Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En löslig tetrazoliumbaserad reduktionsanalys för att utvärdera effekten av antikroppar på Candida tropicalis-biofilmer

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Häri beskrivs ett 96-brunns mikrotiterplattbaserat protokoll som använder en 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduktionsanalys för att studera antikroppars effekter på biofilmer bildade av C. tropicalis. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer.

Abstract

Candida-arter är den fjärde vanligaste orsaken till systemiska nosokomiala infektioner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverar ofta biofilmbildning på implanterade enheter eller katetrar, vilket är förknippat med ökad virulens och dödlighet. Biofilmer som produceras av olika Candida-arter uppvisar ökat motstånd mot olika svampdödande läkemedel. Därför finns det ett behov av att utveckla effektiva immunterapier eller tilläggsbehandlingar mot Candida-biofilmer . Medan rollen som cellulär immunitet är väl etablerad i anti-Candida-skydd , har rollen som humoral immunitet studerats mindre.

Det har antagits att hämning av biofilmbildning och mognad är en av de viktigaste funktionerna för skyddande antikroppar, och Candida albicans bakterierörsantikroppar (CAGTA) har visat sig undertrycka in vitro-tillväxt och biofilmbildning av C. albicans tidigare. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för utvärdering av antikroppars roll på biofilmer bildade av C. tropicalis. Metoden för detta protokoll involverar C. tropicalis biofilmbildning i 96-brunns mikrotiterplattor, som sedan inkuberades i närvaro eller frånvaro av antigenspecifika antikroppar, följt av en 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) analys för mätning av den metaboliska aktiviteten hos svampceller i biofilmen.

Specificiteten bekräftades genom att använda lämpliga serumkontroller, inklusive Sap2-specifikt antikroppsutarmat serum. Resultaten visar att antikroppar som finns i serum hos immuniserade djur kan hämma Candida biofilmmognad in vitro. Sammanfattningsvis ger detta dokument viktiga insikter om antikroppars potential att utveckla nya immunterapier och synergistiska eller kompletterande behandlingar mot biofilmer under invasiv candidiasis. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer.

Introduction

Systemisk candidiasis är den fjärde huvudorsaken till nosokomiala infektioner, som är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. Globalt påverkar systemisk candidiasis cirka 700 000 individer1. Candida-arter, nämligen C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata och C. auris, är den vanligaste orsaken till invasiva Candida-infektioner 2. Candida-arter är opportunistiska patogener som producerar biofilmer3. Biofilmer är främst associerade med Candida virulens, och Candida kan motstå oxidativa och osmotiska stressförhållanden genom att inducera biofilmbildning4. Biofilmer modulerar ytterligare uttrycket av virulensfaktorer och cellväggskomponenter och bildar en exopolymer skyddsmatris, vilket hjälper Candida att anpassa sig till olika värdnischer4. Biofilmer bidrar till jästföljsamhet på värdvävnader och medicinska instrument5. Som sådan är biofilmbildning associerad med en fördel för jäst, eftersom jästceller i biofilmerna kan undvika värdens immunsvar6. Biofilmbildning skyddar också de patogena jästarna från verkan av svampdödande läkemedel5. Minskad känslighet för C. albicans biofilmer för amfotericin B har visats av Pierce et al.7,8. Dessutom visar biofilmer svampdödande läkemedelsresistens mot flukonazol, vilket försämrar effektiv hantering av systemisk candidiasis 9,10.

Mikrober har en inneboende tendens att fästa vid olika biotiska och abiotiska ytor, vilket resulterar i biofilmbildning. Candida albicans, som är en dimorf svamp, finns i jäst- och hyphalformer, och dess biofilmbildning har karakteriserats i olika in vitro- och in vivo-modellsystem 11. Stegen i biofilmbildning inkluderar vidhäftning av Candida-celler till substratet, filamentation, proliferation och biofilmmognad11. Ursprungligen fäster jästformen av C. albicans på substrat, inklusive medicintekniska produkter och mänsklig vävnad, följt av filamentation och proliferation av C. albicans i hyphal och pseudohyphal former, och slutligen mognad av biofilmer inbäddade i extracellulär matris11. Biofilmbildning bidrar till stor del till C. albicans patogenesmekanismer12. Candida-arter bildar läkemedelsresistenta biofilmer, vilket gör deras utrotning utmanande13. En liten delmängd av den C. albicans biofilmproducerande populationen har beskrivits som mycket resistent mot de svampdödande läkemedlen amfotericin B och klorhexidin14. Observera att jästceller i biofilmer uppvisar hög resistens mot multidrogterapi jämfört med jästceller i planktonfasen och proliferationsfas14. Det har föreslagits att jästceller som finns i biofilmer är mycket toleranta mot svampdödande läkemedel, vilket bidrar till C. albicans överlevnad i biofilmer14. Dessa befintliga celler rapporterades vara fenotypiska varianter av C. albicans och inte mutanter14. Dessutom är celler av Candida-biofilmer som kallas "persisterceller" toleranta mot höga doser av amfotericin-B-behandling och bidrar till Candida-överlevnad, vilket utgör en stor börda av återkommande systemiska Candida-infektioner hos högriskindivider 15.

