Forberedelse av faste Drosophila Oocytes for immunostaining: En høy gjennomstrømningsmetode for å fikse og fjerne den ytre membranen

- Begynn med å pulsere bedøvet Drosophila sammen med buffer i en blender for å bryte opp fluer i små biter. Filtrer blandingen gjennom et nett for å fjerne de store kroppsdelene. La eggene synke mens de større fragmentene forblir på overflaten og kan fjernes.

Gjenta denne prosessen ved hjelp av et mindre nett for å fjerne ekstra rusk. Samle eggene i et hetteglass, og hvis eggene skal behandles med et stoff, gjør du det på dette tidspunktet. Deretter fjerner du væsken og erstatter den med fiksering. Legg til heptane for å hjelpe fiksering penetrere membranen rundt egget.

Vask deretter bort fikseringsmiddelet med PBS. For å farge oocyttene, fjern de beskyttende ytre membranene for å tillate antistoffinntrengning. Pipette oocyttene på den frostede delen av en glasssklie. Legg en deksle over eggene og rull forsiktig dekslene i en frem og tilbake-bevegelse for å skille korion- og vitellinemembranen mekanisk fra egget.

I eksempelprotokollen forbereder vi oocytter i meiosis I for å flekke og visualisere spindelapparatet.

- For å begynne med, forskyve innsiden av et 5 milliliter rør og Pasteur pipette med PTB for å forhindre at oocytter stikker til overflatene. Tilsett 100 milliliter Robs buffer til en blender og tilsett deretter 100 til 300 bedøvede fluer og puls tre ganger i ett sekund.

Filtrer den resulterende slurryen i et 250 milliliter beger gjennom et stort nett med porer på rundt 1500 mikrometer. La filtratet slå seg ned i rundt to minutter og aspirer deretter topplaget, fjern så mange store kroppsdeler som mulig. Filtrer slurryen igjen i en 250 milliliter beger gjennom et mindre nett med porestørrelsen på 300 mikrometer.

Skyll det første begeret med ekstra buffer i den belagte pipetten for å samle de resterende oocyttene. La slammet slå seg ned i tre minutter og aspirer deretter alle unntatt de nederste 10 milliliter. Hell så mye av de 10 milliliterene som mulig inn i det belagte 5 milliliterrøret. La slammet slå seg ned i rundt to minutter og fjern deretter væsken forsiktig.

Tilsett resten av de 10 milliliter slurry og la blandingen slå seg ned igjen før du fjerner væsken. Skyll eventuelle gjenværende oocytter ut av begeret ved hjelp av ekstra buffer i den belagte pipetten. La skyllingen slå seg ned i 5 milliliterrøret i tre til fem minutter.

For å fikse eggstokkene, må du først aspirere av all væske fra vevet, og tilsett umiddelbart 1 milliliter fikseringsblanding. Plasser vevet på en mutter i to og et halvt minutt. Deretter legger du til 1 milliliter heptan, virveler røret i ett minutt, og la deretter oocyttene bosette seg i ytterligere et minutt.

Fjern all væske fra det avgjorte vevet, tilsett deretter 1 milliliter 1x PBS. Virvel røret i 30 sekunder, og la deretter oocyttene slå seg ned i ett minutt. Deretter fjerner du all væske fra røret og fyller den med fem milliliter 1x PBS.

Ved hjelp av den belagte pipetten, tilsett omtrent 500 til 1000 oocytter i et frostet glasssklie. Fjern eventuelle fremmede kroppsdeler eller materiale ved hjelp av tang. Plasser en deksle på toppen av vevet, og rull forsiktig oocyttene til alle membranene er fjernet. Dra kanten av dekslene over oocyttene fungerer bra. Kontroller fremdriften av membranfjerning under et mikroskop med jevne mellomrom.