Summary
Et 96-brønds mikrotiterpladebaseret protokol ved anvendelse af en 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduktionsassay er beskrevet heri for at studere antistoffers virkninger på biofilm dannet af C. tropicalis. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm.
Abstract
Candida arter er den fjerde mest almindelige årsag til systemiske nosokomielle infektioner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverer ofte biofilmdannelse på implanterede enheder eller katetre, hvilket er forbundet med øget virulens og dødelighed. Biofilm produceret af forskellige Candida-arter udviser øget resistens over for forskellige svampedræbende stoffer. Derfor er der behov for at udvikle effektive immunterapier eller supplerende behandlinger mod Candida biofilm. Mens rollen som cellulær immunitet er veletableret i anti-Candida-beskyttelse , er rollen som humoral immunitet blevet undersøgt mindre.
Det er blevet antaget, at hæmning af biofilmdannelse og modning er en af de vigtigste funktioner i beskyttende antistoffer, og Candida albicans kimrørantistoffer (CAGTA) har vist sig at undertrykke in vitro-vækst og biofilmdannelse af C. albicans tidligere. Dette papir skitserer en detaljeret protokol til evaluering af antistoffernes rolle på biofilm dannet af C. tropicalis. Metoden til denne protokol involverer C. tropicalis biofilmdannelse i 96-brønds mikrotiterplader, som derefter blev inkuberet i nærvær eller fravær af antigenspecifikke antistoffer efterfulgt af et 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) assay til måling af svampecellernes metaboliske aktivitet i biofilmen.
Specificiteten blev bekræftet ved anvendelse af passende serumkontroller, herunder Sap2-specifikt antistofudtømt serum. Resultaterne viser, at antistoffer til stede i serum af immuniserede dyr kan hæmme Candida biofilm modning in vitro. Sammenfattende giver dette papir vigtig indsigt i antistoffernes potentiale i udviklingen af nye immunterapier og synergistiske eller supplerende behandlinger mod biofilm under invasiv candidiasis. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm.
Introduction
Systemisk candidiasis er den fjerde hovedårsag til nosokomielle infektioner, som er forbundet med høj sygelighed og dødelighed på verdensplan. Globalt påvirker systemisk candidiasis ca. 700.000 individer1. Candida-arter, nemlig C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata og C. auris, er den mest almindelige årsag til invasive Candida-infektioner 2. Candida-arter er opportunistiske patogener, der producerer biofilm3. Biofilm er overvejende forbundet med Candida virulens, og Candida kan modstå oxidative og osmotiske stresstilstande ved at inducere biofilmdannelse4. Biofilm modulerer yderligere ekspressionen af virulensfaktorer og cellevægskomponenter og danner en exopolymer beskyttelsesmatrix, der hjælper Candida med at tilpasse sig forskellige værtsnicher4. Biofilm bidrager til gærbinding på værtsvæv og medicinske instrumenter5. Som sådan er biofilmdannelse forbundet med en fordel for gær, da gærceller i biofilmene kan undgå værtsimmunresponset6. Biofilmdannelse beskytter også de patogene gær mod virkningen af svampedræbende stoffer5. Nedsat modtagelighed af C. albicans biofilm til amphotericin B er blevet påvist af Pierce et al.7,8. Desuden viser biofilm svampedræbende lægemiddelresistens over for fluconazol, hvilket forringer effektiv behandling af systemisk candidiasis 9,10.
Mikrober har en iboende tendens til at klæbe til forskellige biotiske og abiotiske overflader, hvilket resulterer i biofilmdannelse. Candida albicans, som er en dimorf svamp, findes i gær- og hyphalformer, og dens biofilmdannelse er blevet karakteriseret i forskellige in vitro- og in vivo-modelsystemer 11. Trinene til biofilmdannelse inkluderer vedhæftning af Candida-celler til substratet, filamentering, proliferation og biofilmmodning11. Indledningsvis klæber gærformen af C. albicans til substrater, herunder medicinsk udstyr og humant væv, efterfulgt af filamentering og spredning af C. albicans i hyphal- og pseudohyphalformer og endelig modning af biofilm indlejret i ekstracellulær matrix11. Biofilmdannelse bidrager i vid udstrækning til C. albicans patogenesemekanismer12. Candida-arter danner lægemiddelresistente biofilm, hvilket gør deres udryddelse udfordrende13. En lille delmængde af den biofilmproducerende population C. albicans er blevet beskrevet som værende meget resistent over for de svampedræbende stoffer amphotericin B og chlorhexidin14. Det skal bemærkes, at gærceller i biofilm udviser høj modstandsdygtighed over for multidrugbehandling sammenlignet med gærceller i planktonfasen og spredningsfase14. Det er blevet foreslået, at gærceller, der findes i biofilm, er meget tolerante over for svampedræbende stoffer, hvilket bidrager til C. albicans overlevelse i biofilm14. Disse eksisterende celler blev rapporteret at være fænotypiske varianter af C. albicans og ikke mutanter14. Desuden er celler i Candida biofilm kendt som "persisterceller" tolerante over for høje doser af amphotericin-B-behandling og bidrager til Candida-overlevelse og udgør derved en stor byrde af tilbagevendende systemiske Candida-infektioner hos højrisikopersoner15.