Ökningen av svampdödande läkemedelsresistens i Candida-stammar kräver forskning för nya svampdödande medel och immunterapier. Som framgår av ovannämnda studier visar Candida biofilmer minskad mottaglighet för svampdödande läkemedel. Därför finns det ett behov av förbättrade immunterapier för att kontrollera Candida biofilmbildning. Tidigare studier har visat att CAGTA kan ge ett effektivt skydd mot systemiska Candidainfektioner genom att hämma C. albicans biofilmbildning in vitro16. En annan studie rapporterade att immunisering av möss med C. albicans rAls3-N-protein inducerar höga antikroppstitrar som stör C. albicans biofilmbildning in vitro17. Anti-Als3-N-antikroppar utövade också en hämmande effekt på C. albicans spridning från biofilmer17. NDV-3A-vaccin baserat på C. albicans är för närvarande under klinisk prövning och anti-NDV-3A-serum visade sig också minska C. auris biofilmbildning18. En nyligen genomförd studie identifierade hämning av biofilmbildning av Sap2-antikroppar som en skyddsmekanism i en murin modell av systemisk candidiasis19.

Detta dokument beskriver ett detaljerat in vitro-protokoll för utvärdering av effekten av antigenspecifika antikroppar närvarande i polyklonalt serum erhållet från olika grupper av Sap2-vaccinerade möss på förformade Candida tropicalis-biofilmer . För att uppnå detta optimerades och utvecklades en metod baserad på en XTT-reduktionsanalys i laboratoriet, som kan mäta biofilmens livskraft på ett snabbt, känsligt och högt genomströmningssätt, i närvaro eller frånvaro av antikroppar.

XTT-analysen används för att mäta cellulär metabolisk aktivitet som en indikator på cellviabilitet, cellulär proliferation och cytotoxicitet20. Denna kolorimetriska analys är baserad på reduktionen av ett gult tetrazoliumsalt, natrium 3'-[1-(fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoxi-6-nitro) bensensulfonsyrahydrat (XTT) till ett orange formazanfärgämne av metaboliskt aktiva celler. Eftersom endast livskraftiga celler kan minska XTT är mängden reducerad XTT-formazan proportionell mot intensiteten av färg och cellviabilitet. Det formazanfärgade färgämnet som bildas är vattenlösligt och kvantifieras direkt med hjälp av en plattläsare. På grund av sin vattenlösliga natur tillåter XTT-analysen studier av intakta biofilmer, liksom undersökning av biofilmläkemedelskänslighet, utan störning av biofilmstruktur21. Dessutom implementeras denna metod i Candida svamp livskraft bedömningar på grund av dess användarvänlighet, hastighet, noggrannhet, hög genomströmning, och hög grad av reproducerbarhet 7,22.

