nach der Infektion getötet, basierend auf dem Peak von parasiteninfizierten Zellen und ruhenden Amastigotes, die in früheren Arbeiten gefunden wurden (Maßstabsbalken: 400 μm). (Ii) und iii) Vergrößerungen des angezeigten Volumens anzeigen in (Ich), wobei gelbe Pfeile ruhende Parasiten (Cyan) anzeigen (Maßstabsbalken: 200 μm). (D) Nachweis der T-Zell-Rekrutierung in infizierter CD8-Reportermaus. (Ich) Reportermaus war infiziert mit 2 x 105 tdTomato-exprimierende Trypomastigoten und Skelettmuskeln wurden 14 Tage nach der Infektion seziert, geklärt und LSFM abgebildet, ein Zeitpunkt, an dem substanzielle Zellreaktionen nachgewiesen werden. ZsGreen1 exprimierende T-Zellen (blau) sowie T. cruzi-infizierte Zellen (rot) wurden sichtbar gemacht (Maßstab: 400 μm) (siehe auch Film 2). (Ii) zeigt Vergrößerungen des angezeigten Volumens in (Ich) (Maßstabsbalken: 50 μm). (Iii) zeigt die T-Zell-Akkumulation um eine T. cruzi-infizierte Zelle in einem Gewebeschnitt (200 μm) desselben Organs (Maßstabsbalken: 8 μm). (E) Wechselwirkung zwischen verschiedenen T. cruzi Stämme. (Ich) IFN-gamma-defiziente Mäuse wurden mit 2 x 105 tdTomato-exprimierendes Colombiana (rot) und GFP-exprimierendes Brasilien (blau) T. cruzi Stämme. Die Mäuse wurden eingeschläfert, und die intakten Herzen wurden 17 Tage nach der Infektion seziert, fixiert und entfernt (Maßstabsbalken: 400 μm). (Ii) zeigt Vergrößerungen des angezeigten Volumens in (Ich) (Maßstabsbalken: 250 μm). (Iii) zeigt einen vergrößerten optischen Schnitt, der Zellen zeigt, die mit Colombiana (rot) und Brasilien (blau) infiziert sind T. cruzi Stämme (Maßstabsbalken: 150 μm). (F) Visualisierung der Zellularität entlang infizierter Zellen mit Hilfe von Kernreportermaus. (Ich) Eine nukleare Reportermaus wurde mit 2 x 10 infiziert5 GFP-exprimierende Trypomastigoten und Skelettmuskeln wurden 35 Tage nach der Infektion seziert, geklärt und LSFM abgebildet. Es wurden eine nukleäre tdTomato-Expression der Wirtszellen (rot) sowie eine GFP-Parasitenexpression (Cyan) nachgewiesen (Maßstabsbalken: 400 μm). (Ii) zeigt einen vergrößerten optischen Schnitt, der die Ansammlung roter Kerne entlang GFP-exprimierender Parasiten zeigt (Maßstabsbalken: 90 μm). (Iii) bestätigt eine erhöhte Zellularität durch konfokale Bildgebung von Gewebeschnitten desselben Organs (Maßstabsbalken: 8 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Markierung von gereinigten T. cruzi-infizierten Organen mit Antikörpern und nuklearen Färben. (A) CUBIC-Protokoll zur Gewebereinigung, 3D-Immunfärbung und DNA-Markierung ganzer Organe. (B) Markierung des Mausherzens für den Gefäß- und DNA-Nachweis (siehe auch Film 3). (i-iii) Eine Wildtyp-Maus wurde mit 2 x 105 tdTomato-exprimierenden Parasiten infiziert. Die Maus wurde 40 Tage nach der Infektion eingeschläfert, und das Herz wurde seziert, fixiert und gereinigt. Das gereinigte Herz wurde mit einem DNA-Marker markiert und mit Antikörpern gegen α-SMA immungefärbt. Der gleichzeitige Nachweis von Zellkernen (blau), Gefäßen (weiß) und T. cruzi-infizierten Zellen (rot) war möglich. Die Maus wurde zu diesem Zeitpunkt nach der Infektion getötet, wenn Gewebe- und spezielle Gefäßumbauten beurteilt werden können (Maßstabsbalken: 400 μm). (iv) zeigt ein vergrößertes Volumen aus tiefen Herzregionen von (iii) die Zellkerne, Gefäße und infizierte Zellen darstellen (Maßstabsleiste: 90 μm). (v) zeigt einen optischen Schnitt von (iii) (Maßstabsbalken: 90 μm). (C) Erhöhte Zellularität, visualisiert durch DNA-Markierung des gesamten geklärten Skelettmuskels. (i) Skelettmuskelgewebe aus dem vorherigen Experiment war DNA-gefärbt, wobei Bereiche mit intensiver Kernmarkierung (blau) sowie T. cruzi-infizierte Zellen (rot) (Maßstabsbalken: 