Stigningen i svampedræbende lægemiddelresistens i Candida-stammer nødvendiggør forskning i nye svampedræbende midler og immunterapier. Som det fremgår af ovennævnte undersøgelser, viser Candida biofilm nedsat modtagelighed for svampedræbende stoffer. Derfor er der behov for forbedrede immunterapier til at kontrollere Candida biofilm dannelse. Tidligere undersøgelser har vist, at CAGTA kan yde effektiv beskyttelse mod systemiske Candida-infektioner ved at hæmme dannelsen af C. albicans biofilm in vitro16. En anden undersøgelse rapporterede, at immunisering af mus med C. albicans rAls3-N protein inducerer høje antistoftitre, der forstyrrer C. albicans biofilmdannelse in vitro17. Anti-Als3-N antistoffer udøvede også en hæmmende virkning på C. albicans spredning fra biofilm17. NDV-3A-vaccine baseret på C. albicans er i øjeblikket under klinisk forsøg, og anti-NDV-3A-sera viste sig også at reducere C. auris biofilmdannelse18. En nylig undersøgelse identificerede hæmning af biofilmdannelse af Sap2-antistoffer som en beskyttelsesmekanisme i en murinmodel af systemisk candidiasis19.
Dette papir skitserer en detaljeret in vitro-protokol til evaluering af effekten af antigenspecifikke antistoffer til stede i polyklonalt serum opnået fra forskellige grupper af Sap2-vaccinerede mus på præformerede Candida tropicalis-biofilm . For at opnå dette blev en metode baseret på et XTT-reduktionsassay optimeret og udviklet i laboratoriet, som kan måle biofilmlevedygtighed på en hurtig, følsom og høj kapacitet måde i nærvær eller fravær af antistoffer.
XTT-analysen bruges til at måle cellulær metabolisk aktivitet som en indikator for cellelevedygtighed, cellulær proliferation og cytotoksicitet20. Dette kolorimetriske assay er baseret på reduktionen af et gult tetrazoliumsalt, natrium 3'-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzensulfonssyrehydrat (XTT) til et orange formazanfarvestof af metabolisk aktive celler. Da kun levedygtige celler kan reducere XTT, er mængden af reduceret XTT-formazan proportional med intensiteten af farve og cellelevedygtighed. Det dannede formazanfarvestof er vandopløseligt og kvantificeres direkte ved hjælp af en pladelæser. På grund af sin vandopløselige natur tillader XTT-analysen undersøgelsen af intakte biofilm samt undersøgelse af biofilmlægemiddelfølsomhed uden forstyrrelse af biofilmstruktur21. Derudover er denne metode implementeret i Candida svampelevedygtighedsvurderinger på grund af dens brugervenlighed, hastighed, nøjagtighed, høje gennemstrømning og høje grad af reproducerbarhed 7,22.
Ud over XTT-reduktionsanalysen er der også identificeret adskillige alternative teknikker til måling af biofilmmængde. Nogle af disse inkluderer brugen af MTT-reduktionsassay, krystalviolet farvning, DNA-kvantificering, kvantitativ PCR, proteinkvantificering, måling af tørcellevægt og levedygtig kolonitælling. Disse procedurer varierer meget med hensyn til deres tids- og omkostningskrav. Taff et al. udførte en sammenlignende analyse af syv forskellige Candida biofilmkvantitetsanalyser og fandt ud af, at XTT-analysen gav den mest reproducerbare, nøjagtige og effektive metode til kvantitativ estimering af C. albicans biofilm23. Farvningsteknikker såsom krystalviolet har visse begrænsninger; Den krystalviolette test bestemmer indirekte mængden af biofilm ved at måle den optiske tæthed af den krystalvioletfarvede biofilmmatrix og celler. Selvom det krystalviolette assay giver et godt mål for biofilmmasse, giver det ikke et mål for biofilmlevedygtighed, da det pletter både mikrobielle celler og den ekstracellulære matrix24. Dhale et al. rapporterede yderligere, at XTT-reduktionsanalysen var den mest følsomme, reproducerbare, nøjagtige, effektive og specifikke metode til at detektere biofilmproduktion sammenlignet med krystalviolet assay25. Litteraturrapporter har vist, at XTT-analysen korrelerer godt med CFU/ml-parameteren i CFU-tællemetoden. Sammenlignet med XTT-analysen er CFU-metoden imidlertid arbejdskrævende og langsom26. Desuden er fraktionen af fritliggende levende celler muligvis ikke repræsentativ for den oprindelige biofilmpopulation27. Selvom XTT-reduktionsanalysen synes at være den bedste tilgængelige mulighed for at kvantificere levedygtigheden, er der et par begrænsninger ved denne teknik. Mens XTT-metoden er nyttig til sammenligninger, der involverer en svampestamme, kan dens anvendelse være begrænset, når man sammenligner forskellige svampestammer og arter. Interstrain sammenligninger kan være vanskelige i mangel af detaljeret standardisering, da forskellige stammer metaboliserer substrater med forskellige muligheder21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BALB/c mus blev opstaldet i Small Animal Facility på IIT Roorkee. Alle dyr blev holdt i en 12 timer: 12 h lys: mørk cyklus ved 25 ° C og blev forsynet med en pellet kost og vand ad libitum. Alle dyreforsøg blev godkendt af IIT Roorkees institutionelle dyreetiske komité (IAEC).