Förutom XTT-reduktionsanalysen har många alternativa tekniker också identifierats för mätning av biofilmkvantitet. Några av dessa inkluderar användningen av MTT-reduktionsanalysen, kristallviolett färgning, DNA-kvantifiering, kvantitativ PCR, proteinkvantifiering, torrcellsviktmätning och livskraftig koloniräkning. Dessa förfaranden varierar mycket när det gäller deras tids- och kostnadskrav. utförde en jämförande analys av sju olika Candida-biofilmkvantifieringsanalyser och fann att XTT-analysen gav den mest reproducerbara, exakta och effektiva metoden för kvantitativ uppskattning av C. albicans biofilmer23. Färgningstekniker som kristallviolett har vissa begränsningar; Det kristallvioletta testet bestämmer indirekt mängden biofilm genom att mäta den optiska densiteten hos den kristallviolettfärgade biofilmmatrisen och cellerna. Även om den kristallvioletta analysen ger ett bra mått på biofilmmassa, ger den inte ett mått på biofilmens livskraft eftersom den fläckar både mikrobiella celler och den extracellulära matrisen24. rapporterade vidare att XTT-reduktionsanalysen var den mest känsliga, reproducerbara, exakta, effektiva och specifika metoden för att detektera biofilmproduktion jämfört med kristallviolett analys25. Litteraturrapporter har visat att XTT-analysen korrelerar väl med CFU/ml-parametern i CFU-räkningsmetoden. Men jämfört med XTT-analysen är CFU-metoden arbetsintensiv och långsam26. Dessutom kan det hända att andelen fristående levande celler inte är representativ för den ursprungliga biofilmpopulationen27. Även om XTT-reduktionsanalysen verkar vara det bästa tillgängliga alternativet för att kvantifiera lönsamheten, finns det några begränsningar med denna teknik. Medan XTT-metoden är användbar för jämförelser som involverar en svampstam, kan dess användning vara begränsad när man jämför olika svampstammar och arter. Interstrain jämförelser kan vara svåra i avsaknad av detaljerad standardisering eftersom olika stammar metaboliserar substrat med olika kapacitet21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BALB/c-möss inhystes i smådjursanläggningen vid IIT Roorkee. Alla djur hölls i en 12 h:12 h ljus:mörk cykel vid 25 °C och försågs med en pelletsdiet och vatten ad libitum. Alla djurförsök godkändes av IIT Roorkees institutionella djurförsöksetiska kommitté (IAEC).

1. Beredning av C. tropicalis

OBS: Svampen Candida tropicalis tillhör riskgrupp 2-patogener och klassificeras som en BSL2-mikroorganism. Använd alltid certifierade klass II biologiska säkerhetsskåp när du arbetar med Candida-arter . Öva aseptiska och sterila tekniker under arbetet med C. tropicalis och följ de rekommenderade biosäkerhetsprocedurerna för korrekt bortskaffande av denna patogen.

  1. Stryk C. tropicalis (stam ATCC 750) på en Sabouraud dextros (SAB) agarplatta.
  2. Förbered en odlad kultur över natten av C. tropicalis genom att ympa en enda koloni från SAB-agarplattan till ett sterilt 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml SAB-buljongmedium. Alternativt kan du använda en fryst glycerolstam av C. tropicalis och ympa 100 μl av glycerolbuljongen till en steril 250 ml E-kolv som innehåller 50 ml SAB-buljongmedium.
  3. Inkubera C. tropicalis-kulturen i en orbital shaker vid 180 rpm vid 30 °C i 24-48 timmar.
  4. Centrifugera svampkulturen (celler i logaritmisk fas) vid 2 150 × g i 15 minuter vid 21 °C.
  5. Kassera supernatanten och tillsätt 50 ml steril 1x PBS till pelleten. Tvätta och återsuspendera pelleten i steril 1x PBS med mild virvel.
  6. Centrifugera igen vid 2 150 × g i 15 minuter vid 21 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera svamppelleten i 10 ml steril 1x PBS.
  7. Beräkna koncentrationen av celler genom att räkna med en hemocytometer.
  8. Bered svampstammar med en slutlig densitet av 1,0 × 106 celler/ml i RPMI 1640 morfolinepropansulfonsyra (MOPS) medium. Använd cellsuspensionen från steg 1.6 omedelbart.
    OBS: För att sätta upp en 96-brunnsplatta är den totala svampstamvolymen som behövs 10 ml (100 μL / brunn). Skala efter behov.

2. C. tropicalis biofilmbildning

  1. Förbered Candida-biofilmer i en 96-brunns flatbottnad polystyrenmikrotiterplatta som beskrivits tidigare (figur 1)28,29.
  2. Tillsätt 100 μL C . tropicalis-odling (från 106 celler/ml stam, beredd enligt ovan) till en mikrotiterplatta med 96 brunnar med en flerkanalig pipett (figur 2A). Håll de två sista kolumnerna (11 och 12) som "ingen svamp plus serum" och "ingen svamp och inget serum" negativa kontroller genom att inte tillsätta svampceller. Fyll kolumnerna 11 och 12 med 100 μL RPMI 1640 MOPS-medium ensamt.
  3. Täck mikrotiterplattan med lock och aluminiumfolie. Inkubera plattan i 24 timmar vid 37 °C under stationära förhållanden.
  4. Nästa dag, aspirera mediet försiktigt med en flerkanalig pipett (utan att röra eller störa biofilmerna). Knacka försiktigt på plattan i en inverterad position på blottingark för att ta bort eventuellt kvarvarande medium.
  5. Tvätta plattan med 200 μL 1x PBS (per brunn) med en flerkanalig pipett. Tillsätt PBS mycket försiktigt längs brunnens sidoväggar för att undvika att störa biofilmer. Aspirera PBS försiktigt med en flerkanalig pipett. Upprepa PBS-tvätten 2x (totalt tre tvättar).
  6. För att ta bort överskott av PBS, lufttorka plattan (utan lock) i 30 minuter vid rumstemperatur, inuti ett biologiskt säkerhetsskåp.

