Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Sinekleri küçük parçalara ayırmak için bir karıştırıcıda tampon ile birlikte uyuşturulmuş Drosophila'yı titreştirerek başlayın.
Ek döküntüleri gidermek için daha küçük bir ağ kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Yumurtaları bir şişede toplayın ve yumurtalar bir ilaçla tedavi edilecekse, bu noktada yapın. Sonra, sıvıyı çıkarın ve düzeltici ile değiştirin. Sabitleyicinin yumurtayı çevreleyen zara nüfuz etmesine yardımcı olmak için heptan ekleyin.
Ardından, sabitleyiciyi PBS ile yıkayın. Oositleri lekelamak için, antikor penetrasyonuna izin vermek için koruyucu dış zarları çıkarın. Oositleri bir cam kaydırağın buzlu kısmına pipetleyin. Yumurtaların üzerine bir kapak kılıfı yerleştirin ve koro ve vitellin zarını yumurtadan mekanik olarak ayırmak için kapak sapını ileri geri hafifçe yuvarlayın.
Örnek protokolde, iğ aparatını lekelemek ve görselleştirmek için meiosis I'de oositler hazırlayacağız.
- Başlamak için, yüzeylere yapışan oositleri önlemek için 5 mililitrelik bir tüpün ve PTB'li Pasteur pipetin içini önceden kesin. Bir karıştırıcıya 100 mililitre Rob tamponu ekleyin ve ardından bir saniye boyunca üç kez 100 ila 300 anestezi edilmiş sinek ve nabız ekleyin.
Elde ettiği bulamacı yaklaşık 1500 mikrometre gözenekli büyük bir ağ üzerinden 250 mililitrelik bir kabın içine filtreleyin. Filtratın yaklaşık iki dakika yerleşmesine izin verin ve ardından mümkün olduğunca çok sayıda büyük vücut parçasını çıkararak üst tabakayı aspire edin. Bulamacı 300 mikromener gözenek boyutuna sahip daha küçük bir ağ üzerinden 250 milimetrelik bir behere tekrar filtreleyin.
Kalan oositleri toplamak için kaplanmış pipette ek tampon kullanarak ilk beheri durulayın. Bulamacı üç dakika bekletin ve ardından alt 10 mililitre hariç hepsini aspire edin. 10 mililitreden mümkün olduğunca fazlasını kaplanmış 5 mililitrelik tüpe dökün. Bulamacı yaklaşık iki dakika bekletin ve ardından sıvıyı dikkatlice çıkarın.
10 mililitrelik bulamacın geri kalanını ekleyin ve sıvıyı çıkarmadan önce karışımın tekrar yerleşmesine izin verin. Kaplanmış pipette ek tampon kullanarak kalan oositleri beherden durulayın. Durulamayı 5 mililitrelik tüpe üç ila beş dakika boyunca yerleşin.
Yumurtalıkları düzeltmek için, önce dokulardaki tüm sıvıyı epire edin ve hemen 1 mililitre sabit karışımı ekleyin. Mendilleri iki buçuk dakika boyunca bir besleyiciye yerleştirin. Sonra, 1 mililitre hetan ekleyin, tüpü bir dakika boyunca girdaplayın ve ardından oositlerin bir dakika daha yerleşmesine izin verin.
Yerleşmiş dokudaki tüm sıvıyı çıkarın, sonra 1 mililitre 1x PBS ekleyin.
Kaplanmış pipeti kullanarak, buzlu bir cam kaydırağa kabaca 500 ila 1.000 oosit ekleyin. Forseps kullanarak herhangi bir yabancı vücut parçasını veya malzemesini çıkarın. Dokunun üzerine bir kapak ucu yerleştirin ve tüm zarlar çıkarılana kadar oositleri hafifçe yuvarlayın. Örtünün kenarını oositler boyunca sürüklemek iyi çalışır. Membran çıkarma işleminin ilerlemesini periyodik olarak mikroskop altında kontrol edin. Çok fazla basınç oositleri yok edecektir.