1. Fremstilling af C. tropicalis
BEMÆRK: Svampen Candida tropicalis tilhører risikogruppe 2 patogener og er klassificeret som en BSL2 mikroorganisme. Brug altid certificerede klasse II biologiske sikkerhedsskabe, når du arbejder med Candida-arter . Øv aseptiske og sterile teknikker under arbejdet med C. tropicalis og følg de anbefalede biosikkerhedsprocedurer for korrekt bortskaffelse af dette patogen.
- Streak C. tropicalis (stamme ATCC 750) på en Sabouraud dextrose (SAB) agarplade.
- Forbered en natten over dyrket kultur af C. tropicalis ved at inokulere en enkelt koloni fra SAB agarpladen i et sterilt 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml SAB bouillonmedium. Alternativt kan du bruge en frossen glycerolbestand af C. tropicalis og pode 100 μL af glycerolstammen i en steril 250 ml konisk kolbe indeholdende 50 ml SAB bouillonmedium.
- Inkubere C. tropicalis kultur i en orbital shaker ved 180 o / min ved 30 ° C i 24-48 timer.
- Svampekulturen centrifugeres (celler i logaritmisk fase) ved 2.150 × g i 15 minutter ved 21 °C.
- Kassér supernatanten og tilsæt 50 ml steril 1x PBS til pelleten. Pelleten vaskes og resuspenderes i steril 1x PBS med skånsom hvirvelstrøm.
- Centrifuge igen ved 2.150 × g i 15 minutter ved 21 °C. Supernatanten kasseres, og svampepelleten genindtages i 10 ml steril 1x PBS.
- Koncentrationen af celler beregnes ved at tælle med et hæmocytometer.
- Svampebestande forberedes ved en slutdensitet på 1,0 × 106 celler/ml i RPMI 1640 morpholinpropanesulfonsyre (MOPS) medium. Brug cellesuspensionen fra trin 1.6 med det samme.
BEMÆRK: For at opsætte en 96-brøndplade er det samlede svampevolumen, der er nødvendigt, 10 ml (100 μL / brønd). Skaler efter behov.
2. C. dannelse af tropicalis biofilm
- Der fremstilles Candida-biofilm i en 96-brønds fladbundet polystyrenmikrotiterplade som beskrevet tidligere (figur 1)28,29.
- Der tilsættes 100 μL C. tropicalis-kultur (fra 106 celler/ml lager, fremstillet som ovenfor) til en mikrotiterplade med 96 brønde ved hjælp af en flerkanalspipette (figur 2A). Hold de sidste to kolonner (11 og 12) som 'ingen svamp plus serum' og 'ingen svamp og intet serum' negative kontroller ved ikke at tilføje svampeceller. Udfyld kolonne 11 og 12 med 100 μL RPMI 1640 MOPS medium alene.
- Dæk mikrotiterpladen med låg og aluminiumsfolie. Pladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C under stationære forhold.
- Den næste dag skal du aspirere mediet omhyggeligt ved hjælp af en flerkanalspipette (uden at røre ved eller forstyrre biofilmene). Bank forsigtigt på pladen i omvendt position på blottingark for at fjerne eventuelt resterende medium.
- Pladen vaskes med 200 μL 1x PBS (pr. brønd) ved hjælp af en flerkanalspipette. Tilsæt PBS meget forsigtigt langs brøndens sidevægge for at undgå at forstyrre biofilm. Aspirer PBS omhyggeligt ved hjælp af en flerkanals pipette. Gentag PBS-vasken 2x (i alt tre vaske).
- For at fjerne overskydende PBS skal du lufttørre pladen (uden låg) i 30 minutter ved stuetemperatur inde i et biologisk sikkerhedsskab.