3. Behandling av biofilm med antikroppar

OBS: Biofilmer kan nu bearbetas för att bedöma hämningen av biofilmmognad av antikroppar. Murinserum användes som källa till polyklonala antikroppar. Olika grupper av Sap2-immuniserade (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis och Sap2-parapsilosis) tillsammans med skenimmuniserade möss blödde retro-orbitalt och serum isolerades som beskrivits tidigare19. Förekomsten av anti-Sap2-antikroppar bekräftades med Sap2-specifik ELISA som beskrivits tidigare19.

  1. Utför värmeinaktivering av serumet (källa till polyklonala antikroppar) vid 56 °C i 30 minuter före användning för att utesluta komplementets roll i den hämmande aktiviteten. Värm in serumet innan du gör serumutspädning.
    OBS: Använd serum från skenimmuniserade möss, preimmuna möss och Sap2-specifikt antikroppsutarmat serum som ytterligare kontroller19. Antikroppsutarmat serum framställdes enligt en tidigare studie19. Bland de seriella utspädningarna (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1 600, 1:3 200, 1:6 400 och 1:12 800) för serum som testades i detta protokoll observerades hämning av biofilmmognad vid 1:25, 1:50 och 1:100; Därför valdes 1:50 för att hitta en balans mellan hämning och serumkonsumtion.
  2. Bered serieutspädningar av värmeinaktiverade serumprover i sterilt RPMI 1640 MOPS-medium (1:50). Använd en vanlig serumutspädning (1:50) för alla serumprover som ska testas för hämning av biofilmmognad30.
  3. Tillsätt 100 μl av den valda serumutspädningen till varje brunn på mikrotiterplattan med 96 brunnar. För varje prov, tillsätt serumutspädningar i två exemplar, enligt den bifogade layouten (figur 2B).
    1. Tillsätt inte serumutspädning i kolumn 10. lägg endast till RPMI 1640 MOPS-medium för svampens positiva kontroll.
      OBS: Kolumn 10, raderna G1-G8 och H1-H8 hade ursprungligen svampceller i RPMI-MOPS. Men medan RPMI-MOPS lades till i kolumn 10 även efter 24 h, fungerade raderna G1-G8 som PBS-kontroll och raderna H1-H8 som ingen serumkontroll efter 24 h.
    2. I kolumn 11, tillsätt en 1:50 utspädning av serum till alla brunnar för att fungera som ingen svamp plus serumnegativ kontroll.
    3. I kolumn 12, tillsätt inte serumutspädning till någon brunn; behåll detta som ingen svamp ingen serum negativ kontroll.
  4. Täck plattan med lock och aluminiumfolie. Inkubera plattan i 24 timmar vid 37 °C.

