Häri beskrivs ett 96-brunns mikrotiterplattbaserat protokoll som använder en 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduktionsanalys för att studera antikroppars effekter på biofilmer bildade av C. tropicalis. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer.
Candida-arter är den fjärde vanligaste orsaken till systemiska nosokomiala infektioner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverar ofta biofilmbildning på implanterade enheter eller katetrar, vilket är förknippat med ökad virulens och dödlighet. Biofilmer som produceras av olika Candida-arter uppvisar ökat motstånd mot olika svampdödande läkemedel. Därför finns det ett behov av att utveckla effektiva immunterapier eller tilläggsbehandlingar mot Candida-biofilmer . Medan rollen som cellulär immunitet är väl etablerad i anti-Candida-skydd , har rollen som humoral immunitet studerats mindre.
Det har antagits att hämning av biofilmbildning och mognad är en av de viktigaste funktionerna för skyddande antikroppar, och Candida albicans bakterierörsantikroppar (CAGTA) har visat sig undertrycka in vitro-tillväxt och biofilmbildning av C. albicans tidigare. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för utvärdering av antikroppars roll på biofilmer bildade av C. tropicalis. Metoden för detta protokoll involverar C. tropicalis biofilmbildning i 96-brunns mikrotiterplattor, som sedan inkuberades i närvaro eller frånvaro av antigenspecifika antikroppar, följt av en 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) analys för mätning av den metaboliska aktiviteten hos svampceller i biofilmen.
Specificiteten bekräftades genom att använda lämpliga serumkontroller, inklusive Sap2-specifikt antikroppsutarmat serum. Resultaten visar att antikroppar som finns i serum hos immuniserade djur kan hämma Candida biofilmmognad in vitro. Sammanfattningsvis ger detta dokument viktiga insikter om antikroppars potential att utveckla nya immunterapier och synergistiska eller kompletterande behandlingar mot biofilmer under invasiv candidiasis. Detta in vitro-protokoll kan användas för att kontrollera effekten av potentiella nya svampdödande föreningar på den metaboliska aktiviteten hos Candida-artceller i biofilmer.
Systemisk candidiasis är den fjärde huvudorsaken till nosokomiala infektioner, som är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. Globalt påverkar systemisk candidiasis cirka 700 000 individer1. Candida-arter, nämligen C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata och C. auris, är den vanligaste orsaken till invasiva Candida-infektioner 2. Candida-arter är opportunistiska patogener som producerar biofilmer3. Biofilmer är främst associerade med Candida virulens, och Candida kan motstå oxidativa och osmotiska stressförhållanden genom att inducera biofilmbildning4. Biofilmer modulerar ytterligare uttrycket av virulensfaktorer och cellväggskomponenter och bildar en exopolymer skyddsmatris, vilket hjälper Candida att anpassa sig till olika värdnischer4. Biofilmer bidrar till jästföljsamhet på värdvävnader och medicinska instrument5. Som sådan är biofilmbildning associerad med en fördel för jäst, eftersom jästceller i biofilmerna kan undvika värdens immunsvar6. Biofilmbildning skyddar också de patogena jästarna från verkan av svampdödande läkemedel5. Minskad känslighet för C. albicans biofilmer för amfotericin B har visats av Pierce et al.7,8. Dessutom visar biofilmer svampdödande läkemedelsresistens mot flukonazol, vilket försämrar effektiv hantering av systemisk candidiasis 9,10.
Mikrober har en inneboende tendens att fästa vid olika biotiska och abiotiska ytor, vilket resulterar i biofilmbildning. Candida albicans, som är en dimorf svamp, finns i jäst- och hyphalformer, och dess biofilmbildning har karakteriserats i olika in vitro– och in vivo-modellsystem 11. Stegen i biofilmbildning inkluderar vidhäftning av Candida-celler till substratet, filamentation, proliferation och biofilmmognad11. Ursprungligen fäster jästformen av C. albicans på substrat, inklusive medicintekniska produkter och mänsklig vävnad, följt av filamentation och proliferation av C. albicans i hyphal och pseudohyphal former, och slutligen mognad av biofilmer inbäddade i extracellulär matris11. Biofilmbildning bidrar till stor del till C. albicans patogenesmekanismer12. Candida-arter bildar läkemedelsresistenta biofilmer, vilket gör deras utrotning utmanande13. En liten delmängd av den C. albicans biofilmproducerande populationen har beskrivits som mycket resistent mot de svampdödande läkemedlen amfotericin B och klorhexidin14. Observera att jästceller i biofilmer uppvisar hög resistens mot multidrogterapi jämfört med jästceller i planktonfasen och proliferationsfas14. Det har föreslagits att jästceller som finns i biofilmer är mycket toleranta mot svampdödande läkemedel, vilket bidrar till C. albicans överlevnad i biofilmer14. Dessa befintliga celler rapporterades vara fenotypiska varianter av C. albicans och inte mutanter14. Dessutom är celler av Candida-biofilmer som kallas “persisterceller” toleranta mot höga doser av amfotericin-B-behandling och bidrar till Candida-överlevnad, vilket utgör en stor börda av återkommande systemiska Candida-infektioner hos högriskindivider 15.