3. Behandling af biofilm med antistoffer
BEMÆRK: Biofilm kan nu behandles til vurdering af hæmning af biofilmmodning med antistoffer. Murine serum blev brugt som kilde til polyklonale antistoffer. Forskellige grupper af Sap2-immuniserede (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis og Sap2-parapsilose) sammen med sham-immuniserede mus blev blødt retro-orbitalt, og serum blev isoleret som beskrevet tidligere19. Tilstedeværelsen af anti-Sap2-antistoffer blev bekræftet ved anvendelse af Sap2-specifik ELISA som beskrevet tidligere19.
- Der udfør varmeinaktivering af serumet (kilde til polyklonale antistoffer) ved 56 °C i 30 minutter før brug for at udelukke komplementets rolle i den hæmmende aktivitet. Varmeinaktiver serumet, før du foretager serumfortynding.
BEMÆRK: Brug serum fra sham-immuniserede mus, præimmune mus og Sap2-specifikt antistofudtømt serum som yderligere kontroller19. Antistofudtømt serum blev fremstillet i henhold til en tidligere undersøgelse19. Blandt de serielle fortyndinger (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 og 1:12,800) for serum testet i denne protokol blev hæmning af biofilmmodning observeret ved 1:25, 1:50 og 1:100; Derfor blev 1:50 valgt for at finde en balance mellem hæmning og serumforbrug. - Forbered serielle fortyndinger af varmeinaktiverede serumprøver i sterilt RPMI 1640 MOPS-medium (1:50). Brug en almindelig serumfortynding (1:50) til alle serumprøver, der skal testes for hæmning af biofilmmodning30.
- Der tilsættes 100 μL af den valgte serumfortynding til hver brønd i mikrotiterpladen med 96 brønde. For hver prøve tilsættes serumfortyndinger i to eksemplarer i henhold til det vedhæftede layout (figur 2B).
- I kolonne 10 tilsættes ikke serumfortynding; tilføj kun RPMI 1640 MOPS-medium til svampens positive kontrol.
BEMÆRK: Kolonne 10, række G1-G8 og H1-H8 havde oprindeligt svampeceller i RPMI-MOPS. Mens RPMI-MOPS blev føjet til kolonne 10 selv efter 24 timer, fungerede række G1-G8 som PBS-kontrol og række H1-H8 som nul-serumkontrol efter 24 timer. - I kolonne 11 tilsættes en 1:50 fortynding af serum til alle brønde for at tjene som ingen svamp plus serum negativ kontrol.
- I kolonne 12 må der ikke tilsættes serumfortynding til nogen brønd; hold dette som ingen svamp ingen serum negativ kontrol.
- I kolonne 10 tilsættes ikke serumfortynding; tilføj kun RPMI 1640 MOPS-medium til svampens positive kontrol.
- Dæk pladen med låg og aluminiumsfolie. Pladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
4. Estimering af metabolisk aktivitet i biofilm
- Den næste dag skal du aspirere serumet omhyggeligt ved hjælp af en flerkanalspipette (uden at røre ved eller forstyrre biofilmene). Bank forsigtigt på pladen i omvendt position på blottingplader for at fjerne eventuelt resterende serum.
- Pladen vaskes med 200 μL 1x PBS (pr. brønd) ved hjælp af en flerkanalspipette, og PBS tilsættes langs brøndens sidevægge for at undgå at forstyrre biofilmene. Pbs aspireres omhyggeligt ved hjælp af en flerkanalspipette, og PBS-vasken gentages 2x (i alt tre vaske). Lufttør pladen (uden låg) i 30 minutter ved stuetemperatur inde i et biologisk sikkerhedsskab for at tørre overskydende PBS.
- Forberedelse af XTT/menadione:
- Der fremstilles XTT i sterilt Ringers Lactate som en 0,5 g / L opløsning. Opløs 25 mg XTT i 50 ml filtersteriliseret Ringers Lactate. Aliquot 10 ml i separate rør dækket med aluminiumsfolie og opbevares ved -80 °C.
- Forbered menadione som en 10 mM bestand. 8,6 mg menadion opløses i 5 ml acetone og fordeles 50 μL i 100 separate mikrorør. Aliquoterne opbevares ved -80 °C.
- Tilbered XTT/menadionopløsning lige før brug ved at tage 10 ml XTT og tilsætte 1 μL menadion for at opnå en 1 μM arbejdsløsning.
- Der tilsættes 100 μL XTT/menadonopløsning pr. brønd af mikrotiterpladen med 96 brønde. Dæk pladen med låg og aluminiumsfolie. Pladen inkuberes i 2 timer ved 37 °C i mørke.
- Overfør 80 μL af den farvede supernatant fra hver brønd til en frisk 96-brøndplade. Læs pladen ved 490 nm.
- Gennemsnittet af absorbansværdierne i boringerne i kolonne 10 (positiv kontrol, der kun indeholder svampe), beregnes, og som tjener som referenceværdi til beregning af den procentvise biofilmhæmning ved hver serumprøve ved hjælp af ligning (1).