4. Uppskattning av metabolisk aktivitet i biofilm

  1. Nästa dag, aspirera serumet försiktigt med en flerkanalig pipett (utan att röra eller störa biofilmerna). Knacka försiktigt på plattan i en inverterad position på blottingark för att ta bort eventuellt kvarvarande serum.
  2. Tvätta plattan med 200 μL 1x PBS (per brunn) med en flerkanalig pipett och tillsätt PBS längs brunnens sidoväggar för att undvika att störa biofilmerna. Aspirera PBS försiktigt med en flerkanalig pipett och upprepa PBS-tvätten 2x (totalt tre tvättar). Lufttorka plattan (utan lock) i 30 minuter vid rumstemperatur, inuti ett biologiskt säkerhetsskåp för att torka eventuellt överskott av PBS.
  3. Beredning av XTT/menadion:
    1. Bered XTT i sterilt Ringers Laktat som en 0,5 g / L lösning. Lös upp 25 mg XTT i 50 ml filtersteriliserat ringers laktat. Alikvot 10 ml i separata rör täckta med aluminiumfolie och förvaras vid -80 °C.
    2. Förbered menadion som ett 10 mM lager. Lös upp 8,6 mg menadion i 5 ml aceton och fördela 50 μl i 100 separata mikrorör. Förvara alikvoterna vid -80 °C.
    3. Bered XTT/menadionlösning strax före användning genom att ta 10 ml XTT och tillsätt 1 μl menadion för att få en arbetslösning på 1 μM.
  4. Tillsätt 100 μl XTT/menadionlösning per brunn på mikrotiterplattan med 96 brunnar. Täck plattan med lock och aluminiumfolie. Inkubera plattan i 2 timmar vid 37 °C i mörker.
  5. Överför 80 μL av den färgade supernatanten från varje brunn till en ny 96-brunnsplatta. Läs plattan vid 490 nm.
  6. Beräkna medelvärdet av brunnarnas absorbansvärden i kolumn 10 (positiv bekämpning endast av svamp), som kommer att fungera som referensvärde för beräkning av den procentuella biofilmhämningen för varje serumprov med hjälp av ekvation (1).
    % Biofilmhämning = 100 - Equation 1× 100 (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Candida tropicalis biofilmer odlades i 96-brunns mikrotiterplattor och avbildades vid 40x med hjälp av ett inverterat mikroskop (figur 1A). Biofilmen färgades vidare med kristallviolett och observerades vid 40x med hjälp av ett inverterat mikroskop (figur 1B). Svepelektronmikroskopi visar en representativ bild av C. tropicalis biofilm (figur 1C). För att utföra biofilmhämningsanalysen tillsattes 105 celler av Candida till brunnarna på 96-brunns mikrotiterplattan vid tiden 0, enligt layouten (figur 2A). Efter 24 timmar tvättades plattan och serumprover tillsattes till de förformade biofilmerna. En vanlig serumutspädning på 1:50 valdes för att jämföra olika serumprover erhållna från olika grupper av Sap2-immuniserade och skenimmuniserade möss enligt en pilotstudie och en tidigare publicerad rapport30.

Olika serumprover tillsattes till mikrotiterplattan med 96 brunnar enligt layout (figur 2B) och bedömdes i två exemplar. Sera erhållen vid dag 30 efter immunisering från tre möss per grupp (Sap2-albicans immuniserade, Sap2-tropicalis immuniserade, Sap2-parapsilosis immuniserade, skenimmuniserade grupp, preimmuna möss och Sap2-utarmat kontrollprov) analyserades vid en utspädning på 1:50. Plattan lästes vid 490 nm våglängd med hjälp av en ELISA-läsare för att erhålla XTT-kolorimetriska avläsningar (OD490-värden ) för C. tropicalis-biofilmer bildade i närvaro eller frånvaro av serum (tabell 1). Negativt blankt beräknades med hjälp av medelvärdet av kolumnerna 11 och 12 (0,04). Positiv kontroll beräknades genom att beräkna ett genomsnitt av svampbrunnar (kolumn 10; 0,8165). Före beräkningarna subtraherades det genomsnittliga absorbansvärdet för kontrollbrunnarna i kolumnerna 11 och 12 (0,04) från absorbansmätningarna i experimentbrunnarna. Således fastställdes referensvärdet för den positiva kontrollen av biofilmen (kolumn 10) till 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).

De värden (genomsnittligt minusämne) som erhölls för experimentbrunnarna dividerades sedan med denna positiva kontroll (0,7765) och procentandelen erhölls genom att multiplicera med 100. Procentuell biofilmhämning beräknades genom att ytterligare subtrahera värdet erhållet från 100. Ett stapeldiagram visar alla ritade värden (bild 3). Vanlig enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts post hoc-test för flera jämförelser användes för att beräkna p-värden för att bedöma statistiska skillnader mellan olika serumgrupper. Ett p-värde på <0,05 ansågs statistiskt signifikant. Serum från Sap2-parapsilosimmuniserade möss kan förhindra mognad av förformade C. tropicalis-biofilmer med 65%, jämfört med serum från Sap2-albicans (45%) och Sap2-tropicalis (55%) immuniserade möss. I allmänhet var biofilmhämning av Sap2-immunserum signifikant högre än för bluffimmunserum (16%) respektive preimmunt serum (13%). Vid utarmning av Sap2-specifika antikroppar från serum som beskrivs någon annanstans19 reducerades biofilmhämningsförmågan till 10%. Biofilmhämning var nära försumbar vid användning av PBS (5%) och ingen serumkontroll (5%).