200 μm) sichtbar wurden (siehe auch Film 4). (ii) zeigt eine intensive Anhäufung blauer Kerne in Bereichen mit geringerem bis keinem Nachweis von tdTomato-Parasiten (Maßstabsbalken: 100 μm). (iii) Konfokale Bildgebung mit hoher Vergrößerung (60-fach) identifiziert DNA-Markierungen von Zellen und Parasiten in Gewebeschnitten (Maßstab: 10 μm). (D) Verstärkung von tdTomato-Parasiten-Reportermarkern in der gesamten geklärten Skelettmuskulatur. (i-iii) Intaktes Skelettmuskelgewebe von Mäusen, die mit 2 x 105 Parasiten infiziert waren, die tdTomato exprimieren, wurden fixiert, geklärt und mit Antikörpern gegen RFP (RFP Booster) immungefärbt. Ein intensives und gleichmäßiges Fluoreszenzsignal wurde im fernroten Kanal nach RFP-Verstärkung (grün) des tdTomato-Signals (rot) erhalten (Maßstabsbalken: 100 μm). (E) Boosting of GFP parasite reporter markers using anti-GFP nanobodies. (i-iii) Skelettmuskelgewebe von Mäusen, die mit 2 x 105 Parasiten infiziert waren, die GFP exprimieren, wurden fixiert, geklärt und mit Alexa Fluor 647-konjugierten Nanobodies gegen GFP (GFP Booster) immungefärbt. Ein starkes Fluoreszenzsignal wurde im fernroten Kanal nach GFP-Verstärkung (Magenta) der GFP-Fluoreszenz (Cyan) erhalten. Mäuse aus (D) und (E) wurden 30 Tage nach der Infektion getötet, da die Parasitenbelastung zu diesem Zeitpunkt einen Höhepunkt erreicht und parasiteninfizierte Zellen leicht in der Skelettmuskulatur nachgewiesen werden können (Maßstabsbalken: 100 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Film 1: T. cruzi-Infektion des Herzens und der Skelettmuskulatur bei IFN-gamma-defizienten Mäusen. 3D-Rekonstruktionen von CUBIC-geklärten Geweben von IFN-gamma-defizienten Mäusen, die am Tag 17 nach der Infektion mit 2 x 105 tdTomato-exprimierenden Colombiana (rot) und GFP-exprimierenden Brazil (blau) T. cruzi-Stämmen koinfiziert waren . Insgesamt wurden 1151 einzelne Schnitte des Herzens und 559 der Skelettmuskulatur über LSFM erworben. Vergleichbare Bildgebungsergebnisse wurden bei drei unabhängigen Tieren erzielt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 2: Nachweis der T-Zell-Rekrutierung in T. cruzi-infizierter CD8-Reportermaus. 3D-Visualisierung eines CUBIC-geklärten Skelettmuskels einer CD8-Reportermaus, die mit 2 x 105 Tdtomato-exprimierenden Colombiana T. cruzi-Stamm (rot) infiziert und 14 Tage nach der Infektion getötet wurde. Insgesamt wurden 668 einzelne Schnitte der Skelettmuskulatur mittels LSFM abgebildet. ZsGreen1 exprimierende T-Zellen (blau) sowie T. cruzi-infizierte Zellen (rot) wurden visualisiert. Vergleichbare Bildgebungsergebnisse wurden bei zwei Tieren erzielt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 3: Immundetektion des Gefäßsystems bei T. cruzi-infiziertem und geklärtem Herzen. 3D-Rekonstruktion eines CUBIC-geklärten Herzens von Wildtyp-Mäusen, die 40 Tage nach der Infektion mit 2 x 105 tdTomato-exprimierenden Colombiana T. cruzi infiziert und mit Antikörpern gegen α-SMA (blau) immungefärbt waren. Das Durchschneiden des Herzens zeigt das komplizierte Gefäßsystem des Herzens und das Eindringen der α-SMA-Antikörper in das Gewebe. Parasiteninfizierte Zellen konnten als leuchtend rote Flecken in den Herzvorhöfen beobachtet werden (rot, rechts). Vergleichbare Bildgebungsergebnisse wurden bei zwei Tieren erzielt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 4:Die DNA-Färbung des gesamten Organs zeigt Bereiche mit erhöhter Zellularität. 