% Biofilmhæmning = 100 -
× 100 (1)
× 100 (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Candida tropicalis biofilm blev dyrket i 96-brønds mikrotiterplader og afbildet ved 40x ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 1A). Biofilmen blev yderligere farvet ved hjælp af krystalviolet og observeret ved 40x ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 1B). Scanning elektronmikroskopi viser et repræsentativt billede af C. tropicalis biofilm (figur 1C). Til udførelse af biofilmhæmningsanalysen blev 105 celler af Candida tilsat til brøndene i mikrotiterpladen med 96 brønde på tidspunktet 0 i henhold til layoutet (figur 2A). Efter 24 timer blev pladen vasket, og serumprøver blev tilsat til de præformede biofilm. En almindelig serumfortynding på 1:50 blev valgt til at sammenligne forskellige serumprøver opnået fra forskellige grupper af Sap2-immuniserede og sham-immuniserede mus i henhold til en pilotundersøgelse og en tidligere offentliggjort rapport30.
Forskellige serumprøver blev tilføjet til mikrotiterpladen med 96 brønde i henhold til layout (figur 2B) og vurderet i to eksemplarer. Sera opnået på dag 30 efter immunisering fra tre mus pr. gruppe (Sap2-albicans immuniseret, Sap2-tropicalis immuniseret, Sap2-parapsilose immuniseret, sham-immuniseret gruppe, præimmune mus og Sap2-udtømt kontrolprøve) blev analyseret ved en 1:50 fortynding. Pladen blev aflæst ved bølgelængde på 490 nm ved hjælp af en ELISA-læser til opnåelse af XTT-kolorimetriske aflæsninger (OD490-værdier ) for C. tropicalis biofilm dannet i nærvær eller fravær af serum (tabel 1). Negativ blank blev beregnet ved hjælp af gennemsnittet af kolonne 11 og 12 (0,04). Positiv kontrol blev beregnet ved at beregne et gennemsnit af svampebrønde (kolonne 10; 0,8165). Før beregningerne blev den gennemsnitlige absorbansværdi for kontrolhullerne i kolonne 11 og 12 (0,04) trukket fra absorbansmålingerne i forsøgsbrøndene. Referenceværdien for den biofilmpositive kontrol (kolonne 10) blev således sat til 0,7765 (= 0,8165 - 0,04).
Værdierne (gennemsnit minus blindprøve) opnået for forsøgsbrøndene blev derefter divideret med denne positive kontrol (0,7765), og procentdelen blev opnået ved at gange med 100. Procentvis biofilmhæmning blev beregnet ved yderligere at trække værdien opnået fra 100. Et søjlediagram viser alle de afbildede værdier (figur 3). Almindelig envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts post hoc-test til flere sammenligninger blev brugt til at beregne p-værdier til vurdering af statistiske forskelle mellem forskellige serumgrupper. En p-værdi på <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Serum fra Sap2-parapsilosis immuniserede mus kunne forhindre modning af præformerede C. tropicalis biofilm med 65% sammenlignet med serum fra Sap2-albicans (45%) og Sap2-tropicalis (55%) immuniserede mus. Generelt var biofilmhæmning af Sap2-immunserum signifikant højere end ved henholdsvis sham-immunserum (16%) og præimmun serum (13%). Ved udtømning af Sap2-specifikke antistoffer fra serum som beskrevet andetsteds 19 blev biofilmhæmningsevnen reduceret til10%. Biofilmhæmning var tæt på ubetydelig ved brug af PBS (5%) og nul-serumkontrol (5%).