Figure 1
Figur 1: Imaging Candida tropicalis biofilm. (A) Visualisering av Candida tropicalis biofilm bildad på botten av en 96-brunns mikrotiterplatta efter avlägsnande av RPMI-medium, med hjälp av ett inverterat mikroskop. Bilden togs med hjälp av ljusfältmikroskopi (ingen fläck användes). (B) Visualisering av C. tropicalis biofilm bildad på botten av en 96-brunns mikrotiterplatta efter kristallviolett färgning. (C) Visualisering av C. tropicalis biofilm bildad på glasskivor med hjälp av svepelektronmikroskopi. Skalstänger = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Layout för plåtformatet med 96 brunnar. Tillsats av (A) svampceller till brunnarna och (B) serumutspädningar från olika mössgrupper (Sap2-albicans immuniserade, Sap2-tropicalis immuniserade, Sap2-parapsilosis immuniserade och skenimmuniserade; n = 3) bedömda i två exemplar vid en utspädning på 1:50. Ytterligare kontroller inkluderade Sap2-utarmat serum, preimmunt serum, PBS och ingen serumkontroll. Kolumn 10 hade inget serum tillsatt (svampceller närvarande, positiv kontroll). Kolumn 11 hade inga svampceller tillsatta (serum närvarande). Kolumn 12 hade inga svampceller tillsatta (serum frånvarande). Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; Sap2 = utsöndrat aspartylproteinas 2. Termerna m1, m2 och m3 hänvisar till olika möss i varje grupp (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Diagram som visar effektiviteten hos Sap2-specifika polyklonala antikroppar mot förformade C. tropicalis-biofilmer. Källan till immunserum visas på x-axeln, medan procentandelen hämning av C. tropicalis biofilmmognad visas på y-axeln. Staplar representerar medelvärdet ± SEM (n = 3). Vanlig enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts post hoc-test för flera jämförelser användes för att beräkna p-värden. Staplar och symboler representerar skillnaderna mellan Sap2-immuniserade mössgrupper med skenimmuniserade möss. , s < 0,0001. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; Sap2 = utsöndrat aspartylproteinas 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tabell 1: Absorbansavläsningar vid 490 nm för mikrotiterplattan med 96 brunnar. En standardplattläsare (Tecan) användes för att erhålla absorbansavläsningarna och avläsningarna matchades med den layout som beskrivs i figur 2. Efterföljande beräkningar utfördes med hjälp av dessa data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Svampinfektioner orsakade av Candida-arter är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. Det växande hotet om invasiv svampinfektion kräver tidig hantering av sådana livshotande sjukdomar. De flesta Candida-infektioner involverar bildandet av biofilmer, som följer en mängd olika medicintekniska produkter och är ansvariga för uthållighet och återkommande svampinfektioner i sjukhusinställningar31. Biofilmer består av jäst- eller hyphalceller, och de uppvisar betydande resistens mot en majoritet av konventionella svampdödande läkemedel32. Svampdödande resistens av Candida biofilmer har tillskrivits flera mekanismer, inklusive minskad svampdödande penetration, närvaro av extracellulär matris, överuttryck av läkemedels-effluxpumpar, förändrad cellmembransterolkomposition, långsam tillväxt och rumslig heterogenitet, aktivering av olika signalvägar och närvaron av läkemedelstoleranta persisterceller33,34. Hämning av Candida vidhäftning och biofilm bildning är de viktigaste strategierna för att förhindra Candida infektion.