3D-Rekonstruktion der CUBIC-geklärten Skelettmuskulatur einer Wildtyp-Maus 40 Tage nach der Infektion, infiziert mit 2 x 105 tdTomato-exprimierendem Colombiana T. cruzi-Stamm. Der gesamte Quadrizepsmuskelbereich wurde mit einem grünen Kernfarbstoff gefärbt. T. cruzi-infizierte Zellen (rot) und die Kerne jeder Zelle im Gewebe (blau) wurden visualisiert. Zoom-ins der 3D-Rekonstruktion zeigen eine Ansammlung von blauen Kernen entlang von Bereichen, in denen tdTomato-Parasiten nur wenige oder gar keine nachgewiesen werden. Vergleichbare Bildgebungsergebnisse wurden bei zwei Tieren erzielt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Zusatzdossier 1: Zusammensetzung der in der Studie verwendeten Antikörperfärbelösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Fehlen einer umfassenden Ganzorgan-Bildgebung von Parasiten und der Immunantwort schränkt das Verständnis der Komplexität der Wirt-Parasit-Interaktionen ein und behindert die Bewertung von Therapien für die Chagas-Krankheit. Die vorliegende Studie übernahm die CUBIC-Pipeline, um intakte Organe und Gewebe von T. cruzi-infizierten Mäusen zu klären und zu färben.
In dieser Studie wurden mehrere Gewebereinigungsprotokolle getestet (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 und fDISCO13); jedoch bewahrte nur CUBIC hohe Mengen an tdTomato- oder GFP-Parasitenfluoreszenz. In ähnlicher Weise zeigten frühere Berichte die CUBIC-Konservierung endogen exprimierter Marker im Vergleich zu anderen Gewebereinigungsansätzen35.
Die begrenzte Auflösungskapazität ist einer der aktuellen Vorbehalte der konventionellen Lichtblattmikroskopie. Dies zeigt sich in den Schwierigkeiten, einzelne Parasiten in stark infizierten Zellen aufzulösen (Abbildung 2C). Die neu entwickelten Kachellichtblattmikroskope mit verbessertem Auflösungsvermögen und der Anpassung von Gewebeexpansionstechniken könnten dieses Problem lösen36.
Verunreinigungen aus den Waschpuffern, Reinigungslösungen oder anderen Organen können im Gewebe ausfallen und unspezifische Signale erzeugen, die mit parasiteninfizierten Zellen, einzelnen Parasiten oder anderen Strukturen verwechselt werden können. Diese Artefakte fluoreszieren jedoch normalerweise hell in mehreren Kanälen, so dass sie nach der Bildanalyse leicht aus der automatisierten Zählung verworfen werden können, indem Gewebe in einem alternativen Kanal (normalerweise dem grünen Kanal) abgebildet werden. Doppelfarbige Objekte wurden als Artefakte betrachtet und für die automatisierte Quantifizierung ausgeschlossen.
Kernfärbungen DAPI, PI, RedDot2 und SYTOX-G weisen in den meisten der CUBIC-befreiten Organe eine gute Gewebepenetration und Signalintensität auf; Der grüne DNA-Farbstoff zeigte jedoch die beste Leistung (Abbildung 3B, C und Film 4).
Diese Ergebnisse zeigten, dass T. cruzi-infizierte Zellen leicht erkannt und genau quantifiziert werden konnten, während gleichzeitig T-Zell- oder Kernreporter-Mäusesignale identifiziert wurden. Am wichtigsten ist, dass LSFM seltene biologische Ereignisse, wie DiR-positive ruhende Amastigotes, in einer komplexen Gewebeumgebung mit der potenziellen Fähigkeit entdeckte, sie auf Epitop-Immunfärbung und DNA-Markierung auszudehnen. Aktuelle Studien untersuchen auch den Nutzen dieser Ansätze zur Überwachung der Aktivierung von Immuneffektorzellen, der Wechselwirkungen zwischen mehreren Parasitenstämmen im selben Wirt und der Induktion von Gewebeschäden und -reparaturen bei der Chagas-Krankheit.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Etsuo Susaki für ihre wertvolle Hilfe und Empfehlungen zu Protokollen zur Gewebereinigung und Immunfärbung. Außerdem danken wir M. Kandasamy vom CTEGD Biomedical Microscopy Core für die technische Unterstützung mit LSFM und konfokaler Bildgebung. Wir danken auch allen Mitgliedern der Tarleton Research Group für hilfreiche Vorschläge während dieser Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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