Figur 1: Imaging Candida tropicalis biofilm. (A) Visualisering af Candida tropicalis biofilm dannet på bunden af en 96-brønds mikrotiterplade efter fjernelse af RPMI-medium ved hjælp af et omvendt mikroskop. Billedet blev taget ved hjælp af brightfield mikroskopi (ingen plet blev brugt). (B) Visualisering af C. tropicalis biofilm dannet på bunden af en 96-brønds mikrotiterplade efter krystalviolet farvning. (C) Visualisering af C. tropicalis biofilm dannet på glasdias ved hjælp af scanningselektronmikroskopi. Skalabjælker = 100 μm (A, B), 10 μm (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Layout af 96-brønds pladeformatet. Tilsætning af (A) svampeceller til brøndene og (B) serumfortyndinger fra forskellige musegrupper (Sap2-albicans immuniseret, Sap2-tropicalis immuniseret, Sap2-parapsilose immuniseret og sham-immuniseret; n = 3) vurderet i to eksemplarer ved en 1:50 fortynding. Yderligere kontroller omfattede Sap2-udtømt serum, præimmun serum, PBS og nul-serumkontrol. Kolonne 10 havde ingen serum tilsat (svampeceller til stede, positiv kontrol). Kolonne 11 havde ingen svampeceller tilsat (serum til stede). Kolonne 12 havde ingen svampeceller tilsat (serum fraværende). Forkortelser: PBS = fosfatbufferet saltvand; Sap2 = udskilt aspartyl proteinase 2. Udtrykkene m1, m2 og m3 henviser til forskellige mus i hver gruppe (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Graf, der viser effektiviteten af Sap2-specifikke polyklonale antistoffer mod præformerede C. tropicalis biofilm. Kilden til immunserum vises på x-aksen, mens procentdelen af hæmning af C. tropicalis biofilmmodning vises på y-aksen. Søjler repræsenterer middelværdi ± SEM (n = 3). Almindelig envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts post hoc-test til flere sammenligninger blev brugt til at beregne p-værdier . Barer og symboler repræsenterer forskellene mellem Sap2-immuniserede musegrupper med sham-immuniserede mus. , s . < 0,0001. Forkortelser: PBS = fosfatbufferet saltvand; Sap2 = udskilt aspartyl proteinase 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
| <> | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| En | 0.475 | 0.4141 | 0.0441 | 0.4637 | 0.485 | 0.0484 | 0.5179 | 0.4068 | 0.0442 | 0.8826 | 0.0452 | 0.0404 |
| B | 0.3848 | 0.3773 | 0.0428 | 0.369 | 0.3781 | 0.0465 | 0.4105 | 0.3773 | 0.0447 | 0.8428 | 0.0426 | 0.041 |
| C | 0.2754 | 0.2728 | 0.0427 | 0.305 | 0.3083 | 0.0415 | 0.3531 | 0.3213 | 0.0432 | 0.9661 | 0.0444 | 0.0453 |
| D | 0.6965 | 0.7185 | 0.043 | 0.6681 | 0.6711 | 0.0403 | 0.6346 | 0.728 | 0.0433 | 0.8643 | 0.0384 | 0.0358 |
| E | 0.7031 | 0.7117 | 0.0481 | 0.7806 | 0.688 | 0.0521 | 0.7095 | 0.6998 | 0.0525 | 0.7883 | 0.0491 | 0.0416 |
| F | 0.7588 | 0.7441 | 0.0456 | 0.7173 | 0.7233 | 0.0437 | 0.7733 | 0.6808 | 0.0462 | 0.7256 | 0.0468 | 0.0354 |
| G | 0.7681 | 0.7708 | 0.0435 | 0.7949 | 0.7496 | 0.0445 | 0.7695 | 0.7898 | 0.0451 | 0.7335 | 0.0429 | 0.0371 |
| H | 0.7652 | 0.7855 | 0.0469 | 0.7818 | 0.7766 | 0.0428 | 0.7592 | 0.7765 | 0.0445 | 0.7295 | 0.044 | 0.0341 |
Tabel 1: Absorbansaflæsninger ved 490 nm for mikrotiterpladen med 96 brønde. En standard pladelæser (Tecan) blev brugt til at opnå absorbansaflæsningerne, og aflæsningerne blev tilpasset det layout, der er beskrevet i figur 2. Efterfølgende beregninger blev udført ved hjælp af disse data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Svampeinfektioner forårsaget af Candida-arter er forbundet med høj sygelighed og dødelighed over hele verden. Den voksende trussel om invasiv svampeinfektion kræver tidlig håndtering af sådanne livstruende sygdomme. De fleste Candida-infektioner involverer dannelse af biofilm, som klæber til en række medicinske anordninger og er ansvarlige for persistens og gentagelse af svampeinfektioner i hospitalsmiljøer31. Biofilm består af gær- eller hyphalceller, og de udviser betydelig resistens over for et flertal af konventionelle svampedræbende stoffer32. Antifungal resistens af Candida biofilm er blevet tilskrevet flere mekanismer, herunder nedsat svampedræbende penetration, tilstedeværelse af ekstracellulær matrix, overekspression af lægemiddeludstrømningspumper, ændret cellemembran sterolsammensætning, langsom vækst og rumlig heterogenitet, aktivering af forskellige signalveje og tilstedeværelsen af lægemiddeltolerante persisterceller33,34. Hæmning af Candida adhæsion og biofilm dannelse er de vigtigste strategier for at forhindre Candida infektion.