Olika in vitro-analyser, såsom cellviabilitetsanalyser, mikrotiterplattanalyser och torrviktsmätningsanalyser, har använts för att studera Candida biofilmbildning, som är baserade på den specifika tidspunktsbedömningen av biofilmer23. Mer avancerade analyser som mikrofluidiska enhetsbaserade analyser har utvecklats, som kan användas för att bedöma biofilmbildningi realtid 35. Hittills har biofilmbildning studerats med hjälp av in vitro-analyser, men det finns ett behov av att förstå den dynamiska processen för biofilmbildning under in vivo-förhållanden samt36,37. För närvarande gäller de flesta biofilmhämningsstudierna C. albicans och få studier finns tillgängliga för utrotning av icke-albicans Candida-biofilmer. Spektrumet av Candida-infektioner har förändrats gradvis under de senaste decennierna och framväxande Candida-arter som inte är albicaner utgör en hög börda av sjuklighet och dödlighet över hela världen. Därför finns det ett framväxande behov av utveckling av nya strategier för att kontrollera biofilmbildning och utveckling av biofilmhämningsanalyser med fokus på Candida-arter som inte är albicaner. Immunterapi, särskilt antikroppar, har en stor potential att hämma biofilmbildning och kan användas för att behandla systemisk Candida-infektion 38. Flera rapporter har visat antikropparnas roll i biofilmhämning i tidigare stadier av biofilmbildning. Det rapporterades att polyklonala antikroppar genererade som svar på komplementreceptor 3-relaterat protein (CR3-RP, som har en potentiell roll i svampföljsamhet) immunisering hos kaniner minskade vidhäftningen och biofilmbildningen av C. albicans på buckala epitelceller39. Vidare förinkuberades Candida-stammar inklusive kateterisolat med polyklonal anti-CR3-RP-antikropp och monoklonal antikropp, OKM1, vilket minskade vidhäftningen och biofilmbildningen. Cellviabiliteten hos C. albicans utvärderades med hjälp av XTT-analysen under följsamhetsfasen och biofilmbildningsfasen40. Få studier har utvärderat rollen av antikroppar mot icke-albicans Candida art biofilmbildning. utvärderade effektiviteten av polyklonala anti-CR3-RP-antikroppar mot C. albicans tillsammans med C. dubliniensis med hjälp av XTT-analysen. Polyklonala anti-CR3-RP-antikroppar hämmade vidhäftning och biofilmbildning av både C. albicans och C. dubliniensis41.

I denna studie beskrivs ett enkelt, snabbt och användarvänligt protokoll för att bedöma effekten av antikroppar på biofilmmognad och utveckling. Denna 96-brunns mikrotiterplattbaserade XTT-reduktionsanalys mäter den metaboliska aktiviteten hos livskraftiga celler i biofilmer och har anpassats från tidigare studier 7,8. XTT-analysen som beskrivs häri används i stor utsträckning för att uppskatta livskraftig biofilmtillväxt. Det har blivit ett vanligt cellviabilitetstest eftersom det är snabbt, bekvämt och kan användas i högkapacitetsformat som en 96-brunnsplatta. Vidare kan den användas för att kvantifiera både jäst och hyphal former av Candida biofilmer. Det kan också användas för mätning av Candida-biofilmer på en mängd olika substrat såsom medicintekniska produkter (t.ex. katetrar) och kontaktlinser.

Några av de kritiska stegen i detta protokoll inkluderar kraftig virvelning av cellsuspensionerna innan pipettering i alla steg, för att undvika svampaggregering7. Dåliga biofilmer kommer sannolikt att utvecklas när celltätheten antingen är för hög eller för låg. Därför bör användarna följa den ideala svampcellstätheten i den initiala inokulum7. Tvättstegen är mycket kritiska och överdriven celltvätt bör undvikas för att förhindra att biofilmen22 störs. Bottenskiktet i biofilmen bör inte störas under tvättprocessen. Analysen bör alltid utföras under mörka förhållanden, och det är nödvändigt att inkludera flera replikat22. En ny lösning av XTT bör beredas varje gång strax före användning. Eftersom tidsskillnaden mellan två reaktioner kan förvränga resultaten bör användarna arbeta snabbt för att säkerställa en minimal tidsskillnad när XTT-lösningen läggs till den första och sista brunnen på 96-brunnsplattan42. Användning av folie eller parafilm rekommenderas för att förhindra avdunstning. Flera felsökningssteg kan utföras vid behov. Om biofilmtillväxten saknas eller är otillfredsställande bör lämplig utspädning och beräkning av ympinokulum användas. För bättre biofilmbildning kan subkultureringsförhållandena ändras och biofilmtillväxt kan provas med olika ytmaterial. För att avsevärt förbättra XTT-analysens känslighet kan man minska den tid som krävs för att biofilm ska bildas, öka svampdödande medels koncentration eller förkorta analysens inkubationsperiod7. För att undvika att störa biofilmen bör överdriven celltvätt undvikas22. Man kan antingen undvika de yttre brunnarna för att förhindra att analysmedlen utsätts för ljus eller tillsätta vätska till de yttre brunnarna för att förhindra att medlen avdunstar från de inre brunnarna. Skonsamma tvättar ska ges om biofilmen störs under tvätt22. Medan detta protokoll testar effekten av serum på 24 h förformade biofilmer för att bedöma hämningen av biofilmmognad, kan användare också ändra detta protokoll för att lägga till serum vid tiden 0 för att bedöma hämning av biofilmbildning, enligt en tidigare rapport30.