Ökningen av svampdödande läkemedelsresistens i Candida-stammar kräver forskning för nya svampdödande medel och immunterapier. Som framgår av ovannämnda studier visar Candida biofilmer minskad mottaglighet för svampdödande läkemedel. Därför finns det ett behov av förbättrade immunterapier för att kontrollera Candida biofilmbildning. Tidigare studier har visat att CAGTA kan ge ett effektivt skydd mot systemiska Candidainfektioner genom att hämma C. albicans biofilmbildning in vitro16. En annan studie rapporterade att immunisering av möss med C. albicans rAls3-N-protein inducerar höga antikroppstitrar som stör C. albicans biofilmbildning in vitro17. Anti-Als3-N-antikroppar utövade också en hämmande effekt på C. albicans spridning från biofilmer17. NDV-3A-vaccin baserat på C. albicans är för närvarande under klinisk prövning och anti-NDV-3A-serum visade sig också minska C. auris biofilmbildning18. En nyligen genomförd studie identifierade hämning av biofilmbildning av Sap2-antikroppar som en skyddsmekanism i en murin modell av systemisk candidiasis19.
Detta dokument beskriver ett detaljerat in vitro-protokoll för utvärdering av effekten av antigenspecifika antikroppar närvarande i polyklonalt serum erhållet från olika grupper av Sap2-vaccinerade möss på förformade Candida tropicalis-biofilmer . För att uppnå detta optimerades och utvecklades en metod baserad på en XTT-reduktionsanalys i laboratoriet, som kan mäta biofilmens livskraft på ett snabbt, känsligt och högt genomströmningssätt, i närvaro eller frånvaro av antikroppar.
XTT-analysen används för att mäta cellulär metabolisk aktivitet som en indikator på cellviabilitet, cellulär proliferation och cytotoxicitet20. Denna kolorimetriska analys är baserad på reduktionen av ett gult tetrazoliumsalt, natrium 3′-[1-(fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoxi-6-nitro) bensensulfonsyrahydrat (XTT) till ett orange formazanfärgämne av metaboliskt aktiva celler. Eftersom endast livskraftiga celler kan minska XTT är mängden reducerad XTT-formazan proportionell mot intensiteten av färg och cellviabilitet. Det formazanfärgade färgämnet som bildas är vattenlösligt och kvantifieras direkt med hjälp av en plattläsare. På grund av sin vattenlösliga natur tillåter XTT-analysen studier av intakta biofilmer, liksom undersökning av biofilmläkemedelskänslighet, utan störning av biofilmstruktur21. Dessutom implementeras denna metod i Candida svamp livskraft bedömningar på grund av dess användarvänlighet, hastighet, noggrannhet, hög genomströmning, och hög grad av reproducerbarhet 7,22.
Förutom XTT-reduktionsanalysen har många alternativa tekniker också identifierats för mätning av biofilmkvantitet. Några av dessa inkluderar användningen av MTT-reduktionsanalysen, kristallviolett färgning, DNA-kvantifiering, kvantitativ PCR, proteinkvantifiering, torrcellsviktmätning och livskraftig koloniräkning. Dessa förfaranden varierar mycket när det gäller deras tids- och kostnadskrav. utförde en jämförande analys av sju olika Candida-biofilmkvantifieringsanalyser och fann att XTT-analysen gav den mest reproducerbara, exakta och effektiva metoden för kvantitativ uppskattning av C. albicans biofilmer23. Färgningstekniker som kristallviolett har vissa begränsningar; Det kristallvioletta testet bestämmer indirekt mängden biofilm genom att mäta den optiska densiteten hos den kristallviolettfärgade biofilmmatrisen och cellerna. Även om den kristallvioletta analysen ger ett bra mått på biofilmmassa, ger den inte ett mått på biofilmens livskraft eftersom den fläckar både mikrobiella celler och den extracellulära matrisen24. rapporterade vidare att XTT-reduktionsanalysen var den mest känsliga, reproducerbara, exakta, effektiva och specifika metoden för att detektera biofilmproduktion jämfört med kristallviolett analys25. Litteraturrapporter har visat att XTT-analysen korrelerar väl med CFU/ml-parametern i CFU-räkningsmetoden. Men jämfört med XTT-analysen är CFU-metoden arbetsintensiv och långsam26. Dessutom kan det hända att andelen fristående levande celler inte är representativ för den ursprungliga biofilmpopulationen27. Även om XTT-reduktionsanalysen verkar vara det bästa tillgängliga alternativet för att kvantifiera lönsamheten, finns det några begränsningar med denna teknik. Medan XTT-metoden är användbar för jämförelser som involverar en svampstam, kan dess användning vara begränsad när man jämför olika svampstammar och arter. Interstrain jämförelser kan vara svåra i avsaknad av detaljerad standardisering eftersom olika stammar metaboliserar substrat med olika kapacitet21.
Svampinfektioner orsakade av Candida-arter är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. Det växande hotet om invasiv svampinfektion kräver tidig hantering av sådana livshotande sjukdomar. De flesta Candida-infektioner involverar bildandet av biofilmer, som följer en mängd olika medicintekniska produkter och är ansvariga för uthållighet och återkommande svampinfektioner i sjukhusinställningar31. Biofilmer består av jäst- eller hyphalceller, …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Ramalingaswami-bidraget DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) och Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Indiens regering) till SR Författarna erkänner ett ICMR-JRF-bidrag till P.C och DBT-JRF-bidrag till P.S. Författarna tackar Dr. Ravikant Ranjan för förslag på manuskriptet och teknisk hjälp av Pradeep Singh Thakur under SEM.
15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
1x PBS | – | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
Incubator | Generic | ||
Menadione | Sigma | M5625 | |
Microtiter Plate Reader | Generic | ||
Multichannel pipette and tips | Generic | ||
Petri dishes | Tarson | 460090 | |
Ringers Lactate | – | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
XTT | Invitrogen | X6493 |