Forskellige in vitro-assays, såsom cellelevedygtighedsassays, mikrotiterpladeassays og tørvægtsmålingsassays, er blevet brugt til at studere Candida biofilmdannelse, som er baseret på den specifikke tidsvurdering af biofilm23. Der er udviklet mere avancerede assays såsom mikrofluidiske enhedsbaserede assays, som kan bruges til at vurdere biofilmdannelsei realtid 35. Indtil videre er biofilmdannelse blevet undersøgt ved hjælp af in vitro-assays, men der er behov for at forstå den dynamiske proces med biofilmdannelse under in vivo-forhold samt36,37. I øjeblikket gælder de fleste biofilmhæmningsundersøgelser for C. albicans, og der findes få undersøgelser til udryddelse af ikke-albicans Candida-biofilm. Spektret af Candida-infektioner har ændret sig gradvist i løbet af de sidste par årtier, og nye ikke-albicans Candida-arter udgør en stor byrde af sygelighed og dødelighed over hele verden. Derfor er der et voksende behov for udvikling af nye strategier til kontrol af biofilmdannelse og udvikling af biofilmhæmningsassays med fokus på ikke-albicans Candida-arter. Immunterapi, især antistoffer, har et stort potentiale til at hæmme biofilmdannelse og kan bruges til behandling af systemisk Candida-infektion 38. Flere rapporter har vist antistoffers rolle i biofilmhæmning på tidligere stadier af biofilmdannelse. Det blev rapporteret, at polyklonale antistoffer genereret som reaktion på komplementreceptor 3-relateret protein (CR3-RP, der har en potentiel rolle i svampeadhærens) immunisering hos kaniner reducerede vedhæftning og biofilmdannelse af C. albicans på bukkale epitelceller39. Endvidere blev Candida-stammer, herunder kateterisolater, præinkuberet med polyklonalt anti-CR3-RP-antistof og monoklonalt antistof, OKM1, hvilket reducerede vedhæftning og biofilmdannelse. Cellelevedygtighed af C. albicans blev evalueret ved hjælp af XTT-assayet under overholdelsesfasen og biofilmdannelsesfase40. Få undersøgelser har evalueret antistoffernes rolle mod ikke-albicans Candida arter biofilm dannelse. Chupacova et al. evaluerede effektiviteten af polyklonale anti-CR3-RP-antistoffer mod C. albicans sammen med C. dubliniensis ved hjælp af XTT-analysen. Polyklonale anti-CR3-RP antistoffer hæmmede adhærens og biofilmdannelse af både C. albicans og C. dubliniensis41.
I denne undersøgelse beskrives en enkel, hurtig og brugervenlig protokol til vurdering af antistoffers virkning på biofilmmodning og udvikling. Dette 96-brønds mikrotiterpladebaserede XTT-reduktionsassay måler den metaboliske aktivitet af levedygtige celler i biofilm og er blevet tilpasset fra tidligere undersøgelser 7,8. XTT-analysen, der er beskrevet heri, bruges i vid udstrækning til at estimere levedygtig biofilmvækst. Det er blevet en almindeligt anvendt cellelevedygtighedstest, fordi den er hurtig, praktisk og kan bruges i højgennemstrømningsformat såsom en 96-brøndplade. Desuden kan det bruges til at kvantificere både gær og hyphal former for Candida biofilm. Det kan også bruges til måling af Candida biofilm på en række substrater såsom medicinsk udstyr (f.eks. Katetre) og kontaktlinser.
Nogle af de kritiske trin i denne protokol inkluderer kraftigt hvirveldannelse af cellesuspensionerne, før de pipetteres i alle trin for at undgå svampeaggregering7. Dårlige biofilm vil sandsynligvis udvikle sig, når celletætheden enten er for høj eller for lav. Derfor bør brugerne følge den ideelle svampecelletæthed i den oprindelige inokulum7. Vasketrinnene er meget kritiske, og overdreven cellevask bør undgås for at forhindre afbrydelse af biofilmen22. Biofilmens bundlag bør ikke forstyrres under vaskeprocessen. Analysen skal altid udføres under mørke forhold, og det er nødvendigt at inkludere flere replikater22. En frisk opløsning af XTT skal fremstilles hver gang lige før brug. Da tidsforskellen mellem to reaktioner kan skævvride resultaterne, bør brugerne arbejde hurtigt for at sikre en minimal tidsforskel, når XTT-løsningen tilføjes til den første og sidste brønd på 96-brøndspladen42. Brug af folie eller parafilm anbefales til forebyggelse af fordampning. Flere fejlfindingstrin kan udføres, hvis det kræves. Hvis biofilmvæksten er fraværende eller utilfredsstillende, skal der anvendes passende podningsfortynding og beregninger. For bedre biofilmdannelse kan subkultureringsbetingelser ændres, og biofilmvækst kan prøves ved hjælp af forskellige overfladematerialer. For at forbedre XTT-assayets følsomhed betydeligt kan man reducere den tid, der er nødvendig for biofilm at danne, øge svampedræbende middelkoncentration eller forkorte analysens inkubationsperiode7. For at undgå at forstyrre biofilmen bør overdreven cellevask undgås22. Man kan enten undgå de ydre brønde for at forhindre analysemidlerne i at blive udsat for lys eller tilføje væske til de ydre brønde for at forhindre midlerne i at fordampe fra de indre brønde. Der skal vaskes skånsomt, hvis biofilmen bliver forstyrret under vask22. Mens denne protokol tester effekten af serum på 24 timers præformede biofilm til vurdering af inhiberingen af biofilmmodning, kan brugerne også ændre denne protokol for at tilføje serum på tidspunktet 0 til vurdering af hæmning af biofilmdannelse, ifølge en tidligere rapport30.
Sammenlignet med andre alternative metoder til kvantificering af biofilmvækst er XTT-metoden den mest følsomme, reproducerbare, nøjagtige, omkostningseffektive og specifikke metode. Selvom XTT-analysen er en almindeligt anvendt hurtig og nem teknik til evaluering af biofilm, har den visse begrænsninger. Selv om det er nyttigt til bestemmelse af doseringen eller virkningerne af forskellige midler i en biofilm fra en enkelt art, bør det anvendes med forsigtighed til at sammenligne flere isolater samtidigt på grund af metabolisk variabilitet mellem isolater21. For sammenligninger af biofilm mellem stammer bør der udføres detaljeret teknikstandardisering21. Desuden, mens XTT formazan-produktet let opløses i opløsning, kan nogle stammer bevare en vis mængde i celle21. Da der mangler klarhed, der involverer variabler, såsom valg af medie, tidspunkt for biofilmudvikling og specifikationer for serum, er det tilrådeligt at udføre bekræftende bioassays ud over XTT-analysen, for eksempel måling af biofilmtykkelse / biomasse (ved hjælp af krystalviolet) eller cellelevedygtighed (ved hjælp af CFU-metoden)43. Bemærk, at resultaterne af dette XTT-assay korrelerede godt med det krystalviolette assay og CFU-metoden (data ikke vist). Uanset de ovennævnte begrænsninger kan denne metode ekstrapoleres til at evaluere forskellige grupper af serumprøver (kilde til polyklonale antistoffer), monoklonale antistoffer eller supplerende immunterapier. Selvom XTT-reduktionsprotokollen, der præsenteres her, kun viser effekten af antistoffer på C. tropicalis-biofilm, er den også blevet brugt af forskere til at studere effekten af antistoffer på C. auris-biofilm 18. Derudover stammer denne protokol fra tidligere undersøgelser udført med andre Candida-arter såsom C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis og C. auris, som kan fortjene udvidelsen af denne protokol til slægten Candida 16,41,44,45,46,47.
Optimering, standardisering og regelmæssig forbedring af biofilmkvantificeringsassays kan forbedre nøjagtigheden, gennemstrømningen og reproducerbarheden. XTT-reduktionsanalysen, som denne protokol er baseret på, er i vid udstrækning blevet anvendt til vurdering af biofilms metaboliske aktivitet og levedygtighed. Da Candida biofilm ofte er resistent over for svampedræbende medicin, er udforskningen af nye lægemidler og nye kombinationer en presserende nødvendighed33. For at bekæmpe spørgsmålet om biofilmassocierede infektioner skal flere antibiofilmforbindelser undersøges ved hjælp af biofilmscreeningsassays48. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm. Fremtidig forskning baseret på standardisering og forbedring af XTT-reduktionsassay, der involverer antistofbaserede immunterapier, kan hjælpe med udviklingen af forbedrede terapier til effektiv sygdomsstyring og -kontrol.
Biofilmhæmning af Sap2-specifikke antistoffer er blevet rapporteret som en antistofmedieret beskyttelsesmekanisme i Sap2-vaccine medieret beskyttelse under murine systemisk candidiasis forårsaget af C. tropicalis19. En tidligere undersøgelse viste også, at CAGTA, der potentielt genkender Sap-antigener, reducerer væksten og biofilmdannelsen af C. albicans in vitro16. I en anden undersøgelse udviste Sap2-slettede mutanter en biofilmvækstdefekt i nærværelse af pepstatin A49. Derudover spillede Sap2-antigenet under biofilmdannelse en rolle i proteolytisk behandling af mucin Msb2 medieret gennem Cek1 mitogenaktiveret proteinkinasesignalvej50. Derfor kan det spekuleres i, at Msb2-behandling hæmmes af antistofmedieret Sap2-neutralisering, hvilket påvirker biofilmintegriteten. Sammenfattende giver denne artikel en detaljeret protokol til vurdering af serumantistoffernes rolle i C. tropicalis biofilmmodning og udvikling, som kan anvendes til bestemmelse af biofilmmetabolisk aktivitet i forskellige indstillinger ved anvendelse af forskellige svampestammer eller antistofkilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ramalingaswami-bevillingen DBT-843-BIO (Institut for Bioteknologi, Indiens regering) og Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Indiens regering) til S.R. Forfatterne anerkender et ICMR-JRF-tilskud til P.C og DBT-JRF-tilskud til P.S. Forfatterne takker Dr. Ravikant Ranjan for forslag til manuskriptet og teknisk bistand fra Mr. Pradeep Singh Thakur under SEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | - | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | - | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
- Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
- Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
- Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
- Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
- Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
- Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
- Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
- Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
- Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
- Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
- Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
- Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
- Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
- Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
- Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
- Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
- Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
- Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
- Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
- Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
- Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
- Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
- Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
- Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
- Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
- Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
- Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
- Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
- Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).