Jämfört med andra alternativa metoder för att kvantifiera biofilmtillväxt är XTT-metoden den mest känsliga, reproducerbara, exakta, kostnadseffektiva och specifika metoden. Även om XTT-analysen är en vanligt förekommande snabb och enkel teknik för att utvärdera biofilmer, har den vissa begränsningar. Även om det är användbart för att bestämma doseringen eller effekterna av olika medel i en biofilm från en enda art, bör den användas med försiktighet för att jämföra flera isolat samtidigt på grund av metabolisk variation mellan isolat21. För interstrain biofilmjämförelser bör detaljerad teknikstandardisering utföras21. Dessutom, medan XTT-formazanprodukten lätt löses upp i lösning, kan vissa stammar behålla en viss mängd i cellen21. Eftersom det finns en brist på tydlighet som involverar variabler, såsom val av media, tid för biofilmutveckling och serumspecifikationer, är det lämpligt att utföra bekräftande bioassays utöver XTT-analysen, till exempel mätning av biofilmtjocklek / biomassa (med kristallviolett) eller cellviabilitet (med CFU-metoden)43. Observera att resultaten av denna XTT-analys korrelerade väl med kristallviolettanalysen och CFU-metoden (data visas inte). Trots de begränsningar som nämns ovan kan denna metod extrapoleras för att utvärdera olika grupper av serumprover (källa till polyklonala antikroppar), monoklonala antikroppar eller kompletterande immunterapier. Även om XTT-reduktionsprotokollet som presenteras här endast visar effekten av antikroppar på C. tropicalis-biofilmer, har det använts av forskare för att studera effekten av antikroppar på C. auris-biofilmer också18. Dessutom härrör detta protokoll från tidigare studier utförda med andra Candida-arter som C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis och C. auris, vilket kan förtjäna utvidgningen av detta protokoll till släktet Candida 16,41,44,45,46,47 .

Optimering, standardisering och regelbunden förbättring av kvantifieringsanalyser av biofilm kan förbättra noggrannheten, genomströmningen och reproducerbarheten. XTT-reduktionsanalysen som detta protokoll bygger på har använts i stor utsträckning för bedömning av metabolisk aktivitet och livskraft hos biofilmer. Eftersom Candida biofilm ofta är resistent mot svampdödande läkemedel är utforskning av nya läkemedel och nya kombinationer en brådskande nödvändighet33. För att bekämpa problemet med biofilmassocierade infektioner måste fler antibiofilmföreningar undersökas med hjälp av biofilmscreeningsanalyser48. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer. Framtida forskning baserad på standardisering och förbättring av XTT-reduktionsanalys som involverar antikroppsbaserade immunterapier kan hjälpa till att utveckla förbättrade terapier för effektiv sjukdomshantering och kontroll.

Biofilmhämning av Sap2-specifika antikroppar har rapporterats som en antikroppsmedierad skyddsmekanism i Sap2-vaccinmedierat skydd under murin systemisk candidiasis orsakad av C. tropicalis19. En tidigare studie visade också att CAGTA potentiellt igenkännande Sap-antigener minskar tillväxten och biofilmbildningen av C. albicans in vitro16. I en annan studie uppvisade Sap2-raderade mutanter en biofilmtillväxtdefekt i närvaro av pepstatin A49. Dessutom, under biofilmbildning, spelade Sap2-antigenet en roll i proteolytisk bearbetning av mucin Msb2 medierad genom Cek1 mitogenaktiverad proteinkinas signalväg50. Därför kan det spekuleras i att Msb2-bearbetning hämmas av antikroppsmedierad Sap2-neutralisering, vilket påverkar biofilmintegriteten. Sammanfattningsvis ger denna artikel ett detaljerat protokoll för att bedöma serumantikropparnas roll i C. tropicalis biofilmmognad och utveckling, som kan tillämpas för bestämning av biofilmmetabolisk aktivitet i olika inställningar, med användning av olika svampstammar eller antikroppskällor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Ramalingaswami-bidraget DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) och Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Indiens regering) till SR Författarna erkänner ett ICMR-JRF-bidrag till P.C och DBT-JRF-bidrag till P.S. Författarna tackar Dr. Ravikant Ranjan för förslag på manuskriptet och teknisk hjälp av Pradeep Singh Thakur under SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 187
En löslig tetrazoliumbaserad reduktionsanalys för att utvärdera effekten av antikroppar på <em>Candida tropicalis-biofilmer</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter